KR20130132430A

KR20130132430A - 재생불량 빈혈과 관련된 모에신 단편

Info

Publication number: KR20130132430A
Application number: KR1020137011796A
Authority: KR
Inventors: 웨 장; 쥔 바오; 후아 마오; 페이 시앙; 홍빈 순; 지에 치안; 용준 한; 웨이나 시투
Original assignee: 상하이 켁신 바이오테크 씨오., 엘티디.
Priority date: 2010-10-08
Filing date: 2011-10-08
Publication date: 2013-12-04
Also published as: WO2012045275A1; JP5868410B2; US20130203091A1; US9354241B2; EP2624855A1; EP2624855B1; JP2013541538A; CA2814026C; CA2814026A1; KR101708533B1; EP2624855A4

Abstract

본 출원은 후천성 재생불량 빈혈을 검출 및 모니터링하는 데 유용한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

재생불량 빈혈과 관련된 모에신 단편{MOESIN FRAGMENTS ASSOCIATED WITH APLASTIC ANEMIA}

본 출원은 일반적으로 자가면역 질환에 관한 분자 생물학 및 의학 연구 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 출원은 재생불량 빈혈과 관련된 특이적인 자가항체의 독특한 존재에 기초한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

자가면역 질환은 자기 자신의 물질 및 조직에 대한 면역계의 이상 반응으로부터 유발된 질환이다. 80가지 초과의 상이한 유형의 자가면역 질환이 존재하는데, 이는 통틀어 만성 질병 원인 중 2위, 및 최대 64세까지인 모든 연령군의 여성에서 상위 10가지 주요 사망 원인 중 하나에 해당된다.

이에, 자가면역 질환의 기전을 이해하고, 효과적인 진단 및 치료를 찾아내고자 하는 데 상당한 의학적 연구 노력을 기울여 왔다. 현재 다수의 자가면역 질환은 자가항체의 존재 및 비바람직한 활성을 특징으로 한다. 이러한 자가항체는 대개 정상적인 및 건강한 자가 항원을 인식하여 그에 결합함으로써 관련된 조직 및 기관에 상당한 손상 및 기능상실을 유발한다.

재생불량 빈혈 (AA)로도 알려져 있는 후천성 재생불량 빈혈은 골수에 의한 혈액 세포 생산 감소 또는 파괴를 특징으로 하는, 희귀하지만 치명적인 혈액 질환이다. 혈액 세포를 보충시키지 못하는 골수의 기능상실은, 정상적으로 3가지 유형의 혈액 세포--적혈구 세포, 백혈구 세포 및 혈소판, 이들 모두를 생성하는 다분화능 줄기 세포인 조혈 세포의 파괴로부터 초래되는 것으로 여겨진다. 그 결과, 조기에 진단하지 못하게 되면, AA 환자에서는 중증의 증상이 발생하게 되고, 치료하지 않고 방치하게 되면, 치명적일 수 있다. 적혈구 세포 개수의 감소인 빈혈은 헤모글로빈 결핍 및 저산소증 (산소 부족)을 일으키고; 백혈구 세포 개수의 감소인 백혈구 감소증은 개체가 더 쉽게 감염될 수 있게 만들고; 혈소판 개수의 감소인 저혈소판증은 혈액이 쉽게 응고되지 못하게 함으로써 출혈, 타박상 및 쇠약감의 위험을 증가시킨다.

재생불량 빈혈은 많은 내인성 인자 및 환경 인자, 예컨대, 유전자 결핍, 독성 화학물질, 화학요법 및 다른 약물에의 노출, 방사선, 바이러스 및 심지어 임신에 의해서도 유발될 수 있다. 외부 인자에 의해 유발된 것, 즉, 후천성 재생불량 빈혈이 더욱 일반적이다. AA의 한가지 중요한 병리 생리학적 기전은 체내 면역계가 골수내 조혈 세포를 공격하고 파괴하도록 잘못 유도된 것인, 자가면역 반응과 관련이 있는 것으로 여겨진다 (문헌 [Young et al., Blood, 108:2509-19 (2006)]). 최근, 줄기 세포 이식과 함께 면역억제가 AA에 대한 주된 치료법 중 하나가 되었다.

다수의 자가면역 항원은 자가면역 질환 환자로부터 유래된 혈청을 사용하는 면역검정법에 의해 확인되어 왔다. 그러한 표적 항원 중 하나는 막-조직화 연장 스파이크 단백질인 모에신으로서, 이는 류마티스 관절염 (RA) 환자에서 자가항체에 반응성인 것으로 밝혀져 있다 (문헌 [Wagatsuma et al., Mol . Immuol ., 33:1171-6 (1996)]). 모에신은 처음에는 소의 자궁에서 확인되었으며, 헤파린에 대한 수용체로서의 가능성을 지닌 것으로 특징화되었었다 (문헌 [Lankes et al., Biochem J. 251:831-42 (1988)]). 추가 연구를 통해 모에신이 에즈린-라딕신-모에신 (ERM) 단백질 패밀리의 구성원인 것으로서 특징화되었다. 이는 주로 세포질에서 발현되며, 액틴이 풍부한 세포-표면 구조에 집중되어 있는 단백질이다. 이는 형질막과 액틴 세포골격 사이의 구조적 링커로서 작용하며, 미세융모 형성, 세포-세포 부착, 세포 형상 유지, 세포 이동 및 막 수송에서 중요한 역할을 한다. 이는 또한 생리학적 및 병리학적 신호 전달에도 관여하는 것으로 이후 연구에서 밝혀졌다 (문헌 [Louvet-Vallee, Biol. Cell 92:305-16 (2000)]).

ERM 단백질의 서열 및 구조 분석을 통해 상기 단백질은 종간 및 분자간에 고도의 상동성을 공유하는 것으로 밝혀졌다. ERM 단백질은, 밴드 4.1 단백질과 상동성이기 때문에 FERM 도메인 (밴드 4.1, 에즈린, 라딕신, 모에신 상동성 도메인)으로 불리는 N-말단 도메인, 중앙 나선형 도메인 및 C-말단 테일 도메인인, 3개의 도메인을 가진다. C-말단 테일 도메인은 F-액틴에 결합하는 반면, C-말단 테일 도메인은 형질막 중 부착 분자에의 결합을 담당한다 (문헌 [Louvet-Vallee (2000)]).

문헌 [Wagatsuma et al. (1996)]에는 RA 환자에서의 항-ERM 자가항체 검출이 보고되어 있다. 시험된 71개의 환자의 혈청 중 24개의 샘플 (33.8%)은 재조합 ERM 항원 중 1 이상과 반응하였고, 10개의 샘플 (14%)은 오직 재조합 모에신과 반응하였다. 그러나, 상기 연구를 통해서는 항-ERM 항체와, 임상 소견, 예컨대, 유병 기간 또는 단계 사이의 유의적인 상관관계가 발견되지 못했다. 또한, 다른 자가면역 질환, 예컨대, 원발성 쇼그렌 증후군 (PSS) 및 전신 홍반 루푸스 (SLE)를 앓는 환자로부터 유래된 혈청은 3개의 ERM 단백질에 대해 어떤 반응성도 보이지 않았다.

셰르비나(Shcherbina) 등은 혈액 세포 중 ERM 단백질의 발현 패턴 및 기능적 특성을 연구하였다 (문헌 [Shcherbina et al., FEBS Letters 443:31-6 (1999)]). 모에신은 상이한 유형의 혈액 세포에서 발현되는 우세한 ERM 단백질인 것으로 밝혀졌다. 프로테아제 칼페인을 사용하여 수행된 절단 실험을 통해서는 모에신이 무손상의 자극을 받은 림프구에서 칼페인 처리에 대해 내성을 띠는 반면, 에즈린은 칼페인에 대해 감수성을 띤다는 것이 밝혀졌다. 칼페인에 대해 나타내는 상기와 같은 차별적인 감수성은 혈액 세포 중 이러한 ERM 단백질의 상이하고 특수화된 기능을 시사한다. 혈소판에서 모에신은 검출되는 유일의 ERM 단백질이며, 그의 발현은 혈소판 활성에 따라 달라진다. 순환 상태에서 모에신은 활면 혈소판 주변에서 발현되는 것으로 관찰되었다. 혈소판이 활성화되었을 때 모에신은 새로 형성된 미세 융모에서 발현되는 것으로 관찰되었는데, 이는 혈소판 기능을 조정하는 데 있어서의 모에신의 적극적인 역할을 제안한다.

다카마쓰(Takamatsu) 등은 후천성 재생불량 빈혈 (AA) 환자의 혈청 중 모에신에 대한 특이적인 항체의 검출을 보고한 바 있다 (문헌 [Takamatsu et al., Blood 109:2514-20 (2007)]). ELISA를 사용하였을 때, 67명의 AA 환자 중 25명 (37%)에서 항-모에신 항체가 고역가로 나타났다. 추가의 시험관내 연구를 통해 AA 환자로부터의 항-모에신 항체가 염증성 시토카인, 예컨대, TNF-α 및 IFN-γ를 유도하였다는 것이 나타났고, 이는 그의 역할이 상기 질환의 병리생리에 연루되어 있음을 시사한다 (문헌 [Espinoza et al., Intl. Immu. 21:913-23 (2009)]; [Takamatsu et al., J. Immunol . 182:703 (2009)]).

자가면역 질환의 임상 관리에서 도전 과제들 중 하나는 환자에서 상기 질환을 조기에 정확하게 확인하는 것이다. 모든 AA 환자가 면역-매개성은 아니기 때문에, 면역-매개성 AA로부터 비면역-매개성 AA를 구별해 내는 신뢰할 만한 마커를 찾는 것이 중요하다. 그러한 차이에 대한 수단은 표적화된 AA 환자를 면역-억제 요법을 이용하여 선택적으로 치료하는 데 있어서 유용하다. 또한, 항체 역가 측정을 통해 질환 단계 및 치료 진행 상태를 효과적으로 모니터링할 수 있다. 본원에 기술된 본 출원은 이러한 도구 및 다른 이점을 제공한다.

본 출원은 적어도 부분적으로는 특정 모에신의 기능성 도메인으로부터의 모에신 단편의 생성에 기초한 AA를 진단 및 모니터링하기 위한 조성물 및 방법, 및 특이적인 항-모에신 자가항체를 검출하며, 결국 그의 존재 및 수준은 AA 환자에서 질환 유형 및 단계와 상관관계에 있는 것인, 상기 검출에 있어서의 그의 용도를 제공한다.

한 측면에서, 본 출원은 모에신 단편이 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 모에신 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본 출원의 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다.

특정 실시양태에서, C-말단 테일 도메인은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-577로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 출원의 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-574, 471-576, 471-575, 471-577, 472-574, 472-575, 472-576, 472-577, 473-574, 473-575, 473-576, 473-577, 474-574, 474-575, 474-576, 474-577, 471-487, 488-501 또는 502-577 사이의 영역으로부터의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다. 한 실시양태에서, 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 전체 C-말단 테일 도메인을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 출원의 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 특정 실시양태에서, 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-487, 488-501, 502-577, 및 471-577로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 하나와 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 공유한다.

특정 실시양태에서, 본 출원의 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 또는 그의 단편으로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 출원의 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-487, 488-501, 502-577 및 471-577로 본질적으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 본 출원의 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 나선형 도메인 및 N-말단 FERM 도메인의 임의의 실질 부분을 함유하지 않는다. "실질 부분"이라는 용어는 전체 관련 도메인 (나선형 도메인 또는 N-말단 FERM 도메인 또는 C-말단 테일 도메인)에 결합할 수 있는 항체에의 특이 결합에 대하여 관련 도메인 (나선형 도메인 또는 N-말단 FERM 도메인 또는 C-말단 테일 도메인)과 경쟁할 수 있는 관련 도메인 (나선형 도메인 또는 N-말단 FERM 도메인 또는 C-말단 테일 도메인)의 일부를 의미한다. 특정 실시양태에서, 본 출원의 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 N-말단 FERM 도메인의 임의의 실질 부분을 함유하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 출원의 모에신 단편은 인간 모에신 단백질의 나선형 도메인의 임의의 실질 부분을 함유하지 않는다.

