KR20130137574A - 적혈구계 세포의 인 비트로 확장방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 성숙 적혈구 세포의 인 비트로 확장방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 세포 간 물리적으로 직접 접촉되도록 적혈구 세포를 고밀도로 배양하는 것을 특징으로 하는, 농축된 적혈구의 수득 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 방법은 시험관 규모의 바이오리액터의 작은 용기를 통해서 임상적으로 유용한 농축된 적혈구를 대량 수득할 수 있는 점이 매우 유용하다.

Description

적혈구계 세포의 인 비트로 확장방법{A Method for in-vitro Expansion of Erythroid cells}

본 발명은 적혈구계 세포의 인 비트로 확장방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 세포 간 물리적으로 직접 접촉되도록 적혈구계 세포를 고밀도로 배양하는 것을 특징으로 하는, 농축된 적혈구의 수득 방법에 관한 것이다. 특히, 이와 관련하여 접착-관련 유전자(adhesion-related gene) DLC-1, ICAM-4, 및 VLA-4의 발현에 의해 세포간 신호교환 활성이 증가함으로써 적혈구 세포의 생산율을 높인다.

과학 기술의 발달에 따른 인구 노령화와 의료적 수요의 증가로 인하여 수혈용 적혈구의 사용이 증가하였고 이로 인해 많은 양의 수혈용 적혈구의 공급이 부족한 상황이다. 또한, 수혈로 인하여 발생될 수 있는 수혈전파감염은 적혈구의 이용에 있어서 심각한 문제를 야기한다. 이러한 수혈전파감염은 인간면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스와 같은 바이러스 및 세균 오염을 포함한다. 해외 여행의 증가로 인하여 혈액감염으로 전염되는 열대병(blood-borne tropical diseases) 및 변종 크로이츠펠트 야곱병(variant Creutzfeldt-Jacob disease)과 같은 새롭게 등장한 병원체들도 역시 문제가 된다.

이러한 요인들로 인하여 인위적으로 생산된 적혈구의 필요성이 증가하였다(Greenwalt, T. J.; Zehner Sostok, C.; Dumaswala, U. J. Studies in red blood cell preservation. 1. Effect of the other formed elements. Vox Sang. 58:85-89; 1990; Olsson, M. L.; Clausen, H. Modifying the red cell surface: towards an ABO-universal blood supply. Br. J. Haematol. 140:3-12; 2008).

현재, 전 세계적으로 수혈에 필요한 혈액이 이미 많이 부족하기 때문에 환자에 대한 수술 및 치료에 차질을 빚고 있다. 이에 따라, 최근 여러 연구자들이 줄기세포를 이용하여 적혈구를 대량생산하려는 노력을 하고 있지만, 대부분 실험실 수준의 작은 배양 접시(culture well)에서 소량의 세포를 증식시킨 정도에 불과하다.

이처럼, 종래 발표된 보고서(Mountford et al. Prospects for the manufacture of red cells for transfusion. Br J Haematol. 2010, 149, 22-34)에 의하면 세포농도를 높이는 것이 대량생산을 위한 해결되어야 할 중요한 문제점이라고 했다. 또한 적혈구 한팩을 만들기 위해서는 현행 기술상 최고의 결과를 적용시키더라도 산술적 계산에 의하면 테니스 코트 2개 면적이 필요하여(Timmins et al. Blood cell manufacture: current methods and future challenges.Trends in Biotechnology 2009, 27, 415-422), 사실상 대량생산이 어렵다고 알려져 있다.

현재까지 대부분의 연구는 초기 줄기세포 및 전구세포의 증폭에 관하여 대부분의 노력이 집중되고 있다. 그러나 실질적으로 가장 중요한 단계인 후반부 세포의 성숙과정 및 낮은 탈핵율과 낮은 세포생존도에 대한 이유와 해결책에 대해 거의 연구되지 않고 있을 뿐만 아니라 이에 대하여 거의 알려지지 않았다.

본 발명자들은 전술한 선행 기술들의 문제점을 극복하고, 작은 규모의 공간에서도 임상적으로 유용할 수 있는 농축 적혈구 생산을 위해, 적혈구계 세포 간 물리적으로 직접 접촉되도록 고밀도로 배양하거나 ICAM-4 단백질 존재 하에 배양함으로써, 적혈구간의 결합이 특정 단백질을 매개하여 이루어짐을 발견하고, 이에 따른 세포간 신호교환 활성의 증가가 적혈구계 세포의 생산율을 높이는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주요한 목적은 전술한 선행 기술들의 문제점을 극복하면서 임상 등급 적혈구의 대량 생산(확장, 농축)이 가능한, 적혈구 전구세포의 인 비트로 확장방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 적혈구계 세포의 분화 마커용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 DLC-1, ICAM-4 및 VLA-4의 발현 또는 활성 촉진을 통하여 적혈구계 세포의 최종 성숙(terminal maturation)을 증가시키는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해서 본 발명은 세포 간 물리적으로 직접 접촉되도록 적혈구계 세포를 고밀도로 배양하거나 또는 ICAM-4 단백질의 존재 하에 배양하는 것을 특징으로 하는, 적혈구계 세포의 인 비트로 확장방법을 제공한다.

상기 적혈구계 세포는 적혈구 전구세포(erythroid progenitor cell)로부터의 성숙과정에 있는 세포들을 포함하며, 특히 바람직하게는 성숙과정이 거의 완료된 적혈구 세포로서, 더욱 바람직하게는 최종 성숙(terminal maturation) 단계 이후의 것을 포함한다. 이러한 최종 성숙(terminal maturation) 단계에서 적혈구의 탈핵(enucleation) 과정이 이루어진다.

상기 고밀도 배양은 씨딩시부터 세포간 접촉을 유발하기 위해 고밀도로 세포를 배양하는 것으로, 2D 플레이트에 적용시 면적당 세포면적의 개념에서 보면 100% 이상의 컨플루언스(confluence)에서 이루어지는 것을 특징으로 하는데, 예를 들어, 100~200%, 바람직하게는 100~150%의 컨플루언스(confluence)로 이루어질 수 있다. 이 때, 100% 컨플루언스는 약 5.0x10⁶ cells/2cm² (24 well의 바닥 면적이 2cm²) 의 밀도로, 150% 컨플루언스는 약 7.5x10⁶ cells/2cm²의 밀도로 씨딩하여 배양한 경우를 포함한다.

그리고, 상기 ICAM-4 단백질의 존재 하 배양은 예를 들어, ICAM-4 발현 벡터의 도입 또는 ICAM-4 단백질 첨가에 의해 수행될 수 있다.

적혈구계 세포 배양은 플레이트 등을 이용한 2D 배양 또는 튜브 등을 이용한 3D 배양의 형태로 이루어질 수 있는데, 바람직하게는 적혈구계 세포를 가라앉혀 패킹(packing)된 상태에서 이루어지는 3D 배양으로 수행하는 것이 좋다.

한편, 본 발명에 있어서, 배양 중 적혈구계 세포는 DLC-1, ICAM-4 및/또는 VLA-4의 접착-관련 유전자(adhesion-related gene)를 발현하는 것을 특징으로 한다. 골수내에서 접착-관련 유전자 발현에 의해 조혈과정이 조절되는 것처럼, 이러한 접착-관련 유전자 발현에 의해 세포간 신호교환 활성이 증가함으로써 적혈구계 세포의 생산율이 높아지는 것이다.

특히, 배양되는 적혈구 세포는 발현하는 또는 첨가되어 있는 ICAM-4 단백질을 매개로 상호 결합 및 신호전달이 자극되어 있는 것을 특징으로 한다.

그러므로, 본 발명의 다른 구체적인 방법으로서, 적혈구계 세포배양시에, 세포 배양액에 DLC-1, ICAM-4, 및 VLA-4 단백질을 추가로 첨가시켜 효율을 높일 수도 있다.

특히, 본 발명에서는 처음으로 DLC-1 및 분비형 ICAM-4 유전자와 적혈구계 세포의 분화 및 성숙과정과의 관계를 규명하였다. 즉, 종래 DLC-1이 암세포와 관련해서만 알려진 것에 비해, 정상적인 세포의 증식 및 분화 과정에서도 역할이 있음을 처음 규명하게 된 것에 또한 의의가 있다. 그리고, 인간 적혈구계 세포의 분화에 있어, 최종성숙 단계에서 분비형 ICAM-4이 발현하는 것 또한 처음 발견하였다.

상기 DLC-1 및 ICAM-4은 적혈구계 세포가 성숙(maturation)함에 따라 탈핵 전까지 발현 양이 증가한다. 그러므로, 본 발명은 다른 구체예로서 DLC-1 및/또는 ICAM-4을 포함하는 적혈구 분화 마커용 조성물을 제공한다.

DLC-1 및 ICAM-4은 각각 서열번호 1 및 2로 표시되는 핵산 서열로 이루어질 수 있으나, 그 기능을 유지하는 한 적절한 변형이 가능하다.

이 때, 상기 DLC-1은 ICAM-4와 연관되어 접착 관련 신호(adhesion-related signals)를 방출하고, 적혈구 세포간 신호교환 활성이 증가함으로써 적혈구계 세포의 생산율이 높아진다.

유사한 관점에서 본 발명은 또 다른 구체예로서, DLC-1, VLA-4 및 ICAM-4의 발현 또는 활성 촉진을 통하여 적혈구계 세포의 성숙, 특히 최종 성숙(terminal maturation)을 증가시키는 방법을 제공한다. 그리고, 이러한 DLC-1, VLA-4 및 ICAM-4의 발현 또는 활성 촉진 방법을 통해 궁극적으로 임상적으로 유용할 수 있을 정도로 적혈구를 인 비트로 확장시킬 수 있다.

이 때, 상기 적혈구 세포의 최종 성숙(terminal maturation)은 탈핵(enucleation) 단계를 포함하고, DLC-1, VLA-4 및 ICAM-4의 발현 또는 활성 촉진에 의해 이러한 탈핵 공정이 활성화된다. 이 때, 상기 ICAM-4 유전자는 분비형 또는 멤브레인 결합형 단백질로 발현될 수 있다. 바람직하게는 분비형이다.

즉, 본 발명은 DLC-1, VLA-4 및 ICAM-4 발현은 성숙 적혈구 전구세포들(polychromatophilic or orthochromatic erythroblast)간에 신호교환의 활성을 증가시키는 방법 및 이를 이용하여 적혈구 세포의 최종 성숙을 증가시킨다.

그리고, DLC-1, VLA-4 및 ICAM-4의 발현 또는 활성 촉진을 구현하기 위해, 다양한 공지의 방법에 의해 적혈구계 세포에 DLC-1, VLA-4 및 ICAM-4을 도입하는 방법이 사용될 수 있다.

이와 같은 본 발명에 따른 방법 및 조성물은 생물반응장치 시스템(bioreactor systems)과 같은 작은 규모의 시스템을 통해 인간 적혈구의 "대량 생산(확장, 농축, 증폭)"에 적용시킬 수 있는 장점이 있다.

