KR20130127446A - 디케토피페라진 형성 디펩티딜 링커 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 N-말단 펩티드 단편 PEP-N 및 C-말단 펩티드 단편 C-PEP 의 균일 용액상 펩티드 합성 (HSPPS) 방법에 관한 것이며, 이때 C-PEP 는 핸들기 HG 를 포함하는 C-말단 보호기를 포함하는 특정 디케토피페라진 (DKP) 을 운반하고, 상기 HG 는 펩티드 단편의 C-말단에 연결되며; 그로 인해 C-말단 보호기를 포함하는 상기 특정 DKP 는 통상 사용된 C-말단 보호기로서 펩티드로부터 선택적으로 절단될 수 있다. C-말단 보호기를 포함하는 이러한 DKP 및 HG 를 사용하여, HSPPS 및 고체상 펩티드 합성 (SPPS) 의 조합을 기반으로 하는 수렴적 펩티드 합성에서의 특정 공정 단계가 회피될 수 있다. 본 발명은 또한, 증가하는 펩티드 사슬을 수지에 연결시키기 위해 특정 디펩티드 및 HG 를 포함하는 링커를 사용함으로써 SPPS 에 의해 이러한 특이적으로 보호된 단편 C-PEP 를 제조하는 방법에 관한 것이며 (펩티드 단편 C-PEP 가 지지성 수지로부터 절단되는 경우 링커는 상기 DKP 기를 형성함); 또한 상기 제조 방법의 중간체에 관한 것이다.
Description
본 발명은 N-말단 펩티드 단편 PEP-N 및 C-말단 펩티드 단편 C-PEP 의 균일 용액상 펩티드 합성 (HSPPS) 방법에 관한 것이며, 이때 C-PEP 는 핸들기 HG 를 포함하는 C-말단 보호기를 포함하는 특정 디케토피페라진 (DKP) 을 운반하고, 상기 HG 는 펩티드 단편의 C-말단에 연결되며; 그로 인해 C-말단 보호기를 포함하는 상기 특정 DKP 는 통상 사용된 C-말단 보호기로서 펩티드로부터 선택적으로 절단될 수 있다. C-말단 보호기를 포함하는 이러한 DKP 및 HG 를 사용하여, HSPPS 및 고체상 펩티드 합성 (SPPS) 의 조합을 기반으로 하는 수렴적 펩티드 합성에서의 특정 공정 단계가 회피될 수 있다.
본 발명은 또한, 증가하는 펩티드 사슬을 수지에 연결시키기 위해 특정 디펩티드 및 HG 를 포함하는 링커를 사용함으로써 SPPS 에 의해 이러한 특이적으로 보호된 단편 C-PEP 를 제조하는 방법에 관한 것이며 (펩티드 단편 C-PEP 가 지지성 수지로부터 절단되는 경우 링커는 상기 DKP 기를 형성함); 또한 상기 제조 방법의 중간체에 관한 것이다.
본문에서는, 다르게 언급하지 않는다면, 아미노산 및 펩티드의 명명법을 "Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides", Pure & Appl. Chem., Vol. 56, No. 5, pp. 595-624, 1984 에 따라 사용한다.
하기의 축약은 다르게 언급하지 않는다면 하기 목록에서 제공된 바와 같은 의미를 갖는다:
CTC: 클로로트리틸 클로라이드
Alloc: 알릴옥시카르보닐
Boc: tert-부톡시카르보닐
Bsmoc: 1,1-디옥소벤조[b]티오펜-2-일메틸옥시카르보닐
Bzl 또는 Bn: 벤질
cHx: 시클로헥실
Ct: C 말단
Dpr: 2,3-디아미노프로판산
Dde: N-1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)에틸
ivDde: 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)3-메틸부틸
Ddz: 알파,알파-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카르보닐
DKP: 2,5-디케토피페라진
Dmab: 디메틸아미노보란
Fm: 9-플루오레닐메틸
Fmoc: N-(플루오레닐-9-메톡시카르보닐)
Hpr: 피페리딘-2-카르복실산, 호모프롤린
HSHSPPS: 하이브리드 고체 및 균질 용액상 펩티드 합성
HSPPS: 균질 용액상 펩티드 합성
Hyp: 트랜스-4-히드록시프롤린
Mmt: 4-메톡시트리틸
Mpe: 3-메틸펜트-3-일
Mtt: 4-메틸트리틸
Orn: 오르니틴
Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐
PG: 보호기
2-PhiPr: 2-페닐이소프로필
Pmc: 2,2,5,7,8-펜타-메틸크로만-6-술포닐
pN02Z: 니트로벤질옥시카르보닐
Py: 피리딘
SPPS: 고체상 펩티드 합성
tBu: tert-부틸
TES: SiEt3, 트리에틸실릴
TFA: 트리플루오로아세트산
Tfac: 트리플루오로아세틸
Trt 또는 Tr: 트리페닐메틸 또는 트리틸
Z: 벤질옥시카르보닐
다르게 언급하지 않는다면 용어 "단편" 및 "펩티드 단편" 은 동의어로 사용된다. 다르게 언급하지 않는다면 용어 "핸들" 및 "핸들기", 예를 들어 "Fmoc-Rink 아미드 핸들기", "Rink 아미드 핸들" 또는 "Rink 아미드 핸들기", 및 용어 "링커", 예를 들어 "Fmoc-Rink 아미드 링커" 또는 Fmoc-Rink-OH 는 종종 동의어로 사용된다.
펩티드는 종종 하이브리드 고체 및 균질 용액상 펩티드 합성 HSHSPPS 에 의해 제조되며: 먼저 둘 이상의 펩티드 단편이 고체상 펩티드 합성 SPPS 에 의해 제조되어, 그 후 균질 용액상 펩티드 합성 HSPPS 에 의해 고체상에서 커플링되어 목적하는 표적 펩티드가 제공된다.
이러한 접근법은 SPPS 및 HSPPS 둘 모두의 이점을 조합하기 때문에 거대 펩티드의 상업적 규모 제조에 대해 특히 유리하다. 특히, 단편의 SPPS 는 발전되고 신속히 규모 확장될 수 있으며 상대적으로 긴 단편의 HSPPS 에서 종종 처한 많은 용해성 문제를 방지한다. 제조 사이클 시간은 용액상 방법에 비해 짧다. 또한, 특히 종종 정제를 필요로 하지 않는 중간체를 만들어내는 커플링 반응 동안의 과량의 시약 사용으로 인해, 수율 및 순도가 종종 더 높다. SPPS 에 의해 만들어진 단편 배열 선택의 최적화 후, 공정의 최종 단계는 종래의 HSPPS 방법에 의해 규모 확장될 수 있다. 이들 공정 최종 단계는 단편 커플링 및 아미노산 잔기의 최종 탈보호, 즉 측쇄 및 N- 및 C-말단의 탈보호 (둘 모두 용액 중에서 수행됨) 이다. 따라서, HSHSPPS 합성을 적용하는 경우, SPPS 의 이점, 즉 고순도 단편의 신속한 합성, 및 용액상 합성의 이점, 즉 커플링 반응 및 단리의 전체 모니터링 및 임의의 정제 (형성된 중간체 단편의 전체 분석 포함) 를 이용하여, 특히 상업적 규모에서 효과적으로 펩티드를 제조할 수 있다.
HSHSPPS 에서, SPPS 에 의해 제조된 2 개 이상의 단편 PEP-N 및 C-PEP 는 항상 용액상에서 커플링되어 목적하는 펩티드 PEP 가 제공되는데, 이는 최종 펩티드 또는 다시금 중간체 펩티드 단편이고, 그 후 다시 제 3 펩티드 단편 등과 커플링된다. 본원에서 단편 PEP-N 은 펩티드 PEP 의 N-말단을 나타내고, 단편 C-PEP 는 펩티드 PEP 의 C-말단을 나타내며, 그러므로 단편 PEP-N 의 C-말단은 단편 C-PEP 의 N-말단과 커플링되어 펩티드 PEP 가 제공된다. 용액상 커플링 동안 단편 PEP-N 의 N-말단이 보호될 뿐 아니라 단편 C-PEP 의 C-말단이 보호되어, 잘못된 방향으로의 단편 PEP-N 과 단편 PEP-N, 단편 C-PEP 와 단편 C-PEP, 또는 단편 C-PEP 와 단편 PEP-N 의 원치 않는 커플링이 방지될 필요가 있다. 다르게 언급하지 않는다면 이러한 N-말단 보호된 펩티드 단편 PEP-N 은 하기에서 또한 PEP-N 으로 지칭된다. 지지성 수지에서 SPPS 에 의해 제조된 단편 C-PEP 는 마지막 아미노산 잔기의 부가 후 N-말단 보호기를 운반하며, 이후 최종 단계에서 지지성 수지로부터 절단된다. 이러한 절단은 통상 비 (非) 보호된 C-말단을 갖는 단편 C-PEP 가 생기게 하는데, 이는 단편 C-PEP 가 HSPPS 에서 단편 PEP-N 과 커플링될 수 있기 전에 별도의 단계에서 보호되어야만 한다. 실제로, 단편 C-PEP 의 C-말단의 이러한 필요한 보호는 하나의 단계 뿐 아니라 여러 단계, 예컨대 반응, 정제 및 단리, 가능하게는 또 다른 후속적 정제 및 단리를 포함한다.
제조되는 표적 펩티드 PEP 가 펩티드 아미드 PEP-NH2 (즉 카르복사미드기인 C-말단을 갖는) 인 경우, 카르복사미드기 자체가 보호기로서 작용하기 때문에, 각각의 단편 C-PEP-NH2 의 C-말단은 보통 HSPPS 에서 단편 커플링 동안 보호될 필요가 없다. 카르복실산인 C-말단을 갖는 단편 C-PEP-OH 가 절단 후 카르복실산기를 형성하는 수지를 사용하여 SPPS 후 용이하게 수득될 수 있는 한편, 절단 후 카르복사미드기를 형성하는 수지, 예를 들어 Sieber 아미드 수지의 사용은 절단 동안 단편 C-PEP-NH2 의 부분 측쇄 탈보호로 인한 문제점을 일으키는데, 이는 아미드 수지로부터의 절단이 통상 산성 조건, 예컨대 용매 중 3 내지 5 중량% 의 TFA 의 사용을 필요로 하고, 측쇄 보호기, 예컨대 Fmoc/Trt SPPS 의 경우 Trt (예를 들어 His(Trt)) 또는 예컨대 슈도-프롤린 유도체에 있어서의 아세탈 (즉 Fmoc-Ser(tBu)-Thr(psiMe,Mepro)-OH) 이 이러한 절단 조건 하에 완전히 안정하지 않아 측쇄 보호기의 부분적 손실을 일으키기 때문이다. 그러므로 단편 C-PEP-NH2 를 제조하기 위해서는, 단편 C-PEP-NH2 의 C-말단 아미노산 자체가 아니라 목적하는 단편 C-PEP-NH2 의 C-말단 아미노산 잔기로부터의 위치에서의 두 번째 아미노산, 및 절단 후 C-말단으로서 카르복실산을 제공하는 수지로 SPPS 를 시작하는 것이 통상적이다. 따라서 수지로부터의 절단은 목적하는 단편 C-PEP-NH2 의 C-말단 아미노산을 갖지 않는 단편 C-OH 를 제공하며, 상기 단편 C-OH 의 C-말단은 최종적으로 목적하는 단편 C-PEP-NH2 의 C-말단으로부터의 2 번째 위치의 아미노산이고 카르복실산을 포함한다. 단편 C-PEP-NH2 의 소실된 C-말단 아미노산은 이후 별도로, 용액상에서 이의 아미드 H-Xaa-NH2 의 형태로 단편 C-OH 와 커플링된다.
WO 90/09395 는 펩티드와 지지성 수지 사이의 절단성 링커의 용도를 기재하고 있는데, 이는 수지로부터 절단되는 경우 디케토피페라진 (DKP) 링커기를 형성하며, 이때 상기 DKP 기는 펩티드의 C-말단 및 링커기에서의 Lys 의 엡실론 아미노기 사이의 아미드 결합을 통해 펩티드에 연결된다. 이러한 DKP 링커기는 이후의 단계에서 펩티드로부터 선택적으로 제거될 수 없다. 따라서, HSPPS 에 있어서 적합한 비보호된 N-말단을 갖는 완전히 보호된 C-말단 단편이 제조될 수 없다. 또한, WO 90/09395 의 링커기로는 자연적 또는 비개질된 펩티드가 제조될 수 없다. 이는 오직 영구적으로 C-말단 개질된 펩티드의 합성에 대해서만 적합한데, 이는 수지로부터 절단된 임의의 펩티드가 항상 그의 C-말단에서, 펩테드의 다른 펩티드 결합을 절단시키지 않고서는 절단될 수 없는 DKP 링커기를 운반하기 때문이다. 또 다른 불리한 점은 절단 단계 동안 트리플루오로아세트산 (TFA) 의 사용에 대한 이의 절단의 제한이며, 이는 펩티드의 아미노산 잔기 측쇄의 임의의 tBu, Boc, Trt 또는 아세탈계 보호기의 부분적 또는 전체 제거를 내포하여, 비보호된 측쇄 또는 tBu, Boc, Trt 및 아세탈 외의 측쇄 보호기를 갖는 펩티드의 제조에 대한 이의 사용을 제한한다.
반응 순서에서 단계의 수를 감소시킴으로써 HSHSPPS 의 절차를 단순화시키는 것이 필요하였다.
놀랍게도, 이는 단편으로부터의 링커의 특정한 절단 가능성을 제공하는 단편 C-PEP 에 대한 링커 연결의 특정 화학적 성질 및 상이한 유형의 보호기의 적절한 조합과 함께, C-말단 보호기를 포함하는 특정 디케토피페라진을 운반하는 단편 C-PEP 를 제조하는데 사용한 SPPS 에서 특정 디케토피페라진기 형성 디펩티딜 링커를 사용하여 이루어질 수 있다.
아미노산의 측쇄에서의 관능기를 보호하거나 아미노산 또는 펩티드의 N-말단 아미노기 또는 C-말단 카르복시기의 보호를 위한 보호기 (PG) 는 본 발명의 목적을 위해서 다음의 4 가지 상이한 기로 분류된다:
1. 하기에서 "염기성 유형 PG" 로 지칭하는 염기성 절단가능 유형 보호기,
2. 하기에서 "강 유형 PG" 로 지칭하는 강산 절단가능 유형 보호기,
3. 하기에서 "약 유형 PG" 로 지칭하는 약산 절단가능 유형 보호기, 및
4. 하기에서 "환원성 유형 PG" 로 지칭하는 환원성 절단가능 유형 보호기,
이때 2 개 기 "강 유형 PG" 및 "약 유형 PG" 를 또한 집합적으로 "산 절단가능 유형 보호기" 또는 "산 유형 PG" 로 지칭한다.
본 발명의 의미 내에서, 임의의 PG 는 하기의 4 개 분류 반응 조건에 의해 분류된다. 분류는 수지 1 g 당 1.5 내지 1.7 mmol 의 로딩 용량을 갖는 CTC 수지를 사용하여 수행되는데, 상기 수지는 분류할 각각의 PG 를 운반하는 오직 하나의 아미노산으로 로딩된다. 하기 4 개 분류 절차에서의 용어 "부" 는 다르게 언급하지 않는다면 로딩된 CTC 수지 출발 물질의 중량부 인자인 것을 의미한다.
1. 하기 본문에서 "염기성 분류 조건" 으로 지칭하는 염기성 유형 PG 에 대한 분류 반응 조건:
염기성 유형 PG 운반 아미노산이 로딩된 수지의 25 +/- 5℃ 에서 25 +/ 5 분 동안 7 +/- 1 부의 절단 용액으로의 처리 (상기 절단 용액은 디메틸포름아미드 (DMF) 중 피페리딘의 22.5 +/- 2.5 중량% 용액으로 이루어지며, 중량% 는 절단 용액의 총 중량을 기준으로 함).
2. 하기 본문에서 "강 분류 조건" 으로 지칭하는 강 유형 PG 에 대한 분류 반응 조건:
강 유형 PG 운반 아미노산이 로딩된 수지의 25 +/- 5℃ 에서 25 +/ 5 분 동안 7 +/- 1 부의 절단 용액으로의 처리 (상기 절단 용액은 디클로로메탄 (DCM) 중 트리플루오로아세트산 (TFA) 의 85 +/-5 중량% 용액으로 이루어지며, 중량% 는 절단 용액의 총 중량을 기준으로 함).