특정 실시양태에서, 본 출원의 모에신 단편은 캐리어 폴리펩티드를 추가로 포함한다. "캐리어 폴리펩티드"라는 용어는 본 출원의 펩티드의 모에신 단편에 접합될 수 있는 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 캐리어 폴리펩티드는 예컨대, 본 출원의 펩티드의 안정성, 가용성, 특이 또는 비-특이 결합 친화성 및/또는 기능을 촉진시키는 것에 있어서 본 출원의 펩티드에 유익할 수 있다. 그러나, 본 출원의 펩티드에 어떤 이익이나 또는 심지어는 생물학적 기능을 제공하는 데 있어서 캐리어 폴리펩티드가 요구되는 것은 아니다. 보편적으로 사용되는 캐리어 폴리펩티드로는 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 항체 단편, 예컨대, 항체 불변 영역을 포함한다.

한 측면에서, 본 출원은 대상체로부터의 샘플 중 항-모에신 자가항체 검출용 진단 조성물 제조에서 모에신 단편 또는 그의 항체의 용도를 제공한다. 샘플은 예를 들어, 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리학적 특징에 기초하여 특징 규명하고자 하는 및/또는 확인하고자 하는 세포 및/또는 다른 분자 엔티티를 함유하는, 관심의 대상이 되는 대상체로부터 수득되거나, 그로부터 유래되는 임의의 생물학적 조성물일 수 있다. 특정 실시양태에서, 샘플은 대상체로부터 수득된 전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하는 혈액 샘플이다. 대상체는 인간 또는 동물 대상체일 수 있다. 특정 측면에서, 인간 대상체는 AA를 앓고 있거나, 앓을 것으로 의심되는 대상체이다. 검출은 시험관내, 생체내, 또는 생체외에서 수행될 수 있다.

한 측면에서, 본 출원에 의해 진단하고자 하는 AA는 비정상적인 T 림프구 활성과 관련이 있다. 특정 실시양태에서, 질환과 관련이 있는 T 림프구는 비정상적으로 증식한다. 특정 실시양태에서, 본 출원에 의해 진단하고자 하는 AA는 비정상적인 T-세포 방출 시토카인, 예컨대, INF-감마 및 TNF-베타와 관련이 있다.

한 측면에서, 자가항체는 다수의 방법으로, 예컨대, 혈장 또는 혈청을 비롯한 매우 다양한 조직 및 샘플을 검정하는 ELISA 방법 및 웨스턴 블롯에 의해 검출될 수 있다. 상기와 같은 검정 포맷을 사용하는 매우 다양한 면역검정 기법이 이용가능하다. 이는 비경쟁 유형의 단일 부위 및 2 부위 또는 "샌드위치" 검정법 뿐만 아니라, 전통적인 경쟁 결합 검정법을 포함한다. 이러한 검정법은 또한 표지된 항원의 표적 자가항체에의 직접적인 결합을 포함한다.

한 측면에서, 본 출원은 a) 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 모에신 단편; b) 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 검출 항체; 및 c) 고체상을 포함하는, 샘플 중 항-모에신 자가항체를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 모에신 단편은 고체상에 결합되어 있다. 특정 실시양태에서, 검출 항체는 화학적으로 표지되어 있다.

또 다른 측면에서, 자가항체는 검출제로서의 제2 항체를 사용하지 않고 검출될 수 있다. 항원-항체 결합을 직접적으로 검출하기 위한 공지의 많은 기법들이 이용가능하고, 이는 본 출원을 실시하는 데 사용될 수 있다. 항체의 존재가 검출될 수 있다.

한 측면에서, 본 출원은 상기 기술된 바와 같이 모에신 단편에 결합할 수 있는 항-모에신 항체를 제공한다. 상기 항체는 대상체에서 특이적 모에신 단편에의 결합에 대하여 모에신 자가항체와 경쟁할 수 있다. 상기 항체는 결합 신호의 감소가 상응하는 자가항체의 존재 및 역가를 나타내는 것일 수 있는 경쟁 결합 검정법에서 사용될 수 있다.

한 측면에서, 본 출원은 a) 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 모에신 단편을 제공하는 단계; b) 상기 모에신 단편을 샘플과 반응시키는데, 여기서, 상기 모에신 단편은 항-모에신 자가항체에 결합하는 것인 단계; 및 c) 모에신 단편에 결합한 항-모에신 자가항체를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 중 항-모에신 자가항체를 검출하는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 출원은 a) 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 모에신 단편을 제공하는 단계; b) 시험관내에서 상기 모에신 단편을 대상체로부터 수득된 샘플과 반응시키는데, 여기서, 상기 모에신 단편은 항-모에신 자가항체에 결합하는 것인 단계; 및 c) 항-모에신 자가항체가 상기 샘플 중에, 정상 참조 샘플 중의 상기 항-모에신 자가항체 수준보다 더 큰 수준으로 존재하는지 여부를 결정하고, 이로써 대상체가 AA를 앓는지를 나타내는 것인 단계를 포함하는, 대상체에서 AA를 진단하는 방법을 제공한다. 항-모에신 자가항체의 상이한 수준이 대상체에서 AA의 상이한 단계 및 중증도와 상관관계가 있을 수 있다.

한 측면에서, 본 출원은 a) 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 모에신 단편을 제공하는 단계; b) 시험관내에서 상기 모에신 단편을 대상체로부터 수득된 샘플과 반응시키는데, 여기서, 상기 모에신 단편은 항-모에신 자가항체에 결합하는 것인 단계; c) 항-모에신 자가항체의 역가를 측정하는 단계; 및 d) c) 단계로부터의 역가를 항-모에신 자가항체의 역가와 AA의 병리학적 상태의 상관관계를 보여주는 참조 데이터베이스와 비교함에 따라 환자의 병리학적 상태를 결정하는 단계를 포함하는, AA를 앓는 환자의 병리학적 상태를 결정하는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 출원은 a) 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 모에신 단편을 제공하는 단계; b) 시험관내에서 상기 모에신 단편을 대상체로부터 수득된 샘플과 반응시키는데, 여기서, 상기 모에신 단편은 항-모에신 자가항체에 결합하는 것인 단계; c) 항-모에신 자가항체의 역가를 측정하는 단계; 및 d) c) 단계로부터의 역가를, 요법을 받기 전인 동일의 대상체로부터 수득된 항-모에신 자가항체의 역가와 비교하고, 여기서, 역가가 감소하였다면, 이는 대상체가 해당 치료법에 대하여 양성 반응을 띤다는 것을 나타내는 것인 단계를 포함하는, AA 요법을 받고 있는 대상체에서 치료 진행 상태를 모니터링하는 방법을 제공한다.

도 1은 전장의 인간 모에신 단백질의 아미노산 서열 (서열 번호 1, 또는 모에신-5로도 지칭됨)을 나타낸 것이다.
도 2는 모에신 단편: 모에신-1 (서열 번호 2), 모에신-2 (서열 번호 3), 모에신-3 (서열 번호 4), 및 모에신-4 (서열 번호 5)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 전장의 인간 모에신 단백질을 코딩하는 cDNA 서열 (서열 번호 6)을 나타낸 것이다.
도 4는 pET32a(+) 발현 벡터의 클로닝 지도를 나타낸 것이다.
도 5는 pET28a(+) 발현 벡터의 클로닝 지도를 나타낸 것이다.

본 발명을 수행하기 위한 모드

달리 명시되지 않는 한, 본 출원의 실시는 당업계의 기술 내에 포함되는, 종래의 (재조합 기법을 비롯한) 분자생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학 기법을 이용할 것이다. 상기 기법은 문헌, 예컨대, 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; ["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)]; ["Methods in Enzymology" series (Academic Press, Inc.)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, 및 정기 간행물의 최신판)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994)]에 상세하게 설명되어 있다. 본 출원에서 사용되는 프라이머, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 당업계에 공지된 표준 기법을 사용하여 생성될 수 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가가 통상적으로 이해하는 것과 같은 의미를 지닌다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)], 및 [March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]는 당업자에게 본 출원에서 사용되는 다수의 용어에 대한 일반적인 가이드를 제공한다.

정의

"모에신"이라는 용어는 문헌 [Lankes and Furthmayr (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., 88:8297-8301]에 기술되어 있는 바와 같이, 막-조직화 연장 스파이크 단백질(membrane-organizing extension spike protein)을 나타낸다. 전장의 인간 모에신 단백질은 도 1에 제시된 아미노산 서열 (서열 번호 1)을 가지는, 577개의 아미노산으로 된 폴리펩티드이다. 인간 모에신 단백질은 하기에 추가로 정의되는 바와 같이, N-말단 FERM 도메인, 나선형 도메인, 및 C-말단 테일 도메인인 3개의 도메인으로 이루어진다. 이는 ERM (에즈린-라딕신-모에신) 패밀리에 속한다. 주로 형질막 바로 밑의 세포질에서 발현되는 3개의 ERM 단백질은 고도의 서열 상동성을 공유하며, 형질막과 액틴 세포골격 사이의 연결 단백질로서 작용한다. 추가로, 인간 모에신 단백질은 다른 종으로부터의 모에신, 예컨대, 마우스 및 소 모에신과 고도의 서열 상동성을 공유한다 (문헌 [Sato et al. (1992) J. Cell Sci. 103:131-143].

"모에신 단편"이라는 용어는 전장의 야생형 모에신 단백질보다 짧은 모에신 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 특히, 상기 용어는 모에신의 특정 도메인 (하기에 추가로 정의되는 바와 같은 C-말단 테일 도메인, 나선형 도메인 또는 C-말단 테일 도메인) 내의 아미노산 서열을 가지는 10개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 도메인-특이 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 상기와 같은 모에신 단편이 본 출원에서 유용하다. 모에신 단편의 "단편"이라는 용어는 상기 모에신 단편보다 짧으며, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 능력을 보유하는 모에신 단편의 일부를 의미한다.

인간 모에신 단백질의 "N-말단 FERM 도메인"이란 구조상 상기 단백질의 아미노-말단에 가장 가깝게 위치하고 있으며, 기능적으로는 단백질을 형질막으로 국소화시키는 것, 및 부착 분자와 상호작용하는 것을 담당하는 야생형 인간 모에신 단백질의 구형 부분을 의미한다. 밴드 4.1 단백질과 상동성이라는 이유에서 밴드 4.1 단백질, 에즈린, 라딕신, 모에신 상동성 도메인이라는 것을 나타내는 것인 FERM 도메인은, 세포 골격 단백질, 예컨대, 적혈구 밴드 4.1, 탈린, 및 에즈린-라딕신-모에신 (ERM) 단백질 패밀리 뿐만 아니라, 수개의 티로신 키나제 및 포스파타제 및 종양 억제 단백질인 멀린을 포함하는 것인 밴드 4.1 수퍼패밀리의 구성원을 의미한다. 구체적으로, 상기 용어는 성숙한 형태의 인간 모에신 단백질의 처음 약 297개의 아미노산 잔기 (예컨대, 아미노산 잔기 1-297 (서열 번호 2))를 의미한다. 특정 문헌에서는 동일의 도메인이 N-ERM 관련 도메인 (N-ERMAD)으로도 또한 알려져 있는데, 이는 본원의 정의에 포함된다 (문헌 [Bretscher et al. (1995) Biochem. 34, 16830-7]).

인간 모에신 단백질의 "C-말단 테일 도메인"이란 구조상 상기 단백질의 카르복시-말단에 가장 가깝게 위치하고 있으며, 기능적으로는 액틴 필라멘트에 결합하여 그와 상호작용하는 것을 담당하는 야생형 인간 모에신 단백질의 일부를 의미한다. 모에신의 테일 도메인은 양전하를 띠고, 연장된 만곡형(meandering) 구조를 취한다. 구체적으로, 상기 용어는 인간 모에신 단백질의 마지막 약 107개의 아미노산 잔기 (예컨대, 아미노산 잔기 471-577 (서열 번호 5))를 의미한다. 특정 문헌에서는 동일의 도메인이 C-ERM 관련 도메인 (C-ERMAD)으로도 알려져 있는데, 이는 본원의 정의에 포함된다 (문헌 [Bretscher et al. (1995)]). C-말단 테일 도메인의 마지막 34개의 아미노산 잔기는 ERM 단백질 중에서 고도로 보존적이며, F-액틴에의 결합을 위한 영역을 형성한다. F-액틴 결합 영역 내에는 단백질의 활성화 동안에 인산화되는 것인 트레오닌 잔기 (야생형 인간 모에신에서 Thr558)가 존재한다.