본 발명은 적혈구계 세포 간 물리적으로 직접 접촉되도록 고밀도로 배양하거나 ICAM-4 존재 하에 배양함으로써, 접착-관련 유전자(adhesion-related gene)의 발현 및 이에 따른 세포간 신호교환 활성을 증가시켜, 작은 규모의 생물반응장치 시스템에서도 효과적으로 적혈구계 세포의 생산율을 높일 수 있다. 즉, 좁은 공간에서도 임상적으로 유용할 수 있을 정도로 적혈구를 확장시킬 수 있다.

따라서 본 발명은 적혈구 한팩을 만들기 위해 최소한 테니스 코트 2개 면적이 필요하고 바이오리액터를 이용한 최적의 이론적 계산에서도 최종 배양시 1000 L가 필요하기 때문에, 사실상 대량생산이 어렵다고 알려진 종래의 보고를 완전히 뒤집고, 세포간 접촉을 극대화 시킨 패킹(packing)상태인 200~400 mL (0.2~0.4 L)의 공간에서 농축적혈구 한 팩의 생산을 가능하게 한다.

도 1은 다양한 밀도 조건에서 적혈구 세포를 배양하는 본 발명의 실시예들에 대한 모식도 및 각 밀도의 조건하에서 배양한 세포관찰 모습이다.
도 2는 적혈구 세포의 최종 성숙(terminal maturation) 단계에서 50%, 100%, 150% 컨플루언스(confluence)로 배양한 경우의 염색, 탈핵율, 세포사멸 분석 결과이다(화살표는 망상적혈구를 나타냄).
도 3은 적혈구 세포의 최종 성숙(terminal maturation) 단계에서 50%, 100%, 150% 컨플루언스(confluence)로 배양한 경우의 유세포 분석 및 RT-PCR 분석 결과이다.
도 4는 사용한 배지의 생화학적 분석 결과이다.
도 5는 적혈구 형성과정에서의 적혈구세포끼리의 결합(contact)을 보여주는 모습을 관찰한 결과이다.
도 6은 고밀도 배양을 이용하여 배양한 적혈구 세포의 최종 성숙 단계에서의 밀도접착 관련 유전자인 DCL-1 및 VLA-4의 발현 분석 결과이다.
도 7은 K562 세포에서 DLC-1이 발현됨을 보여주는 결과이다.
도 8은 고밀도 배양을 이용하여 배양한 적혈구 세포의 최종 성숙단계에서의 밀도 접착 관련 유전자인 DLC-1과 ICAM-4의 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 9는 K562 세포내에서 DLC-1과 ICAM-4이 서로 결합함을 보여주는 결과이고, 인간 적혈구계 세포에서 DLC1의 발현 및 ICAM4 발현부위에서의 유사한 발현을 보여주는 현광 현미경 사진이다.
도 10은 세포에서 분비되어 배지 내에 존재하는 분비형(secretory form) ICAM-4의 발현 분석 결과이다.
도 11은 재조합된 ICAM-4 단백을 최종 성숙 단계의 적혈구 분화세포(late matruing erythroblast)에 처리했을 때의 세포의 분화 정도, 세포의 생존율, 탈핵율, 이형성증의 정도 그리고 적혈구 생성률을 분석한 결과이다.
도 12는 적혈구계 세포가 패킹(packing)상태에서 배양 가능함을 확인한 것으로, 각 시기마다 세포의 상태를 위상차 현미경으로 관찰하고 트립판 블루 염색으로 세포수를 계수하여 생존률을 계산한 것이다.
도 13은 농축된 적혈구 1팩을 형성하기 위해 필요한 세포 배양 면적 및 부피에 대한 종래 방법 및 본 발명의 방법의 경우를 비교한 그림이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

"프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.

'재조합 단백질(recombinant protein)'은 재조합 DNA(recombinant DNA)를 통하여 생산된 단백질이다. 재조합 DNA(recombinant DNA)는 유전자가 운반체(vector)를 통하여 세포 속으로 도입되어 유전자의 기능이 발현되도록 하는 유전자 재조합기술을 통하여 만들어진 것을 의미한다. 재조합 기술에 의하여 만들어진 최종산물인 재조합 단백질은 대량생산 및 공정을 가능함을 의미한다.

'전구세포(progenitor cell)'는 자기 복제능 및 분화능(differentiation potency)을 가진 미분화 세포이지만, 최종적으로 분화하는 세포의 종류가 이미 결정되어 있는 궁극적으로 분화된 세포이다. 전구세포는 분화 경로가 예정되어 있지만, 일반적으로 성숙한 완전히 분화된 세포의 마커를 발현하지 않거나, 성숙한 완전히 분화된 세포로서는 기능하지 않는다. 따라서, 전구세포는 관련 세포 타입으로 분화되지만 정상적인 상태에서는 매우 다양한 세포 타입을 형성할 순 없다. 본 발명에서는 적혈구 전구세포를 사용한다.

'분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

'확장, 농축 또는 증폭'(expansion 또는 concentration)이라는 용어는 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다. 세포수가 증식(증폭)되어 어느 시기에 이르면, 형질이 변화(분화)되어 가는 것과 동시에 제어되고 있는 것이 보통이다. 체내에서 세포가 증가되어 가는 것과, 또 세포 내에서 세포질이 신생(新生)되어 가는 경우에는 생장으로 구별하는 경우가 많다. 그러나 생물학적으로 세포수가 증가된다는 점에서 보면, 다세포생물의 발생기에서 분화가 일어나지 않는 시기는 증식(확장, 증폭)으로 보는 것이 정당하다. 본 발명에서는 상기 세 용어가 혼용되어 쓰이고 있다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 산업적으로 사용할 수 있을 정도로 인 비트로에서 적혈구를 대량 생산(확장, 농축)할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 적혈구 세포의 확장 시에 세포 간 물리적으로 직접 접촉되도록 적혈구 세포를 고밀도로, 종래 알려진 경우보다 약 10배 이상의 고밀도로 배양함에 의해 작은 크기의 인 비트로 규모에서 농축 적혈구 한 팩의 생산이 가능함을 확인하였다. 그리고, 이러한 고밀도 배양 중 접촉-관련 특정 유전자 DCL-1, ICAM-4, 및 VLA-4이 발현함을 확인하면서, 특히, 적혈구 전구세포간의 결합이 ICAM-4를 매개로 이루어짐을 발견하였다.

그러므로, 이러한 발견을 기초로, 비록 고밀도로 배양하지 않는 경우라도 ICAM-4 단백질의 존재 하에 적혈구를 배양하는 경우에도 효과적으로 적혈구를 대량으로 수득하는 방법으로 추가로 착안하였다.

이러한 본 발명은, 종래 적혈구 한 팩을 만들기 위해 약 테니스 코트 2개에 해당하는 면적이 필요하다는 보고를 뒤엎고, 기존 보고의 260.8^{- 1} 의 배양기 단면적 혹은 배양기 용적 2m³에서도 농축 적혈구 한 유닛(U)을 생산할 수 있음을 보여줌으로써 공장화를 통한 대량 생산이 가능함을 시사한다.

본 발명은 적혈구계 세포의 인 비트로 확장방법에 관한 것이다.

적혈구계 세포(erythroid cells)은, 적혈구 전구세포(erythroid progenitor cell)로부터의 성숙과정에 있는 모든 세포를 포함하고, 특히, 적혈구 전구세포(erythroid progenitor cell)로부터의 성숙과정이 거의 완료된 세포가 바람직하며, 가장 바람직하게는 최종 성숙(terminal maturation) 단계인 염기성 적아세포(polychromatophilic erythroblast)와 정염성 적아세포(orthochromatic erythroblast) 단계의 것을 의미한다. 이러한 최종 성숙(terminal maturation) 단계에서 적혈구의 탈핵(enucleation) 과정이 이루어진다.

적혈구 전구세포는 다양한 소스, 예컨대 말초혈액, 제대혈 또는 골수로부터 얻을 수 있다. 적혈구 전구세포로서의 CD34+세포는 당업계에 공지된 다양한 세포 분리 방법, 예컨대 CD34+항체를 이용하는 면역자기-비드 분리방법에 따라 분리할 수 있고, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 CD34+세포는 제대혈로부터 유래된 세포일 수 있다.

적혈구 전구세포는 다음과 같은 단계로 이루어진 적혈구 형성 과정(erythropoiesis)를 거쳐 성숙한 적혈구(erythrocyte)로 분화한다: (a) 조혈모세포(hematopoietic stem cell)에서 전적아세포(proerythroblast)로 분화하는 단계; (b) 전적아세포에서 호염기성 적아세포(basophilic erythroblast)로 분화하는 단계; (c) 호염기성 적아세포에서 다염기성 적아세포(polychromatophilic erythroblast)로 분화하는단계; (d) 다염기성 적아세포에서 정염성 적아세포(orthochromatic erythroblast)로 분화하는 단계; (e) 정염성 적아세포에서 다염성 적혈구(polychromatic erythrocyte)로 분화하는 단계; 및 (f) 다염성 적혈구에서 적혈구(erythrocyte)로 분화하는 단계.

따라서 본 발명은 성숙단계의 적혈구(erythrocyte) 단계(d, e, f 단계)에 있는 세포들을 포함하는 것이 바람직하다.

즉, 본 발명은 성숙단계의 적혈구(erythrocyte) 단계의 세포들을 산업적으로 유용할 수 있을 정도로 확장(expansion) 및/또는 농축(concentration) 시켜 임상적 사용이 가능한, 적혈구 팩 단위의 양으로 대량으로 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

일 구체적인 태양으로서, 본 발명은 세포 간 물리적으로 직접 접촉되도록 적혈구 세포를 고밀도로 배양하는 것을 특징으로 하는, 적혈구계 세포의 인 비트로 확장방법에 관한 것이다.

즉, 적혈구 세포들이 서로 물리적으로 직접 접촉하여 세포간 상호작용이 일어날 수 있을 정도로 높은 밀도로 배양하는 것을 일 특징으로 한다.

상기 고밀도 배양은 전통적으로 세포간에 증식할 수 있는 여지를 주기 위해 30~70%의 컨플루언스(confluence)가 되도록 씨딩(seeding)하던 것이 아니라, 씨딩시부터 세포간 접촉을 유발하기 위해 고밀도로 세포를 배양하는 것을 의미한다.

제한은 없지만, 2D 평면 배양의 경우, 2D 플레이트에 적용시 면적당 세포면적의 개념에서 보면 100% 이상의 컨플루언스(confluence)에서 이루어지는 것을 특징으로 하는데, 예를 들어, 100~200%, 바람직하게는 100~150%의 컨플루언스(confluence)를 나타내는 것을 포함한다. 100% 컨플루언스는 종래 적혈구 세포 배양에서의 세포 밀도의 약 10배 이상의 밀도 크기에 해당한다. 또한, 3D 배양의 경우 세포가 배양공간 내에서 아래로 가라앉아 패킹(packing)되어 있는 상태로서 한 유닛의 헌혈혈액의 경우 200~400 mL 안에 약 2x10¹² 개의 세포가 들어있다.