3. 하기 본문에서 "약 분류 조건" 으로 지칭하는 약 유형 PG 에 대한 분류 반응 조건:
약 유형 PG 운반 아미노산이 로딩된 수지의 25 +/- 5℃ 에서 25 +/ 5 분 동안 7 +/- 1 부의 절단 용액으로의 처리 (상기 절단 용액은 DCM 중 TFA 의 2 +/-1 중량% 용액으로 이루어지며, 중량% 는 절단 용액의 총 중량을 기준으로 함).
4. 하기 본문에서 "환원성 분류 조건" 으로 지칭하는 환원성 유형 PG 에 대한 분류 반응 조건:
환원성 유형 PG 가 로딩된 수지의 25 +/- 5℃ 에서 30 +/ 5 분 동안 7 +/- 1 부의 DMF, DMF 에 용해된 0.1 mol 당량의 가용성 유기 Pd(0) 촉매, 바람직하게는 Pd[PPh3]4 로의 처리 (상기 mol 당량은 수지에 로딩된 절단가능 기의 mol 을 기준으로 함).
펩티드 화학에서 통상 사용되는 PG 및 PG 절단을 위한 통상적인 반응 조건 및 매개변수 및 시약은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, T. W. Greene, P.G. M. Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis" John Wiley & Sons, Inc., 1999; 또는 Lloyd-Williams, P., Albericio, F., Giralt, E., "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins" CRC: Boca Raton, Florida, 1997).
염기성 유형 PG 는 바람직하게는, 하기 본문에서 "염기성 절단 조건" 으로 지칭하는 하기의 가능한 반응 조건 하에 절단된다:
염기성 절단 조건은 염기성 절단 용액으로의 각각의 물질 처리를 포함한다. 상기 염기성 절단 용액은 염기성 시약 및 용매를 포함한다. 바람직하게는, 상기 염기성 절단 용액은 염기성 시약 및 용매로 이루어진다. 염기성 시약이 염기성 절단이 수행되는 온도에서 액체인 경우, 상기 염기성 시약은 또한 동시에 용매로서 작용할 수 있다 (즉, 염기성 시약과 상이한 용매가 사용되지 않음). 염기성 시약은 바람직하게는 2 차 아민이고, 보다 바람직하게는 염기성 시약은 피페리딘, 4-(아미노메틸)피페리딘, 트리스(2-아미노에틸)아민, 모르폴린, 디시클로헥실아민, 1,3-시클로헥산비스(메틸아민)피페라진, 1,8-디아자바이시클로[5.4.0]운데크-7-엔 및 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된다. 보다 더 바람직하게는, 염기성 시약은 피페리딘이다.
염기성 절단 용액은 또한 부가제를 포함할 수 있으며, 상기 부가제는 바람직하게는 6-클로로-1-히드록시-벤조트리아졸, 2,4-디니트로페놀, 피크르산, 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸, 1-히드록시-벤조트리아졸 및 에틸 2-시아노-2-히드록시이미노-아세테이트 및 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된다.
바람직하게는, 용매는 디메틸술폭시드 (DMSO), 디옥산, 테트라히드로푸란 (THF), 1-메틸-2-피롤리돈 (NMP), N,N-디메틸포름아미드 (DMF), N,N-디메틸아세트아미드 (DMA), 피리딘, 디클로로메탄 (DCM), 디클로로에탄 (DCE), 클로로포름, 디옥산, 테트라히드로피란, 에틸 아세테이트, 톨루엔, 아세토니트릴 및 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되고; 보다 바람직하게는 용매는 1-메틸-2-피롤리돈 (NMP), N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 또는 이의 혼합물이다.
염기성 절단 조건의 상기 설명에서의 용어 "부" 는 염기성 유형 PG (들) 를 운반하는 처리된 물질의 중량부 인자인 것을 의미한다.
바람직하게는, 5 내지 20 부, 보다 바람직하게는 5 내지 15 부의 염기성 절단 용액이 사용된다.
바람직하게는, 염기성 시약의 양은 염기성 절단 용액의 총 중량을 기준으로 하는 중량% 로, 1 내지 30 중량%, 보다 바람직하게는 10 내지 25 중량%, 보다 더 바람직하게는 15 내지 20 중량% 이다.
바람직하게는, 염기성 절단은 10 내지 50℃, 보다 바람직하게는 10 내지 30℃, 보다 더 바람직하게는 15 내지 25℃ 의 온도에서 수행된다.
바람직하게는, 염기성 절단은 대기압에서 수행된다.
바람직하게는, 염기성 절단에 대한 반응 시간은 5 분 내지 2 시간, 보다 바람직하게는 10 분 내지 1 시간, 보다 더 바람직하게는 15 분 내지 30 분이다.
강 유형 PG 는 바람직하게는, 하기 본문에서 "강 절단 조건" 으로 지칭하는 하기의 가능한 반응 조건 하에 절단된다:
강 절단 조건은 강 절단 용액으로의 각각의 물질 처리를 포함한다. 강 절단 용액은 산용해성 시약을 포함한다. 산용해성 시약은 바람직하게는 수소 산, 예컨대 트리플루오로아세트산 (TFA), 염산 (HCl), 수성 염산 (HCl), 액체 불화수소산 (HF) 또는 트리플루오로메탄술폰산, 루이스산, 예컨대 트리플루오로보레이트 디에틸 에테르 부가물 또는 트리메틸실릴브로마이드, 및 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된다.
강 절단 용액은 바람직하게는 하나 이상의 스캐빈져를 포함하며, 상기 스캐빈져는 디티오트레이톨 (DTT), 에탄디티올 (EDT), 디메틸술피드 (DMS), 트리이소프로필실란 (TIS), 트리에틸실란 (TES), 1,3-디메톡시벤젠 (DMB), 페놀, 아니솔, p-크레솔 및 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된다.
강 절단 용액은 또한 물, 용매 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있으며, 상기 용매는 강 절단 조건 하에 안정하다.
바람직하게는, 용매는 디클로로메탄, 디클로로에탄, 아세토니트릴, 톨루엔, 테트라히드로푸란, TFA, 디옥산 및 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 산용해성 시약은 동시에 용매로서 작용하여, 추가의 용매가 필요하지 않다.
강 절단 용액의 상기 설명에서의 용어 "부" 는 강 유형 PG (들) 를 운반하는 처리된 물질의 중량부 인자인 것을 의미한다.
바람직하게는, 10 내지 30 부, 보다 바람직하게는 15 내지 25 부, 보다 더 바람직하게는 19 내지 21 부의 강 절단 용액이 사용된다.
바람직하게는, 산용해성 시약의 양은 강 절단 용액의 총 중량을 기준으로 한 중량% 로, 30 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 50 내지 100 중량%, 보다 더 바람직하게는 70 내지 100 중량%, 특히 80 내지 100 중량% 이다.
바람직하게는, 강 절단 용액의 총 중량을 기준으로 한 중량% 로, 1 내지 25 중량% 총량, 보다 바람직하게는 5 내지 15 중량% 의 스캐빈져가 사용된다.
바람직하게는, 강 절단은 -10 내지 30℃, 보다 바람직하게는 -10 내지 30℃, 보다 더 바람직하게는 5 내지 15℃ 의 온도에서 수행된다.
바람직하게는, 강 절단은 대기압에서 수행된다.
바람직하게는, 강 절단에 대한 반응 시간은 30 분 내지 20 시간, 보다 바람직하게는 1 시간 내지 10 시간, 보다 더 바람직하게는 1 시간 내지 5 시간이다.
약 유형 PG 는 바람직하게는, 하기 본문에서 "약 절단 조건" 으로 지칭하는 하기의 가능한 반응 조건 하에 절단된다:
약 절단 조건은 약 절단 용액으로의 각각의 물질 처리를 포함한다. 약 절단 용액은 산용해성 시약을 포함한다. 산용해성 시약은 바람직하게는 수소 산, 예컨대 트리플루오로아세트산 (TFA), 트리플루오로에탄올 (TFE), 염산 (HCl), 아세트산 (AcOH), 이의 혼합물 및/또는 물로 이루어지는 군에서 선택된다.
약 절단 용액은 또한 물, 용매 또는 이의 혼합물을 포함하며, 상기 용매는 약 절단 조건 하에 안정하다.
바람직하게는, 용매는 디클로로메탄, 디클로로에탄, 아세토니트릴, 톨루엔, 테트라히드로푸란, TFA, 디옥산 및 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된다.
약 절단 용액의 상기 설명에서의 용어 "부" 는 약 유형 PG (들) 를 운반하는 처리된 물질의 중량부 인자인 것을 의미한다.
바람직하게는, 4 내지 20 부, 보다 바람직하게는 5 내지 10 부의 약 절단 용액이 사용된다.
바람직하게는, 산용해성 시약의 양은 약 절단 용액의 총 중량을 기준으로 한 중량% 로, 0.01 내지 5 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%, 보다 더 바람직하게는 0.15 내지 3 중량% 이다.
바람직하게는, 약 절단은 10 내지 50℃, 보다 바람직하게는 20 내지 40℃, 보다 더 바람직하게는 25 내지 35℃ 의 온도에서 수행된다.
바람직하게는, 약 절단은 대기압에서 수행된다.
바람직하게는, 약 절단에 대한 반응 시간은 5 분 내지 2 시간, 보다 바람직하게는 10 분 내지 1 시간, 보다 더 바람직하게는 10 분 내지 30 분이다.
약 유형 PG 는 서로 구별되는 추가의 기로 하위분류될 수 있으며, 절단에 필요한 산의 양에 따라 연속적으로 정렬될 수 있다. 약 분류 조건의 상기 정의에 따라, 모든 약 유형 PG 는 DCM 중 TFA 의 2 +/- 1 중량% 용액을 사용하여 절단될 수 있다 (상기 중량% 는 절단 용액의 총 중량을 기준으로 함). DCM 중 TFA 의 1 중량% 이상의 용액에 의해서만 절단되나 TFA 를 덜 갖는 용액에 의해서는 절단되지 않는 약 유형 PG 는 "약 유형 1 PG" 로 지칭되며, 절단 조건은 "약 1 절단 조건" 으로 지칭되고;
DCM 중 TFA 의 0.1 중량% 이상의 용액에 의해 이미 절단되나 TFA 를 덜 갖는 용액에 의해서는 절단되지 않는 약 유형 PG 는 "약 유형 2 PG" 로 지칭되며, 절단 조건은 "약 2 조건" 으로 지칭되고;
DCM 중 TFA 의 0.01 중량% 이상의 용액에 의해 이미 절단되는 약 유형 PG 는 "약 유형 3 PG" 로 지칭되며, 절단 조건은 "약 3 조건 " 으로 지칭되고;
상기 중량% 는 절단 용액의 총 중량을 기준으로 한다.
환원성 유형 PG 는 바람직하게는, 하기 본문에서 "환원성 절단 조건" 으로 지칭하는 하기의 가능한 반응 조건 하에 절단된다:
환원성 절단 조건은 환원성 절단 용액으로의 각각의 물질 처리를 포함한다. 환원성 절단 용액은 촉매, 부가제 및 용매를 포함한다.
촉매는 바람직하게는 Pd(0) 의 유기 유도체 및 Pd(II) 의 유기 유도체로 이루어지는 군에서 선택되고, 보다 바람직하게는 Pd[PPh3]4, PdCl2[PPh3]2, Pd[OAc]2[P(2,4-자일로일)3]2, Pd[OAc]2[P(오르토-톨릴)3]2, 덜 안정적으로 배위된 Pd-착물과 리간드를 혼합하여 제조된 인시츄 (in situ) 제조 Pd(0) 촉매, 예컨대 PdCl2(PPh3)2 / PPh3, PdCl2(PPh3)2 / P(오르토-톨릴)3, Pd(DBA)2 / P(오르토-톨릴)3 또는 Pd[P(오르토-톨릴)3]2, Pd(OAc) / 트리에틸-포스파이트, Pd(OAc)2 / PPh3 또는 Pd(OAc)2 / P(오르토-톨릴)3, 및 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되고; 보다더 바람직하게는 Pd[PPh3]4, PdCl2[PPh3]2, Pd[OAc]2[P(2,4-자일로일)3]2, Pd[OAc]2[P(오르토-톨릴)3]2 및 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된다.
부가제는 바람직하게는 디메틸바르비투르산, 티오살리실산, N-메틸아닐린, Bu4N+BH4 -, NH3BH3, Me2NHBH3, tBu-NH2BH3, Me3NBH3, PyBH3, HCOOH/DIEA, 디에틸디티오카르바메이트 나트륨, 디메돈, 모르폴린, AcOH/NMM, 페닐실란, PhSO2H, tolSO2Na, 나트륨 2-에틸헥사노에이트 (SEH), 나트륨 2-티오펜술피네이트 (STS), 나트륨 4-클로로-3-니트로벤젠술피네이트 (SCNBS) 및 i-BuSO2Na 를 포함하는 술핀산, 및 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되고; 보다 바람직하게는 부가제는 tolSO2Na 이다.
바람직하게는, 용매는 디메틸술폭시드 (DMSO), 디옥산, 테트라히드로푸란 (THF), 1-메틸-2-피롤리돈 (NMP), N,N-디메틸포름아미드 (DMF), N,N-디메틸아세트아미드 (DMA), 피리딘, 디클로로메탄 (DCM), 디클로로에탄 (DCE), 클로로포름, 디옥산, 테트라히드로피란, 에틸 아세테이트, 톨루엔, 아세토니트릴 및 이의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되고; 보다 바람직하게는 용매는 1-메틸-2-피롤리돈 (NMP), N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 또는 이의 혼합물이다.
바람직하게는, 촉매는 용매에 용해가능하며 용매에 용해된다.
환원성 절단 조건의 상기 설명에서의 용어 "부" 는 환원성 유형 PG (들) 를 운반하는 처리된 물질의 중량부 인자인 것을 의미한다.
바람직하게는, 4 내지 20 부, 보다 바람직하게는 5 내지 10 부의 환원성 절단 용액이 사용된다.
바람직하게는, 0.001 내지 1 mol 당량, 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.05 mol 당량의 촉매가 사용되며, 상기 mol 당량은 수지에 로딩된 환원성 절단가능 기의 mol 을 기준으로 한다.
바람직하게는, 1 내지 10 mol 당량, 보다 바람직하게는 1.5 내지 5 mol 당량의 부가제가 사용되며, 상기 mol 당량은 수지에 로딩된 환원성 절단가능 기의 mol 을 기준으로 한다.
바람직하게는, 환원성 절단은 10 내지 60℃, 보다 바람직하게는 30 내지 50℃, 보다 더 바람직하게는 35 내지 45℃ 의 온도에서 수행된다.
바람직하게는, 환원성 절단은 대기압에서 수행된다.
바람직하게는, 환원성 절단에 대한 반응 시간은 15 분 내지 10 시간, 보다 바람직하게는 30 분 내지 4 시간, 보다 더 바람직하게는 30 분 내지 2 시간이다.
바람직하게는, 환원성 절단 용액은 빛으로부터 보호되어야 한다. 바람직하게는, 환원성 절단은 금속으로 만들어진 용기 내에서 수행된다.
염기성 유형 PG 는 강 또는 약 절단 조건에 의해 절단가능하지 않다.
바람직하게는, 염기성 유형 PG 는 강, 약 또는 환원성 절단 조건에 의해 절단가능하지 않다.
강 유형 PG 는 약 또는 염기성 절단 조건에 의해 절단가능하지 않다.
바람직하게는, 강 유형 PG 는 약, 염기성 또는 환원성 절단 조건에 의해 절단가능하지 않다.
약 유형 PG 는 염기성 절단 조건에 의해 절단가능하지 않으나, 강 절단 조건에 의해 절단가능하다.
바람직하게는, 약 유형 PG 는 염기성 또는 환원성 절단 조건에 의해 절단가능하지 않으나, 강 절단 조건에 의해 절단가능하다.
약 유형 1 PG 는 약 유형 2 또는 약 3 절단 조건에 의해 절단가능하지 않고;
약 유형 2 PG 는 약 1 절단 조건에 의해 절단가능하나, 약 3 절단 조건에 의해 절단가능하지 않고;
약 유형 3 PG 는 약 1 및 약 2 절단 조건에 의해 절단가능하다.