인간 모에신 단백질의 "나선형 도메인"은 N-말단 FERM 도메인과 C-말단 테일 도메인 사이에 있는 야생형 인간 모에신의 중앙 부분을 의미한다. 이는 상기 두 말단 도메인 사이의 링커로서의 역할을 하며, 연장된 알파-나선형 구조를 취한다. 구체적으로, 상기 용어는 대략적으로 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 298-470 (서열 번호 4)을 포함하는 영역을 의미한다.

"항-모에신 자가항체"라는 용어는 개체 자신의 모에신 단백질 또는 그의 단편을 인식하여 그에 결합하는 개체의 면역계에 의해 생산된 항-모에신 항체를 의미한다. 항-모에신 자가항체의 존재는 AA와 관련이 있을 수 있으며, 체내 항-모에신 자가항체의 역가는 AA의 병리학적 상태와 상관관계에 있을 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "진단"이라는 용어는 분자적 또는 병리학적 상태, 질환 또는 병증을 확인하는 것, 예컨대, 자가면역 질환을 확인하는 것을 의미하거나, 또는 특정 치료 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 자가면역 질환 환자를 확인하는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 진단이란 특정 유형의 AA를 확인하는 것을 의미한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 진단이란 항-모에신 자가항체가 대상체에 정상적인 것보다 더 높게 존재하는 것과 관련된 AA를 확인하는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "예후"라는 용어는 예를 들어, 질환의 재발, 발적 확장(flaring), 및 약물 내성을 비롯한, 질환 증상의 결과의 가능성을 예측하는 것을 의미한다. 상기 용어는 또한 요법으로부터의 임상적 이익의 가능성을 예측하는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "예측"이라는 용어는 환자가 약물 또는 약물 세트 또는 특정 요법 과정에 대해 유리하게 또는 불리하게 반응할지에 대한 가능성을 의미한다. 한 실시양태에서, 예측은 상기 반응의 정도에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 예측은 환자가 치료, 예를 들어, 특정 치료제를 이용한 치료 후에, 그리고 질환의 재발없이 특정 기간 동안 생존 또는 호전되게 될지 여부, 및/또는 그렇게 될 확률에 관한 것이다. 본 출원의 예측 방법은 임의의 특정 환자에 대해 가장 적절한 치료 양식을 선택함으로써 치료법을 결정하는 데 임상적으로 사용될 수 있다. 본 출원의 예측 방법은 환자가 치료 요법, 예를 들어, 주어진 치료제의 투여 또는 그 병용 실시, 외과 수술, 스테로이드 치료 등을 비롯한, 주어진 치료 요법에 대해 유리하게 반응할 수 있는 가능성이 있는지 여부, 또는 치료 요법 이후 환자가 장기간 동안 생존할 수 있는 가능성이 있는지 여부를 예측하는 데 있어서 가치가 큰 도구이다.

본원에서 "샘플" 또는 "시험 샘플"이란 예를 들어, 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리학적 특징에 기초하여 특징 규명, 및/또는 확인하고자 하는 세포적 및/또는 다른 분자적 엔티티를 함유하는, 관심의 대상이 되는 대상체로부터 수득되거나 유래된 조성물을 의미한다. 한 실시양태에서, 상기 정의는 혈액 및 생물학적 기원의 다른 액체 샘플 및 조직 샘플, 예컨대, 생검 표본 또는 조직 배양물 또는 그로부터 유래된 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 조직 샘플의 공급원은 신선, 냉동 및/또는 보존된 기관 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 것과 같은 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 성분, 예컨대, 혈장 또는 혈청; 체액; 및 대상체의 임신 또는 발생 중 어느 시간에나 그로부터 유래된 세포, 또는 혈장일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 대상체로부터 수득된 전혈, 혈청 또는 혈장이다. 대상체는 인간 또는 동물 대상체일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 AA를 앓거나, 앓을 것으로 의심되는 대상체이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 정의는 그의 입수 후 어느 방식에 의해서든, 예컨대, 시약 처리, 가용화, 또는 특정 성분, 예컨대, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 강화에 의해 조작된 생물학적 샘플을 포함한다.

한 실시양태에서, 샘플은 임의 치료 이전에 대상체 또는 환자로부터 수득된다. 또 다른 실시양태에서, 시험 샘플은 치료, 예컨대, AA 요법 동안, 또는 그 이후에 수득된다. 한 실시양태에서, 시험 샘플은 임상 샘플이다. 또 다른 실시양태에서, 시험 샘플은 진단 검정에 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 본 출원의 방법으로 시험되기 이전에 다른 공지된 임상 기법 (예컨대, 혈액 검사 방법)으로 사전 검사된다. 특정 실시양태에서, 샘플은 예컨대, 전체 혈구 계수, 간 효소, 신장 기능, 비타민 B₁₂ 수준, 엽산 수준, 적혈구 침강 속도, 말초 혈액 도말, 골수 생검 등에 대해 사전 검사된다.

본원에서 사용되는 바, "참조 샘플"이란, 그를 확인하기 위해 본 출원의 방법 또는 조성물이 사용되는 것인 질환 또는 병증을 앓지 않는 것으로 알려져 있거나, 그러한 것으로 간주되는 공급원으로부터의 샘플을 의미한다. 한 실시양태에서, 참조 샘플은 질환 또는 병증이 본 출원의 방법 또는 조성물을 사용하여 확인된, 동일의 대상체 또는 환자의 건강한 신체 일부로부터 수득된다. 한 실시양태에서, 참조 샘플은 질환 또는 병증이 본 출원의 조성물 또는 방법을 사용하여 확인된 대상체 또는 환자가 아닌 개체의 건강한 신체 일부로부터 수득된다. 한 실시양태에서, 참조 샘플은 정상적인 혈소판 계수를 가진 건강한 개체로부터의 샘플이다.

본원에서 사용되는 바, "질환 참조 샘플"이란, 그를 확인하기 위해 본 출원의 방법 또는 조성물이 사용되는 것인 질환 또는 병증을 앓는 것으로 임상적으로 확인된 공급원으로부터의 샘플을 의미한다. 한 실시양태에서, 질환 참조 샘플은 AA인 것으로 임상적으로 진단을 받은 대상체 또는 환자로부터 수득된 샘플이다. 한 실시양태에서, AA인 것으로 임상적으로 진단을 받은 대상체 또는 환자는 AA에 대한 치료 중에 있는 것이다.

본원에서 사용되는 바, "참조 데이터베이스"란 하나 이상의 참조 샘플 또는 질환 참조 샘플로부터의 데이터, 표준, 또는 수준 수집물을 의미한다. 한 실시양태에서, 그러한 데이터, 표준, 또는 수준 수집물은 하나 이상의 샘플로부터의 데이터와의 비교 목적으로 사용될 수 있도록 정규화된다. "정규화하다" 또는 "정규화"란 측정 미가공 데이터를 그렇게 정규화된 다른 데이터와 직접 비교할 수 있는 데이터로 전환시키는 과정이다. 정규화는 검정에 따라 달라질 수 있는 인자, 예를 들어, 로딩량, 결합률, 검출 감도의 차이에 의해 유발될 수 있는 검정-특이 오차, 및 다른 다양한 오차를 극복하는 데 사용된다. 한 실시양태에서, 참조 데이터베이스로는 항-모에신 자가항체의 역가, 혈소판 계수, 혈액 세포 계수, 및/또는 하나 이상의 참조 샘플 또는 질환 참조 샘플로부터의 다른 실험실 및 임상 데이터를 포함한다. 한 실시양태에서, 참조 데이터베이스는 각각, 참조 샘플 또는 질환 참조 샘플과 동일한 조건하에 시험된 대조군 샘플의 항-모에신 자가항체 수준 (예컨대, 항-모에신 자가항체의 공지된 양)의 백분율로서 정규화된 항-모에신 자가항체의 수준을 포함한다. 상기와 같이 정규화된 항-모에신 자가항체의 수준과의 비교를 위해, 시험 샘플의 항-모에신 자가항체의 수준 또한 측정하고, 시험 샘플과 동일한 조건하에 시험된 대조군 샘플의 항-모에신 자가항체 수준의 백분율로서 계산한다. 한 실시양태에서, 참조 데이터베이스는, 건강한 대상체로부터, 및/또는 질환 또는 병증이 본 출원의 조성물 또는 방법을 사용하여 확인된, 동일의 대상체 또는 환자의 신체 비-이환부로부터의 참조 샘플 데이터를 컴파일링함으로써 확립된다. 한 실시양태에서, 참조 데이터베이스는 AA에 대한 치료 중에 있는 개체로부터 유래된 질환 참조 샘플로부터의 데이터를 컴파일링함으로써 확립된다. 한 실시양태에서, 참조 데이터베이스는 예를 들어, 상이한 수준의 혈소판 계수 및 다른 임상 적응증에 의해 입증되는 바와 같은, 상이한 단계의 AA를 앓는 개체로부터 유래된 질환 참조 샘플로부터의 데이터를 컴파일링함으로써 확립된다.

특정 실시양태에서, "증가하다"라는 용어는 당업계에 공지된 표준 방법, 예컨대, 본원에 기술된 방법에 의해 검출된 자가항체 수준이 참조 샘플과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상으로 전반적으로 증가한 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 증가하다라는 용어는, 증가가 참조 샘플 중 자가항체 수준의 약 1.25X, 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X, 또는 100X 이상인 것인, 샘플 중 자가항체 수준의 증가를 의미한다.

특정 실시양태에서, 본원에서 "감소하다"라는 용어는 당업계에 공지된 표준 방법, 예컨대, 본원에 기술된 방법에 의해 검출된 자가항체 수준이 참조 샘플과 비교하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상으로 전반적으로 감소한 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 감소하다라는 용어는, 감소가 참조 샘플 중 자가항체 수준의 약 0.9X, 0.8X, 0.7X, 0.6X, 0.5X, 0.4X, 0.3X, 0.2X, 0.1X, 0.05X, 또는 0.01X 이상인 것인, 샘플 중 자가항체 수준의 감소를 의미한다.

"검출 항체"라는 용어는 검출 수단에 의해 증폭된 표지를 통해 직접적으로, 또는 예컨대, 표지된 다른 항체를 통해 간접적으로 검출될 수 있는 항체를 의미한다. 직접적인 표지를 위해, 전형적으로는 항체를 일부 수단에 의해 검출가능한 모이어티에 접합시킨다. 한 실시양태에서, 검출가능한 항체는 비오티닐화된 항체이다.

"검출 수단"이라는 용어는 본원에서 ELISA로 검출가능한 항체의 존재를 검출하는 데 사용되는 모이어티 또는 기법을 의미하며, 이는 고정화된 표지, 예컨대, 마이크로타이터 플레이트 상에 포획되어 있는 표지를 증폭시키는 검출용 제제를 포함한다. 한 실시양태에서, 검출 수단은 비색 검출용 제제, 예컨대, 아비딘 또는 스트렙트아비딘-HRP이다. 또 다른 실시양태에서, 검출 수단은 H₂O₂/TMB 착색 시스템이다.

"포획용 시약"이라는 용어는 샘플 중 표적 분자에 결합하여 그를 포획함으로써 적합한 조건하에서는 포획용 시약-표적 분자 복합체가 나머지 샘플로부터 분리될 수 있도록 할 수 있는 시약을 의미한다. 전형적으로, 포획용 시약은 고정화되어 있거나, 고정화가능한 것이다. 샌드위치 면역검정에서, 포획용 시약은 바람직하게는 표적 항원에 대한 항체 또는 상이한 항체들의 혼합물이다.