상기 물리적인 접촉 외에 배양액 당 세포 농도를 일정하게 유지하기 위해 50, 100, 150% 컨플루언스 조건당 배양액은 1, 2, 3 mL을 넣어 영양분이나 세포대사 노폐물의 농도 조건을 일정하게 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 적혈구계 세포 배양은 플레이트 등을 이용한 2D 배양 또는 튜브 등을 이용한 3D 배양의 형태로 이루어질 수 있는데, 특히, 적혈구계 세포를 가라앉혀 패킹(packing)된 상태에서 이루어지는 3D 배양으로 수행하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 패킹(packing) 상태로 배양시 세포의 생존도가 월등히 높게 나타남을 확인하였고, 이를 통해, 3차원적인 접촉을 이용하여 접촉을 극대시킨 상기 배양법이 적혈구계 세포의 대량 생산에 적용할 수 있음을 알 수 있다.

이처럼, 본 발명의 일 구체예에서는 고밀도로 적혈구 세포를 배양함으로써, 적혈구 세포 간 물리적으로 직접 접촉(contact)이 이루어지고, 이에 의해 적혈구 세포 간 상호작용이 나타난다. 본 발명의 일 실시예에서는 세포간의 직접 접촉은 세포막을 염색하여 형광현미경 관찰을 통하여 확인하였으며 세포간의 상호작용이 증거로 나타났다. 또한, 세포를 가라앉혀 패킹(packing)된 상태에서 배양하는 경우높은 세포 생존능을 확인하였다.

본 발명의 상기 방법에 따른, 상기 세포 간 물리적으로 직접 접촉된 적혈구 세포는 배양 중 DCL-1(Deleted in Liver Cancer 1), ICAM-4(Intercellular Adhesion Molecule-4), VLA-4(Very Late Antigen-4) 등의 접착-관련 유전자(adhesion-related gene)를 발현하는 것을 특징으로 한다.

즉, 본 발명의 방법에 따라 적혈구 세포 밀도가 높아지면, 접착-관련 유전자인 DCL-1, ICAM-4 및 VLA-4 발현이 증가하고 이에 의해 세포간 신호교환 활성도 증가한다. 그리고 이러한 세포 간 신호교환 활성 증가는 적혈구계 세포의 생산율을 높일 수 있게 한다. 특히, 적혈구 세포간의 결합이 ICAM-4를 매개로 이루어지는데, DLC-1과 ICAM-4이 서로 결합하여 적혈구 세포간의 결합을 형성하는 것이다.

상기 메커니즘에 기초하여, 다른 구체적인 태양으로서 본 발명은 ICAM-4 단백질의 존재 하에 배양하는 것을 특징으로 하는, 적혈구계 세포의 인 비트로 확장방법에 관한 것이다.

즉, 적혈구 세포간의 결합이 ICAM-4를 매개로 이루어지는 사실의 발견으로부터 ICAM-4 발현 벡터를 도입하거나 ICAM-4 단백질을 첨가하는 등 ICAM-4 단백질의 존재 하에 적혈구계 세포를 배양하는 것을 특징으로 한다. 이 때, ICAM-4 발현 벡터 도입하기 위해서, 당업계에 공지된 유전자 전달 시스템 및 유전자 조작법을 당업자가 적절히 사용할 수 있다.

처음부터 ICAM-4 존재 하에 적혈구계 세포를 배양시키는 경우에 세포간의 직접적인 결합 없이도 고밀도 배양의 경우와 동일한 효과를 가진다. 적혈구 세포의 성숙단계에서 농도에 비례하여 생존능을 증가시키고, 핵분열을 저해함으로써 적혈구생성을 막는 이형성증(dysplasia)를 감소시킨다. 즉, 적혈구계 세포의 탈핵률을 증가시켜 결국 최종 적혈구의 생성을 증가시키는 것이다.

이와 같이, 본 발명은 세포 간 물리적으로 직접 접촉되도록 적혈구계 세포를 고밀도로 배양하거나 또는 ICAM-4 단백질의 존재 하에 배양하는 것을 특징으로 하는, 적혈구계 세포의 인 비트로 확장방법을 제공한다.

본 발명의 상기 방법들에 따른 배양 중 적혈구계 세포는 DCL-1, ICAM-4, VLA-4 등의 접착-관련 유전자(adhesion-related gene)를 발현하고, 이러한 유전자들의 기능에 의해 세포 간 신호교환 활성이 증가되어 적혈구계 세포의 생산율을 높인다.

그러므로, 이러한 기작을 이용하는 본 발명의 다른 구체적인 방법으로서, 배양시 DLC-1, ICAM-4, 및 VLA-4 단백질을 적혈구계 세포 배양액에 첨가시켜 고밀도 배양의 경우와 유사한 환경을 만드는 방법을 이용할 수도 있다.

이러한 단백질 첨가 방법 또한 2D 또는 3D 배양방법으로 수행될 수 있음은 상기 설명한 바와 같다. 특히, 이러한 단백질 첨가는 바이오리액터(bioreactor) 등을 이용하여 적혈구계 세포를 배양할 때, 생성 효율을 더욱 높일 수 있는 한 수단으로 용이하게 사용될 수 있을 것이다.

한편, 본 발명은 또 다른 관점에서 적혈구계 세포배양에서 발현하는 상기 유전자 DLC-1, ICAM-4, 및 VLA-4의 기능에 관한 것이다.

특히, VLA-4는 체내 및 체외에서의 적아세포 분화와 팽창에 필수적인 유전자로, 적혈구가 생성되는 동안 많이 발현된다고 알려져 있지만(Dormer et al. 등), DLC-1이 적혈구계 세포에서 발현된다는 것은 보고된 바가 없다.

본 발명자들은 DLC-1이 적혈구로 분화유도가 가능한, 인간 적혈구계 세포주인 K562 세포에서 발현하는 것을 처음으로 확인하였다. 특히 DLC-1이 적혈구계 세포의 분화과정, 특히 성숙과정에 관여한다는 사실을 확인하였다.

DLC-1의 발현은 탈핵 공정 동안 더욱 증가하는데, DLC-1은 VLA-4와 결합하여 접착 관련 신호(adhesion-related signals)를 방출함으로써 이러한 탈핵 공정(enucleation) 및 최종 성숙 단계를 더욱 활성화시킨다. 따라서, 상기 DLC-1는 적혈구 세포의 분화-특이적, 즉, 성숙 단계가 진행됨에 따라 그 발현이 증가함으로 적혈구 세포의 분화(성숙) 마커로 기능할 수 있다.

또한 인간 적혈구계 세포에서 분비형(secretory form) ICAM-4의 발현 역시 처음으로 확인하였다. 이러한 분비형 ICAM-4 발현은 세포간 신호교환의 활성에 영향을 준다.

그러므로, 본 발명은 다른 관점에서 DLC-1 및/또는 ICAM-4을 포함하는 적혈구 분화 마커용 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 적혈구 세포의 최종 성숙 단계 여부를 판단하는데 상기 조성물을 이용할 수 있다. 본 발명의 마커 조성물은 DLC-1을 주요 성분으로 포함할 수 있고, 바람직하게는 DLC-1 및 ICAM-4의 두 유전자를 모두 포함하는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명은 다른 관점에서, 본 발명은 상기 DLC-1의 발현 또는 활성 촉진을 통하여 적혈구 세포의 최종 성숙(terminal maturation)을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 앞서 설명한 바와 같이, 상기 적혈구 세포의 최종 성숙(terminal maturation)은 탈핵(enucleation) 단계를 포함한다.

또한, 상기 DLC-1의 발현 또는 활성 촉진은 VLA-4 및/또는 ICAM-4 유전자의 발현 또는 활성 촉진과 함께 이루어질 수 있다.

이 때, 상기 DLC-1, VLA-4, 및 ICAM-4의 발현 또는 활성 촉진은 적혈구 세포에 DLC-1을 도입하는 방법으로 이루어질 수 있다. "DLC-1, VLA-4, 및 ICAM-4를 도입(형질도입)한다"는 것은 상기 유전자들을 암호화하는 핵산을 적혈구계 세포로 도입하는 것을 말한다.

적혈구계 세포에 상기 유전자들을 도입하기 위해 DNA-칼슘 침전법,리포좀을 이용하는 방법, 폴리아민 계열을 사용하는 방법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 레트로바이러스를 이용하는 방법, 아데노바이러스를 이용하는 방법 등 당분야에 공지된 유전자의 세포내 도입기술 방법이 사용될 수 있다. 일 구체예로서 DLC-1을 암호화하는 핵산을 각각 별개의 발현 벡터 또는 하나의 발현벡터에 삽입시킨 후, 이를 적혈구 세포에 도입하는 것을 포함한다.

상기 DLC-1, VLA-4, 및 ICAM-4을 암호화하는 각 핵산은 당업계에 공지된 DLC-1, VLA-4, 및 ICAM-4을 암호화하는 염기서열을 가지는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다.

또한 상기 핵산은 DLC-1, VLA-4, 및 ICAM-4의 각 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1, 2 및 3으로 표시되는 각각의 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는80％,보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 본 발명의 DLC-1 실질적으로 동등한 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. '동등한 생리활성'이란 적혈구 세포의 확장에 있어서 접착 관련 신호(adhesion-related signals)를 방출함으로써 적혈구 세포의 탈핵 공정(enucleation) 및 최종 성숙 단계를 더욱 활성화시키는 활성을 의미한다.

또한 상기 DLC-1, VLA-4, 및/또는 ICAM-4을 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다(Sambrook, Fritsch and Maniatis, 'Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory press, 1989; Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992). 예컨대, 게놈으로부터 핵산을 증폭시키기 위한 PCR 증폭, 화학적 합성법 또는 cDNA 서열을 제조하는 기술이 있다. 본 발명은 이런 기술에 따라 합성된 재조합 DLC-1, VLA-4, 및/또는 ICAM-4 단백질을 배양액에 넣어 사용되는 방법을 포함한다.

본 발명에 따른 적혈구계 세포는 당업계에 공지된 적절한 방법 또는 이를 변형한 방법에 의해 증식 및 확장될 수 있다.

일 구체예로서, 무기질(stroma-free), 무혈청(serum-free) 및/또는 무혈장(plasma-free) 배지를 이용할 수 있다. 이 때, 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분만을 포함하는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)를 사용할 수 있는데, 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등의 상업적으로 제조된 배지를 사용하거나 인위적으로 합성하여 제조하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 배지는 체외에서 산화 스트레스로부터 안정 상태를 유지할 수 있도록 비타민 C를 포함할 수 있고, 필요에 따라 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 추가로 포함할 수도 있으며, 줄기세포인자, 인터루킨-1, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-11, 과립구 대식세포 집락자극인자, 대식세포 집락자극인자, 과립구 집락자극인자 또는 에리쓰로포이에틴 중 적어도 하나를 추가로 더 포함할 수도 있다.