바람직하게는, 약 유형 1, 2 및 3 PG 는 또한 염기성 또는 환원성 절단 조건에 의해 절단가능하지 않다.
바람직하게는, 환원성 유형 PG 는 강, 약 및 염기성 절단 조건에 의해 절단가능하지 않으며, 이들은 "배타적 환원성 유형 PG" 로 지칭된다.
약 및 염기성 절단 조건에 의해 절단가능하지 않으나 강 절단 조건에 의해 절단가능한 환원성 유형 PG 는 "혼합 유형 PG" 로 지칭된다.
펩티드에 대한 링커의 연결은 또한 이들 4 개의 절단 조건 중 1 개의 조건 하에 절단가능한 것으로 분류될 수 있다.
수지에 대한 아미노산의 연결은 또한 이들 4 개의 절단 조건 중 1 개의 조건 하에 절단가능한 것으로 분류될 수 있다.
바람직하게는, 염기성 유형 PG 는 Fmoc, Bsmoc, Tfac, Dde, Dmab 및 cHx 로 이루어지는 군에서 선택된다.
바람직하게는, 강 유형 PG 는 Boc, tBu, Pmc, Mpe, Pbf, Z, Bzl, cHx, pN02Z 및 Ddz 로 이루어지는 군에서 선택된다.
바람직하게는, 약 유형 PG 는 Trt, Mmt, Mtt, 아세탈 및 2-PhiPr 로 이루어지는 군에서 선택된다.
약 유형 PG 가 실제로 약 유형 1 PG 또는 약 유형 2 PG 인지는 그것이 보호하는 측쇄기에 의해 결정된다.
바람직하게는, 환원성 유형 PG 는 Alloc, 알릴, ivDde 및 Z 로 이루어지는 군에서 선택된다.
보다 바람직하게는, 염기성 유형 PG 는 Fmoc 이다.
보다 바람직하게는, 강 유형 PG 는 Boc 이다.
보다 바람직하게는, 약 유형 PG 는 Trt 이다.
보다 바람직하게는, 환원성 유형 PG 는 Alloc 이다.
종래의 SPPS 에서, 펩티드는 SPPS 가 완료된 후 수지로부터 절단되고, 상기 절단은 SPPS 에서 사용한 수지 및 가능한 핸들에 따라 자유 카르복실산기의 형태 또는 카르복사미드의 형태로 C-말단을 갖는 펩티드가 생기게 한다. 그의 C-말단에 자유 카르복실기를 갖는 이러한 펩티드가 C-말단 펩티드 단편 C-PEP 로서 HSPPS 에서 사용되는 경우, 이러한 자유 카르복실산기는 펩티드가 HSPPS 에서 사용될 수 있기 전에 첫 번째로 보호되어야 한다. 자유 C-말단의 이러한 보호는 여러 공정 단계 (반응, 단리, 가능하다면 정제) 를 필요로 한다.
본 발명은 SPPS 후 수지로부터의 단편의 절단으로 인한 단편의 C-말단에서 자유 카르복실산을 보호하기 위해 필요한 이들 단계를 감소시키는 방법을 개시한다. 이는 상기 디케토피페라진 형성 디펩티딜 링커를 사용하여 SPPS 에서 상기 링커를 통해 목적하는 단편 C-PEP 의 제 1 아미노산 XaaC(1) 를 수지 지지체에 커플링시킴으로써 이루어지며, 상기 링커는 SPPS 가 완료되고 합성된 단편 C-PEP 가 수지로부터 절단되는 경우 C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기를 형성한다. 디케토피페라진 형성 디펩티딜 링커는 디펩티드 부분을 포함하는데, 이의 제 1 아미노산 Xaa1 은 이의 카르복실산기를 통해 수지에 연결되고, 이의 제 2 아미노산 Xaa2 는 이의 측쇄를 통해 핸들기 HG 에 연결되며, 이때 핸들기 HG 는 펩티딜 라디칼에 연결되고, Xaa2 는 N-말단 보호기 PG2 를 운반한다.
C-말단 보호기를 포함하는 상기 디케토피페라진 잔기의 형성은 Xaa2 의 보호기 PG2 를 제거함으로써 Xaa2 와 Xaa1 사이의 분자내 폐환을 가능하게 하여 이루어지며, 폐환은 상기 디케토피페라진 잔기를 형성하며 동시에 수지로부터 Xaa1 을 절단시킨다.
수지로부터의 절단에 의해 형성된 이러한 C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기는 수지로부터의 절단 후에도 단편 C-PEP 의 C-말단에 연결된 채 남아 있으며, 그에 따라 단편 C-PEP 의 C-말단의 보호기로서 작용하며, 이는 따라서 HSPPS 에서 직접 사용될 수 있다. 펩티드 PEP 을 수득하기 위한 상기 C-말단 단편 C-PEP 와 N-말단 펩티드 단편 PEP-N 의 HSPPS 에 의한 커플링 후, C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기는, 바람직하게는 단편 PEP 에서 임의의 보호된 측쇄의 탈보호와 동시에, 펩티드 PEP 로부터 절단된다.
상기 디케토피페라진 형성 디펩티딜 링커 및 생성된 C-말단 보호기 포함 디케토피페라진 잔기는 핸들기 HG 를 포함하는데, 이는 C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기로부터 펩티드 PEP 가 절단될 수 있게 한다.
이러한 목적하는 기능을 가능하게 하기 위해서, 상기 디케토피페라진 형성 디펩티딜 링커는 하기 4 개 주요 절단 단계:
1. SPPS 의 사이클 동안 아미노산의 각 N-말단 보호기를 절단하는 단계,
2. Xaa2 로부터 보호기 PG2 를 절단한 후, C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기를 형성시켜 잔기로부터 Xaa1 을 절단함으로써 수지로부터 단편 C-PEP 를 절단하는 단계, 및
3. 펩티드 PEP 로부터 C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기를 절단하는 단계 (이는 C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기에서의 HG 로부터의 펩티드 절단임),
4. 임의의 측쇄 PG 를 절단하는 단계;
가 상이한 반응 조건 하에 수행될 수 있어, 따라서 각각의 절단이 반응 순서에서의 적절한 시기에서 다른 절단과 별도로, 그리고 독립적으로 수행될 수 있는 방식으로 구축된다.
이러한 기능을 이루기 위해서, 반응 계획에 포함된 다양한 PG 의 화학적 성질 및 링커의 핸들기 HG 의 펩티드에 대한 연결의 화학적 성질은, 임의의 PG 가 이렇게 4 가지 유형의 PG 중 1 개에 속하고, 핸들기 HG 의 펩티드에 대한 연결이 이러한 반응 조건 하에 절단가능하고, 보호기의 이러한 그룹화 및 핸들기 HG 의 펩티드에 대한 연결 성질의 이러한 선택이 바람직하고 필요한 별개 및 단계적 절단을 가능하게 하는 방식으로 선택된다.
목적하는 펩티드 C-PEP 에 하나 이상의 측쇄 PG 가 존재하는 경우, 한 바람직한 구현예는 하기와 같다:
1. 임의의 측쇄 보호기가 강, 환원성 또는 혼합 유형 PG 이고;
2. 마지막 것을 제외하고 (즉, 펩티드 C-PEP 의 N-말단 아미노산의 N-말단 PG 를 제외하고) C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 아미노산의 임의의 N-말단 PG 가 염기성 유형 PG 이거나,
마지막 것을 제외하고 (즉, 펩티드 C-PEP 의 N-말단 아미노산의 N-말단 PG 를 제외하고) C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 아미노산의 임의의 N-말단 PG 가 염기성, 환원성 또는 혼합 유형 PG 이고 (임의의 측쇄 보호기가 환원성 또는 혼합 유형 PG 가 아닌 경우);
3. 임의의 측쇄 보호기 및 마지막 것을 제외하고 (즉, 펩티드 C-PEP 의 N-말단 아미노산의 N-말단 PG 를 제외하고) C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 아미노산의 임의의 N-말단 PG 가 환원성 또는 혼합 유형 PG 가 아닌 경우, PG2 가 약, 환원성 또는 혼합 유형 PG 이거나,
PG2 가 약 유형 PG 이고;
4. C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 마지막 아미노산의 N-말단 PG, 즉 펩티드 C-PEP 의 N-말단 아미노산의 N-말단 PG 가 염기성 또는 약 유형 PG 이거나,
펩티드 C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 마지막 아미노산의 N-말단 PG, 즉 펩티드 C-PEP 의 N-말단 아미노산의 N-말단 PG 가 염기성, 약, 환원성 또는 혼합 유형 PG 이고 (임의의 측쇄 보호기가 환원성 또는 혼합 유형 PG 가 아닌 경우);
5. PEP 또는 C-PEP 의 C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기가
강 절단 조건에서, 또는
강 또는 환원성 절단 조건에서 (C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 환원성 또는 혼합 유형 PG 가 아닌 경우), 또는
약 절단 조건에서 (C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 약 유형 PG 가 아닌 경우), 또는
약 1 절단 조건에서 (C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 약 유형 1 PG 가 아닌 경우)
펩티드 PEP 또는 C-PEP 로부터 절단가능함.
목적하는 펩티드 C-PEP 에 하나 이상의 측쇄 PG 가 존재하는 경우, 하나 이상의 바람직한 구현예는 하기와 같다:
1. 임의의 측쇄 보호기가 강 유형 PG 이고;
2. 마지막 것을 제외하고 (즉, 펩티드 C-PEP 의 N-말단 아미노산의 N-말단 PG 를 제외하고) C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 아미노산의 임의의 N-말단 PG 가 염기성 유형 PG 이고;
3. 임의의 측쇄 보호기 및 마지막 것을 제외하고 (즉, 펩티드 C-PEP 의 N-말단 아미노산의 N-말단 PG 를 제외하고) C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 아미노산의 임의의 N-말단 PG 가 환원성 또는 혼합 유형 PG 가 아닌 경우, PG2 가 약, 환원성 또는 혼합 유형 PG 이고;
4. C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 마지막 아미노산의 N-말단 PG, 즉 펩티드 C-PEP 의 N-말단 아미노산의 N-말단 PG 가 염기성, 약, 환원성 또는 혼합 유형 PG 이고 (임의의 측쇄 보호기가 환원성 또는 혼합 유형 PG 가 아닌 경우);
5. PEP 또는 C-PEP 의 C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기가
강 절단 조건에서, 또는
강 또는 환원성 절단 조건에서 (C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 환원성 또는 혼합 유형 PG 가 아닌 경우), 또는
약 절단 조건에서 (C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 약 유형 PG 가 아닌 경우), 또는
약 1 절단 조건에서 (C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 약 유형 1 PG 가 아닌 경우)
펩티드 PEP 또는 C-PEP 로부터 절단가능함.
목적하는 펩티드 C-PEP 에 하나 이상의 측쇄 PG 가 존재하는 경우, 또 다른 보다 바람직한 구현예는 하기와 같다:
1. 임의의 측쇄 보호기가 강, 환원성 또는 혼합 유형 PG 이고;
2. 마지막 것을 제외하고 (즉, 펩티드 C-PEP 의 N-말단 아미노산의 N-말단 PG 를 제외하고) C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 아미노산의 임의의 N-말단 PG 가 염기성 유형 PG 이고;
3. PG2 가 약 유형 PG 이고;
4. C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 마지막 아미노산의 N-말단 PG, 즉 펩티드 C-PEP 의 N-말단 아미노산의 N-말단 PG 가 염기성 또는 약 유형 PG 이고;
5. PEP 또는 C-PEP 의 C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기가
강 또는 환원성 절단 조건에서 (C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 환원성 또는 혼합 유형 PG 가 아닌 경우), 또는
약 1 절단 조건에서 (C-PEP 의 합성에서 SPPS 에서 사용한 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 약 유형 1 PG 가 아닌 경우)
펩티드 PEP 또는 C-PEP 로부터 절단가능함.
목적하는 펩티드 C-PEP 에 측쇄 PG 가 존재하지 않는 경우,
하나의 바람직한 구현예는 다음과 같다:
1. 마지막의 것을 제외하고는, 즉 펩티드 C-PEP 의 N-말단 아미노산의 N-말단 PG 를 제외하고는 C-PEP 의 합성에서 SPPS 에 사용된 아미노산의 임의의 N-말단 PG 를 제외한 C-PEP 의 합성에서 SPPS 에 사용된 아미노산의 임의의 N-말단 PG 가 염기성, 환원성 또는 혼합 유형 PG 인 것; 및
2. 마지막의 것을 제외하고는, 즉 펩티드 C-PEP 의 N-말단 아미노산의 N-말단 PG 를 제외하고는 C-PEP 의 합성에서 SPPS 에 사용된 아미노산의 임의의 N-말단 PG 가 환원성 또는 혼합 유형 PG 가 아닌 경우, PG2 가 강, 약, 환원성 또는 혼합 유형 PG 이거나,
PG2 가 강, 약 또는 혼합 유형 PG 이고;
3. C-PEP 의 합성에서 SPPS 에 사용된 마지막 아미노산의, 즉 펩티드 C-PEP 의 N-말단 아미노산의 N-말단 PG 가 염기성, 강, 약, 환원성 또는 혼합 유형 PG 이고;
4. C-PEP 의 합성에서 SPPS 에 사용된 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 강 유형 PG 가 아닌 경우, 강 절단 조건에서, 또는
C-PEP 의 합성에서 SPPS 에 사용된 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 강, 환원성 및 혼합 유형 PG 가 아닌 경우, 강 또는 환원성 절단 조건에서, 또는
C-PEP 의 합성에서 SPPS 에 사용된 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 강 또는 약 유형 PG 가 아닌 경우, 약 절단 조건에서, 또는
C-PEP 의 합성에서 SPPS 에 사용된 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 강 또는 약 1 유형 PG 가 아닌 경우, 약 1 절단 조건에서
PEP 또는 C-PEP 의 C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기가 펩티드 PEP 또는 C-PEP 로부터 절단가능함.
목적하는 펩티드 C-PEP 에 측쇄 PG 가 존재하지 않는 경우,
하나 이상의 바람직한 구현예는 다음과 같다:
1. 마지막의 것을 제외하고는, 즉 펩티드 C-PEP 의 N-말단 아미노산의 N-말단 PG 를 제외하고는 C-PEP 의 합성에서 SPPS 에 사용된 아미노산의 임의의 N-말단 PG 를 제외한 C-PEP 의 합성에서 SPPS 에 사용된 아미노산의 임의의 N-말단 PG 가 염기성 유형 PG 이고;
2. PG2 가 강, 약, 환원성 또는 혼합 유형 PG 인 이거나,
3. C-PEP 의 합성에서 SPPS 에 사용된 마지막 아미노산의, 즉 펩티드 C-PEP 의 N-말단 아미노산의 N-말단 PG 가 염기성, 강, 약, 환원성 또는 혼합 유형 PG 이고;
4. C-PEP 의 합성에서 SPPS 에 사용된 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 강 유형 PG 가 아닌 경우, 강 절단 조건에서, 또는
C-PEP 의 합성에서 SPPS 에 사용된 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 강, 환원성 및 혼합 유형 PG 가 아닌 경우, 강 또는 환원성 절단 조건에서, 또는
C-PEP 의 합성에서 SPPS 에 사용된 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 강 또는 약 유형 PG 가 아닌 경우, 약 절단 조건에서, 또는
C-PEP 의 합성에서 SPPS 에 사용된 아미노산의 임의의 N-말단 PG 및 PG2 가 강 또는 약 1 유형 PG 가 아닌 경우, 약 1 절단 조건에서
PEP 또는 C-PEP 의 C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기가 펩티드 PEP 또는 C-PEP 로부터 절단가능함.