"상관관계를 보여주다" 또는 "상관관계를 보여주는"이라는 것은 어느 방식으로든 제1 분석법 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과를 제2 분석법 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과와 비교하는 것을 의미한다. 예를 들어, 제2 프로토콜을 수행할 때 제1 분석법 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있고/거나, 제2 분석법 또는 프로토콜을 수행하여야 하는지 여부를 결정하기 위해 제1 분석법 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있다. 자가항체 검출 실시양태와 관련하여, 특정의 치료 요법을 수행하여야 하는지 여부를 결정하기 위해 검출 분석법 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있다.

"표지"라는 단어는 본원에서 사용될 때, 시약, 예컨대, 핵산 프로브 또는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되거나 융합되어, 그에 접합되거나 융합된 시약이 용이하게 검출될 수 있도록 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출가능한 것이거나 (예컨대, 방사성 동위원소 표지 또는 형광성 표지), 효소 표지인 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매화시킬 수 있다.

"단리된" 폴리펩티드는 그의 천연 환경의 오염 성분으로부터 확인되고, 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드에 대한 진단 또는 치료학적 용도를 방해하는 물질이며, 이는 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 로우리(Lowry) 법에 의해 측정되는 바, 95중량% 초과의 폴리펩티드로, 또는 99중량% 초과로, (2) 방사 컵 배열 결정 장치의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하는 데 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue), 또는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 균질하게 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드는 폴리펩티드의 천연 환경의 1종 이상의 오염 성분도 존재하지 않는 바, 재조합 세포내 계내에서 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 보통 단리된 폴리펩티드는 1 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

본 출원의 모에신 도메인 또는 단편과 관련하여 "아미노산 서열 동일성(%)이란 서열들을 정렬하고, 필요할 경우, 서열 동일성(%)이 최대가 되도록 하기 위해 갭을 도입한 후, 임의의 보존적 아미노산 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않으면서, 모에신 도메인 또는 단편 중 아미노산 잔기와 동일한, 관심의 대상이 되는 서열 중 아미노산 잔기의 백분율(%)로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성(%) 측정을 목적으로 하는 정렬은 당업계에 포함되어 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 멕얼라인(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)]; [Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)]을 참조할 수 있다. 당업자는 비교되는 전장의 서열 전반에 걸쳐 최대로 정렬될 수 있도록 하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯한, 정렬을 측정하는 데 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.

"항체"라는 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이는 구체적으로는 원하는 항원 결합 활성을 보이는 한, 모노클로날 항체 (전장의 또는 무손상 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 2가지 이상의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이성 항체 (예컨대, 이중특이성 항체), 및 항체 단편 (하기 참조)을 포함한다.

"치료"란 치료학적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치 둘 모두를 의미한다. 치료를 필요로 하는 대상은 장애를 이미 앓고 있는 대상 뿐만 아니라, 그 장애를 예방하고자 하는 대상을 포함한다.

환자의 반응성은 제한없이, (1) 질환 진행의 저속화 및 완전한 정지를 비롯한, 어느 정도까지의 질환 진행 억제; (2) 질환 에피소드 및/또는 증상 수의 감소; (3) 병변 크기 감소; (4) 질환 세포의 인접한 주변 기관 및/또는 조직으로의 침윤 억제 (즉, 감소, 저속화 또는 완전한 중단); (5) 질환 확산 억제 (즉, 감소, 저속화 또는 완전한 중단); (6) 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 완화; (7) 치료 후 무병 제시 기간의 연장; (8) 예컨대, 무진행 생존과 같이, 질환 병변의 퇴행 또는 절제를 초래할 수는 있지만, 그러할 필요는 없는, 자가면역 반응 감소; (9) 전체적인 생존 기간 연장; (10) 반응 속도 증가; 및/또는 (11) 치료 후 주어진 시점에서의 사망율 감소를 비롯한, 환자에게의 이익을 시사하는 임의의 종점을 사용함으로써 평가할 수 있다.

"이익"이라는 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 이는 임의의 바람직한 효과를 의미하고, 구체적으로는 임상적 이익을 포함한다.

본 발명의 전형적인 방법 및 물질

본 출원은 항-모에신 자가항체의 존재 및 역가와 관련된 AA를 진단 및 모니터링하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 출원을 수행하는 데 당업자에게 공지된 종래의 방법이 사용될 수 있다.

벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법

본 출원의 폴리펩티드는 쉽게 수득할 수 있는 기법 및 물질을 사용함으로써 재조합적으로 제조될 수 있다. 본 출원의 폴리펩티드의 재조합적 제조를 위해, 그를 코딩하는 핵산을 단리시키고, 추가의 클로닝 (DNA 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 종래 방법을 사용함으로써 쉽게 단리시키고, 서열 분석할 수 있다. 예를 들어, 인간 모에신 단백질을 코딩하는 DNA는 예컨대, 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써 단리시키고, 서열 분석한다. 많은 벡터들이 이용가능하다. 벡터 성분으로는 일반적으로 하기: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 선별 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

신호 서열 성분

본 출원의 폴리펩티드는 직접적으로 뿐만 아니라, 전형적으로는 신호 서열이거나, 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이 절단 부위를 가진 다른 폴리펩티드인 이종성 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 제조될 수 있다. 선택된 이종성 신호 서열은 전형적으로 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이다. 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열 안정성 내독소 II 리더로 이루어진 군으로부터 선택되는 원핵 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 예컨대, 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더 포함), 또는 산성 포스파타제 리더, C. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 WO 90/13646에 기술되어 있는 신호일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라, 바이러스성 분비 리더, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스(herpes simplex) gD 신호가 이용가능하다.

상기 전구체 영역에 대한 DNA를 리딩 프레임 내에서 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 결찰시킨다.

복제 기점 성분

발현 및 클로닝 벡터 둘 모두 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제될 수 있도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 상기 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와는 상관없이 독립적으로 복제될 수 있도록 하는 핵산 서열이며, 이는 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 상기와 같은 서열은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대한 것으로 주지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 대해 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 대해 적합하며, 각종 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 대해서는 필요하지 않다 (전형적으로 SV40 기점은 단지 그가 조기 프로모터를 함유하고 있다는 이유 때문에 사용될 수 있다).

선별 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는, 선별가능한 마커로도 불리는 선별 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예컨대, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 매질로부터는 이용불가능한 중요한 영양소, 예컨대, 바실리(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자를 공급하는 단백질을 코딩한다.

선별 방식에 대한 일례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생산하게 되고, 따라서, 선별 요법으로부터 생존하게 된다. 그러한 우성 선별의 예는 약물인 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 이용한다.

포유동물 세포에 대하여 적합한 선별가능한 마커의 또 다른 일례로는 세포 성분의 확인을 통해 핵산이 소비될 수 있도록 하는 것, 예컨대, DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 전형적으로 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이 있다.

예를 들어, 먼저, DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 포함하는 배양 배지 중에서 형질전환체 모두를 배양함으로써 DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포를 확인한다. 야생형 DHFR이 사용될 때, 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성에 결함이 있는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.

별법으로, 본 출원의 폴리펩티드, 야생형 DHFR 단백질, 및 또 다른 선별가능한 마커, 예컨대, 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환 또는 공-형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 포함하는 야생형 숙주)는 선별가능한 마커에 대한 선별 제제, 예컨대, 아미노글리코시드 항생제, 예컨대, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418을 함유하는 배지 중에서의 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. 미국 특허 번호 4,965,199를 참조할 수 있다.

효모에서 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 Yrp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]). trp1 유전자는 예를 들어, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1과 같이, 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 부족한 돌연변이체 효모 균주에 대한 선별 마커를 제공한다 (문헌 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)]). 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 중 trp1 병변의 존재는 트립토판 부재하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출할 수 있도록 하는 데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.

프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 유기체에 의해 인식되고, 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 원핵 숙주에서 사용하기에 적합한 프로모터로는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대, tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터도 적합하다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno: S.D.) 서열을 포함할 것이다.

프로모터 서열은 진핵생물에 대해서도 알려져 있다. 실제로, 모든 진핵 유전자에는 전사가 개시되는 부위로부터 상류쪽으로 대략 25 내지 30개의 염기만큼의 위치에 AT가 풍부한 영역이 존재한다. 많은 유전자의 전사 출발점으로부터 상류쪽으로 70 내지 80개의 염기만큼의 위치에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역 (여기서, N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다)이다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에는 폴리 A 테일의, 코딩 서열의 3' 말단에의 부가를 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 존재한다. 이들 서열은 모두 진핵 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.

효모 숙주에서 사용하기에 적합한 프로모팅 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소, 예컨대, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.

전사가 성장 조건에 의해 제어되는 추가의 이점을 가지고 있는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터로는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산성 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이 있다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기술되어 있다. 또한 효모 인핸서가 효모 프로모터와 함께 사용되는 것이 이롭다.

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 본 출원의 폴리펩티드의 전사는, 본 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성이라면, 예를 들어, 바이러스, 예컨대, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종성 포유동물 프로모터, 예컨대, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열-쇼크 프로모터로부터 수득되는 프로모터에 의해 제어된다.

SV40 바이러스에 대한 조기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점 또한 포함하는 SV40 제한 단편으로서 알맞게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 알맞게 수득된다. 벡터로서, 소 유두종 바이러스를 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키기 위한 시스템은 미국 특허 번호 4,419,446에 개시되어 있다. 상기 시스템의 변형은 미국 특허 번호 4,601,978에 기술되어 있다. 또한, 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 제어하의 마우스 세포에서의 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 관해서는 문헌 [Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)]을 참조할 수 있다. 별법으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복부가 프로모터로서 사용될 수 있다.

인핸서 요소 성분

고등 진핵생물에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 대개인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 현재 포유동물 유전자로부터의 것인 많은 인핸서 서열이 알려져 있다 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-펙토단백질, 및 인슐린). 전형적으로, 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예로는 복제 기점의 후반부 측 (bp 100-270) 상의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후반부 측 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 대해서는 문헌 [Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)]를 참조할 수 있다. 인핸서는 폴리펩티드 코딩 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 전형적으로는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.

전사 종결 성분

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터는 또한 전사를 종결시키는 데, 및 mRNA를 안정화시키는 데 필요한 서열을 포함할 것이다. 그러한 서열은 보통 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이러한 영역은 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역부 중 폴리아데닐화된 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 그에 개시된 발현 벡터를 참조할 수 있다.

숙주 세포의 선택 및 형질전환

본원의 벡터에서 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 클로닝 또는 발현시키는 데 적합한 숙주 세포는 상기 기술된 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵 세포이다. 본 목적에 적합한 원핵생물로는 유박테리아, 예컨대, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어, 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대, 에스케리키아(Escherichia), 예컨대, E. 콜라이(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예컨대, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예컨대, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 및 시겔라(Shigella) 뿐만 아니라, 바실리, 예컨대, B. 섭틸리스(B. subtilis) 및 B. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예컨대, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시되어 있는 B. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대, P. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 비록 다른 균주, 예컨대, E. 콜라이 B, E. 콜라이 BL21 (DE3), E. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 E. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하기는 하지만, 전형적으로, E. 콜라이 클로닝 숙주는 E. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이다. 이러한 예들은 제한적이라기보다는 예시적인 것이다.

원핵생물 이외에도, 진핵 미생물, 예컨대, 사상 진균 또는 효모가 본 출원의 폴리펩티드를 코딩하는 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 하등 진핵 숙주 미생물 중 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반 제빵 효모가 가장 보편적으로 사용된다. 그러나, 예컨대, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대, K. 락티스(K. lactis), K. 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), K. 위커하미(K. wickerhamii) (ATCC 24,178), K. 왈티(K. waltii) (ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), K. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 K. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 리제이(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈완니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대, 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예컨대, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예컨대, A. 니둘란스(A. nidulans) 및 A. 니거(A. niger)와 같은 다수의 다른 속, 종, 및 균주가 일반적으로 이용가능하며, 본원에서 유용하다.

본 출원의 폴리펩티드의 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래될 수 있다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 배큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 숙주, 예컨대, 스포돕프테라 푸르기페다(Spodoptera frugiperda) (캐터필라), 아에데스 아에기프티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보피크투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (초파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)로부터의 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 형질감염용으로서 다양한 바이러스 균주가 공개적으로 이용가능하며, 그 예로는 오토그래파 캘리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체, 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 있으며, 상기 바이러스는 본원에서 본 출원에 따른 바이러스로서, 특히, 스포돕프테라 푸르기페다 세포의 형질감염을 위한 것으로서 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토, 및 담배의 식물 세포 배양물 또한 숙주로서 사용될 수 있다.