또한, 본 발명의 방법에 있어서, 적혈구계 세포의 배양은 통상의 배양용기, 즉 일반 배양용기(예를 들어, CO₂ 인큐베이터) 혹은 바이오리액터(bioreactor) 등을 이용하여 수행할 수 있다

본 발명은 세포 간 물리적으로 직접 접촉되도록 적혈구 세포를 고밀도로 배양하거나 ICAM-4 존재하에 배양함으로써, 세포간 신호교환 활성을 증가시켜 더욱 고농도의 적혈구를 생산 가능하게 하는 바, 임상에서 사용되는 적혈구 한 팩을 만들기 위해 테니스 코트 2개 면적이 필요하여 사실상 대량생산이 어렵다는 종래의 발표를 뒤엎고, 바닥 면적 1m², 높이 2m의 매우 작은 바이오리액터에서 생산이 가능함을 증명하여 적혈구 생산의 공장화가 가능함을 시사한다(도 13).

즉, 기존 보고의 260.8분의 1의 면적에서 농축적혈구 한 팩의 생산이 가능하게 된 것이다.

한편, 본 발명의 방법에 의해 수득된 농축된 적혈구는 다양한 치료학적 적용을 가질 수 있다.

특정의 구체예에서, 적용하는 적혈구는 수혈에 사용될 수 있다. 수혈을 위한 다량의 세포를 생성시키는 능력은 전국적으로 혈액 은행 및 병원에서 겪고 있는 혈액의 만성적 부족을 완화시킬 수 있다. 본 발명의 방법은 수혈을 위한 범용 세포 (universal cells)의 생산을 허용한다.

본 발명의 특정한 관점은 인간 적혈구 세포를 상업적 양에 도달하도록 확장(expansion)시키는데 관한 것이다.

인간 적혈구 세포는 대규모로 생산되고, 필요한 경우에 저장되며, 병원, 임상의 또는 다른 건강관리 시설에 공급된다. 일단 환자가 예를 들어, 허혈 또는 혈관 상해와 같은 적응증을 나타내거나, 조혈성 재구성을 필요로 한다면, 인간 적혈구 세포를 시기 적절한 방식으로 주문하고 공급받을 수 있다. 따라서, 본 발명은 인간 적혈구 세포를 상업적 규모에 도달하도록 생성 및 확장시키는 방법, 상기 방법으로부터 유도된 인간 적혈구 세포를 포함하는 세포 제제뿐만 아니라, 인간 적혈구 세포를 병원 및 임상의에게 제공하는 (즉, 생산하고, 임의로 저장하고, 판매하는) 방법에 관한 것이다.

추가로, 본 발명의 다른 특정한 관점은 본 발명에 기술된 방법에 의해서 확장된 적혈구 세포를 생산, 저장, 및 배포하는 방법에 관한 것이다. 시험관 내에서 인간 적혈구 세포를 생성 및 증량시킨 후에, 인간 적혈구 세포를 수확하고, 정제하고, 환자의 치료 전에 임의로 저장할 수 있다. 따라서, 특별한 구체예에서 본 발명은 적혈구 세포를 병원, 건강관리 센터, 및 임상의에게 공급하는 방법을 제공하며, 이에 의해서 본 발명에 기술된 방법에 의해서 생산된 적혈구 세포는 저장되고, 병원, 건강관리 센터, 또는 임상의에 의한 요구에 따라 주문하여 적혈구 세포 치료법이 필요한 환자에 투여된다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 본 발명에 따른 적혈구 세포의 생산 및 다양한 특성 확인 테스트

1. 세포 배양 및 산출( enumeration )

면역자성 마이크로비드 분리법(immunomagnetic microbead selection method) 및 EasySep CD34 분리 키트(StemCell Technologies, 밴쿠버, 캐나다)를 사용하여 건강한 기증자의 제대혈로부터 CD34+를 분리하였다.

CD34+세포들은 이용될 때까지 냉동 상태로 보관되었고, 냉동시 이 세포들은 17일에서 18일 동안 기질 및 혈청이 없는 조건에서 3 x 10⁵ cells/ml의 밀도에 배양되어졌다.

여러가지 사이토카인들이 CD34+ 세포의 분화를 위해 첨가되었다. 0일에서 7일까지, 세포들은 10 ㎛ 하이드로코르티손(Sigma), 100 ng/ml 줄기세포 인자(미국 미네아폴리스, 미네아폴리스, SCF; R&D Systems), 10 ng/ml 인터루킨 (IL)-3 (R&D Systems), 그리고 6 IU/ml 에리스로포이에틴 (미국, 캘리포니아, 라 졸라, EPO; Calbiochem)으로 보충된 배지에서 배양되었다.

7일에서 13일까지 확대된 적아세포들이 50 ng/ml SCF, 10 ng/ml IL-3, 그리고 3 IU/ml EPO 상태에서 배양되었다. 13일부터 17일까지, 50 ng/ml SCF 그리고 2 IU/ml EPO가 첨가되었다. 배양 매체는 2일마다 교체되었다. 그리고, 13일부터는 싸이토카인을 넣지 않고 배양하였다. 세포들은 37℃에서 CO₂ 인큐베이터(일본, 산요)에서 배양되었다. 트리판 블루 염색이 세포의 수를 사용하는데 사용되어졌고, 남은 살아있는 세포만이 셀 확장의 분석에 포함되었다.

2. 밀도 효과를 위한 세포 배양

배양 시작부터 13일째 까지, 세포들은 낮은 세포 밀도에서 유지되었다. 이 단계에서, 세포들은 너무 급격하게 팽창하여 일정한 밀도를 유지할 수가 없다, 하지만 세포들은 원기왕성하고 생존능력이 세포 밀도와는 무관하게 높게 남아있었다

2-1. 2D 배양

배양 17일째 날, 정염성 적아세포(orthochromatic erythroblast)를, 웰 배양 판 위에 50% (2.5x10⁶ cells/ml), 100% (5.0x10⁶ cells/2 ml), 150%의 컨플루언스(confluence) (7.5x10⁶ cells/3ml) (Figures 1A-C)로 씨딩하였다.

배양시, 플레이트 중앙에 모여있는 세포들로 나타나는 컨플루언스(confluence)를 매일 체크하였다. 배지는 매일 보충되었고 같은 배양 상태를 유지하기 위해 컨플루언스를 조절하였다. 세포 컨플루언스(confluence)는 위상차 현미경으로 관찰되었고 세포 손상여부(cell integrity)를 Wright-giemsa의 염색법을 사용하여 확인하였다.

2-2. 3D 배양

3D 배양을 이용하여 적혈구계 세포가 세포간 접촉이 가장 극대화된 패킹(packing)된 상태에서 배양이 가능한지, 그리고 세포 생존도가 떨어지거나 응집이 일어나는지 관찰하기 위해, 상기 24웰 배양법(2D 배양)과 동시에 EPtube에 세포를 packing되도록 넣었다. 그 후, 매주 살아 있는 세포수를 계수하고, 세포상태를 위상차 현미경으로 관찰하였다.

3. 적혈구 세포의 영상화

세포원심분리기(Cellspin, Hanil Science Industrial, Seoul, Korea)를 이용한 사이토스핀법에 이어서 Wright-Giemsa 염색법(Sigma-Aldrich)에 의해 세포형태를 분석하였다.

핵의 제거 속도를 측정하기 위해, 400-450 개의 세포들이 매 밀도 상태와 시간 지점에서 총 수를 알기 위해 계수되었다. 염색된 세포의 사진을 디지털카메라(Eclipse TE2000-U, Nikon, Japan)로 찍었고, Nikon ACT-1 프로그램을 사용했다.

4. 세포 생존력의 결정

트리판 블루 염색법과 아넥신 V 분석을 사용한 유세포측정기로 세포 생존력을 측정하였다. 아넥신 V-PE와 프로피디움 아이오다이드(뉴저지, 프랭클린 레이크스, BD PharMingen)로 상온에서 15분 동안 세포를 염색하였다. 염색된 세포들은 세척 완충액으로 2회 세척되었고 유세포 계측법을 사용하여 분석되었다.

5. 적혈구 세포 검출의 유세포측정 분석

적혈구 세포의 성장 동안 표현형 변화를 측정하기 위하여 13일, 17일, 21일에 다음과 같은 항 인간 항체를 세포에 붙였다: (i) 글리코포린 A (GPA)-FITC (BD PharMingen, Franklin Lakes, NJ) (ii) CD71-FITC (eBioscience, San Diego, CA). 면역글로불린 G1(IgG1)-FITC 및 IgG1-PE(BeckmanCoulter,Miami,FL)를 동형 대조 염색을 위해 사용하였다. 면역표현형을 위하여, 세포를 인산염완충식염수(PBS)에서 세척하고, 각각의 단일클론항체와 함께 15분 동안 4 ℃에서 배양하였다. 세척 후, 세포를 인산염완충식염수(PBS)에 현탁시키고 유세포측정기를 사용하여 분석하였다.

헤모글로빈(Hb)의 세포내 발현을 FITC접합 항태아성헤모글로빈(HbF)과 PerCP접합 항성인형헤모글로빈(Hbβ, BD PharMingen)을 이용하여 분석했다. 간략히, 세포를 상온에서 10분 동안 차가운 0.05%의 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 안에서 다시 현탁시키고, 0.1%의 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 포함하는 인산염완충식염수(PBS)에서 세척하고, 상온의 0.1% 트리톤 X-100에서 5분 동안 현탁시켰다. 세척 후, 상온에서 15분 동안 상기 세포에 항체를 첨가하고 세척하였다. 유세포측정기 BD FACSCalibur™ (BD Biosciences, San Jose, CA) 및 제공되는 소프트웨어를 이용하여 염색된 세포를 분석하였다.

6. 형광 염색 및 세포 관찰

적혈구 성숙을 위하여 배양하는 세포에 세포막에 염색되는 시약(DiO)를 5분간 처리하고 완충용액을 이용하여 3번 세척하였다. 이후 세포를 배양액 속에 저장한 뒤 세포가 자라는 배양기의 환경 조건과 같게 맞추어져 있는 이미지 장비(live-cell imaging microscopy)의 안에서 4시간동안 배양하면서 사진 촬영하였다.

7. 생화학적 분석

19일째와 21일째에, 배양 배지가 수집되었고, 포도당 농도가 자동화된 분석기를 사용하여 결정되었다. pH와 칼륨 이온(K+) RapidSystems 혈액 가스 분석기를 사용하여 분석되었다(Siemens, USA). 락테이트 수준은 수집 2일 이내 Cobas Integra 800(스위스, Roce Diagnostics; Rotkreuz, )을 가진 효소 공법을 활용하여 측정되었다.