본 발명의 대상은 펩티드 C-PEP 의 제조 방법(C-PEP) 이며;
C-PEP 는 펩티딜 라디칼 PEP-C 를 포함하고, 상기 PEP-C 의 C-말단은 보호기 DKP-PG 에 의해 보호되고, DKP-PG 는 핸들기 HG, 임의적으로는 스페이서기 SG, 및 디케토피페라진 잔기 DKP 를 포함하고;
SG 는 펩티드 화학에 통상 사용되는 스페이서기이고;
DKP 는 디펩티드 잔기 DPR 로부터 유래된 디케토피페라진 잔기이고;
DPR 은 알파 아미노산 잔기 Xaa1 및 Xaa2 를 포함하고;
Xaa1 은 DPR 의 C-말단 아미노산 잔기이고;
Xaa2 는 DPR 의 N-말단 아미노산 잔기이고, Xaa2 는 측쇄를 갖고, 상기 측쇄는 관능기 FG 에 의해 치환되고;
PEP-C 는 XaaC(1) 를 통해 HG 에 연결되고;
XaaC 는 PEP-C 의 아미노산 잔기이고;
XaaC(1) 에서의 지수 (1) 은 PEP-C 의 C-말단 위치를 나타내고;
XaaC(1) 는 PEP-C 의 C-말단 아미노산 잔기이고;
HG 는, 펩티드 내 2 개의 아미노산 잔기를 연결시키는 아미드 결합을 절단시키지 않는 조건 하에서 HG 로부터 C-말단을 절단시킬 수 있는, 펩티드의 C-말단을 고체 상에 연결시키기 위한 고체 상 펩티드 합성 SPPS 에 통상 사용되는 핸들기이고;
HG 는 FG 에 직접 연결되거나, 또는 SG 가 존재한다면, HG 는 SG 와 연결되고 SG 는 FG 와 연결되고;
방법(C-PEP) 는 단계 (iii) 을 포함하고;
단계 (iii) 은 반응(INRIFO) 을 포함하고;
반응(INRIFO) 은 펩티드 PEP-C-DKP-L-ResinA 에서 분자내 고리 형성 및 동시적 절단 반응을 포함하는 반응이고;
PEP-C-DKP-L-ResinA 는 C-PEP 의 전구체이고 PEP-C 및 수지 DKP-L-ResinA 를 포함하며, 여기서 PEP-C 는 DKP-L-ResinA 에 연결되고;
DKP-L-ResinA 는 ResinA 및 DKP-PG 형성 링커 DKP-L 을 포함하며, 여기서 ResinA 는 DKP-L 에 연결되고;
ResinA 는 SPPS 에서 고체 상으로서 통상 사용되는 수지이고,
DKP-L 은 HG, 임의적으로 SG, 및 DPR 을 포함하며, 여기서 Xaa1 의 카르복실산기인 DPR 의 C-말단 카르복실산기는 ResinA 에 연결되고;
반응(INRIFO) 에서 분자내 고리 형성은, Xaa2 의 알파 아미노기인 DPR 의 N-말단 아미노기와, DPR 의 C-말단 카르복실산기와의 반응이며, 이에 의해 DKP 이 형성되고, 이에 의해 Xaa1 이 ResinA 로부터 동시에 절단되고 DKP-PG 가 형성되고;
HG 는 HG 와 XaaC(1) 간의 결합이 반응(INRIFO) 시 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택된다.
HG 의 사용에 의해, 펩티드 내 2 개의 아미노산 사이의 어떠한 아미드 결합도 절단시키는 일 없이 선택적으로 절단될 수 있는 XaaC(1) 와 ResinA 사이의 절단 부위가 제공되고; 상기 절단 부위는 XaaC(1) 와 HG 사이의 결합이다. 이러한 절단에 의해, XaaC(1) 의 C-말단은 HG 의 화학적 성질에 따라 비보호된 자유 카르복실산기의 형태로 자유로워지거나, 또는 C-말단 카르복실산기는 아미드기 형태로, 바람직하게는 C(0)NH2 로서 자유로워진다.
HG 의 사용에 의해, C-말단 보호기를 포함하는 이러한 특정 DKP 는 통상 펩티드 화합에 사용되는 C-말단 보호기로서 작용한다.
바람직하게는, PEP-C 는 고체 상 펩티드 합성 SPPS(PEP-C) 에 의한 반응(INRIFO) 이전에 제조되며, 보다 바람직하게는 SPPS(PEP-C) 는 고체 상으로서 DKP-L-ResinA 를 사용한다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은 방법(C-PEP) (여기서 방법(C-PEP) 은 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같음) 으로서, 여기서 PEP-C 는 단계 (iii) 이전에 고체 상 펩티드 합성 SPPS(PEP-C) 에 의해 제조되고, 보다 바람직하게는 SPPS(PEP-C) 는 고체 상으로서 DKP-L-ResinA 를 사용한다. SPPS(PEP-C) 에서, PEP-C 는 XaaC 를 연속적으로, 우선 고체 상에, 그 후 성장 펩티드 사슬에 커플링함으로써 구축된다. 각종 XaaC 는 개별적으로 및 순차적으로 커플링되지만, 그 중 2 개 이상은 또한 예컨대 디펩티드, 트리펩티드 또는 올리고펩티드로서 고체 상에 또는 성장 펩티드 사슬에 커플링될 수 있다.
ResinA 는 ResinA 와 Xaa1 사이의 결합이 SPPS(PEP-C) 동안 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택된다.
바람직하게는, SPPS(PEP-C) 는 추가로 단계 (i) 및 단계 (ii) 를 포함하며;
단계 (i) 에서 XaaC(1) 은 DKP-L-ResinA 에 부착되고;
단계 (ii) 에서, PEP-C 의 서열에 따른 추가의 아미노산 XaaC 는
연속적으로 SPPS(PEP-C) 에 의해 처음에는 XaaC(1) 에 및 그 후 성장 펩티딜 사슬의 N-말단에 연결되며, DKP-L 을 통해 ResinA 에 결합된다;
HG 는 HG 와 XaaC(1) 사이의 결합이 SPPS(PEP-C) 동안 절단되지 않도록; 및
HG 및 XaaC(1) 사이의 결합이 반응(INRIFO) 동안 절단되지 않도록;
하는 방식으로 선택되고;
여기서 C-PEP, ResinA, DKP-PG, HG, SG, DPR, DKP, Xaa1, XaaC(1), XaaC, PEP-C, SC-PG, 반응(INRIFO) 은 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같고;
PEP-C, HG, SG 및 DPR 및 ResinA 사이의 연결성은 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같다.
반응(INRIFO) 이전에, Xaa2 의 알파 아미노기인 DPR 의 N-말단은 보호기 PG2 에 의해 보호된다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은 방법(C-PEP) (여기서 방법(C-PEP) 은 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같음) 으로서, 단계 (iii) 는 보호기 PG2 의 절단을 포함하고;
PG2 는 펩티트 화학에 통상 사용되는 N-말단 보호기이고, 염기성 절단가능한 유형 보호기, 산 절단가능한 유형 보호기 및 환원성 절단가능한 유형 보호기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
PG2 는 단계 (iii) 에서 반응(INRIFO) 이전에 Xaa2 로부터 절단된다.
바람직하게는, PG2 는 SPPS(PEP-C) 이후 Xaa2 로부터 절단된다.
바람직하게는, PG2 는 단계 (ii) 에서 PEP-C 의 N-말단 아미노산 잔기의 첨가 이후 Xaa2 로부터 절단된다.
Xaa2 로부터의 PG2 의 절단 및 반응(INRIFO) 은 연속적으로 또는 동시적으로 일어날 수 있다.
PG2 는 PG2 와 Xaa2 간의 결합이 SPPS(PEP-C) 동안 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택된다.
PG2 및 HG 는 HG 와 XaaC(1) 간의 결합이 Xaa2 로부터의 PG2 의 절단시 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택된다.
C-PEP 또는 PEP-C 의 임의의 측쇄는 보호기 SG-PG 에 의해 C-PEP 또는 PEP-C 의 임의의 다른 측쇄로부터 독립적으로 보호될 수 있고, 하나 초과의 SC-PG 가 C-PEP 또는 PEP-C 에 존재하는 경우, 이들 SC-PG 는 서로 독립적으로 동일 또는 상이하다. 임의의 SC-PG 는 SPPS 동안 또는 HSPPS 동안 펩티드의 아미노산 잔기의 측쇄를 보호하기 위한 또는 아미노산의 측쇄를 보호하기 위한 펩티드 화학에 통상 사용되는 보호기이다.
바람직하게는, 임의의 SC-PG 는 SPPS(PEP-C) 동안 어떠한 SC-PG 도 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택된다.
바람직하게는, 임의의 SC-PG 는 반응(INRIFO) 동안 어떠한 SC-PG 도 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택된다.
바람직하게는, PG2 및 보호기 SC-PG 는 Xaa2 로부터 PG2 의 절단시 어떠한 SC-PG 도 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택된다.
복잡한 설명을 회피하기 위해, 약어 XaaC 는 합성 PEP-C 및 C-PEP 에 사용된 아미노산에 대해 사용되거나, 또는 PEP-C 및 C-PEP, 또는 PEP-N 의 아미노산 잔기에 각각 사용되며; 마찬가지로 XaaN 은 합성 PEP-N 에 사용된 아미노산에 대해 사용되거나, 또는 PEP-N 의 아미노산 잔기에 대해 사용된다.
따라서 이들 약어는 아미노산과 아미노산 잔기를 구별하지 않는다. 당업자는 아미노산 또는 아미노산 잔기를 의미하는지를 문맥으로부터 모호하지 않게 구별할 수 있다.
연결성을 다음과 같이 요약한다:
PEP-C 는 XaaC(1) 를 통해 HG 에 연결된다.
HG 는 FG 를 통해 Xaa2 에 직접 연결되거나, 또는 SG 가 존재할 경우, HG 는 SG 와 연결되고 SG 는 FG 를 통해 Xaa2 와 연결된다.
Xaa2 는 펩티드 결합을 통해 Xaa1 와 연결되고, Xaa2 는 DPR 에서 N-말단이고 Xaa1 은 C-말단 아미노산이다.
PEP-C-DKP-L-ResinA 에서, Xaa1 의 카르복실산기는 ResinA 에 연결된다.
ResinA 는 SPPS (PEP-C) 동안 ResinA 와 Xaa1 간의 결합이 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택된다.
HG 는 반응(INRIFO) 동안 HG 와 XaaC(1) 간의 결합이 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택된다.
HG 는 SPPS(PEP-C) 동안 HG 와 XaaC(1) 간의 결합이 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택된다.
PG2 는 SPPS(PEP-C) 동안 PG2 와 Xaa2 간의 결합이 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택된다.
PG2 및 HG 는 Xaa2 로부터의 PG2 의 절단시 HG 와 XaaC(1) 간의 결합이 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택된다.
바람직하게는, 임의의 SC-PG 는 SPPS(PEP-C) 동안 어떠한 SC-PG 도 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택된다.
바람직하게는, 임의의 SC-PG 는 반응(INRIFO) 동안 어떠한 SC-PG 도 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택된다.
바람직하게는, PG2 및 임의의 보호기 SC-PG 는 Xaa2 로부터의 PG2 의 절단시 어떠한 SC-PG 도 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택된다.
바람직하게는, C-PEP 는 PEP-C 이고, 그의 C-말단은 DKP-PG 에 의해 보호된다.
바람직하게는, DPR 은 아미노산 잔기 Xaa1 및 Xaa2 로 이루어진다.
Xaa1 및 Xaa2 는 반응(INRIFO) 에 의해 DKP 의 형성을 가능하게 하는 방식으로 선택된다.
바람직하게는, C-PEP 의 임의의 측쇄는 보호기 SC-PG 에 의해 보호된다.
임의의 SC-PG 가 C-PEP 에 존재하는 경우, 바람직하게는 HG 는 HG,, 및 그에 의해 DKP-PG 가, SC-PG, 바람직하게는 모든 SC-PG 들을 절단하는 반응에서 동시에 XaaC(1) 로부터 절단되는 방식으로 선택된다.
바람직하게는, SC-PG 는 염기성 절단가능한 유형 보호기, 산 절단가능한 유형 보호기 및 환원성 절단가능한 유형 보호기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, 임의의 SC-PG 는 강 유형 PG 이다.
바람직하게는, FG 는, HG 또는 SG 에 연결된 경우, 연결기 CG 로서 존재한다.
바람직하게는, FG 는 COOH, NH2, OH 및 SH 로 이루어진 군, 보다 바람직하게는 NH2 및 OH 로 이루어진 군으로부터 선택되며; 따라서 CG 는 바람직하게는 -C(0)0-, -N(H)-, -O- 및 -S- 로 이루어진 군, 보다 바람직하게는 -N(H)- 및 -0- 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
HG 와 FG 간의 결합, 또는 SG 가 DKP-PG 에 존재할 경우, HG 와 SG 간의 결합 및 SG 와 FG 간의 결합은,
그들이 SPPS (PEP-C) 동안 절단되지 않고; 및
그들이 반응(INRIFO), 단계 (i), 단계 (ii) 또는 단계 (iii) 동안 절단되지 않고; 바람직하게는 그들이 또한 임의의 보호기의 임의의 절단시 절단되지 않는
화학적 성질로 된 것이 선택된다.
바람직하게는, HG 와 FG 간의 결합, 또는 SG 가 DKP-PG 에 존재할 경우, HG 와 SG 간의 결합 및 SG 와 FG 와의 결합은 아미드 또는 에스테르 결합, 보다 바람직하게는 아미드 결합이다. 특히, 이들 결합은 펩티드 내 2 개의 아미노산 잔기 사이의 종래의 아미드 결합과 유사한 성질 또는 안정성을 갖는 것이다.
C-PEP 의 N-말단은 보호기 N-PG 에 의해 보호될 수 있고, N-PG 는 펩티드 화학에 통상 사용되는 N-말단 보호기이다.
바람직하게는, N-PG 는 염기성 절단가능한 유형 보호기, 산 절단가능한 유형 보호기 및 환원성 절단가능한 유형 보호기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
따라서, C-PEP 는 N-말단 비보호된 구현예 및 PEP-C 의 N-말단이 N-PG 에 의해 보호되어 있는 구현예를 모두 포함한다.
본 발명의 추가의 대상은 C-PEP 의 제조 방법(C-PEP) 으로서, 고체 상 펩티드 합성 SPPS(PEP-C) 및 후속 반응(INRIFO) 을 포함하는 단계 (i), (ii) 및 (iii) 를 특징으로 하고;
SPPS(PEP-C) 는 고체 지지체로서의 수지 DKP-L-ResinA 에 대해 행해지고,
DKP-L-ResinA 는 ResinA 로서, 이는 관능기로서 DKP-PG 형성 링커 DKP-L 을 갖고,
DKP-L 은 HG, 임의적으로는 SG, 및 DPR 을 포함하며, 여기서 DPR 의 Xaa1 은 그의 C-말단 카르복실산기를 통해 ResinA 에 연결되고,
반응(INRIFO) 은 DPR 의 N-말단 아미노기와 DPR 의 C-말단 카르복실산기의 분자내 고리 형성 반응이며, 이에 의해 DKP 를 형성하고;
반응(INRIFO) 에 의해 Xaa1 은 ResinA 로부터 동시에 절단되고, DKP-PG 가 형성되고;
단계 (i) 에서 XaaC(1) 은 DKP-L-ResinA 에 부착되고;
단계 (ii) 에서 PEP-C 의 서열에 따른 추가의 아미노산 XaaC 는 연속적으로 SPPS(PEP-C) 에 의해 처음에는 XaaC(1) 에, 그 후 성장 펩티드 사슬의 N-말단에 연결되어, DKP-L 을 통해 ResinA 에 연결되고;
단계 (ii) 에서 PEP-C 의 N-말단 아미노산 잔기의 첨가 후 행해진 단계 (iii) 에서, C-PEP 는 반응(INRIFO) 에 의해 형성되고,
ResinA 는 SPPS(PEP-C) 동안 ResinA 와 Xaa1 간의 결합이 절단되지 않도록 하는 방식으로 선택되고;
HG 는 SPPS(PEP-C) 동안 HG 와 XaaC(1) 간의 결합이 절단되지 않도록; 및
반응(INRIFO) 동안 HG and XaaC(1) 간의 결합이 절단되지 않도록
하는 방식으로 선택되고;
C-PEP 의 측쇄를 보호하는 임의의 SC-PG 는 SPPS(PEP-C) 동안 SC-PG 가 절단되지 않도록; 및
반응(INRIFO) 동안 SC-PG 가 절단되지 않도록
하는 방식으로 선택되고;
여기서 C-PEP, ResinA, DKP-PG, HG, SG, DPR, DKP, Xaa1, XaaC(1), XaaC, PEP-C, SC-PG, 반응(INRIFO) 은 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같고;
PEP-C, HG, SG 및 DPR 및 ResinA 사이의 연결성은 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 추가의 대상은 DKP-PG 형성 링커 DKP-L 의 제조 방법(DKP-L) 이고,
방법(DKP-L) 은 단계 (DKP-L-i), 단계 (DKP-L-iii) 및 임의적으로는 단계 (DKP- L-ii) 를 포함하고;
단계 (DKP-L-i) 에서 Xaa2 는 Xaa1 에 커플링되고;
임의적인 단계 (DKP-L-ii) 에서 SG 는, SG 가 DKP-L 에 존재할 경우 Xaa2 에 커플링되고;
단계 (DKP-L-iii) 에서 HG 는, SG 가 DKP-L 에 존재할 경우에는 SG 에 커플링되거나, 또는 Xaa2 에 커플링되고;
여기서 DKP-PG, DKP-L, DKP, Xaa2, Xaa1, HG and SG 는 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같다.