그러나, 척추동물 세포가 더 큰 관심의 대상이 되어 왔으며, 배양물 (조직 배양물) 중에서의 척추동물 세포의 증식이 통상적인 방법이 되어 왔다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양물 중에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol . Reprod . 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad . Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주 (Hep G2)가 있다.

숙주 세포는 본 출원의 폴리펩티드의 제조를 위해 상기 기술된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는 데 적절하게 변형된 종래 영양 배지 중에서 배양된다.

숙주 세포 배양

본 출원의 폴리펩티드를 제조하는 데 사용되는 숙주 세포를 다양한 배지 중에서 배양할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대, 햄즈 F10(Ham's F10) (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코스 변형 이글스 배지 (DMEM, 시그마)가 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 추가로, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기술된 배지 중의 임의 배지가 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 상기 배지 중 임의의 것으로 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, 겐타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), (일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 유기 화합물로서 정의되는) 미량 원소, 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물 또한 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대, 온도, pH 등은 발현을 위해 선택되는 숙주 세포와 함께 앞서 사용된 것이며, 이는 당업계의 숙련가에게 자명할 것이다.

펩티드의 화학적 합성

본 출원의 펩티드는 또한 화학적 합성법, 예를 들어, 문헌 [Merrifield in J.A.C.S. 85: 2149-2154 (1963)]에 기술되어 있는 고체상 합성 방법, 또는 문헌 ["Peptide Synthesis" by Bodanszky, et al., second edition, John Wiley and Sons, 1976]에 기술되어 있는 표준 용액 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 서적은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다.

고체상 펩티드 합성 방법의 일반적인 방법은 먼저 펩티드의 보호된 C-말단 아미노산을 수지에 부착시키는 단계를 포함한다. 부착 후, 수지를 여과하고, 세척하고, C-말단 아미노산의 알파 아미노기 상의 보호기 (예컨대, t-부틸옥시카르보닐)를 제거한다. 상기 보호기 제거는 물론 아미노산과 수지 사이의 결합을 파괴시키지 않으면서 일어나야 한다. 이어서, 생성된 수지 펩티드에, 말단에서 두 번째 위치에 있는 C-말단 보호된 아미노산을 커플링시킨다. 상기 커플링은 제2 아미노산의 유리 카르복시기와, 수지에 부착된 제1 아미노산의 아미노기 사이의 아미드 결합 형성에 의해 이루어진다. 상기와 같은 순서의 이벤트는 연속된 아미노산을 통해 펩티드의 아미노산 모두가 수지에 부착될 때까지 반복된다. 마지막으로, 보호된 펩티드는 수지로부터 절단되고, 보호기는 제거됨으로써 원하는 펩티드가 수득된다. 펩티드를 수지로부터 분리하고, 보호기를 제거하는 데 사용되는 절단 기법은 수지 및 보호기 선택에 따라 달라지며, 이는 펩티드 합성 분야의 당업자에게 공지되어 있다.

상기 언급된 수지는 임의의 적합한 중합체일 수 있고, 이는 제1 보호된 아미노산이 공유 결합에 의해 그에 견고하게 연결될 수 있는 작용기를 포함하여야 한다. 본 목적을 위해 다양한 중합체, 예컨대, 셀룰로스, 폴리비닐 알콜, 폴리메틸메타크릴레이트, 및 폴리스티렌이 적합하다. 고체상 합성법에서 사용될 수 있는 적절한 보호기로는 t-부틸옥시카르보닐 (BOC), 벤질 (BZL), t-아밀옥시카르보닐 (AOC), 토실 (TOS), o-브로모페닐메톡시카르보닐 (BrZ), 2,6-디클로로벤질 (BZLCl₂), 및 페닐메톡시카르보닐 (Z 또는 CBZ)을 포함한다. 추가의 보호기는 또한 문헌 [J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973]에 기술되어 있다. 상기 서적은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다.

표준 용액 합성 방법은 아미드 결합 형성의 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 아미노산 또는 펩티드 단편의 단계식 또는 블록 커플링에 의해 수행될 수 있다. 이러한 용액 합성 방법은 당업계에 주지되어 있다.

폴리펩티드 정제

본 출원의 폴리펩티드 또는 단백질은 대상체로부터 회수될 수 있다. 재조합 기법을 사용하여, 본 출원의 폴리펩티드를 세포내에서, 주변세포질 공간에서 제조할 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비시킬 수 있다. 본 출원의 폴리펩티드는 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 막에 결합되어 있을 경우, 적합한 세제 용액 (예컨대, 트리톤-X 100)을 사용하여, 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 방출시킬 수 있다. 본 출원의 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해, 예컨대, 냉동-해동 사이클링, 초음파 처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제에 의해 파괴될 수 있다.

펩티드가 화학적으로 합성되는 경우, 본 출원의 펩티드는 배지 중 다른 성분으로부터 원하는 펩티드를 분리해 낼 수 있는 임의의 적합한 기법에 의해 반응 매질로부터 회수될 수 있다. 고체상 합성 방법의 경우, 먼저 적합한 절단 용액을 사용하여 보호된 펩티드를 수지로부터 절단해 낸다. 절단 용액 선택은 수지, 및 그에 결합하는 아미노산의 특성에 따라 달라진다 (예컨대, FMOC 방법의 경우, 트리플루오로아세트산). 절단은 일반적으로 산성 조건하에서 수행된다. 절단 종료시, 이어서, 해리성 펩티드를 수득하고, 임의의 적합한 기법 (예컨대, 하기 기술되는 방법)을 사용하여 추가로 정제한다.

하기 방법은 적합한 단백질 정제 방법의 일례이다: 이온-교환 칼럼 상에서의 분별; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(SEPHAROSE)™ 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼, DEAE 등) 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스(Sephadex) G-75를 이용한 겔 여과; 오염 물질, 예컨대, IgG를 제거하는 단백질 A 세파로스 칼럼; 및 에피토프 태깅된 형태의 본 출원의 폴리펩티드에 결합하는 금속 킬레이팅 칼럼에 의한 것. 다양한 단백질 정제 방법이 사용될 수 있고, 그러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이는 예를 들어, 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology , 182 (1990)]; [Scopes, Protein Purification : Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기술되어 있다. 선택된 정제 단계(들)는 예를 들어, 사용되는 제조 공정 및 제조되는 본 출원의 특정 폴리펩티드의 성질에 따라 달라질 것이다.

검출 방법

본 출원의 방법에서, 생물학적 샘플은 AA를 앓을 것으로 의심되는 대상체로부터 수득되고, 이는 하나 이상의 항-모에신 자가항체의 발현에 대해 검사된다. 샘플 중 다양한 항-모에신 자가항체의 발현은 많은 방법에 의해 분석될 수 있는데, 그러한 방법들 중 다수는 당업계에 공지되어 있으며, 당업자에 의해 이해되고 있고, 그 예로 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 효소-결합 면역-유동 검정법 (ELIFA), 면역블롯팅, 웨스턴 블롯 분석법, 면역조직화학적 분석법, 면역침전법, 분자 결합 검정법 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다중 면역검정법, 예컨대, 룰즈 베이스드 메디슨(Rules Based Medicine) 또는 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery: MSD)로부터 이용가능한 것 또한 사용될 수 있다. 이러한 방법은 단일 부위 및 비-경쟁적 유형의 2-부위 또는 "샌드위치" 검정법 둘 모두와, 그뿐만 아니라, 전통적인 경쟁적 결합 검정법에서의 것도 포함한다. 검출은 시험관내, 생체내, 또는 생체외에서 수행될 수 있다.

그 중에서 샌드위치 검정법이 가장 유용하고 보편적으로 사용되는 검정법이다. 샌드위치 검정 기법에 대한 많은 변형 방법이 존재하며, 이들 모두 본 출원에 포함되는 것으로 한다. 간략하면, 전형적인 정방향 샌드위치 검정법에서, 비표지된 포획용 시약 (예컨대, 모에신 단편)을 고체 기판 상에 고정화시키고, 표적 단백질 (예컨대, 항-모에신 자가항체)에 대해 시험하고자 하는 샘플을 결합된 분자와 접촉시킨다. 항체-항원 복합체가 형성될 수 있도록 하는 데 충분한 기간 동안의 적합한 기간 동안 인큐베이션시킨 후, 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 리포터 분자로 표지된, (예컨대, 항-모에신 자가항체의 Fc 영역에의 결합을 통해) 표적 단백질에 특이적인 검출 항체를 첨가하고, 포획용 시약-표적 단백질-검출 항체의 또 다른 복합체가 형성될 수 있도록 하는 데 충분한 기간 동안 인큐베이션시킨다. 임의의 비반응 물질을 세척하여 제거하고, 리포터 분자에 의해 발생될 신호를 관찰함으로써 표적 단백질의 존재를 측정한다. 결과는 간단하게 가시적 신호를 관찰함으로써 얻은 정질적 결과일 수 있거나, 또는 공지된 양의 리포터 분자를 함유하는 대조군 샘플과의 비교에 의해 정량화될 수 있다.

전형적인 정방향 샌드위치 검정법에서, 표적 단백질에 대하여 특이성을 가진 포획용 시약을 고체 지지체 상에 공유적으로 또는 수동적으로 결합시킨다. 고체 지지체는 전형적으로 유리 또는 중합체이며, 가장 보편적으로 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 튜브, 비드, 마이크로플레이트의 디스크, 또는 면역검정법을 수행하는 데 적합한 임의의 다른 표면 형태일 수 있다.

정방향 검정법에 대한 변형법으로는 샘플 및 검출 항체 둘 모두를 포획용 시약에 동시에 첨가하는 동시 검정법을 포함한다. 쉽게 자명해지는 바와 같이, 임의의 최소의 변형을 포함하는 상기와 같은 기법은 당업자에게 주지되어 있다. 또 다른 대체 방법은 샘플 중 표적 단백질을 고정화시킨 후, 고정화된 표적 단백질을, 리포터 분자로 표지되거나 표지될 수 없는 본 출원의 펩티드에 노출시키는 것을 포함한다. 표적 단백질의 양, 및 리포터 분자 신호의 강도에 따라, 결합된 표적 단백질은 포획용 시약 (예컨대, 모에신 단편)으로의 직접적인 표지화에 의해 검출가능할 수 있다. 별법으로, 포획용 시약에 특이적인 제2 검출 항체를 표적 단백질-포획용 시약 복합체에 노출시켜 표적 단백질-포획용 시약-검출 항체 3원 복합체가 형성되도록 한다. 리포터 분자에 의해 방출되는 신호에 의해 상기 복합체를 검출한다.

본원에서 사용되는 바, "리포터 분자"라는 용어는 그의 화학적 성질에 의해서, 항원-결합된 항체가 검출될 수 있도록 하는 분석적으로 확인가능한 신호를 발생시키는 분자를 의미한다. 이러한 유형의 검정법에서 가장 보편적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단 또는 방사성핵종 함유 분자 (즉, 방사성 동위원소) 및 화학발광 분자이다.

특정 실시양태에서, 리포터 분자는 검출 항체에 접합된 효소이다. 효소는 일반적으로 다양한 기법을 사용하여 측정될 수 있는 발색성 기질의 화학적 변경을 촉매화시킨다. 예를 들어, 효소는 분광광도측정법으로 측정될 수 있는, 기질의 변색을 촉매화시킬 수 있다. 별법으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 특정 파장 광 조사에 의해 활성화되었을 때, 형광체는 광 에너지를 흡수하여 분자 상태를 여기 상태로 유도한 후, 광학 현미경으로 시각적으로 검출가능한 특징적인 색상으로 광을 방출한다. 화학발광성 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된 후, (예를 들어, 케밀루미노미터를 사용하여) 측정될 수 있는 광을 방출할 수 있거나, 에너지를 형광성 억셉터에 공여한다. 효소적 표지의 예로는, 루시퍼라제 (예컨대, 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제; 미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제 예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예컨대, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예컨대, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키는 기법은 문헌 [Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기술되어 있다.