8. RT - PCR

전체 RNA를 Trizol (Invitrogen)을 사용하여 분리해내고, SuperScript III 역 전사 효소(Invitrogen)를 사용하여 상기 전체 RNA를 역전사하였다. triplicates에서(LightCycler 480 II; Roche Diagnostics) SYBR Premix ExTaq (Takara-Bio, Shiga, Japan)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 상대적 정량분석은 내생적 β-actin으로의 정상화(normalization)에 의해 달성하였다.

사용된 프라이머 세트는 Primer3 software를 사용하여 고안되었고, 프라이머의 특성을 확인하기 위해 BLAST 분석을 받았다.

사용된 프라이머 세트의 서열은 다음과 같다(forward/reverse):

E-cadherin: 5'-CGGGAATGCAGTTGAGGATC-3'(서열번호 4)

5'-AGGATGGTGTAAGCGATGGC-3'(서열번호 5);

VLA-4 : 5'-AGGATGGTGTAAGCGATGGC-3'(서열번호 6)

5'-TGCTGAAGAATTGGCTGAAGTGGTGG-3'(서열번호 7);

DLC-1 : 5'-AGTGCGTGCAACAAGCGGGT-3'(서열번호 8)

5'-TCCGGGTAGCTCTCGCGGTT-3'(서열번호 9);

ICAM-4 : 5'-CCGGACTAAGCGGGCGCAAA-3'(서열번호 10)

5'-AGCCACGAACTCCGGGCTCA-3'(서열번호 11).

9. ELISA( Enzyme - Linked ImmunoSpecific Assay )

immuno 코팅이 되어 있는 96 well plate에 첫 번째 항체(ICAM-4, santa cruze, USA)를 넣고 4℃에서 20시간 방치하였다. 이후 wash buffer(0.05%Tween-20이 포함된 PBS)를 이용하여 세 번 씻어낸 후 10% FBS가 포함된 PBS를 넣어 방치하였다. 2시간 후 다시 wash buffer를 이용하여 세 번 씻어낸 후 같은 수의 세포를 배양하여 얻은 상등액을 넣어 주고 18시간 4℃에서 방치한 후 wash buffer를 이용하여 5번 씻어 준 후 두 번째 항체 (HRP-conjugated secondary Ab, Jackson ImmunoResearch Antibody, USA)를 넣어 주고 상온에서 방치하였다. 1시간 후 wash buffer를 이용하여 7번 씻어 준 후 detection solution (Bio legend, USA)를 넣어 준 후 30분 후　ELISA reader (Applied Biosystems, USA)를 통해 읽었다.

10. 웨스턴 블럿( Western blot )

전체 단백질을 lysis 용액을 통해 분리시킨 후 50 ㎍으로 정량하여 사용하였다. 그 후 SDS-PAGE에 전기 영동 한 후 Hybond-ELC nitrocellulose membrane으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 membrane은 1시간동안 상온에서 5% skin milk ( in TBST: Tris buffer saline with Tween; 25mM Tris, 140 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH8.0)에 넣어 방치하였다. 1시간이 지난 후 primary 항체 (DLC-1, santa cruze, USA)를 4℃에 넣어 12시간 이상 보관하였다. TBST로 10분씩 3번 세척 후 HRP-conjugated secondary 항체 (anti-rabbit, Jackson ImmunoResearch Antibody, USA)를 넣어서 1시간 동안 상온에서 방치한 후 다시 TBST로 10분간 3회 반복하여 세척하였다. 이 후 detection reagent (ECL solution)을 가한 후 X-ray film에 노출시켜 각각의 단백질 발현을 확인하였다.

11. 재조합 단백질 처리

코팅되어 있는 24 웰에 성숙단계에 이른 erythroblast를 배양하였다. 2시간 후 재조합 단백질 ICAM-4(the purified recombinant ICAM-4 protein; OriGene Technologies, Baltimore, MD, USA) 을 0, 2, 5, 10 ㎍/㎖을 첨가 한 후 24시간 배양하였다. 24, 48 시간 후에 세포를 염색하고 세포의 수 및 생존능(viability)를 측정하여 분석하였다. 또한 세포의 영상화 방법을 통하여 한 세포 내에 핵이 비정상적으로 2~5개에 이르는 세포의 이형성증의 비율(dysplasia), 탈핵률 및 적혈구 세포의 생성률 등을 측정하여 분석하였다.

12. 통계적 분석

프리즘 소프트웨어 (Prism, Version 5.0, GraphPad, San Diego, CA)를 사용한 통계 분석을 수행했다. 결과는 평균 ± 평균의 표준오차(sem)로서 나타냈다. 통계적 유의성을 0.05 이하의 p값에서 설정했다. 샘플 그룹의 비교를 위해 한 쌍을 이루는 티-테스트(t-tests)를 사용하였다.

실시예 2: 본 발명에 따른 확장된 적혈구 세포 테스트 결과

(1) 동종 적혈구 세포 간 상호작용의 효과

시험관 내 적혈구 생성이 혈청과 기질이 없는 조건 하에 CD34+ 세포들을 사용하여 이루어졌다. CD34+세포들은 EPO, IL-3, 그리고 SCF를 포함한 적혈구의 분화 배지에서 배양되었다. 배양 17일째부터, 대부분의 세포들은 다염성(polychromatic)과 정염성(orthochromatic)이었을 때, 세포들이 다양한 밀도에서 배양되었다(도. 1). 이전의 연구에서처럼, 웰 당 배지 양은 일정하게 유지된 반면, 범위 당 세포 수들은 웰들 사이에서 변화하였다.

세포 형태를, Wright-Giemsa 염색을 사용하여 최종 성숙 동안 배양 밀도의 효과를 평가하였다. 그 결과, 세포 염색을 통해 낮은 밀도에서 배양의 경우가 형태가 좋지 않음를 확인하였고(50% 컨플루언스; 도 2 A), 이는 트라이판 블루를 사용한 생존 능력 시험 결과와도 일치했다(도 2 B). 이에 반해, 100%와 150% 컨플루언스의 배양에서 세포 생존 능력은 현저히 높았다.

적혈구 세포들이 다염성 단계(polychromatic stage)를 종료하면서, 세포 증식은 감퇴했고 세포사망률은 증가하였다. 50% 컨플루언스 (18.4%) (p<0.05) (도 2 C)의 적혈구 세포의 경우와 비교했을 때, 100% 와 150% 컨플루언스(각각 25.5% 및 20.6%)의 배양에서 고 수준의 핵의 제거(탈핵)가 관찰되었다.

생산된 RBC들의 수와 비교하면, 상응하는 세포 밀도에서 핵의 제거(탈핵) 속도로 증가된 배수(fold-expansion)으로 표현했을 때, 50%의 컨플루언스 배양은 100%와 150% 컨플루언스의 배양과 현저히 다른 양상을 보였다(paired t-tests, p < 0.05) (도. 2D). 100%의 컨플루언스(confluence)에서, 40%까지 이르는 탈핵율과 함께 8.6x105개의 망상적혈구들을 얻었다.

그리고, 적혈구 성숙의 최종 단계에서, 세포 자살률이 급격히 늘어났다. 카스파제-3활성화와 아넥신 V를 사용한 세포사멸 분석에서, 50%의 컨플루언스(confluence)에서 세포의 경우와 비교해볼 때 100%와 150%의 컨플루언스(confluence)에서 배양된 세포에서 세포사멸이 현저히 낮음을 확인하였다(도 2 E 및 F).

세포 생존율의 증가를 통해 100 %의 컨플루언스(confluence)에서 가장 높은 확장율이 나타남을 확인하였다. 이는 증가된 세포 밀도에서, 즉 고밀도에서 세포 대 세포의 접촉이 세포 사멸을 막을 수 있단 것을 의미한다.

(2) 형태 평가와 유세포 분석을 통한 세포 성숙 분석

호염기성 적아세포(basophilic erythroblast)에서 다염기성 적아세포(polychromatophiic erythroblast) 및/또는 정염성 적아세포(orthochromatic erythroblast)로의 성숙을, Wright-Giemsa 염색법을 사용하여 확인하였다(데이터 도시 않음).

그리고, 우선, 밀도 실험을 시작한 17일째에, 유세포 분석방법(flow cytometry)을 사용하여, 다염성과 정염성의 단계에 각각 상응하는 CD71 (>53.7%) 와 GPA (>87.3%)의 발현을 확인하였다(도 3).

그 후, 밀도 실험의 마지막날인 21일째에서, 유세포 분석방법(flow cytometry)을 사용하여 표현형 변화를 측정하였다. 그 결과, 배양 밀도에 따라, CD71과 GPA 발현들이 현저히 다르게 나타나지 않았고, 성숙 마커 GATA-1 및 Hbβ 발현 역시 크게 다르게 나타나지 않았다.

즉, 적혈구 성숙은 세가지 배양밀도에서 모두 비슷한 정도로 일어났다(도 3)

(3) 배양된 배지의 분석

신진대사 조절의 잠재적 효과를 최소화하기 위해서, 실험의 배양 밀도는 일정하게 유지되었다. 배양 조건을 평가하기 위하여, 우리는 포도당 소비, pH, 그리고 용해된 이온 농도를 분석했다.

전체 배양기간 동안 포도당 소비의 평균률은 저밀도 배양과 고밀도 배양이 21일째 되던 날까지는 크게 다르지 않았다. 배지의 pH와 칼륨 농도가 모든 밀도 조건에서 비슷했다(도.4).

(4) 배양하는 세포의 물리적 결합 확인

세포간의 물리적 결합이 이루어지는지를 확인하기 위하여 세포의 세포막을 염색시약을 이용하여 염색한 후 세포의 모습을 관찰하였다. 이때 세포의 분열과 다른 세포의 결합 모습이 확인되었다. 그 모습을 분석한 결과 적혈구 전구 세포 간의 물리적 결합이 이루어졌음을 처음으로 확인할 수 있었다(도.5)

(5) 유전자 발현에서 접촉-관련 변화

최종의 적혈구 성숙에서 접착 분자의 역할을 조사하기 위해, 마이크로 어레이 분석을 사용하여 분화시 다르게 발현된 유전자를 확인코자 하였다. 상기 후보 유전자로 ICAM-4, VLA-4, DLC-1 및 E-cadherin을 포함했다. 그리고 다른 밀도에서 배양된 세포에서 이러한 유전자 각각의 발현을 평가했다.

도 6에 나타난 바와 같이, 접착-관련 신호 유전자인 VLA-4 와 DLC-1 유전자는 모두 중간과 높은 수준의 밀도(100%와 150% 컨플루언스)에서는 과발현되었다(VLA-4, 4.4배 및 2.8배; DLC-1, 5.1배와 3.4배). 이 때, 100% 컨플루언스의 경우, 두 유전자의 발현량이 다소 더 많았다.

이를 통해, 적혈구 세포 사이의 물리적인 접촉은 접착-관련 신호 유전자의 발현에 의해 자발적인 접착관련 신호들(autonomous adhesion-related signals)을 유도함을 알 수 있다. 즉, 높은 밀도로 배양된 적혈구 세포들은 가용성 신호 인자를 분비하여 세포의 최종 성숙에 영향을 미치는 것이다.