단계 (DKP-L-i), (DKP-L-iii) 및 임의적인 단계 (DKP-L-ii) 는 임의의 순서로 행해질 수 있다.
바람직하게는 우선 단계 (DKP-L-i) 가 행해지고, 그 후 SG 가 DKP-L 에 존재할 경우 임의적인 단계 (DKP-L-ii) 가 행해지고, 마지막 단계로서 단계 (DKP-L-iii) 가 행해진다.
본 발명의 추가의 대상은 DKP-L-ResinA 의 제조 방법(DKP-L-ResinA) 이고,
방법(DKP-L-ResinA) 은 방법(X1) 또는 방법(X2) 이고;
방법(X1) 은 단계 (X1-i), 단계 (X1 -ii), 단계 (X1-iv) 및 임의적으로 단계 (X1-iii) 를 포함하고;
단계 (X1-i) 에서 아미노산 Xaa1 은 ResinA 에 커플링되고;
단계 (X1-ii) 에서 아미노산 Xaa2 는 Xaa1 에 커플링되고;
임의적인 단계 (X1-iii) 에서 SG 는, SG 가 DKP-L-ResinA 에 존재할 경우 Xaa2 의 측쇄에 커플링되고;
단계 (X1-iv) 에서 HG 는 SG 가 DKP-L-ResinA 에 존재할 경우 SG 에 커플링되거나 또는 Xaa2 에 커플링되고;
방법(X2) 은 단계 (X2-i) 를 포함하고;
단계 (X2-i) 에서 DPK-L 은 ResinA 에 커플링되고;
여기서 DKP-L-ResinA, ResinA, DKP-PG, DKP-L, DKP, Xaa2, Xaa1 , HG 및 SG 은 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같다.
방법(X1) 에서, 단계 (X1-i), (X1-ii), (X1-iv) 및 임의적인 단계 (X1-iii) 는 임의의 순서로 행해질 수 있다.
바람직하게는, 우선 단계 (X1-i), 그 후 단계 (XI-ii) 가 행해지고, 그 후 SG 가 DKP-L-ResinA 에 존재하는 경우 임의적인 단계 (XI-iii) 가 행해지고, 마지막 단계로서 단계 (X1-iv) 가 행해진다.
HG, 임의의 SG, Xaa2 및 Xaa1 은, 방법(DKP-L-ResinA) 에서 또는 방법(DKP-L) 에서 빌딩 블록으로서 사용되는 경우, 보호기를 지닐 수 있다.
방법(X1) 또는 방법(DKP-L) 에서 빌딩 블록으로서 사용된, Xaa1 은, 종래 C-말단 보호된 아미노산으로서 사용되고, 상기 보호기는 보호기 C-PG 이다. Xaa1 의 알파 아미노기는 비보호되어 있으며 각각의 커플링 반응에서의 커플링 부위이다.
방법(X1) 또는 방법(DKP-L) 에서 빌딩 블록으로서 사용된, Xaa2 는, 종래 N-말단 보호된 아미노산으로서 사용되고, 상기 보호기는 보호기 N-PG 이다. Xaa2 의 1-카르복실산기는 비보호되어 있으며 각각의 커플링 반응에서의 커플링 부위이다.
Xaa1 또는 Xaa2 의 임의의 측쇄는 바람직하게는 또한 SC-PG 에 의해 보호된다.
C-PG 는 아미노산의 카르복실산기를 보호하기 위해 또는 펩티드의 C-말단을 보호하기 위해 펩티드 화학에 통상 사용되는 보호기이다.
바람직하게는, C-PG 는 염기성 절단가능한 유형 보호기, 산 절단가능한 유형 보호기 및 환원성 절단가능한 유형 보호기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
각각의 커플링 반응에서 개별적인 빌딩 블록의 형태인 각각의 HG 및 SG 는, 2 개 이상의 반응성 관능기를 가진다. 첫번째 반응성 관능기는 펩티드 합성에서 아미노산 빌딩 블록의 알파 아미노기를 닮은 관능기로서 사용되고, 적합한 보호기에 의해, 바람직하게는 보호기 N-PG 에 의해 보호될 수 있고; 바람직하게는, 이 관능기는 OH 또는 NH2 이고 -O- 또는 -N(H)- 로서 보호된 상태로 존재한다.
HG 및 SG 의 다른 반응성 관능기는 펩티드 합성에서 아미노산 빌딩 블록의 카르복실산기를 닮은 관능기로서 사용되고, 통상 비보호되어 있으며 각각의 커플링 반응에서 커플링 부위이다. 바람직하게는, 이 비보호된 부위는 카르복실산기이다. 이 커플링 반응 후, 첫번째 반응성 관능기의 보호기, 바람직하게는 상기 N-PG 는, 이 첫번째 반응기가 다음 커플링 반응에 이용가능하도록 하기 위해 절단될 수 있다.
방법(DKP-L) 에 의해 수득가능한, DKP-PG 형성 링커 DKP-L 은, 통상, 방법(X2) 에서 ResinA 에의 커플링에 사용가능하도록 하기 위해 HG 의 임의의 보호기를 여전히 지닌다. 방법(X2) 에서의 커플링 이전에, Xaa1 의 C-PG 는 절단되어 나가야 한다. 바람직하게는 방법(DKP-L) 은 Xaa1 로부터의 이러한 C-PG 의 절단을 포함한다. 따라서, DKP-L 은, 한 구현예가 Xaa1 상의 보호기 C-PG 를 갖는 것이고 다른 구현예가 Xaa1 상의 보호기 C-PG 를 갖지 않는 것인 두 구현예를 모두 포함한다.
DKP-L-ResinA 에서, HG 는 여전히 DKP-L-ResinA 를 제조하는데 사용된 빌딩 블록 HG 에 존재하는 보호기를 지닐 수 있다. HG 상의 임의의 보호기는 방법(C-PEP) 에서 단계 (i) 이전에 절단되어 나가야 한다. 바람직하게는, 방법(DKP-L-ResinA) 은 HG 로부터의 임의의 보호기의 이러한 절단을 포함한다. 따라서, DKP-L-ResinA 는 하나가 HG 상의 임의의 보호기를 갖는 것이고 다른 것이 Xaa1 상의 C-PG 를 갖지 않는 것인 두 구현예를 모두 포함한다.
본 발명의 추가의 대상은 펩티드 PEP 의 제조 방법(PEP-HSPPS) 이고,
상기 방법(PEP-HSPPS) 은 단계 (i-pep) 및 단계 (ii-pep) 를 포함하고,
단계 (i-pep) 에서 펩티드 C-PEP 는 방법(C-PEP) 에 따라 제조되고; 그 다음
단계 (ii-pep) 에서, 단계 (i-PEP) 에서 수득한 C-PEP 는 N-말단 보호된 아미노산과, 또는 N-말단 보호된 펩티드 PEP-N 와 균질 용액 상 펩티드 합성 HSPPS 에 의해 커플링되고;
여기서 방법(C-PEP), C-PEP 및 PEP-N 는 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같다.
방법(PEP-HSPPS) 은 추가의 단계 (ii-pep) 를 포함하는 방법(C-PEP) 이다.
PEP-N 의 임의의 측쇄는 보호기 SC-PG 에 의해 PEP-N 의 임의의 다른 측쇄로부터 독립적으로 보호되고, 하나 초과의 SC-PG 가 PEP-N 에 존재하는 경우, 이들 SC-PG 는 서로 독립적으로 동일 또는 상이하고; 여기서 SC-PG 는 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같다.
방법(PEP-HSPPS) 에서 C-PEP 는 N-말단 비보호되어 사용된다. 따라서, C-PEP 의 N-말단을 보호하는 임의의 보호기 N-PG 는 방법(PEP-HSPPS) 의 커플링 반응 이전에 절단된다. 이 절단 반응은 바람직하게는 방법(C-PEP) 에 포함된다. PEP-C 가 SPPS(PEP-C) 에 의해 만들어지기 때문에, SPPS(C-PEP) 에서 사용된 PEP-C 의 N-말단 아미노산은 통상 그의 알파 아미노기 상의 보호된 아미노기 N-PG 와 함께 사용된다. PEP-C 의 N-말단의 이 보호기 N-PG 의 성질에 따라서, 이 N-PG 는 반응(INRIFO) 에서 고리 형성의 조건 하에 동시에 N-말단으로부터 절단될 수 있거나, 또는 반응(INRIFO) 이전에 Xaa2 로부터 PG2 의 절단과 동시에 N-말단으로부터 절단될 수 있다.
본 발명의 추가의 대상은 이하의 방법이다:
1. 방법(C-PEP) 의 DKP-L-ResinA 가 방법(DKP-L-ResinA) 에 의해 제조된, 방법(PEP-HSPPS);
2. 방법(C-PEP) 의 DKP-L-ResinA 가 방법(DKP-L-ResinA) 의 방법(X1) 에 의해 제조된, 방법(PEP-HSPPS);
3. 방법(C-PEP) 의 DKP-L-ResinA 가 방법(DKP-L-ResinA) 의 방법(X2) 에 의해 제조되고;
방법(DKP-L-ResinA) 의 DKP-L 이 방법(DKP-L) 에 의해 제조된, 방법(PEP-HSPPS);
4. DKP-L-ResinA 가 방법(DKP-L-ResinA) 에 의해 제조된, 방법(C-PEP);
5. DKP-L-ResinA 가 방법(DKP-L-ResinA) 의 방법(X1) 에 의해 제조된 방법(C-PEP);
6. DKP-L-ResinA 가 방법(DKP-L-ResinA) 의 방법(X2) 에 의해 제조되고;
방법(DKP-L-ResinA) 의 DKP-L 이 방법(DKP-L) 에 의해 제조된, 방법(C-PEP).
본 발명의 추가의 대상은 C-PEP, PEP-C-DKP-L-ResinA, DKP-L-ResinA 및 DKP-L 로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이며, 여기서 C-PEP, PEP-C-DKP-L-ResinA, DKP-L-ResinA 및 DKP-L 은 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 추가의 대상은 N-말단 보호된 아미노산과 또는 N-말단 보호된 펩티드 PEP-N 과의 C-PEP 의 커플링 반응에 의한 펩티드 PEP 의 제조를 위한 균질 용액 상 펩티드 합성 HSPPS 에서의 C-PEP 의 용도이며, 여기서 C-PEP 는 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 추가의 대상은
펩티드 화학에서; 또는
펩티드의 제조를 위한; 또는
펩티드의 제조 방법에서; 또는
펩티드의 제조 방법의 단계에서; 또는
펩티드 커플링 반응에서; 또는
펩티드의 제조를 위한 SPPS 에서; 또는
펩티드의 제조를 위한 HSPPS 에서의,
C-PEP, PEP-C-DKP-L-ResinA, DKP-L-ResinA 및 DKP-L 로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물의 용도; 또는 DKP-PG 형성 링커로서의 DKP-L 의 용도이며, 여기서 C-PEP, PEP-C-DKP-L-ResinA, DKP-L-ResinA, DKP-L 및 DKP-PG 는 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 이하의 구현예 중 어느 것이든 여기에 기재된 본 발명의 구현예에 포함된다.
본 발명의 추가의 대상은, 보호기 PGIII 에 의해 N-말단 보호된 아미노산의, 또는 N-말단 보호된 펩티드 단편 PEP-N (여기서 N-말단 보호된 펩티드 단편 PEP-N 은 식 (III-PEP-N-PG):
의 화합물임) 의, 식 (III-H):
의 화합물과의, 균질 용액 상 커플링에 의한 식 (III-PEP-PG):
의 화합물의 제조 방법(A) 이다.
HG 는 펩티드의 C-말단을 고체 상에 연결시키기 위한 고체 상 펩티드 합성 SPPS 에 통상 사용되는 핸들기이며, 이에 의해, 펩티드 내 2 개의 아미노산 잔기를 연결시키는 아미드 결합을 절단시키지 않는 조건 하에서 HG 로부터의 C-말단의 절단이 가능하고;
n 은 0 또는 1 이고;
SG 는 펩티드 화학에 통상 사용되는 스페이서기이고;
Xaa1 은 알파 아미노산 잔기이고;
Xaa2 는 2-(C1-5 알킬)-알파 아미노산 잔기이고, C1-5 알킬기는 관능기 FG 에 의해 치환되고, FG 는 NH2, OH, SH 및 COOH 로 이루어진 군으로부터 선택되고; FG 는 n 이 1 인 경우 SG 와 결합되고; FG 는 n 이 0 인 경우 HG 와 결합되고, 따라서 FG 는 -N(H)-, -0-, -S- 및 -C(0)0- 로 이루어진 군으로부터 선택된 연결기 CG 로서 식 (III-PEP-PG) 의 화합물에 존재하고;
PEP-C 는 식 (XaaC(ipc))pc 의 펩티딜 라디칼이고;
식 (III-H) 에서 (1) 로 나타낸 수소 H 는 PEP-C 의 비보호된 N-말단의 수소이고;
XaaC 는 펩티딜 라디칼 PEP-C 의 아미노산 잔기이고;
XaaC(ipc) 에서, (ipc) 는, PEP-C 의 C-말단으로부터 위치를 카운팅하기 시작하여 위치 ipc 에서의 PEP-C 의 XaaC 의 지수를 나타내고,
pmax 는 502 이고;
pc 는 2 내지 (pmax-2) 의 정수로서 PEP-C 내 아미노산 잔기의 전체 개수를 나타내고;
ipc 는 1 내지 pc 의 정수이고;
식 (III-PEP-PG) 및 (III-PEP-N-PG) 에서의 PGIII 는 동일하며 펩티드 화학에 통상 사용되는 N-말단 보호기이고;
PEP 는 식 (XaaP(ip))p 의 펩티딜 라디칼이고;
pn 은 2 내지 (pmax-pc) 의 정수로서 PEP-N 내 아미노산 잔기의 전체 개수를 나타내고;
p 는 pc + pn 이고;
XaaN 은 펩티드 단편 PEP-N 의 아미노산 잔기이고;
XaaN(ipn) 에서, (ipn) 은 PEP-N 의 C-말단으로부터 위치를 카운팅하기 시작하여 위치 ipn 에서의 PEP-N 의 XaaN 의 지수를 나타내고;
XaaP 는 아미노산 잔기이고;
XaaP(ip) 에서, (ip) 는 PEP 의 C-말단으로부터 위치를 카운팅하기 시작하여 위치 ip 에서의 PEP 의 XaaP 의 지수를 나타내고;
ipn 은 1 내지 pn 의 정수이고;
ip 는 1 내지 p 의 정수이고;
단, XaaP(ip) 는, 1 내지 ipc 의 값을 갖는 ip 의 경우 XaaC(ipc) 와 동일하고;
XaaP(ip) 는, 값 (pc + ipn) 을 갖는 ip 의 경우 XaaN(ipn) 과 동일하고;
여기서 pmax, pc, XaaC, XaaC(ipc), ipc 및 식 (III-H) 의 화합물은 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같고;
식 (III-H) 에서의 XaaC, 및 XaaN 은 서로 독립적으로 동일 또는 상이하다.
따라서, PEP-C 는 pc 개의 아미노산 잔기 XaaC 를 갖는 펩티딜 라디칼이다.
바람직하게는, Xaa1 의 알파 아미노기가 펩티드 결합에 의해 Xaa2 의 1-카르복시기에 커플링된다.
식 (III-H) 의 화합물은 상기 정의된 C-PEP 의 구현예이다.