효소-기질 조합의 예로는 예를 들어: (i) 기질로서 히드로겐 퍼옥시다제와 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO) (여기서, 히드로겐 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예컨대, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킨다); (ii) 발색성 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트와 알칼리성 포스파타제 (AP); 및 (iii) 발색성 기질과 β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal) (예컨대, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광성 기질과 상기의 것 (예컨대, 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제)를 포함한다. 다수의 다른 효소-기질 조합이 당업자에게 이용가능하다. 이에 관한 일반적인 리뷰를 위해, 미국 특허 번호 4,275,149 및 4,318,980을 참조할 수 있다.

특정 실시양태에서, 리포터 분자는 희토류 킬레이트 (유로피움 킬레이트), 텍사스 레드(Texas Red), 로다민, 플루오레세인, 단실, 리싸민, 움벨리페론, 피코에리트린, 피코시아닌, 또는 상업적으로 이용가능한 형광단, 예컨대, 스펙트럼 오렌지7(SPECTRUM ORANGE7) 및 스펙트럼 그린7(SPECTRUM GREEN7) 및/또는 상기 중 임의의 하나 이상의 것의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 형광단이다. 형광단은 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, Pubs. (1991)]에 개시된 기법을 사용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 사용함으로써 정량화될 수 있다.

특정 실시양태에서, 리포터 분자는 방사성 동위원소, 예컨대, ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, 및 ¹³¹I이다. 검출 항체 또는 포획용 시약은 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌 동일]에 기술된 기법을 사용하여 방사성 동위원소로 표지될 수 있고, 방사능은 섬광 계수를 사용하여 측정될 수 있다.

종종, 표지는 검출 항체 또는 포획용 시약과 간접적으로 접합된다. 당업자는 상기를 달성하기 위한 다양한 기법에 대해 알고 있을 것이다. 예를 들어, 검출 항체를 비오틴과 접합시키고, 표지를 아비딘과 접합시킬 수 있거나, 또는 그 반대로도 가능하다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하는 바, 따라서, 표지는 간접적인 방식으로 검출 항체와 접합될 수 있다. 별법으로, 표지를 검출 항체와 간접적으로 접합시키기 위해, 검출 항체를 작은 합텐과 접합시키고, 표지를 항-합텐 항체와 접합시킨다. 따라서, 표지는 항체와 간접적으로 접합될 수 있다.

특정 실시양태에서, 검출 방법은 경쟁 항-모에신 항체가 사용되는 경쟁 결합 검정법이다. 그러한 경쟁 항체는 본 출원의 펩티드에의 결합에 대하여 모에신 자가항체와 경쟁할 수 있다. 경쟁 결합 검정법에서, 결합 신호가 감소하였다는 것은 상응하는 자가항체의 존재 및 역가를 나타내는 것일 수 있다.

진단용 키트

상기에서 기술되거나 제안된 적용에서 사용하기 위해, 본 출원은 또한 키트 또는 제조물품을 제공한다. 그러한 키트는, 각각의 용기 수단은 본 방법에서 사용하고자 하는 별개의 요소들 중 하나를 포함하는 것인, 하나 이상의 용기 수단, 예컨대, 바이알, 튜브 등을 긴밀하게 제한되는 상태로 수용하도록 구획화된 캐리어 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 용기 수단 중 하나는 검출가능하게 표지된 또는 표지될 수 있는 프로브를 포함할 수 있다. 그러한 프로브는 항-모에신 자가항체에 대해 특이적 모에신 단편일 수 있다.

본 출원의 키트는 전형적으로 상기 기술된 용기 및 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지를 비롯한, 상업적 관점 및 사용자 견지에서 바람직할 수 있는 물질을 포함하는 하나 이상의 다른 용기, 및 사용 설명서를 포함하는 패키지 인서트를 포함할 것이다. 라벨은 본 조성물이 특정 요법 또는 비-치료학적 적용을 위해 사용된다는 것을 지시하기 위해 용기 상에 존재할 수 있고, 이는 또한 예컨대, 상기 기술된 것과 같이 생체에서 또는 시험관내에서의 사용을 위한 설명을 명시할 수 있다.

본 출원의 키트는 다수의 실시양태를 가진다. 전형적인 실시양태는 용기, 상기 용기 상의 라벨, 및 상기 용기 내에 포함되어 있는 조성물, 및 샘플 중 항-모에신 자가항체의 존재를 평가하기 위해 본 출원의 펩티드를 사용하는 것에 관한 설명서를 포함하며; 여기서, 상기 조성물은 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 본 출원의 펩티드를 포함하고, 상기 용기 상의 라벨은 조성물이 샘플 중 항-모에신 자가항체의 존재를 평가하는 데 사용될 수 있음을 명시하는 것인 키트이다. 키트는 추가로 샘플을 제조하고, 본 출원의 펩티드를 샘플에 적용시키기 위한 한 세트의 설명서 및 물질을 포함할 수 있다. 키트는 표지, 예컨대, 효소적 표지에 접합된 제2 항체를 포함할 수 있다.

키트 중 다른 임의적 성분으로는 하나 이상의 완충제 (예컨대, 차단용 완충제, 세척용 완충제, 기질 완충제 등), 다른 시약, 예컨대, 효소적 표지에 의해 화학적으로 변경되는 기질 (예컨대, 색원체), 에피토프 검색용 용액, 대조군 샘플 (양성 및/또는 음성 대조군), 대조군 슬라이드(들) 등을 포함한다.

하기는 본 출원의 방법 및 조성물의 일례이다. 상기 제공된 일반 설명을 고려해 볼 때, 다양한 다른 실시양태가 수행될 수 있음을 이해하여야 한다.

실시예

실시예 1. 모에신 단편 시리즈의 생성

하기 5가지의 모에신 단편을 제조하였다:

a. 인간 모에신 단백질의 N-말단 도메인 근처의, 인간 모에신 단백질의 아미노산 1-297 (서열 번호 2)을 함유하는 모에신-1;

b. 인간 모에신 단백질의 나선형 및 C-말단 테일 도메인 근처의, 인간 모에신 단백질의 아미노산 298-577 (서열 번호 3)을 함유하는 모에신-2;

c. 인간 모에신 단백질의 나선형 도메인 근처의, 인간 모에신 단백질의 아미노산 298-470 (서열 번호 4)을 함유하는 모에신-3;

d. 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인 근처의, 인간 모에신 단백질의 아미노산 471-577 (서열 번호 5)을 함유하는 모에신-4; 및

e. 전장의 인간 모에신 단백질, 아미노산 1-577 (서열 번호 1)인 모에신-5.

진뱅크(Genebank) (수탁 번호 AB527296.1)로부터 전장의 모에신 cDNA 서열 (l-1,734 bp)을 수득하고, 이를 서열 번호 6으로서 도 3에 나타내었다. 상기 원하는 모에신 단편을 생성하기 위해, PCR을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 상이한 아미노산 단편에 상응하는 cDNA 단편을 증폭시켰다.

PCR-증폭된 모에신 DNA 단편을 pET32a(+) 및 pET28a(+)로부터 선택된 발현 벡터로 클로닝하였다. 이어서, 배양 및 발현을 위해 구축된 벡터를 사용하여 E. 콜라이 숙주 세포주 BL21(DE3)을 형질전환시켰다. pET32a(+) 및 pET28a(+)의 제한 및 클로닝 지도는 각각 도 4 및 5에 제시되어 있다. 제한 효소 분해를 이용하여 다양한 모에신 단편에 대한 구축된 발현 시스템을 확인한 후, 서열 분석함으로써 모에신 단편의 발현을 위해 올바른 리딩 프레임을 확인하였다.

충분히 배양시킨 후, 모에신 단편의 수집 및 정제를 위해 발현된 모에신 단편을 가진 숙주 세포를 표준 단백질 발현 프로토콜에 따라 수거하였다. SDS-PAGE로 생성된 단백질 단편을 검정하여 그의 아이덴티티 및 순도를 확인하였다.

실시예 2. AA 환자의 혈청 중 특이적인 항- 모에신 자가항체의 검출 및 측정

다양한 단계의 AA를 앓는 환자로부터 혈청 또는 혈장 샘플을 수집하고, 모에신 단백질의 특이 영역을 인식하고 그에 결합하는 항-모에신 자가항체의 존재에 대하여 시험하였다. 환자의 프로파일과 임상적 정보를 사용하여 그의 질환의 유형 및 단계에 기초하여 환자를 분류하였다.

실시예 1로부터 수득한 모에신 단편을, 항-모에신 항체에 대한 ELISA 검정법에서 항원으로서 사용하였다. 구체적으로, ELISA 플레이트의 각각의 마이크로웰을 2℃ 내지 8℃에서 12-16시간 동안 약 400 ng의 모에신 단편으로 코팅한 후, 차단 용액으로 차단시키기 전에 PBS로 1회에 걸쳐 세척하고, 보관 및 추후 사용을 위해 진공 건조시켰다. 그렇게 고도로 정제된 모에신 단편 항원을, 그 항원을 그의 천연 상태 그대로 보존할 수 있는 조건하에서 폴리스티렌 마이크로웰 플레이트의 웰에 결합시켰다.

추후 ELISA 검사를 위해 AA인 것으로 임상적으로 진단을 받은 45명의 환자 (환자군)로부터 혈청 샘플을 수집하고, 제조하였다. 비교 목적으로, 폐 질환인 것으로 임상적으로 진단을 받은 83명의 환자 (대조군-1), 종양인 것으로 임상적으로 진단을 받은 65명의 환자 (대조군-2), CTD인 것으로 임상적으로 진단을 받은 300명의 환자 (대조군-4), 및 150명의 건강한 개체 (대조군-3)를 포함하는, 4개의 대조군 또한 제공하였고, 추후 ELISA 검사를 위해 그로부터 혈청 샘플을 수집하고, 제조하였다.

대조군 및 환자 혈청을 PBS-T 완충제 (즉, 0.05% (v/v)의 트윈-20을 함유하는 PBS 완충제)를 이용하여 희석시키고, 이어서, 상기와 같이 희석된 대조군 및 희석된 환자 혈청 100 ㎕를 별개의 웰에 첨가하여 존재하는 임의의 항-모에신 항체가 고정화된 항원에 결합할 수 있도록 하였다. PBS-T 완충제를 이용하여 비결합 샘플은 세척하여 제거하고, 효소 표지된 항-인간 IgG 접합체를 각각의 웰에 첨가하였다. 2차 인큐베이션을 통해 효소 표지된 항-인간 IgG가, 마이크로웰에 부착되어 있는 임의의 항-모에신 항체에 결합할 수 있도록 하였다. 임의의 비결합 효소 표지된 항-인간 IgG를 세척하여 제거한 후, 발색성 기질 (H₂O₂/TMB)을 첨가하고, 발색되는 색상의 강도를 측정함으로써 남아있는 효소의 활성을 측정하였다. 이어서, 100 ㎕의 HRP 정지 용액 (예컨대, 2 M H₂SO₄)을 각각의 웰에 첨가하였다. HRP 정지 용액을 첨가하고 유지시키는 순서 및 시간은 TMB 크로모겐(TMB Chromogen)에 따라 진행되었다. 손가락으로 가볍게 각각의 ELISA 플레이트를 톡톡 두드림으로써 웰이 완전하게 혼합될 수 있도록 하였다.

분광광도측정계를 이용하여 검정을 평가하여 환자 웰에서 발색된 색상 강도를 측정하고, 이를 대조군 웰에서의 색상과 비교하였다. 구체적으로, 이색성 측정법을 사용하여 색상 강도를 측정하고, 비교하였는데, 여기서, 각 웰의 OD₄₅₀ 값 및 OD₆₃₀ 값 (참조로서의 값) 둘 모두 반응 종결로부터 15 min 이내에 판독하였다. OD₆₃₀값에서 OD₄₅₀ 값을 감산함으로써 각 시험군 또는 대조군 샘플의 OD 값을 계산하였다.