(6) ICAM -4와 DLC -1의 발현 특성 및 적혈구 세포 분화에 대한 표지 기능

본 발명자들은 적혈구성 분화 유도가 가능한 K562 세포에서 DLC-1발현이 나타남을 처음으로 발견하였다(도7). 즉, 적혈구계 세포에서의 발현을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 적혈구성 분화유도가 가능한 세포주인 K562 세포에서 DLC-1과 secretory form ICAM-4의 발현을 처음으로 확인하였다.

마이크로 어레이 분석을 통해, 적혈구계 세포의 성숙과 함께 DLC-1 발현이 증가하는 것을 발견했다. 특히 DLC-1의 발현은 밀도에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 밀도가 증가할수록 DLC-1의 발현도 증가하는 것을 확인하였고 결과적으로는 밀도의 증가가 탈핵율의 증가를 동반하는 것을 확인했다(도 8A).

또한 적혈구계 세포에서 발현한다고 이미 알려져 있으며 mRNA를 통하여 확인한 ICAM-4의 단백질 변화도 확인하였다. 이는 mRNA와 마찬가지로 밀도의 증가에 따라 발현하는 것으로 확인되었다(도 8B)

이처럼, 상기 DLC-1 및 ICAM-4 발현은 밀도가 증가할수록 발현량도 증가하였고, 이러한 밀도증가는 중간밀도와 고밀도 배양에서의 탈핵율을 증가시킨다.

나아가, 본 발명자들은 이러한 점을 토대로 두 유전자간의 관계를 확인하기 위하여 두 유전자의 결합을 확인하였다.

이를 도 9에 도시하였다. 즉, K562세포내에 존재하는 ICAM-4와 DLC-1의 유전자로 생성되는 단백질의 결합을 통하여 확인하였다. 도 9의 형광현미경 사진은 인간 적혈구계 세포에서 DLC1이 발현되고, 또한, ICAM4 발현부위에서 비슷하게 발현됨을 보여주었다.

이러한 결과는 세포간 신호 교환에 있어 중요한 역할을 할 것이라고 예상되는 두 유전자의 결합은 분화에 있어 두 유전자가 세포의 접촉과 관련이 있을 것이라는 보여준다.

이는 DLC-1과 ICAM-4가 적혈구계 세포에서 발현이 가능하고 더 나아가 세포간 신호교환에 역할을 할 것이라는 것을 예상케 한다. 그리고, 지금까지 암세포에서만 발견된다고 보고되어 왔던 DLC-1이 세포의 접촉, 특히 혈액과 관련이 깊은 적혈구계 세포 간의 접촉에 연관이 되어 있음을 보여주었다.

그러므로, 상기 실험 결과들은 DLC-1 및 ICAM-4이 적혈구계 세포에서 분화 특성 표지로 기능할 수 있음을 시사한다.

(7) 분비형 ICAM -4의 발현 분석

특히, 분비형 ICAM-4의 발현에 대해 확인하였다.

지금까지 성숙된 적혈구계 세포(erythrocyte)에서 ICAM-4의 secretory 형태로 존재한다는 보고되지 않았다. 본 발명에서는 K562와 성숙된 적혈구계 세포(erythrocyte)내에서 secretory form ICAM-4가 발현 유무와 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 것과 같이 untreated control (세포가 없는 control media)을 100%로 환산시, 성숙된 적혈구세포(erythrocyte)에서는 약 10%의 secretory form ICAM-4를 확인하였고, K562세포에서는 40% 정도의 secretory form ICAM-4가 발현됨을 확인할 수 있었다.

이는 기존에 세포의 직접결합을 통한 세포막간 결합을 통해 적혈구계세포 분화(erythropoiesis)과정이 조절되는 것 외에도, 분비형 ICAM-4와 같은 가용성(수용성) 단백질이 세포 분화에 직간접적인 역할을 함을 시사한다.

(8) ICAM -4에 의한 최종 성숙 단계 증진

본 발명자들은 적혈구세포에서만 발현하는 것으로 보고되어 있는 ICAM-4가 세포내에서 어떠한 역할로 존재하는지 알아보기 위하여 재조합 ICAM-4를 사용하여 그 역할을 확인코자 하였다.

성숙단계에 이르는 적혈구 세포에 재조합 ICAM-4를 각각 다른 농도(2, 5, 10㎍/㎕)로 처리하여 배양하였을 때 세포의 생존능 및 탈핵율을 관찰하였다.

도 11에 재조합된 ICAM-4 단백을 최종 성숙 단계의 적혈구 분화세포(late matruing erythroblast)에 처리했을 때의 세포의 분화 정도, 세포의 생존율, 탈핵율, 이형성증의 정도 그리고 적혈구 생성률 분석결과를 도시하였다.

이를 통해 알 수 있는 바와 같이, 재조합 ICAM-4를 농도가 높아질수록 세포내 형성이상(dysplasia)증은 감소되고 탈핵율은 증가되었고, 이것은 적혈구의 생성이 증가되는 결과를 가져왔다. 또한 적혈구로 가는 성숙(maturation)과정으로 가는 세포의 수를 확인한 결과 이러한 결과를 재조합 ICAM-4의 양의 비례하여 성숙이 빨리 유도되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과를 통해, 상기 ICAM-4는 적혈구성 세포의 적혈구 생성을 촉진시키는 역할을 한다는 것을 알 수 있다.

실시예 3: 3D 배양

한편, 상기 24웰 배양법과 동시에 EP tube를 이용하여 3D 배양의 경우 적혈구계 세포의 생성을 관찰하였다.

즉, 적혈구계 세포가 세포간 접촉이 가장 극대화된 패킹(packing)된 상태에서도 배양이 가능한지, 이 때, 세포 생존도가 떨어지거나 응집이 일어나는지 여부를 관찰하고자 하였다.

배양 17~20일때 적혈구계 세포를 상기 기술한 배지에서 기존 단층으로 culture plate에 놓은 것과, EP tube에 packing하여 배양하여 세포가 엉기거나 압박에 의해 생존도가 낮아지는지 비교실험하였다. 매주 살아 있는 세포수를 계수하고, 세포상태를 위상차 현미경으로 관찰하였다.

그 결과를 도 12에 도시하였다. 2주때 packing한 조건에서 생존능(도)이 월등히 높음을 확인하였다. 즉, 3D 배양을 이용하여, 적혈구계 세포간 접촉을 극대화한 배양법이 적혈구계 세포 대량 생산에 적용 가능함을 확인하였다.