HG, SG, Xaa2 및 Xaa1 은 상기 정의된 펩티드 C-PEP 의 각각의 HG, SG, Xaa2 및 Xaa1 의 구현예이다.
예컨대 식 (III-H) 에서의 시클릭 디펩티드는 상기 언급한 DKP, 즉 DPR 로부터 유래된 디케토피페라진 잔기의 한 구현예이다.
바람직하게는, PEP-C 는 SPPS 에 의해 제조된다.
PEP-C 가 제조되는 SPPS 는, 상기에서 SPPS(PEP-C) 라 칭한다.
바람직하게는, PEP-C 는 식 PGXaaC(ipc) - XaaC(ipc) - OH 의 아미노산을 이용한 SPPS 에 의해 합성된 식 (XaaC(ipc))pc 의 펩티딜 라디칼이다.
PGXaaC 는 SPPS 에 통상 사용되는 N-말단 보호기이며 염기성 절단가능한 유형 보호기, 산 절단가능한 유형 보호기 및 환원성 유형 절단가능한 보호기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
PGXaaC(ipc) 에서, 지수 (ipc) 는 PGXaaC(ipc) 를 아미노산 PGXaaC(ipc)-XaaC(ipc)-OH 의 보호기로서 한정하며, 이때 각 PGXaaC(ipc) 는 서로 독립적으로 또 다른 PGXaaC(ipc) 와 동일 또는 상이하다.
바람직하게는, PGXaaC 및 PGXaaC(ipc) 는 각각, PEP-C 를 합성하기 위한 각각 SPPS 에서 사용된 임의의 아미노산 PGXaaC-XaaC-OH 및 PGXaaC(ipc)-XaaC(ipc)-OH 의 알파 아미노기를 보호하기 위해, SPPS 에 통상 사용되는 N-말단 보호기이다.
복잡한 설명을 회피하기 위해, 명세서 내 약어 PGXaaC 는 SPPS 동안 각종 단계에서 PEP-C 및 C-PEP 의 N-말단 아미노산 잔기의 N-말단 보호기에 사용되거나, 또는 PEP-C 및 C-PEP 를 합성하는데 사용되는 아미노산의 아미노기의 보호기에 대해 사용된다. 당업자는 두 의미 중 어느 것을 의미하는지를 문맥으로부터 모호하지 않게 구별할 수 있다.
따라서, PEP-N 은 pn 개의 아미노산 잔기 XaaN 를 갖는 펩티딜 라디칼이다.
따라서, PEP 는 p 개의 아미노산 잔기 XaaP 를 갖는 펩티딜 라디칼이다.
예컨대 식 (III-PEP-PG) 에서 나타나는 식 (III-res):
의 잔기는 상기 언급한 DKP-PG 의 구현예이고;
여기서 HG, SG, n, Xaa2 및 Xaa1 는 상기 정의한 바와 같고;
여기서 Xaa2 및 Xaa1 는 상기 언급한 DKP 를 형성하고;
여기서 (8) 은 펩티딜 라디칼 PEP-C 와 HG 간의 결합을 나타낸다.
식 (III-PEP-PG) 의 화합물은 상기 정의된 펩티드 PEP 의 구현예이며 또한 상기 정의된 C-PEP 의 구현예일 수 있다.
PEP-N 은 SPPS 에 의한, HSPPS 에 의한, 또는 SPPS 와 HSPPS 의 조합에 의한, 바람직하게는 SPPS 에 의한 종래의 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.
식 (III-PEP-PG) 의 화합물이 다음 단편 C-PEP 로서 다음 단편 PEP-N 과의 방법(A) 에 따른 다음의 HSPPS 커플링에 사용되어야만 하는 경우, 식 (III-PEP-PG) 의 상기 화합물의 N-말단 보호기 PGIII 만이 제거되어, 방법(A) 에 따른 상기 다음 HSPPS 커플링을 위해 상기 다음 단편 C-PEP 에, 즉 식 (III-H) 의 다음 화합물에 제공될 필요가 있다.
식 (III-H) 의 화합물과 PEP-N 은 모두 그의 제조 단계 중 하나에서 그 자체가 방법(A) 에 의해 제조되었기 때문에, 용액 상 커플링이 여전히 적당한 시간 안에 이루어지는 한 사실상 임의의 개수의 아미노산을 가질 수 있다.
바람직하게는, pmax 는 500, 보다 바람직하게는 pmax 는 400 또는 402, 보다 더 바람직하게는 300 또는 302, 특히 200 또는 202, 보다 특히 150 또는 152, 보다 더 특히 100 또는 102, 구체적으로 80 또는 82, 보다 구체적으로 50 또는 52, 보다 더 구체적으로 25 또는 27 이다.
바람직하게는, 펩티딜 라디칼 PEP-C 는 선형 펩티딜 라디칼이고, 바람직하게는 PEP-N 은 선형 펩티드로서, 선형 펩티딜 라디칼 PEP 를 제공한다.
바람직하게는, 식 (III-H) 의 화합물 내 PEP-C 및/또는 PEP-N 이 SPPS 를 이용해 제조된 경우, 이들은 서로 독립적으로 2 내지 100, 보다 바람직하게는 2 내지 50, 보다 더 바람직하게는 2 내지 40, 특히 바람직하게는 2 내지 25 개의 아미노산 잔기를 가진다.
바람직하게는, 식 (III-H) 의 화합물 내 PEP-C 및/또는 PEP-N 이 HSPPS 를 이용해 제조된 경우, 이들은 서로 독립적으로 2 내지 250, 보다 바람직하게는 2 내지 200, 보다 더 바람직하게는 2 내지 100, 특히 바람직하게는 2 내지 50, 구체적으로 2 내지 25 개의 아미노산 잔기를 가진다.
펩티딜 라디칼 PEP-C 및 PEP-N 의 개별적인 아미노산 잔기의 측쇄 상의 임의의 관능기는 서로 독립적으로 보호기 SC-PG 들에 의해 보호되거나 또는 비보호되고;
바람직하게는, 펩티딜 라디칼 PEP-C 및 PEP-N 의 개별적인 아미노산 잔기의 측쇄 상의 모든 관능기는 보호기 SC-PG 들에 의해 보호되거나 또는 비보호되고;
보다 바람직하게는, 펩티딜 라디칼 PEP-C 및 PEP-N 의 개별적인 아미노산 잔기의 측쇄 상의 모든 관능기는 식 (III-H) 의 화합물과의 단편 PEP-N 의 방법(A) 에 따른 용액 상 커플링 도중 보호되고,
보다 더 바람직하게는, 펩티딜 라디칼 PEP-C 및 PEP-N 의 개별적인 아미노산 잔기의 측쇄 상의 모든 관능기는 강 유형 PG 에 의해 보호된다.
바람직하게는, 펩티딜 라디칼 PEP 또는 PEP-C 의 C 말단 또는, C-말단 아미노산 잔기가 측쇄를 갖는 경우, C-말단 아미노산 잔기의 측쇄는 각각 HG 에 결합되고;
보다 바람직하게는, 펩티딜 라디칼 PEP 또는 PEP-C 의 C 말단은 각각 HG 에 결합된다.
바람직하게는,
HG 는, SPPS 에 의해 합성되는 펩티드의 C-말단 아미노산 잔기가 될 것인, 아미노산을 상기 HG 를 통해 고체 상에, 바람직하게는 ResinA 에 연결시키기 위한 고체 상 펩티드 합성 SPPS 에 통상 사용되는 핸들기이다.
HG 는 펩티드 내 2 개의 아미노산 잔기를 연결시키는 아미드 결합을 절단하지 않는 조건 하에서 HG 로부터 C-말단 아미노산 잔기의 절단을 가능하게 한다.
보다 바람직하게는,
HG 는 식 (HGF-I) 의 핸들기, 식 (HGF-II) 의 핸들기, 식 (HGF-III) 의 핸들기, 식 (HGF-IV) 의 핸들기, 식 (HGF-V) 의 핸들기 및 식 (HGF-VI) 의 핸들기로 이루어진 군으로부터 선택되는 핸들기이다.
식 중,
(*) 는 각각의 펩티딜 라디칼의, 예컨대 식 (III-PEP-PG) 에 대한 PEP 의, 식 (III-H) 에 대한 PEP-C 의, 또는 방법(C-PEP) 에서의 PEP-C 의 C 말단의 C 원자와, HG 사이의 결합을 나타내거나, 또는
각각의 펩티딜 라디칼의, 예컨대 식 (III-PEP-PG) 에 대한 PEP 의, 식 (III-H) 에 대한 PEP-C 의, 또는 방법(C-PEP) 에서의 PEP-C 의 C-말단 아미노산 잔기가, 측쇄를 갖고 이 측쇄를 통해 HG 와 연결되는 경우, 각각의 펩티딜 라디칼의, 예컨대 식 (III-PEP-PG) 에 대한 PEP 의, 식 (III-H) 에 대한 PEP-C 의, 또는 방법(C-PEP) 에서의 PEP-C 의 C-말단 아미노산 잔기의 측쇄와, HG 사이의 결합을 나타내고,
(**) 는 n 이 1 인 경우 HG 와 SG 간의 결합을 나타내거나, 또는 n 이 0 인 경우 HG 와 FG 간의 결합을 나타내고, 여기서 SG 및 FG 는 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같고;
R1, R2, R3, R4, R10 및 R11 은 동일 또는 상이하며 서로 독립적으로 수소 및 O-C1-4 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고,
s1-1, s2, s3, s4 및 s6 은 동일 또는 상이하며 서로 독립적으로 1, 2, 3 및 4 로 이루어진 군으로부터 선택되고,
s5-1 은 0, 1, 2, 3 또는 4 이고,
s1-2, s5-2 및 s5-3 은 동일 또는 상이하며 서로 독립적으로 0 또는 1 이고,
T1-1 은 O 또는 NH 이고,
T1-2 및 T5-1 은 O 이고,
여기서 n, SG, FG, PEP-C 및 방법(C-PEP) 은 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같다.
바람직하게는,
(*) 는 각각의 펩티딜 라디칼의, 예컨대 식 (III-PEP-PG) 에 대한 PEP 의, 식 (III-H) 에 대한 PEP-C 의, 또는 방법(C-PEP) 에서의 PEP-C 의 C 말단의 C 원자와, HG 사이의 결합을 나타낸다.
바람직하게는,
SG 는 바람직하게는 하나 이상, 보다 바람직하게는 1 내지 500 개의 에틸렌옥시드 단위를 포함하는, SPPS 에 통상 사용되는 스페이서기이다.
보다 바람직하게는
SG 는 식 (SG-I) 의 스페이서기, 식 (SG-II) 의 스페이서기, 식 (SG-III) 의 스페이서기, 식 (SG-IV) 의 스페이서기 및 식 (SG-V) 의 스페이서기로 이루어진 군으로부터 선택되는 스페이서기이다.
m1 , m5, m6, m7, m9, m10, m11 및 m12 는 동일 또는 상이하며 서로 독립적으로 1 내지 500 의 정수이고;
m2, m3 및 m4 는 동일 또는 상이하며 서로 독립적으로 1, 2, 3 또는 4 이고,
(***) 는 n 이 1 인 경우 SG 에서 HG 로의 결합이고,
(****) 는 n 이 1 인 경우 SG 와 Xaa2 간의 결합이다.
(***) 는 n 이 1 인 경우 HG 의 각각의 구현예에서 (**) 에 의해 나타낸 결합이다.
(****) 는 n 이 1 인 경우 SG 와 FG 간의 결합이고;
여기서 HG, Xaa2 및 n 은 또한 모든 그의 바람직한 구현예와 함께 상기에서 정의한 바와 같다.
바람직하게는, XaaC 및 XaaN 은 알파 아미노산 잔기이다.
보다 바람직하게는, XaaC 및 XaaN 은 자연 발생의 알파 아미노산 잔기이다.
XaaC 또는 XaaN 이 관능기를 갖는 측쇄를 갖는 경우, XaaC 또는 XaaN 의 측쇄의 이러한 관능기는 보호되거나 또는 비보호되고, 바람직하게는 보호된다.
보다 바람직하게는, XaaC 및 XaaN 은 동일 또는 상이하며 서로 독립적으로 Ala, Aib, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Asp, Asn, Glu 및 Gln 으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기서 측쇄 중의 임의의 관능기는 보호되거나 또는 비보호되고, 바람직하게는 보호된다.
바람직하게는, PGIII 은 염기성 유형 PG, 강 유형 PG, 약 유형 PG 및 환원성 유형 PG 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
펩티딜 라디칼 PEP-C 및 PEP-N 의 개개의 아미노산 잔기의 측쇄 상의 모든 관능기가 강산 절단가능한 유형 보호기에 의해 보호된다면, 및 식 (III-PEP-PG) 의 화합물이 다음 단편 C-PEP 로서 다음 단편 PEP-N 과의 방법(A) 에 따른 다음의 HSPPS 커플링에 사용되어야만 하는 경우, PGIII 은 바람직하게는 염기성 유형 PG, 약 유형 PG 및 환원성 유형 PG 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
식 (HGF-I) 의 핸들기 및 식 (HGF-IV) 의 핸들기는 강 절단 조건에 의해 PEP-C 로부터 절단가능하고,
식 (HGF-II) 의 핸들기는 강 절단 조건에 의해 절단가능하고,
식 (HGF-III) 의 핸들기는 약 또는 강 절단 조건에 의해 절단가능하고,
식 (HGF-V) 의 핸들기는 환원성 절단 조건에 의해 절단가능하고,
식 (HGF-VI) 의 핸들기는 약 또는 강 절단 조건에 의해 절단가능하다.
바람직하게는, HG 는 식 (HGF-I) 의 핸들기, 식 (HGF-IV) 의 핸들기 및 식 (HGF-VI) 의 핸들기로 이루어진 군으로부터 선택되는 핸들기이다.
바람직하게는, R1, R2, R3, R4, R10 및 R11 은 동일 또는 상이하며 서로 독립적으로 수소 및 0-CH3 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는, R1 및 R2 는 동일 또는 상이하며 수소 및 0-CH3 으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게는 R3, R4, R10 및 R11 은 0-CH3 이다.
바람직하게는, s1-1 및 s6 은 1 이다.
바람직하게는, s1-2, s5-1, s5-2 및 s5-3 은 서로 독립적으로 0 또는 1 이다.
바람직하게는, s2 및 s3 은 4 이다.
바람직하게는, s4 는 1 또는 2 이다.
바람직하게는, T1-1 은 NH 이고, s1-1 은 1 이고, s1-2 는 1 이다.
바람직하게는, T1-1 은 O 이고, s1-1 은 1 이고, s1-2 는 0 이다.
바람직하게는, T1-1 은 O 이고, s1-1 은 1 이고, s1-2 는 1 이다.
특히, HG 는
식 (HG-Ia) 의 핸들기, 식 (HG-Ib) 의 핸들기, 식 (HG-Ic) 의 핸들기, (HG-Id) 의 핸들기, 식 (HG-II) 의 핸들기, 식 (HG-III) 의 핸들기, 식 (HG-IVa) 의 핸들기, 식 (HG-IVb) 의 핸들기, 식 (HG-Va) 의 핸들기, 식 (HG-Vb) 의 핸들기 및 식 (HG-VI) 의 핸들기로 이루어진 군으로부터 선택되는 핸들기이다:
[식 중,
(*) 는 상기 및 이의 바람직한 구현예에서 정의된 바와 같고,
(**) 는 상기 및 이의 바람직한 구현예에서 정의된 바와 같음].
더욱 특히, HG 는 식 (HG-Ia) 의 핸들기, 식 (HG-Ib) 의 핸들기, 식 (HG-Ic) 의 핸들기, 식 (HG-Id) 의 핸들기, 식 (HG-IVa) 의 핸들기, 식 (HG-IVb) 의 핸들기, 및 식 (HG-VI) 의 핸들기로 이루어진 군으로부터 선택된 핸들기이다.
보다 더욱 특히, HG 는 식 (HG-Ia) 의 핸들기, 식 (HG-IVa) 의 핸들기, 또는 식 (HG-VI) 의 핸들기이다.
각종 핸들기들 HG 은 공지된 핸들기이거나, 또는 공지된 핸들기의 구조적으로 밀접한 유도체이다. 이들 핸들기 HG 중 임의의 것을 각 핸들기 HG 에 연결된 펩티딜 라디칼에서 절단하는데 필요한 반응 조건도 또한 펩티드 화학에 있어서 공지되어 있다.