모든 배치의 샘플을 이용하여 ELISA 저 양성 대조군, ELISA 고 양성 대조군 및 ELISA 음성 대조군에 대해 진행함으로써 모든 시약과 방법이 적절히 수행될 수 있도록 하였다. ELISA 음성 대조군을 위해 건강한 개체로부터 혈청을 수집하였다. 50명의 건강한 개체로부터 수집된 혈청의 OD 값을 각각 측정하고, 상기 50개의 샘플로부터의 평균 OD 값 ("대조군 OD 값") 및 표준 편차 ("대조군 표준 편차")를 계산하였다. 상기 대조군 OD 값 및 대조군 표준 편차를 사용하여 ELISA 저 양성 대조군 및 고 양성 대조군의 농도를 측정하였다. ELISA 저 양성 대조군은 대조군 OD 값 + 3 X 대조군 표준 편차와 동일한 OD 값을 나타내도록 충분히 희석된, 면역성 혈소판 감소증 환자로부터의 혈청을 포함하였다. ELISA 고 양성 대조군은 3 X ELISA 저 양성 대조군의 OD 값과 동일한 OD 값을 나타내도록 희석된, 면역성 혈소판 감소증 환자로부터의 혈청을 포함하였다. 희석은 0.01 M PBS-T 완충제를 사용하여 수행하였다.

먼저, 샘플당 2벌로 이루어진 각 세트에 대한 평균 OD 값을 측정하고, 그의 평균 OD 값이 ELISA 저 양성 대조군의 평균 OD 값보다 높다면, 샘플은 양성인 것으로 결정지었다. 각 샘플에 대한 역가를 샘플의 평균 OD 값으로서 측정하였다.

당업자가 이해하는 바와 같이, 마커 수준과 AA의 존부와의 상관관계를 보여주는 단계는 상이한 방식으로 수행 및 달성될 수 있다. 일반적으로, 참조 집단을 선택하고, 정상 범위를 확립한다. 적절한 참조 집단을 사용하여 두 항-모에신 항체 모두에 대한 정상 범위를 확립하는 것은 상당히 통상적이다. 정상 범위는 어느 정도까지, 그러나, 제한적으로 그 범위가 확립되는 참조 집단에 따라 달라질 수 있다는 것은 일반적으로 받아들여지고 있는 사실이다. 한 측면에서, 참조 집단의 개체수는 예컨대, 수백 내지 수천에 이르기까지 많고, 연령, 성별 및 임의로 관심의 대상이 되는 다른 변수에 대해 매치된다. 주어진 농도와 같이, 절대값에 있어서 정상 범위는 또한 사용되는 검정법, 및 검정법을 만들어 내는 데 사용되는 표준화에 따라 달라질 수 있다.

항-모에신에 대한 수준은 실시예 섹션에서 주어진 검정 방법을 이용하여 측정되고 확립될 수 있다. 상이한 검정법은 상이한 컷-오프 값으로 이어질 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

실험실 시험의 임상적 성능은 그의 진단 정확도, 또는 대상체를 임상적으로 관련된 서브군으로 정확하게 분류할 수 있는 능력에 따라 달라질 수 있다. 진단 정확도는 조사되는 대상체의 두 상이한 상태를 정확하게 구별해 낼 수 있는 시험의 능력을 평가한다. 상기 상태는 예를 들어, 건강 및 질환 또는 양성 대 악성 질환이다.

즉, 특정 환자 집단으로부터 수득된 값이 유의적으로 더 높다면, 이는 상응하는 항-모에신 자가항체의 존재가 양성임을 시사하는 것이다.

본 실험의 결과는, 특정 모에신 단편에 특이적인 상이한 항-모에신 항체의 양성 존재에 관하여 다양한 환자군을 비교하여 나타낸 하기 표에 열거되어 있다 (표 1):

표 1에 제시되어 있는 바와 같이, 모에신의 C-말단 테일 도메인을 특이적으로 인식하고, 그에 결합하는 항-모에신 자가항체가 정상 존재치보다 높은 것은 AA의 발병률 (약 42.2%)과 유의적인 상관관계가 있었다.

AA 환자에서도 또한 상이한 모에신 단편에 대한 자가항체 역가를 측정하였다. 각 단편에 대한 평균 역가 값을 계산하고, 다른 단편의 것과 비교하였다. 하기 표 2 및 3의 결과를 참조할 수 있다.