<110> HANYANG UNIVERSITY INDUSTRY COOPERATION FOUNDATION <120> A Method for in-vitro Expansion of Erythroid cells Using high-density culture <130> 2011-P-079 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3850 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tatgggctcg agcggccgcc cgggcaggtg cccgagcgag ggcgcttcgc tcccagccag 60 gacatggccg cacctctccg catcaggagc gccggctcac ggacttctcg cccaactccc 120 tgagcgctcc ctcgtttcga tctttagaaa accccgcttt ctttctgggg ccgtgacgag 180 gggcagggag cggcgagcaa ggatgcgttg aggaccgcga gggcgcgcgt ctcgggtgcc 240 gccgtgggtc ccgacgcgga agccgagccg cctccgcctg cctcgacttc cccacagcgc 300 ttccgccgcc gcctgccgtg cttgatgtgc agaaagaagc cggacaccat gatcctaaca 360 caaattgaag ccaaggaagc ttgtgattgg ctacgggcaa ctggtttccc ccagtatgca 420 cagctttatg aagatttcct gttccccatc gatatttcct tggtcaagag agagcatgat 480 tttttggaca gagatgccat tgaggctcta tgcaggcgtc taaatacttt aaacaaatgt 540 gcggtgatga agctagaaat tagtcctcat cggaaacgaa gtgacgattc agacgaggat 600 gagccttgtg ccatcagtgg caaatggact ttccaaaggg acagcaagag gtggtcccgg 660 cttgaagagt ttgatgtctt ttctccaaaa caagacctgg tccctgggtc cccagacgac 720 tcccacccga aggacggccc cagccccgga ggcacgctga tggacctcag cgagcgccag 780 gaggtgtctt ccgtccgcag cctcagcagc actggcagcc tccccagcca cgcgcccccc 840 agcgaggatg ctgccacccc ccggactaac tccgtcatca gcgtttgctc ctccagcaac 900 ttggcaggca atgacgactc tttcggcagc ctgccctctc ccaaggaact gtccagcttc 960 agcttcagca tgaaaggcca cgaaaaaact gccaagtcca agacgcgcag tctgctgaaa 1020 cggatggaga gcctgaagct caagagctcc catcacagca agcacaaagc gccctcaaag 1080 ctggggttga tcatcagcgg gcccatcttg caagagggga tggatgagga gaagctgaag 1140 cagctcagct gcgtggagat ctccgccctc aatggcaacc gcatcaacgt ccccatggta 1200 cgaaagagga gcgtttccaa ctccacgcag accagcagca gcagcagcca gtcggagacc 1260 agcagcgcgg tcagcacgcc cagccctgtt acgaggaccc ggagcctcag tgcgtgcaac 1320 aagcgggtgg gcatgtactt agagggcttc gatcctttca atcagtcaac atttaacaac 1380 gtggtggagc agaactttaa gaaccgcgag agctacccag aggacacggt gttctacatc 1440 cctgaagatc acaagcctgg cactttcccc aaagctctca ccaatggcag tttctccccc 1500 tcggggaata acggctctgt gaactggagg acgggaagct tccacggccc tggccacatc 1560 agcctcagga gggaaaacag tagcgacagc cccaaggaac tgaagagacg caattcttcc 1620 agctccatga gcagccgcct gagcatctac gacaacgtgc cgggctccat cctctactcc 1680 agttcagggg acctggcgga tctggagaac gaggacatct tccccgagct ggacgacatc 1740 ctctaccacg tgaaggggat gcagcggata gtcaatcagt ggtcggagaa gttttctgat 1800 gagggagatt cggactcagc cctggactcg gtctctccct gcccgtcctc tccaaaacag 1860 atacacctgg atgtggacaa cgaccgaacc acacccagcg acctggacag cacaggcaac 1920 tccctgaatg aaccggaaga gccctccgag atcccggaaa gaagggattc tggggttggg 1980 gcttccctaa ccaggtccaa caggcaccga ctgagatggc acagtttcca gagctcacat 2040 cggccaagcc tcaactctgt atcactacag attaactgcc agtctgtggc ccagatgaac 2100 ctgctgcaga aatactcact cctaaagcta acggccctgc tggagaaata cacaccttct 2160 aacaagcatg gttttagctg ggccgtgccc aagttcatga agaggatcaa ggttccagac 2220 tacaaggacc ggagtgtgtt tggggtccca ctgacggtca acgtgcagcg cacaggacaa 2280 ccgttgcctc agagcatcca gcaggccatg cgatacctcc ggaaccattg tttggatcag 2340 gttgggctct tcaaaaaatc gggggtcaag tcccggattc aggctctgcg ccagatgaat 2400 gaaggtgcca tagactgtgt caactacgaa ggacagtctg cttatgacgt ggcagacatg 2460 ctgaagcagt attttcgaga tcttcctgag ccactaatga cgaacaaact ctcggaaacc 2520 tttctacaga tctaccaata tgtgcccaag gaccagcgcc tgcaggccat caaggctgcc 2580 atcatgctgc tgcctgacga gaaccgggtg gttctgcaga ccctgcttta tttcctgtgc 2640 gatgtcacag cagccgtaaa agaaaaccag atgaccccaa ccaacctggc cgtgtgctta 2700 gcgccttccc tcttccatct caacaccctg aagagagaga attcctctcc cagggtaatg 2760 caaagaaaac aaagtttggg caaaccagat cagaaagatt tgaatgaaaa cctagctgcc 2820 actcaagggc tggcccatat gatcgccgag tgcaagaagc ttttccaggt tcccgaggaa 2880 atgagccgat gtcgtaattc ctataccgaa caagagctga agcccctcac tctggaagca 2940 ctcgggcacc tgggtaatga tgactcagct gactaccaac acttcctcca ggactgtgtg 3000 gatggcctgt ttaaagaagt caaagagaag tttaaaggct gggtcagcta ctccacttcg 3060 gagcaggctg agctgtccta taagaaggtg agcgaaggac cccgtctgag gctttggagg 3120 tcagtcattg aagtccctgc tgtgccagag gaaatcttaa agcgcctact taaagaacag 3180 cacctctggg atgtagacct gttggattca aaagtgatcg aaattctgga cagccaaact 3240 gaaatttacc agtatgtcca aaacagtatg gcacctcatc ctgctcgaga ctacgttgtt 3300 ttaagaacct ggaggactaa tttacccaaa ggagcctgtg cccttttact aacctctgtg 3360 gatcacgatc gcgcacctgt ggtgggtgtg agggttaatg tgctcttgtc caggtatttg 3420 attgaaccct gtgggccagg aaaatccaaa ctcacctaca tgtgcagagt tgacttaagg 3480 ggccacatgc cagaatggta cacaaaatct tttggacatt tgtgtgcagc tgaagttgta 3540 aagatccggg attccttcag taaccagaac actgaaacca aagacaccaa atctaggtga 3600 tcactgaagc aacgcaaccg cttccaccac catggtgttt gtttttagaa gttttgccag 3660 tccttgaaga atgggttctg tgtgtaatcc tgaaacaaag aaaactacaa gctggagtgt 3720 aggaattgac tatagcaatt tgatacattt ttaaagctgc ttcctgtttg ttgagggtct 3780 gtattcatag accttgactg gaatatgtaa gactgtgcga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840 aaaaaaaaaa 3850 <210> 2 <211> 6082 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ataacgtctt tgtcactaaa atgttcccca ggggccttcg gcgagtcttt ttgtttggtt 60 ttttgttttt aatctgtggc tcttgataat ttatctagtg gttgcctaca cctgaaaaac 120 aagacacagt gtttaactat caacgaaaga actggacggc tccccgccgc agtcccactc 180 cccgagtttg tggctggcat ttgggccacg ccgggctggg cggtcacagc gaggggcgcg 240 cagtttgggg tcacacagct ccgcttctag gccccaacca ccgttaaaag gggaagcccg 300 tgccccatca ggtccgctct tgctgagccc agagccatcc cgcgctctgc gggctgggag 360 gcccgggcca ggacgcgagt cctgcgcagc cgaggttccc cagcgccccc tgcagccgcg 420 cgtaggcaga gacggagccc ggccctgcgc ctccgcacca cgcccgggac cccacccagc 480 ggcccgtacc cggagaagca gcgcgagcac ccgaagctcc cggctggcgg cagaaaccgg 540 gagtggggcc gggcgagtgc gcggcatccc aggccggccc gaacgctccg cccgcggtgg 600 gccgacttcc cctcctcttc cctctctcct tcctttagcc cgctggcgcc ggacacgctg 660 cgcctcatct cttggggcgt tcttccccgt tggccaaccg tcgcatcccg tgcaactttg 720 gggtagtggc cgtttagtgt tgaatgttcc ccaccgagag cgcatggctt gggaagcgag 780 gcgcgaaccc ggcccccgaa gggccgccgt ccgggagacg gtgatgctgt tgctgtgcct 840 gggggtcccg accggccgcc cctacaacgt ggacactgag agcgcgctgc tttaccaggg 900 cccccacaac acgctgttcg gctactcggt cgtgctgcac agccacgggg cgaaccgatg 960 gctcctagtg ggtgcgccca ctgccaactg gctcgccaac gcttcagtga tcaatcccgg 1020 ggcgatttac agatgcagga tcggaaagaa tcccggccag acgtgcgaac agctccagct 1080 gggtagccct aatggagaac cttgtggaaa gacttgtttg gaagagagag acaatcagtg 1140 gttgggggtc acactttcca gacagccagg agaaaatgga tccatcgtga cttgtgggca 1200 tagatggaaa aatatatttt acataaagaa tgaaaataag ctccccactg gtggttgcta 1260 tggagtgccc cctgatttac gaacagaact gagtaaaaga atagctccgt gttatcaaga 1320 ttatgtgaaa aaatttggag aaaattttgc atcatgtcaa gctggaatat ccagttttta 1380 cacaaaggat ttaattgtga tgggggcccc aggatcatct tactggactg gctctctttt 1440 tgtctacaat ataactacaa ataaatacaa ggctttttta gacaaacaaa atcaagtaaa 1500 atttggaagt tatttaggat attcagtcgg agctggtcat tttcggagcc agcatactac 1560 cgaagtagtc ggaggagctc ctcaacatga gcagattggt aaggcatata tattcagcat 1620 tgatgaaaaa gaactaaata tcttacatga aatgaaaggt aaaaagcttg gatcgtactt 1680 tggagcttct gtctgtgctg tggacctcaa tgcagatggc ttctcagatc tgctcgtggg 1740 agcacccatg cagagcacca tcagagagga aggaagagtg tttgtgtaca tcaactctgg 1800 ctcgggagca gtaatgaatg caatggaaac aaacctcgtt ggaagtgaca aatatgctgc 1860 aagatttggg gaatctatag ttaatcttgg cgacattgac aatgatggct ttgaagatgt 1920 tgctatcgga gctccacaag aagatgactt gcaaggtgct atttatattt acaatggccg 1980 tgcagatggg atctcgtcaa ccttctcaca gagaattgaa ggacttcaga tcagcaaatc 2040 gttaagtatg tttggacagt ctatatcagg acaaattgat gcagataata atggctatgt 2100 agatgtagca gttggtgctt ttcggtctga ttctgctgtc ttgctaagga caagacctgt 2160 agtaattgtt gacgcttctt taagccaccc tgagtcagta aatagaacga aatttgactg 2220 tgttgaaaat ggatggcctt ctgtgtgcat agatctaaca ctttgtttct catataaggg 2280 caaggaagtt ccaggttaca ttgttttgtt ttataacatg agtttggatg tgaacagaaa 2340 ggcagagtct ccaccaagat tctatttctc ttctaatgga acttctgacg tgattacagg 2400 aagcatacag gtgtccagca gagaagctaa ctgtagaaca catcaagcat ttatgcggaa 2460 agatgtgcgg gacatcctca ccccaattca gattgaagct gcttaccacc ttggtcctca 2520 tgtcatcagt aaacgaagta cagaggaatt cccaccactt cagccaattc ttcagcagaa 2580 gaaagaaaaa gacataatga aaaaaacaat aaactttgca aggttttgtg cccatgaaaa 2640 ttgttctgct gatttacagg tttctgcaaa gattgggttt ttgaagcccc atgaaaataa 2700 aacatatctt gctgttggga gtatgaagac attgatgttg aatgtgtcct tgtttaatgc 2760 tggagatgat gcatatgaaa cgactctaca tgtcaaacta cccgtgggtc tttatttcat 2820 taagatttta gagctggaag agaagcaaat aaactgtgaa gtcacagata actctggcgt 2880 ggtacaactt gactgcagta ttggctatat atatgtagat catctctcaa ggatagatat 2940 tagctttctc ctggatgtga gctcactcag cagagcggaa gaggacctca gtatcacagt 3000 gcatgctacc tgtgaaaatg aagaggaaat ggacaatcta aagcacagca gagtgactgt 3060 agcaatacct ttaaaatatg aggttaagct gactgttcat gggtttgtaa acccaacttc 3120 atttgtgtat ggatcaaatg atgaaaatga gcctgaaacg tgcatggtgg agaaaatgaa 3180 cttaactttc catgttatca acactggcaa tagtatggct cccaatgtta gtgtggaaat 3240 aatggtacca aattctttta gcccccaaac tgataagctg ttcaacattt tggatgtcca 3300 gactactact ggagaatgcc actttgaaaa ttatcaaaga gtgtgtgcat tagagcagca 3360 