식 (HG-Ia) 의 핸들기는 Rink 아미드 핸들로부터, (HG-Ib), (HG-Ic) 및 (HG-Id) 는 벤즈히드릴 핸들로부터, (HG-II) 는 PAL 핸들로부터, (HG-III) 는 Sieber 핸들로부터, (HG-IVa) 는 HMPA(-Wang) 핸들로부터, (HG-IVb) 는 HMPP(-Wang) 핸들로부터, 및 (HG-Va) 및 (HG-Vb) 은 알릴 핸들로부터, (HG-VI) 는 Ramage 핸들로부터 유래된다.
바람직하게, m1, m5, m6, m7, m9, m10, m11 및 m12 는 동일 또는 상이하고, 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 이고;
더욱 바람직하게, m1, m5, m6, m7, m9, m10, m11 및 m12 는 동일 또는 상이하고, 서로 독립적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 23 또는 27 이고;
보다 더욱 바람직하게, m1, m5, m6, m7, m10, m11 및 m12 는 동일 또는 상이하고, 서로 독립적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이고; m9 는 4, 8, 12 또는 27 이고;
특히, m1 은 3; m5 는 1 또는 2; m6 및 m7 은 2; m9 는 4, 8, 12 또는 27; m10 은 1; m11 은 3 이다.
Xaa1 은 바람직하게 비-자연 발생적 알파 아미노산, 자연 발생적 알파 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
더욱 바람직하게는, 자연 발생적 알파 아미노산 잔기, 알파-N-메틸아미노산 잔기, L-Hpr 잔기, D-Hpr 잔기, DL-Hpr 잔기, 2-(C1-5-알킬)-D-아미노산 잔기, 2-(C1-5-알킬)-L-아미노산 잔기, 2-(C1-5-알킬)-DL-아미노산 잔기 및 하기 식 (HypX) 의 화합물로부터 유래된 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
[식 중,
X 는 O, S 또는 C(R13)R14 이고;
R5, R7, R12, R13 및 R14 는 동일 또는 상이하고, 서로 독립적으로 수소, C1-4 알킬 및 0-R8 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R8 은 펩티드 화학에서 측쇄 보호화에 통상 사용되는 보호기, 또는 하기 식 (Sub-R8) 의 치환기임:
{식 중,
m8 은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이고;
R9 는 C1 -4 알킬임}].
바람직하게,
X 는 C(R13)R14 이고;
R5, R7, R12 및 R14 는 수소이고;
R13 은 O-R8 이고;
R8 은 펩티드 화학에서 측쇄 보호화에 통상 사용되는 보호기이다.
알파-N-메틸아미노산 잔기는 바람직하게 L-알파-N-메틸아미노산 잔기, D-알파-N-메틸아미노산 잔기 및 DL-알파-N-메틸아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
더욱 바람직하게는, N-메틸글리신 잔기 (사르코신), L-N-메틸페닐알라닌 잔기, D-N-메틸페닐알라닌 잔기, DL-N-메틸페닐알라닌 잔기, L-N-메틸알라닌 잔기, D-N-메틸알라닌 잔기, DL-N-메틸알라닌 잔기, L-N-메틸발린 잔기, D-N-메틸발린 잔기, DL-N-메틸발린 잔기, L-N-메틸트립토판 잔기, D-N-메틸트립토판 잔기, DL-N-메틸트립토판 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
자연 발생적 알파 아미노산 잔기는 바람직하게 Pro 잔기 및 Gly 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고; 더욱 바람직하게는, L-Pro 잔기, D-Pro 잔기, DL-Pro 잔기 및 Gly 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게, 식 (HypX) 의 화합물은 L-Hyp, D-Hyp 또는 DL-Hyp 로부터 유래되고, 더욱 바람직하게는 L-4Hyp, D-4Hyp 또는 DL-4Hyp 로부터 유래된다.
특히, Xaal 은 L-N-메틸글리신 잔기, D-N-메틸글리신 잔기, DL-N-메틸글리신 잔기, L-N-메틸페닐알라닌 잔기, D-N-메틸페닐알라닌 잔기, DL-N-메틸페닐알라닌 잔기, L-Pro 잔기, D-Pro 잔기, DL-Pro 잔기, 측쇄 보호화 L-Hyp 잔기, 측쇄 보호화 D-Hyp 잔기, 측쇄 보호화 DL-Hyp 잔기, L-Hpr 잔기, D-Hpr 잔기 및 DL-Hpr 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고; 이때, Hyp 는 바람직하게 4Hyp 이다.
더욱 특히, Xaa1 은 L-N-메틸페닐알라닌 잔기, D-N- 메틸페닐알라닌 잔기, DL-N- 메틸페닐알라닌 잔기, L-Pro 잔기, D-Pro 잔기, DL-Pro 잔기, 측쇄 보호화 L-Hyp 잔기, 측쇄 보호화 D-Hyp 잔기, 측쇄 보호화 DL-Hyp 잔기이고; 이때, Hyp 는 바람직하게 4Hyp 이다.
보다 더욱 특히, Xaa1 은 D-Pro 잔기, D-N- 메틸페닐알라닌 잔기 또는 측쇄 보호화 D-Hyp 잔기이고; 이때, Hyp 는 바람직하게 4Hyp 이다.
FG 는 SG 의 각 구현예에서 n 이 1 인 경우, 결합 (***) 을 통해 SG 와 결합되거나, 또는 FG 는 HG 의 각 구현예에서 결합 (**) 을 통해 HG 에 결합된다.
바람직하게, Xaa2 는 L-Lys 잔기, D-Lys 잔기, DL-Lys 잔기, L-Orn 잔기, D-Orn 잔기, DL-Orn 잔기, L-4-아미노프롤린 잔기, D-4-아미노프롤린 잔기, DL-4-아미노프롤린 잔기, L-알파,감마-디아미노-부탄산 잔기, D-알파,감마-디아미노부탄산 잔기, DL-알파,감마-디아미노-부탄산 잔기, L-알파,베타-디아미노프로판산 잔기, D-알파,베타-디아미노-프로판산 잔기, DL-알파,베타-디아미노프로판산 잔기, L-Ser 잔기, D-Ser 잔기, DL-Ser 잔기, L-Thr 잔기, D-Thr 잔기, DL-Thr 잔기, L-Cys 잔기, D-Cys 잔기, DL-Cys 잔기, L-호모시스테인 잔기, D-호모시스테인 잔기, DL-호모시스테인 잔기, L-Asp 잔기, D-Asp 잔기, DL-Asp 잔기, L-Glu 잔기, D- Glu 잔기 및 DL- Glu 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게 FG 는 NH2 또는 OH, 더욱 바람직하게 NH2 이고; 그리하여, CG 는 바람직하게 -N(H)- 또는 -O-, 더욱 바람직하게 -N(H)- 이고; 따라서 Xaa2 는 그에 따라 선택되는 것이 바람직하다.
더욱 바람직하게, Xaa2 는 L-Lys 잔기, D-Lys 잔기, DL-Lys 잔기, L-알파,베타-디아미노-프로판산 잔기, D-알파,베타-디아미노-프로판산 잔기 및 DL-알파,베타-디아미노-프로판산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 더욱 바람직하게, Xaa2 는 L-Lys 잔기 또는 L-알파,베타-디아미노-프로판산 잔기이다.
바람직한 구현예는, Xaa2 가 L-알파 아미노산 잔기이고, Xaa1 는 D-알파 아미노산 잔기이거나, 또는 대안적으로 Xaa2 는 D- 이고 Xaa1 는 L-알파-아미노산 잔기이며, 이때 Xaa1 및 Xaa2 는 상기에서 및 이의 바람직한 구현예에서 정의된 바와 같은 것인 조합이다.
더욱 바람직하게, Xaa1 는 L-Pro 잔기, D-Pro 잔기, DL-Pro 잔기, L-N-메틸페닐알라닌 잔기, D-N- 메틸페닐알라닌 잔기 및 DL-N- 메틸페닐알라닌 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및 Xaa2 는 L-Lys 잔기, D-Lys 잔기, DL-Lys, L-알파,베타-디아미노-프로판산 잔기, D-알파,베타-디아미노-프로판산 잔기 및 DL-알파,베타-디아미노-프로판산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 더욱 바람직하게, Xaa1 는 D-Pro 또는 D-N- 메틸페닐알라닌 잔기이고, Xaa2 는 L-Lys 또는 L-알파,베타-디아미노-프로판산 잔기이거나; 또는 Xaa1 는 L-Pro 또는 L-N- 메틸페닐알라닌 잔기이고, Xaa2 는 D-Lys 또는 D-알파,베타-디아미노-프로판산 잔기이다.
특히, Xaa2 는 L- 배치이고, Xaa1 는 D-배치이며, 이때 Xaa1 및 Xaa2 는 상기 및 이의 바람직한 구현예에서 정의된 바와 같다.
더욱 특히, Xaa1 는 D-Pro 또는 D-N- 메틸페닐알라닌 잔기이고, Xaa2 는 L-Lys 또는 L-알파,베타-디아미노-프로판산 잔기이다.
방법 (A) 에서, 균질 용액 상 커플링, 즉 HSPPS 는 HSPPS 에 전형적인 시약 및 통상의 프로세스 매개변수를 이용하여 수행된다.
HSPPS 는 용매 중에서 하나 이상의 커플링 시약을 이용하여 통상적으로 수행되고, 바람직하게는 하나 이상의 커플링 부가제의 존재 하에서, 바람직하게 하나 이상의 3가 염기의 존재 하에서 수행된다.
HSPPS 에 사용된 바람직한 커플링 시약은 포스포늄 또는 오로늄 염 및 카르보디이미드 커플링 시약이다.
포스포늄 및 우로늄 염은 바람직하게 벤조트리아졸의 유도체이고; 더욱 바람직하게는 포스포늄 및 우로늄 염은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
BOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸 아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트),
PyBOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트),
HBTU (O-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트),
HCTU (O-(1H-6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3- 테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트),
TCTU (O-(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트),
HATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트),
TATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트),
TBTU (O-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라-메틸우로늄 테트라플루오로보레이트),
TOTU (O-[시아노(에톡시카르보닐)메틸렌아미노]-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트),
HAPyU (O-(벤조트리아졸-1-일)옥시비스-(피롤리디노)-우로늄 헥사플루오로포스페이트,
PyAOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트),
COMU (1-[(1-(시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)-디메틸아미노-모르폴리노메틸렌)] 메탄아미늄헥사플루오로포스페이트),
PyClock (6-클로로-벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트),
PyOxP (O-[(1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴)아미노]-옥시트리(피롤리딘-1-일) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트) 및
PyOxB (O-[(1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴)아미노]-옥시트리(피롤리딘-1-일) 포스포늄 테트라플루오로보레이트).
카르보디이미드 커플링 시약은 바람직하게 디이소프로필-카르보디이미드 (DIC), 디시클로헥실-카르보디이미드 (DCC) 및 수용성 카르보디이미드 (WSCDI), 예컨대 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보-디이미드 (EDC) 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
기타 커플링 기법은 미리-형성된 활성 에스테르, 예컨대 히드록시숙신이미드 (HOSu) 및 p-니트로페놀 (HONp) 에스테르, 미리 형성된 대칭 무수물, 비대칭 무수물, 예컨대 N-카르복시안히드리드 (NCAs) 및 산 할라이드, 예컨대 아실 플루오라이드 또는 아실 클로라이드를 이용한다.
바람직한 커플링 시약은 포스포늄 또는 우로늄 커플링 시약, 특히 TCTU, TOTU 또는 PyBop 이다.
바람직하게, HSPPS 에 사용된 상기 3 차 염기의 컨쥬게이션된 산은 pKa 값이 7.5 내지 15, 더욱 바람직하게 7.5 내지 10 이다. 상기 3 차 염기는 바람직하게 트리알킬아민, 예컨대 디이소프로필에틸아민 (DIEA) 또는 트리에틸아민 (TEA), 나아가 N,N'-디-C1-4 알킬아닐린, 예컨대 N,N-디에틸아닐린, 2,4,6-트리-C1-4 알킬피리딘, 예컨대 콜리딘 (2,4,6-트리메틸피리딘), 또는 N-C1-4 알킬-모르폴린, 예컨대 N-메틸모르폴린으로, 이때, 임의의 C1-4 알킬은 동일 또는 상이하고, 서로 독립적으로 선형 또는 분지형 C1-4 알킬이다.
커플링 부가제는 활성화 에스테르를 형성할 수 있는 친핵성 히드록시 화합물이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 산성, 친핵성 N-히드록시 관능기를 갖는 것으로, 이때 N 은 이미드이거나 또는 N-아실 또는 N-아릴 치환된 트리아제노이고, 이때 트레아제노 유형 커플링 부가제는 바람직하게 N-히드록시-벤조트리아졸 유도체 (또는 1-히드록시-벤조트리아졸 유도체) 또는 N-히드록시벤조트리아진 유도체이다. 이러한 커플링 부가제는 WO 94/07910 및 EP 410 182 에 기재되어 있다. 이들은 또한 스캐빈져로서 작용하기 때문에, 스캐빈져로도 불리운다.
바람직한 커플링 부가제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
N-히드록시-숙신이미드 (HOSu), 6-클로로-1-히드록시-벤조트리아졸 (Cl-HOBt), N-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HOOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt), 1-히드록시-벤조트리아졸 (HOBt) 및
에틸 2-시아노-2-히드록시이미노-아세테이트 (CHA).
CHA 는 상표명 OXYMAPURE® 로 입수가능하다. CHA 는 유효한 스캐빈져로 입증되어져 있는데, 그 이유는 벤조트리아졸-기재 스캐빈져와 견주어 라세미화가 더욱 억제되기 때문이다. 게다가, CHA 는 예를 들어 HOBt 또는 Cl-HOBt 보다 폭발성이 덜하므로, 이의 취급이 유리하며, 추가 장점으로, 반응 혼합물의 색 변화에 의해 커플링 진행이 시작적으로 모니터링될 수 있다는 점이 있다.
바람직하게, HOBt 또는 CHA, 더욱 바람직하게 HOBt 이 사용된다.
바람직한 구현예에서, HSPPS 반응에서의 시약들의 조합은 TCTU/Cl-HOBt/DIPEA, TOTU/CHA/DIPEA 및 PyBop/HOBt/DIPEA 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용매로서, 반응물을 용해할 수 있는 임의의 불활성 액체 용매가 HSPPS 에 사용될 수 있다.
바람직한 용매는 디메틸 술폭시드 (DMSO), 디옥산, 테트라히드로푸란 (THF), 1-메틸-2-피롤리돈 (NMP), N,N-디메틸포름아미드 (DMF), N,N-디메틸아세트아미드 (DMA), 피리딘, 디클로로메탄 (DCM), 디클로로에탄 (DCE), 클로로포름, 디옥산, 테트라히드로피란, 에틸 아세테이트, 톨루엔, 아세토니트릴 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더욱 바람직한 용매는 NMP, DMF 및 그 혼합물이다.
바람직하게, HSPPS 는 0 내지 50℃, 더욱 바람직하게 5 내지 30℃, 보다 더욱 바람직하게 15 내지 25℃ 의 온도에서 수행된다.
바람직하게, HSPPS 는 대기압에서 수행된다.
바람직하게, HSPPS 의 반응 시간은 15 분 내지 20 시간, 더욱 바람직하게 30 분 내지 5 시간, 보다 더욱 바람직하게 30 분 내지 2 시간이다.
HSPPS 의 반응 조건의 상기 기술에서 용어 "부"란, 달리 지시되지 않는 한, 조합된 펩티드 물질의 중량부 인자를 의미한다.
바람직하게, 1 내지 30 부, 더욱 바람직하게 5 내지 10 부의 용매가 사용된다.
바람직하게, 0.9 내지 5 mol 당량, 더욱 바람직하게 1 내지 1.5 mol 당량의 커플링 시약이 사용되며, 이때 mol 당량은 반응성 C-말단 카르복시기의 mol 을 기준으로 한다.
바람직하게, 0.1 내지 5 mol 당량, 더욱 바람직하게 0.5 내지 1.5 mol 당량의 커플링 부가제가 사용되며, 이때 mol 당량은 커플링 시약 mol 기준이다.