역가 분석을 통해, 모에신의 C-말단 테일 도메인은 AA 환자에서 그의 존재 비율(%)이 가장 높을 뿐만 아니라, 역가도 가장 높은 것 (그러므로, 감수성을 띤다)으로 나타났다. 그러므로, C-말단 테일 도메인의 아미노산을 포함하는 모에신 단편은 AA를 앓고 있거나, 앓을 것으로 의심되는 환자에 대한 진단용 또는 예후용 수단으로서 사용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Shanghai Kexin Biotech Co. Ltd. <120> MOESIN FRAGMENTS ASSOCIATED WITH APLASTIC ANEMIA <130> 034569-8003WO02 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 577 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> the Full Length Human Moesin Protein <400> 1 Met Pro Lys Thr Ile Ser Val Arg Val Thr Thr Met Asp Ala Glu Leu 1 5 10 15 Glu Phe Ala Ile Gln Pro Asn Thr Thr Gly Lys Gln Leu Phe Asp Gln 20 25 30 Val Val Lys Thr Ile Gly Leu Arg Glu Val Trp Phe Phe Gly Leu Gln 35 40 45 Tyr Gln Asp Thr Lys Gly Phe Ser Thr Trp Leu Lys Leu Asn Lys Lys 50 55 60 Val Thr Ala Gln Asp Val Arg Lys Glu Ser Pro Leu Leu Phe Lys Phe 65 70 75 80 Arg Ala Lys Phe Tyr Pro Glu Asp Val Ser Glu Glu Leu Ile Gln Asp 85 90 95 Ile Thr Gln Arg Leu Phe Phe Leu Gln Val Lys Glu Gly Ile Leu Asn 100 105 110 Asp Asp Ile Tyr Cys Pro Pro Glu Thr Ala Val Leu Leu Ala Ser Tyr 115 120 125 Ala Val Gln Ser Lys Tyr Gly Asp Phe Asn Lys Glu Val His Lys Ser 130 135 140 Gly Tyr Leu Ala Gly Asp Lys Leu Leu Pro Gln Arg Val Leu Glu Gln 145 150 155 160 His Lys Leu Asn Lys Asp Gln Trp Glu Glu Arg Ile Gln Val Trp His 165 170 175 Glu Glu His Arg Gly Met Leu Arg Glu Asp Ala Val Leu Glu Tyr Leu 180 185 190 Lys Ile Ala Gln Asp Leu Glu Met Tyr Gly Val Asn Tyr Phe Ser Ile 195 200 205 Lys Asn Lys Lys Gly Ser Glu Leu Trp Leu Gly Val Asp Ala Leu Gly 210 215 220 Leu Asn Ile Tyr Glu Gln Asn Asp Arg Leu Thr Pro Lys Ile Gly Phe 225 230 235 240 Pro Trp Ser Glu Ile Arg Asn Ile Ser Phe Asn Asp Lys Lys Phe Val 245 250 255 Ile Lys Pro Ile Asp Lys Lys Ala Pro Asp Phe Val Phe Tyr Ala Pro 260 265 270 Arg Leu Arg Ile Asn Lys Arg Ile Leu Ala Leu Cys Met Gly Asn His 275 280 285 Glu Leu Tyr Met Arg Arg Arg Lys Pro Asp Thr Ile Glu Val Gln Gln 290 295 300 Met Lys Ala Gln Ala Arg Glu Glu Lys His Gln Lys Gln Met Glu Arg 305 310 315 320 Ala Met Leu Glu Asn Glu Lys Lys Lys Arg Glu Met Ala Glu Lys Glu 325 330 335 Lys Glu Lys Ile Glu Arg Glu Lys Glu Glu Leu Met Glu Arg Leu Lys 340 345 350 Gln Ile Glu Glu Gln Thr Lys Lys Ala Gln Gln Glu Leu Glu Glu Gln 355 360 365 Thr Arg Arg Ala Leu Glu Leu Glu Gln Glu Arg Lys Arg Ala Gln Ser 370 375 380 Glu Ala Glu Lys Leu Ala Lys Glu Arg Gln Glu Ala Glu Glu Ala Lys 385 390 395 400 Glu Ala Leu Leu Gln Ala Ser Arg Asp Gln Lys Lys Thr Gln Glu Gln 405 410 415 Leu Ala Leu Glu Met Ala Glu Leu Thr Ala Arg Ile Ser Gln Leu Glu 420 425 430 Met Ala Arg Gln Lys Lys Glu Ser Glu Ala Val Glu Trp Gln Gln Lys 435 440 445 Ala Gln Met Val Gln Glu Asp Leu Glu Lys Thr Arg Ala Glu Leu Lys 450 455 460 Thr Ala Met Ser Thr Pro His Val Ala Glu Pro Ala Glu Asn Glu Gln 465 470 475 480 Asp Glu Gln Asp Glu Asn Gly Ala Glu Ala Ser Ala Asp Leu Arg Ala 485 490 495 Asp Ala Met Ala Lys Asp Arg Ser Glu Glu Glu Arg Thr Thr Glu Ala 500 505 510 Glu Lys Asn Glu Arg Val Gln Lys His Leu Lys Ala Leu Thr Ser Glu 515 520 525 Leu Ala Asn Ala Arg Asp Glu Ser Lys Lys Thr Ala Asn Asp Met Ile 530 535 540 His Ala Glu Asn Met Arg Leu Gly Arg Asp Lys Tyr Lys Thr Leu Arg 545 550 555 560 Gln Ile Arg Gln Gly Asn Thr Lys Gln Arg Ile Asp Glu Phe Glu Ser 565 570 575 Met <210> 2 <211> 297 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> N-terminal FERM domain of human moesin protein <400> 2 Met Pro Lys Thr Ile Ser Val Arg Val Thr Thr Met Asp Ala Glu Leu 1 5 10 15 Glu Phe Ala Ile Gln Pro Asn Thr Thr Gly Lys Gln Leu Phe Asp Gln 20 25 30 Val Val Lys Thr Ile Gly Leu Arg Glu Val Trp Phe Phe Gly Leu Gln 35 40 45 Tyr Gln Asp Thr Lys Gly Phe Ser Thr Trp Leu Lys Leu Asn Lys Lys 50 55 60 Val Thr Ala Gln Asp Val Arg Lys Glu Ser Pro Leu Leu Phe Lys Phe 65 70 75 80 Arg Ala Lys Phe Tyr Pro Glu Asp Val Ser Glu Glu Leu Ile Gln Asp 85 90 95 Ile Thr Gln Arg Leu Phe Phe Leu Gln Val Lys Glu Gly Ile Leu Asn 100 105 110 Asp Asp Ile Tyr Cys Pro Pro Glu Thr Ala Val Leu Leu Ala Ser Tyr 115 120 125 Ala Val Gln Ser Lys Tyr Gly Asp Phe Asn Lys Glu Val His Lys Ser 130 135 140 Gly Tyr Leu Ala Gly Asp Lys Leu Leu Pro Gln Arg Val Leu Glu Gln 145 150 155 160 His Lys Leu Asn Lys Asp Gln Trp Glu Glu Arg Ile Gln Val Trp His 165 170 175 Glu Glu His Arg Gly Met Leu Arg Glu Asp Ala Val Leu Glu Tyr Leu 180 185 190 Lys Ile Ala Gln Asp Leu Glu Met Tyr Gly Val Asn Tyr Phe Ser Ile 195 200 205 Lys Asn Lys Lys Gly Ser Glu Leu Trp Leu Gly Val Asp Ala Leu Gly 210 215 220 Leu Asn Ile Tyr Glu Gln Asn Asp Arg Leu Thr Pro Lys Ile Gly Phe 225 230 235 240 Pro Trp Ser Glu Ile Arg Asn Ile Ser Phe Asn Asp Lys Lys Phe Val 245 250 255 Ile Lys Pro Ile Asp Lys Lys Ala Pro Asp Phe Val Phe Tyr Ala Pro 260 265 270 Arg Leu Arg Ile Asn Lys Arg Ile Leu Ala Leu Cys Met Gly Asn His 275 280 285 Glu Leu Tyr Met Arg Arg Arg Lys Pro 290 295 <210> 3 <211> 280 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> helical and C-terminal tail domains of human moesin protein <400> 3 Asp Thr Ile Glu Val Gln Gln Met Lys Ala Gln Ala Arg Glu Glu Lys 1 5 10 15 His Gln Lys Gln Met Glu Arg Ala Met Leu Glu Asn Glu Lys Lys Lys 20 25 30 Arg Glu Met Ala Glu Lys Glu Lys Glu Lys Ile Glu Arg Glu Lys Glu 35 40 45 Glu Leu Met Glu Arg Leu Lys Gln Ile Glu Glu Gln Thr Lys Lys Ala 50 55 60 Gln Gln Glu Leu Glu Glu Gln Thr Arg Arg Ala Leu Glu Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Arg Lys Arg Ala Gln Ser Glu Ala Glu Lys Leu Ala Lys Glu Arg 85 90 95 Gln Glu Ala Glu Glu Ala Lys Glu Ala Leu Leu Gln Ala Ser Arg Asp 100 105 110 Gln Lys Lys Thr Gln Glu Gln Leu Ala Leu Glu Met Ala Glu Leu Thr 115 120 125 Ala Arg Ile Ser Gln Leu Glu Met Ala Arg Gln Lys Lys Glu Ser Glu 130 135 140 Ala Val Glu Trp Gln Gln Lys Ala Gln Met Val Gln Glu Asp Leu Glu 145 150 155 160 Lys Thr Arg Ala Glu Leu Lys Thr Ala Met Ser Thr Pro His Val Ala 165 170 175 Glu Pro Ala Glu Asn Glu Gln Asp Glu Gln Asp Glu Asn Gly Ala Glu 180 185 190 Ala Ser Ala Asp Leu Arg Ala Asp Ala Met Ala Lys Asp Arg Ser Glu 195 200 205 Glu Glu Arg Thr Thr Glu Ala Glu Lys Asn Glu Arg Val Gln Lys His 210 215 220 Leu Lys Ala Leu Thr Ser Glu Leu Ala Asn Ala Arg Asp Glu Ser Lys 225 230 235 240 Lys Thr Ala Asn Asp Met Ile His Ala Glu Asn Met Arg Leu Gly Arg 245 250 255 Asp Lys Tyr Lys Thr Leu Arg Gln Ile Arg Gln Gly Asn Thr Lys Gln 260 265 270 Arg Ile Asp Glu Phe Glu Ser Met 275 280 <210> 4 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> helical domain of human moesin protein <400> 4 Asp Thr Ile Glu Val Gln Gln Met Lys Ala Gln Ala Arg Glu Glu Lys 1 5 10 15 His Gln Lys Gln Met Glu Arg Ala Met Leu Glu Asn Glu Lys Lys Lys 20 25 30 Arg Glu Met Ala Glu Lys Glu Lys Glu Lys Ile Glu Arg Glu Lys Glu 35 40 45 Glu Leu Met Glu Arg Leu Lys Gln Ile Glu Glu Gln Thr Lys Lys Ala 50 55 60 Gln Gln Glu Leu Glu Glu Gln Thr Arg Arg Ala Leu Glu Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Arg Lys Arg Ala Gln Ser Glu Ala Glu Lys Leu Ala Lys Glu Arg 85 90 95 Gln Glu Ala Glu Glu Ala Lys Glu Ala Leu Leu Gln Ala Ser Arg Asp 100 105 110 Gln Lys Lys Thr Gln Glu Gln Leu Ala Leu Glu Met Ala Glu Leu Thr 115 120 125 Ala Arg Ile Ser Gln Leu Glu Met Ala Arg Gln Lys Lys Glu Ser Glu 130 135 140 Ala Val Glu Trp Gln Gln Lys Ala Gln Met Val Gln Glu Asp Leu Glu 145 150 155 160 Lys Thr Arg Ala Glu Leu Lys Thr Ala Met Ser Thr Pro 165 170 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> C-terminal tail domain of human moesin protein <400> 5 His Val Ala Glu Pro Ala Glu Asn Glu Gln Asp Glu Gln Asp Glu Asn 1 5 10 15 Gly Ala Glu Ala Ser Ala Asp Leu Arg Ala Asp Ala Met Ala Lys Asp 20 25 30 Arg Ser Glu Glu Glu Arg Thr Thr Glu Ala Glu Lys Asn Glu Arg Val 35 40 45 Gln Lys His Leu Lys Ala Leu Thr Ser Glu Leu Ala Asn Ala Arg Asp 50 55 60 Glu Ser Lys Lys Thr Ala Asn Asp Met Ile His Ala Glu Asn Met Arg 65 70 75 80 Leu Gly Arg Asp Lys Tyr Lys Thr Leu Arg Gln Ile Arg Gln Gly Asn 85 90 95 Thr Lys Gln Arg Ile Asp Glu Phe Glu Ser Met 100 105 <210> 6 <211> 1734 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cDNA Sequence encoding for the Full Length Human Moesin Protein <400> 6 atgcccaaaa cgatcagtgt gcgtgtgacc accatggatg cagagctgga gtttgccatc 60 cagcccaaca ccaccgggaa gcagctattt gaccaggtgg tgaaaactat tggcttgagg 120 gaagtttggt tctttggtct gcagtaccag gacactaaag gtttctccac ctggctgaaa 180 ctcaataaga aggtgactgc ccaggatgtg cggaaggaaa gccccctgct ctttaagttc 240 cgtgccaagt tctaccctga ggatgtgtcc gaggaattga ttcaggacat cactcagcgc 300 ctgttctttc tgcaagtgaa agagggcatt ctcaatgatg atatttactg cccgcctgag 360 accgctgtgc tgctggcctc gtatgctgtc cagtctaagt atggcgactt caataaggaa 420 gtgcataagt ctggctacct ggccggagac aagttgctcc cgcagagagt cctggaacag 480 cacaaactca acaaggacca gtgggaggag cggatccagg tgtggcatga ggaacaccgt 540 ggcatgctca gggaggatgc tgtcctggaa tatctgaaga ttgctcaaga tctggagatg 600 tatggtgtga actacttcag catcaagaac aagaaaggct cagagctgtg gctgggggtg 660 gatgccctgg gtctcaacat ctatgagcag aatgacagac taactcccaa gataggcttc 720 ccctggagtg aaatcaggaa catctctttc aatgataaga aatttgtcat caagcccatt 780 gacaaaaaag ccccggactt cgtcttctat gctccccggc tgcggattaa caagcggatc 840 ttggccttgt gcatggggaa ccatgaacta tacatgcgcc gtcgcaagcc tgataccatt 900 gaggtgcagc agatgaaggc acaggcccgg gaggagaagc accagaagca gatggagcgt 960 gctatgctgg aaaatgagaa gaagaagcgt gaaatggcag agaaggagaa agagaagatt 1020 gaacgggaga aggaggagct gatggagagg ctgaagcaga tcgaggaaca gactaagaag 1080 gctcagcaag aactggaaga acagacccgt agggctctgg aacttgagca ggaacggaag 1140 cgtgcccaga gcgaggctga aaagctggcc aaggagcgtc aagaagctga agaggccaag 1200 gaggccttgc tgcaggcctc ccgggaccag aaaaagactc aggaacagct ggccttggaa 1260 atggcagagc tgacagctcg aatctcccag ctggagatgg cccgacagaa gaaggagagt 1320 gaggctgtgg agtggcagca gaaggcccag atggtacagg aagacttgga gaagacccgt 1380 gctgagctga agactgccat gagtacacct catgtggcag agcctgctga gaatgagcag 1440 gatgagcagg atgagaatgg ggcagaggct agtgctgacc tacgggctga tgctatggcc 1500 aaggaccgca gtgaggagga acgtaccact gaggcagaga agaatgagcg tgtgcagaag 1560 cacctgaagg ccctcacttc ggagctggcc aatgccagag atgagtccaa gaagactgcc 1620 aatgacatga tccatgctga gaacatgcga ctgggccgag acaaatacaa gaccctgcgc 1680 cagatccggc agggcaacac caagcagcgc attgacgaat ttgagtctat gtaa 1734

Claims

모에신 단편이 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 모에신 단편을 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, C-말단 테일 도메인이 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-577로 이루어진 것인 조성물.
제1항에 있어서, 모에신 단편이 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 471-487 사이의 영역으로부터의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 모에신 단편이 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 488-501 사이의 영역으로부터의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 모에신 단편이 인간 모에신 단백질의 아미노산 잔기 502-577 사이의 영역으로부터의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 모에신 단편이 인간 모에신 단백질의 전체 C-말단 테일 도메인을 포함하는 것인 조성물.
모에신 단편이 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있고, 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 것인, 샘플 중 항-모에신 자가항체의 시험관내 검출을 위한 진단 조성물의 제조에 있어서 모에신 단편의 용도.
제7항에 있어서, 샘플이 인간 대상체로부터 수득된 전혈, 혈청 또는 혈장인 용도.
제8항에 있어서, 대상체가 재생불량 빈혈 (AA)을 앓고 있거나, 앓을 것으로 의심되는 것인 용도.
제9항에 있어서, AA가 면역 매개성인 용도.
제10항에 있어서, AA가 비정상적인 T 림프구 활성과 관련이 있는 것인 용도.
제11항에 있어서, AA가 비정상적인 종양 괴사 인자 (TNF)-알파 활성과 관련이 있는 것인 용도.
제11항에 있어서, AA가 비정상적인 인터페론 (IFN)-감마 활성과 관련이 있는 것인 용도.
a) 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 모에신 단편; b) 항-모에신 자가항체에 결합할 수 있는 검출 항체; 및 c) 고체상을 포함하며, 여기서 모에신 단편은 고체상에 결합되어 있는 것인, 샘플 중 항-모에신 자가항체를 검출하기 위한 키트.
a) 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 모에신 단편을 제공하는 단계; b) 상기 모에신 단편을 샘플과 반응시키는 단계; 및 c) 상기 모에신 단편에 결합한 항-모에신 자가항체를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 중 항-모에신 자가항체를 검출하는 방법.
a) 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 모에신 단편을 제공하는 단계;
b) 시험관내에서 상기 모에신 단편을 대상체로부터 수득된 샘플과 반응시키며, 여기서 상기 모에신 단편은 항-모에신 자가항체에 결합하는 것인 단계; 및
c) 항-모에신 자가항체가 상기 샘플 중에, 정상 참조 샘플 중의 상기 항-모에신 자가항체 수준보다 더 큰 수준으로 존재하는지 여부를 결정하고, 이로써 대상체가 AA를 앓는지를 나타내는 것인 단계
를 포함하는, 대상체에서 AA를 진단하는 방법.
a) 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 모에신 단편을 제공하는 단계;
b) 시험관내에서 상기 모에신 단편을 AA를 앓는 환자로부터 수득된 샘플과 반응시키며, 여기서 상기 모에신 단편은 항-모에신 자가항체에 결합하는 것인 단계;
c) 항-모에신 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 및
d) c) 단계로부터의 수준을, 항-모에신 자가항체의 역가와 AA의 병리학적 상태의 상관관계를 보여주는 참조 데이터베이스와 비교함에 따라 환자의 병리학적 상태를 결정하는 단계
를 포함하는, AA를 앓는 환자의 병리학적 상태를 결정하는 방법.
a) 인간 모에신 단백질의 C-말단 테일 도메인의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 모에신 단편을 제공하는 단계;
b) 시험관내에서 상기 모에신 단편을 AA 요법을 받고 있는 대상체로부터 수득된 샘플과 반응시키며, 여기서 상기 모에신 단편은 항-모에신 자가항체에 결합하는 것인 단계;
c) 항-모에신 자가항체의 수준을 측정하는 단계; 및
d) c) 단계로부터의 수준을, 요법을 받기 이전의 동일 대상체로부터 수득된 항-모에신 자가항체의 수준과 비교하며, 여기서 역가의 감소는 대상체가 AA의 치료에 대하여 양성 반응을 보임을 나타내는 것인 단계
를 포함하는, AA 요법을 받고 있는 대상체에서 치료 반응을 모니터링하는 방법.