aaagagtgca atgcagacct tgaaaggcat agtccggttc ttgtccaaga ctgataagag 3420 gctattgtac tgcataaaag ctgatccaca ttgtttaaat ttcttgtgta attttgggaa 3480 aatggaaagt ggaaaagaag ccagtgttca tatccaactg gaaggccggc catccatttt 3540 agaaatggat gagacttcag cactcaagtt tgaaataaga gcaacaggtt ttccagagcc 3600 aaatccaaga gtaattgaac taaacaagga tgagaatgtt gcgcatgttc tactggaagg 3660 actacatcat caaagaccca aacgttattt caccatagtg attatttcaa gtagcttgct 3720 acttggactt attgtacttc tgttgatctc atatgttatg tggaaggctg gcttctttaa 3780 aagacaatac aaatctatcc tacaagaaga aaacagaaga gacagttgga gttatatcaa 3840 cagtaaaagc aatgatgatt aaggacttct ttcaaattga gagaatggaa aacagactca 3900 ggttgtagta aagaaattta aaagacactg tttacaagaa aaaatgaatt ttgtttggac 3960 ttcttttact catgatcttg tgacatatta tgtcttcatg caaggggaaa atctcagcaa 4020 tgattactct ttgagataga agaactgcaa aggtaataat acagccaaag ataatctctc 4080 agcttttaaa tgggtagaga aacactaaag cattcaattt attcaagaaa agtaagccct 4140 tgaagatatc ttgaaatgaa agtataactg agttaaatta tactggagaa gtcttagact 4200 tgaaatacta cttaccatat gtgcttgcct cagtaaaatg aaccccactg ggtgggcaga 4260 ggttcatttc aaatacatct ttgatacttg ttcaaaatat gttctttaaa aatataattt 4320 tttagagagc tgttcccaaa ttttctaacg agtggaccat tatcacttta aagcccttta 4380 tttataatac atttcctacg ggctgtgttc caacaaccat tttttttcag cagactatga 4440 atattatagt attataggcc aaactggcaa acttcagact gaacatgtac actggtttga 4500 gcttagtgaa attacttctg gataattatt tttttataat tatggatttc accatctttc 4560 tttctgtata tatacatgtg tttttatgta ggtatatatt taccattctt cctatctatt 4620 cttcctataa cacaccttta tcaagcatac ccaggagtaa tcttcaaatc ttttgttata 4680 ttctgaaaca aaagattgtg agtgttgcac tttacctgat acacgctgat ttagaaaata 4740 cagaaaccat acctcactaa taactttaaa atcaaagctg tgcaaagact agggggccta 4800 tacttcatat gtattatgta ctatgtaaaa tattgactat cacacaacta tttccttgga 4860 tgtaattctt tgttaccctt tacaagtata agtgttacct tacatggaaa cgaagaaaca 4920 aaattcataa atttaaattc ataaatttag ctgaaagata ctgattcaat ttgtatacag 4980 tgaatataaa tgagacgaca gcaaaatttt catgaaatgt aaaatatttt tatagtttgt 5040 tcatactata tgaggttcta ttttaaatga ctttctggat tttaaaaaat ttctttaaat 5100 acaatcattt ttgtaatatt tattttatgc ttatgatcta gataattgca gaatatcatt 5160 ttatctgact ctgccttcat aagagagctg tggccgaatt ttgaacatct gttataggga 5220 gtgatcaaat tagaaggcaa tgtggaaaaa caattctggg aaagatttct ttatatgaag 5280 tccctgccac tagccagcca tcctaattga tgaaagttat ctgttcacag gcctgcagtg 5340 atggtgagga atgttctgag atttgcgaag gcatttgagt agtgaaatgt aagcacaaaa 5400 cctcctgaac ccagagtgtg tatacacagg aataaacttt atgacattta tgtattttta 5460 aaaaactttg tatcgttata aaaaggctag tcattctttc aggagaacat ctaggatcat 5520 agatgaaaaa tcaagccccg atttagaact gtcttctcca ggatggtctc taaggaaatt 5580 tacatttggt tctttcctac tcagaactac tcagaaacaa ctatatattt caggttatct 5640 gagcacagtg aaagcagagt actatggttg tccaacacag gcctctcaga tacaagggga 5700 acacaattac atattgggct agattttgcc cagttcaaaa tagtatttgt tatcaactta 5760 ctttgttact tgtatcatga attttaaaac cctaccactt taagaagaca gggatgggtt 5820 attctttttt ggcaggtagg ctatataact atgtgatttt gaaatttaac tgctctggat 5880 tagggagcag tgaatcaagg cagacttatg aaatctgtat tatatttgta acagaatata 5940 ggaaatttaa cataattgat gagctcaaat cctgaaaaat gaaagaatcc aaattatttc 6000 agaattatct aggttaaata ttgatgtatt atgatggttg caaagttttt ttgtgtgtcc 6060 aataaacaca ttgtaaaaaa aa 6082 <210> 3 <211> 3448 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cggggtctcg caacattgcc cagacttcct ttgtgttagt taataaagct ttctcaactg 60 cctcagcctt gtgtgagttg aggggaggtg tcacatccag ctggagtcct ttctaagcag 120 ccacagcctg atcctcccac ttcctccccc aagaaaacat tgtgggttga tggccatacc 180 ctgaggttct ggtccaaatc ggactttcta tgaccttctg ggtctctagt gaaaactaaa 240 gactcctctc cagaaaaaaa catttggttt ctaatgaggc ctggaatctt attcttgacc 300 tggggagcgg aatccctttt tgcagtactc ccgggccctc tgttggggcc tccccttcct 360 ctccagggtg gagtcgagga ggcggggctg cgggcctcct tatctctaga gccggccctg 420 gctctctggc gcggggcccc ttagtccggg ctttttgcca tggggtctct gttccctctg 480 tcgctgctgt tttttttggc ggccgcctac ccgggagttg ggagcgcgct gggacgccgg 540 actaagcggg cgcaaagccc caagggtagc cctctcgcgc cctccgggac ctcagtgccc 600 ttctgggtgc gcatgagccc ggagttcgtg gctgtgcagc cggggaagtc agtgcagctc 660 aattgcagca acagctgtcc ccagccgcag aattccagcc tccgcacccc gctgcggcaa 720 ggcaagacgc tcagagggcc gggttgggtg tcttaccagc tgctcgacgt gagggcctgg 780 agctccctcg cgcactgcct cgtgacctgc gcaggaaaaa cacgctgggc cacctccagg 840 atcaccgcct acagtgaggg acaggggctc ggtcccggct ggggtgaggg gagggggctg 900 gaagaggtgg gggaagggta gttgacagtc gctctatagg gagcgcccgc ggacctcact 960 cagaggctcc cccttgcctt agaaccgccc cacagcgtga ttttggagcc tccggtctta 1020 aagggcagga aatacacttt gcgctgccac gtgacgcagg tgttcccggt gggctacttg 1080 gtggtgaccc tgaggcatgg aagccgggtc atctattccg aaagcctgga gcgcttcacc 1140 ggcctggatc tggccaacgt gaccttgacc tacgagtttg ctgctggacc ccgcgacttc 1200 tggcagcccg tgatctgcca cgcgcgcctc aatctcgacg gcctggtggt ccgcaacagc 1260 tcggcaccca ttacactgat gctcggtgag gcacccctgt aaccctgggg actaggagga 1320 agggggcaga gagagttatg accccgagag ggcgcacaga ccaagcgtga gctccacgcg 1380 ggtcgacaga cctccctgtg ttccgttcct aattctcgcc ttctgctccc agcttggagc 1440 cccgcgccca cagctttggc ctccggttcc atcgctgccc ttgtagggat cctcctcact 1500 gtgggcgctg cgtacctatg caagtgccta gctatgaagt cccaggcgta aagggggatg 1560 ttctatgccg gctgagcgag aaaaagagga atatgaaaca atctggggaa atggccatac 1620 atggtggctg acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggcc gaggcaggag aatcgcttga 1680 gcccaggagt tcgagaccag cctggacaac atagtgagac cccgtctatg caaaaaatac 1740 acaaattagc ctggtgtggt ggcccgcacc tgtggtccca gctacccggg aggctgagtt 1800 gggaggatcc tttgagccct gaaagtcgag gttgcagtga gccttgatcg tgccactgca 1860 ctccagcctg ggggacagag cacgaccctg tctccaaaaa taaaataaaa ataaaaataa 1920 atattggcgg gggaaccctc tggaatcaat aaaggcttcc ttaaccagcc tctgtcctgt 1980 gacctaaggg tccgcattac tgcccttctt cggaggaact ggtttgtttt tgttgttgtt 2040 gttgtttttg cgatcacttt ctccaagttc cttgtctccc tgagggcacc tgaggtttcc 2100 tcactcaggg cccacctggg gtcccgaagc cccagactct gtgtatcccc agcgggtgtc 2160 acagaaacct ctccttctgc tggccttatc gagtgggatc agcgcgggcc ggggagagcc 2220 acgggcaggg gcggggtggg gttcatggta tggctttcct gattggcgcc gccgccacca 2280 cgcggcagct ctgattggat gttaagtttc ctatcccagc cccaccttca gaccctgtgc 2340 tttcctggag gccaaacaac tgtggagcga gaactcatct ccaaaataac ttaccacgct 2400 ggagtgagac cacgaatggt ggggagggga gggtcccacg gacatattga gggacgtgga 2460 tacgcagaag aggtatccat gtggtggcag ccgggaaggg gtgatcagat ggtccacagg 2520 gaatatcaca aactcgaatt ctgacgatgt tctggtagtc acccagccag atgagcgcat 2580 ggagttgggg gtggggggtg tcaaagcttg gggcccggaa gcggagtcaa aagcatcacc 2640 ctcggtccct tgttctcgcg tggatgtcag ggcccccacc caccgagcag aaggcggact 2700 caggggcgct ccagggtggc tcgagctcac acacgctgag tagacacgtg cccgctgcac 2760 cctgggtaaa tacagacccg gagccgagcg gattctaatt tagacgcccg cgaacgctgc 2820 gcgcacgcac acgtgtcctc ggctcgctgg cactttcgtc ccgccccctc cgtcgcgtgc 2880 cggagctgac ccggaggggt gcttagaggt atggctccgc ggggtcaaaa ggagaaggat 2940 cagtgagaga ggcatcccca caccctcccc tagaactgtc ctttccccat ccagtgcctc 3000 ccaaatctct cttagtcccc aaatgtatcc ccgccctaag gggcgctggt gggaggagct 3060 aaatgtgggg gcggagctcg gagtccagct tattatcatg gcatctcagc cagggctggg 3120 gtaggggttt gggaagggca acccagcatc ccccgatccc agagtcgcgg ccggggatga 3180 cgcgagagag cgtggtcgcc cccagaaggc cctgggccat catgccggcc tccacgtaga 3240 ccccaggggt cgctcactcc tgccagctcg ccttcaccaa ggccaggagc ttagcgcacg 3300 ctcgcctccc gcccccccgc cgcctctgcc gccgccccct ccttggaaac caagttacca 3360 acgttaaacc aatccccaag cgcaactctg cctcccccac accccacccg ccgcgccgcg 3420 cggagccgtc ctctagccca gctcctcg 3448 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E-cadherin <400> 4 cgggaatgca gttgaggatc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E-cadherin <400> 5 aggatggtgt aagcgatggc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for VLA-4 <400> 6 aggatggtgt aagcgatggc 20 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for VLA-4 <400> 7 tgctgaagaa ttggctgaag tggtgg 26 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for DLC-1 <400> 8 agtgcgtgca acaagcgggt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for DLC-1 <400> 9 tccgggtagc tctcgcggtt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ICAM-4 <400> 10 ccggactaag cgggcgcaaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ICAM-4 <400> 11 agccacgaac tccgggctca 20

Claims (5)

1. 세포 간 물리적으로 직접 접촉되도록 적혈구계 세포를 가라앉혀 패킹(packing)된 상태에서 3D 형태로 배양하는 것을 특징으로 하는, 적혈구계 세포의 인 비트로 확장방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 적혈구계 세포는 최종 성숙(terminal maturation) 단계 이후에 있는 세포인 것을 특징으로 하는, 적혈구계 세포의 인 비트로 확장방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 3D 배양된 적혈구계 세포는 DCL-1(Deleted in Liver Cancer 1), ICAM-4(Intercellular Adhesion Molecule-4) 및 VLA-4(Very Late Antigen-4) 중 하나 이상의 접착 관련 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 적혈구계 세포의 인 비트로 확장방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 방법은 인큐베이터 또는 바이오리액터에서 수행되는 것을 특징으로 하는 적혈구계 세포의 인 비트로 확장방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 3D 형태의 배양은 적혈구계 세포 간 접촉을 극대화시키는 것을 특징으로 하는 적혈구계 세포의 인 비트로 확장방법.

Images