바람직하게, 1 내지 10 mol 당량, 더욱 바람직하게 2 내지 3 mol 당량의 3차 염기가 사용되며, 이때 mol 당량은 커플링 시약 mol 기준이다.
방법 (A) 에 따라 제조된 N-말단 및 C-말단 보호화 PEP 가 목표 펩티드를 나타내는 경우, N-말단 보호기 및 C-말단 보호기 및 임의의 측쇄 보호기가 방법 (A) 에 따른 제조법 후 제거되어 비보호화 펩티드 PEP 를 제공하는 것이 바람직하다. 이것은 통상 전반적인 탈보호화로 지칭된다.
적용되야 할 전반적인 탈보호화 조건은 선택된 PG 의 성질에 좌우된다. 바람직하게, 관련 PG 는, PG 의 성질에 따라, 상기에서 정의된 바와 같이 약, 강 또는 환원성 절단 조건 하에서 전반적인 탈보호화가 가능하게 되게 선택된다.
PEP 의 C-말단 보호기, 즉 DKP-PG 는 펩티딜 라디칼에서 각 핸들기 HG 를 절단하기에 적당한 조건에 의해 절단될 수 있고, 이들 조건은 펩티드 화학에서 공지되어 있다. 통상, 상기 조건은 상기에서 정의된 바, 환원성, 약 또는 강 절단 조건이다.
바람직하게, 핸들기 HG 는 산성 조건 하 펩티딜 라디칼 PEP 에서부터 절단가능하게 선택되고, 이 경우, 단편 PEP-N의 N-말단 보호기가 염기성 절단가능 보호기 또는 환원성 절단가능 보호기인 경우, N-말단 보호기 및 C-말단 보호기 및 임의의 측쇄 보호기는 2 단계로 방법 (A) 에 따른 제조 후 제거되는 것이 바람직하나; 그러나, 단편 PEP-N 의 N-말단 보호기가 산성 유형 제거가능 보호기인 경우, N-말단 보호기 및 C-말단 보호기 및 임의의 측쇄 보호기는 1 단계로 방법(A) 에 따른 제조 후 제거되는 것이 바람직하다.
임의의 측쇄 보호기는 통상 HSPPS 의 종료 때까지 보유된다. 상기 탈보호화 반응은 사용되어진 바 있는 각종 측쇄 보호기에 적용되는 조건 하에서 실시될 수 있고, 이들 조건은 펩티드 화학에 공지되어 있다. 상이한 유형의 측쇄 보호기가 선택되는 경우에는, 이들은 연속해서 절단될 수 있다. 유리하게는, 측쇄 보호들은 동시에, 더욱 유리하게는 PEP 의 N-말단 보호기와 수반되어 절단되도록 선택된다.
통상, 측쇄 PG 는 상기 정의된 바 강, 약 또는 환원성 절단 조건에 의해 절단된다.
본 발명의 추가 대상은, 식 (III-H) 의 화합물의 펩티드 PEP 의 제조를 위한 용도 (A) (이때, 식 (III-H) 의 화합물은 상기 및 이의 바람직한 구현예에서 정의된 바와 같음) 이고;
바람직하게는, 식 (III-H) 의 화합물의 N-말단 보호화 아미노산 또는 N-말단 보호화 PEP-N (이때, PEP-N 은 상기 및 그 바람직한 구현예에서 정의된 바와 같음) 와의 커플링 반응에 의한 펩티드 PEP 의 제조를 위한 균질 용액 상 펩티드 합성에서, 식 (III-H) 의 화합물 (이때, 식 (III-H) 의 화합물은 상기 및 이의 바람직한 구현예에서 정의된 바와 같음) 의 용도 (A) 이다.
용도 (A) 는 HSPPS 에서 C-PEP 의 상기 정의된 용도의 구현예이다.
본 발명의 추가 대상은, 보호기 PGXaaC(pc) 를 하기 식 (III-PGXaaC(pc)) 에서 절단시키는 것을 특징으로 하는, 식 (III-H) 의 화합물 (식 (III-H) 의 화합물은 상기 및 이의 바람직한 구현예에서 정의된 바와 같음) 의 제조 방법 (B) 이다:
[식 중,
PGXaaC 는 SPPS 에 통상 사용된 N-말단 보호기로, 염기성 절단가능 보호기, 산성 절단가능 보호기 및 환원전 절단가능 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
pc, XaaC, PEP-C, HG, n, SG, Xaa1 및 Xaa2 는 상기 및 이의 바람직한 구현예에서 정의된 바와 같고;
PGXaaC(pc) 에서, 지수 (pc) 는 PEP-C 의 N-말단 보호기로서 PGXaaC(pc) 를 정의하고;
단, PGXaaC(pc) 가 HG 로부터 PEP-C 를 절단하지 않은 채 PEP-C 에서 절단될 수 있는 절단가능 보호기 중에서 선택됨].
바람직하게, PEP-C 가 측쇄 PG 를 갖는 경우, PEP-C 로부터 임의의 측쇄 PG 를 절단하지 않은 채 PEP-C 로부터 PGXaaC(pc) 를 절단할 수 있도록 PGXaaC(pc) 는 절단가능 보호기에서 선택된다.
이에 따라, PGXaaC(pc) 는 N-PG 의 구현인 PEP-C 의 N-말단 아미노산 잔기의 보호기이다.
방법(B) 는 상기 정의된 방법 (C-PEP) 에 포함된다.
식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물은 상기 정의된 C-PEP 의 구현이다.
PGXaaC(pc) 이 염기성 유형 PG 인 경우, 이는 바람직하게 Fmoc 이다.
PGXaaC(pc) 이 강 유형 PG 인 경우, 이는 바람직하게 Boc 이다.
PGXaaC(pc) 이 약 유형 PG 인 경우, 이는 바람직하게 Trt 이다.
PGXaaC(pc) 이 환원성 유형 PG 인 경우, 이는 바람직하게 Alloc 이다.
PGXaaC( pc ) 은 이의 유형에 따라, 강, 약, 염기성 또는 환원성 절단 조건에 의해 절단되고, 이들 조건은 상기에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 추가 대상은 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물 (이때, 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물은 상기 및 이의 바람직한 구현예에서 정의된 바와 같음)의 제조 방법 (C) 로, 상기 방법 (C) 는 연속적인 단계 a) 및 b) 를 포함하며,
이때,
단계 a) 에서, 보호기 PG2 가 하기 식 (II-PG2) 의 화합물:
[식 중,
PGXaaC(pc), PGXaaC, pc, PEP-C, HG, n, SG, Xaa1 및 Xaa2 는 상기에서 및 이의 바람직한 구현예에서와 동일한 정의를 갖고;
PG2 는 펩티드 화학에서 통상 사용된 N-말단 보호기이며, 염기성 절단가능 보호기, 산성 절단가능 보호기 및 환원성 절단가능 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Xaa2 의 알파 아미노기는 PG2 에 의해 보호되고,
ResinA 는 SPPS 내 고체 상으로서 통상 사용된 수지이고;
Xaa1 의 1-카르복시기는 ResinA 의 관능기에 커플링됨]
에서 절단되어, 하기 식 (II-H) 의 화합물이 제공되고:
[식 중,
PGXaaC(pc), PGXaaC, pc, PEP-C, HG, n, SG, Xaa1, Xaa2 및 ResinA 는 상기 및 이의 바람직한 구현예에서와 동일한 정의를 갖고;
(2) 로 표시된 수소 H 는 아미노산 잔기 Xaa2 의 비보호화 알파 아미노기의 수소임];
단, PG2 는 PEP-C 를 HG 에서부터 절단하지 않고 Xaa2 로부터 PG2 가 절단될 수 있도록 절단가능 보호기의 것에서 선택되며,
단계 b) 에서, 식 (II-H) 의 화합물의 Xaa2 의 알파 아미노기와 Xaa1 의 카르복실기 사이에서, 분자내 고리 형성 반응 (INRIFO) 에 의해, Xaa1 로부터 ResinA 가 절단되며, 이때 반응 (INRIFO) 는 Xaa1 및 Xaa2 의 시클릭 디펩티드를 형성해 식 (III-PGXaaC( pc )) 의 화합물을 제공하고;
단, ResinA 및 Xaa1 간 연결은, PEP-C 를 HG 에서부터 절단하지 않은 채 상기 반응 (INRIFO) 에 의해 ResinA 가 Xaa1 으로부터 절단될 수 있는 절단 조건 하에서 절단가능할 수 있게 선택된다.
이는, PEP-C 를 HG 에서부터 절단하지 않은 채 PG 가 절단될 수 있게 하는, Xaa2 에서부터 PG2 를 절단하는데 필요한 절단 조건과는 상이한 절단 조건 하에서 절단될 수 있게 HG 가 선택되고, PG2 가 절단가능 보호기의 것중에서 선택되는 것을 의미하고;
이는 또한,
HG 에서 PEP-C 를 절단하지 않으면서 반응 (INRIFO) 에 의해 ResinA 가 Xaa1 으로부터 절단될 수 있는 절단 조건 하에서 절단되도록, ResinA 과 Xaa1 간 연결이 선택, 즉 ResinA 가 선택되는 것을 의미한다.
바람직하게, PEP-C 가 측쇄 PG 를 갖는 경우, PG2 는 PEP-C 에서 임의의 측쇄 PG 를 절단하지 않으면서 Xaa2 에서부터 PG 를 절단할 수 있도록 하는 절단가능 보호기의 것에서 선택된다.
바람직하게, PEP-C 가 측쇄 PG 를 갖는 경우, ResinA 와 Xaa1 간 연결은, PEP-C 에서 임의의 측쇄 PG 를 절단하지 않으면서 반응 (INRIFO) 에 의해 Xaa1 으로부터 ResinA 를 절단할 수 있는 절단가능 보호기의 것에서 선택된다.
식 (II-PG2) 의 화합물은 상기 정의된 PEP-C-DKP-L-ResinA 의 구현이다.
예를 들어, 식 (II-H) 에서 디펩티드는 DKP, 즉 디켑토피페라진 잔기를 형성하는 상술된 DPR 의 한 구현이다.
PGXaaC(pc) 및 PG2 는 상이한 보호기일 수 있으며, 이는 상이한 반응 조건 하에서 절단되고, 이 경우, PEP-C 의 N-말단의 탈보호화 및 Xaa2 의 탈보호화, 즉 방법(B) 및 방법(C) 가 연속해서 수행된다.
그러나, 바람직하게 PGXaaC(pc) 및 PG2 는 상동의 보호기이거나, 또는 적어도 동일한 반응 조건 하에서 절단가능한 상이한 보호기이며; 이 경우, PEP-C 의 N-말단의 탈보호화 및 Xaa2 의 탈보호화; 즉 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물으로부터 PGXaaC(pc) 의 절단 (즉, 방법 (B)) 및 식 (II-PG2) 의 화합물에서 PG2 의 절단 (즉, 방법 (C) 의 단계 (a)) 은 하나의 단계로 동시에 수행될 수 있다.
PG2 는 그의 유형에 따라 강, 약, 염기성 또는 환원성 절단 조건에 의해 절단되며, 이들 조건은 상기에서 정의된 바와 같다.
바람직하게, PG2 는 Fmoc, Alloc, Boc, Trt, Mtt, Mmt 및 Ddz 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
PG2 가 강 유형 PG 인 경우, 이는 바람직하게 Boc 이다.
PG2 가 약 유형 PG 인 경우, 이는 바람직하게 Trt 이다.
PG2 가 환원성 유형 PG 인 경우, 이는 바람직하게 Alloc 이다.
PG2 가 염기성 유형 PG 인 경우, 이는 바람직하게 Fmoc 이다.
ResinA 는 SPPS 에서 고체 상으로서 통상 사용된 수지로, ResinA 와 Xaa1 간 결합은 펩티드의 2 개의 아미노산 잔기간 아미드 결합을 절단하지 않는 조건 하에서 절단될 수 있다.
바람직하게, ResinA 는 SPPS 에 고체 담체로서 통상 사용되는, 관능기를 갖는 수지로, 이때 상기 관능기는 NH2 또는 OH 이다.
바람직하게, ResinA 는 에스테르 또는 아미드 결합에 의해 Xaa1 의 1-카르복실산기에 커플링된다.
더욱 바람직하게, ResinA 는, ResinA 가 에스테르 또는 아미드 결합 (이들 결합 중 어느 것도 염기성, 약 또는 환원성 절단 조건 하에서 절단가능하지 않음) 에 의해 Xaa1 의 카르복시기의 C1-원자에 커플링되는 수지인 것이 선택된다.
바람직하게, ResinA 는 히드록시메틸폴리스티렌 (HMPS) 수지, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 기재 수지, PEG 가 PEG 수지와는 상이한 수지 상에 그래프트된 수지, 폴리스티렌 수지, p-벤질옥시벤질 알코올 수지, 클로로메틸 폴리스티렌-디비닐벤젠 수지, 폴리(비닐 알코올)-그래프트-폴리(에틸렌 글리콜) (PVA-g-PEG) 수지로 이루어진 군으로부터 선택된다.
PEG 가 PEG 수지와는 상이한 수지 상에 그래프트된 수지는, 바람직하게 폴리스티렌 수지 상, p-벤질옥시벤질 알코올 수지 상, 또는 클로로메틸 폴리스티렌-디비닐벤젠 수지 상에 PEG 가 그래프트된 수지이다.
더욱 바람직하게, ResinA 는 HMPS 수지 또는 클로로메틸 폴리스티렌-디비닐벤젠 수지이다.
HydroxyChemMatrix® 수지는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 지지체인 ChemMatrix®지지체를 갖는 것으로, 상기는 폴리에틸렌 글리콜 기재 수지에 대한 예이다.
HydroxyTentagel® 수지는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 이 그래프트된 저 가교 폴리스티렌 매트릭스로 이루어진 그래프트된 공중합체인 Tentagel®지지체를 갖는 것으로, 이는 폴리스티렌 기재 수지의 예이다.
p-벤질옥시벤질 알코올 수지는 Wang 수지로 지칭된다.
클로로메틸 폴리스티렌-디비닐벤젠 수지는 Merrifield 수지로 지칭된다.
단계 (a) 및 단계 (b) 는 상이한 반응 조건을 요구할 수 있고, 즉 단계 (a) 및 단계 (b) 는 연속하여 수행될 수 있다.
바람직하게, 단계 (a) 및q 단계 (b) 는 동일한 반응 조건을 요구하고, 즉 단계 (a) 및 단계 (b) 는 한 단계로 동시에 수행된다.
바람직하게, 방법(B), 즉 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물에서부터 PGXaaC(pc) 의 절단, 방법(C) 의 단계 (a), 즉 식 (II-PG2) 의 화합물에서부터 PG2 의 절단 및 방법(C) 의 단계 (b), 즉 반응 (INRIFO) 는 동일한 반응 조건을 필요로 하며, 그리하여 한 단계로 동시에 수행될 수 있다.
바람직하게, 단계 (b), 반응 (INRIFO) (ResinA 에서 Xaa1 을 절단함) 은 용매 (b) 에서 수행된다.
단계 (b) 는 바람직하게, 비프로톤화 아미노기로서 비프로톤화된 상태가 되게, 즉 암모늄 이온으로서 존재하지 않게, Xaa2 의 알파 아미노기를 제공하는 조건에서 수행된다.
더욱 바람직하게, 단계 (b) 는 하나 이상의 염기 (b) 의 첨가에 의해 수행된다.
단계 (a) 가 산성 조건에서 수행되는 경우, pH 가, 염기, 바람직하게 3 차 염기, 더욱 바람직하게 상술된 HSPPS 에서 사용된 것들 중 하나인 3차 염기의 첨가에 의해 중화되는 것이 바람직하다. 단계 (b) 의 반응 (INRIFO) 을 유도하기 위해, 염기 (b) 가 첨가되는데, 바람직하게는 염기 (b) 는 2차 아민이고, 더욱 바람직하게는 상기 2차 아민의 컨쥬게이션된 산의 pKa 값은 5.0 내지 15, 더욱 바람직하게는 7.5 내지 10 이다. 상기 2 차 아민은 바람직하게 디알킬아민이고, 더욱 바람직하게 이는 디메틸아민, 디-n-프로필아민, 디에틸아민, 알파-(p-톨릴)피롤린, 피롤리딘, 알파-에틸피롤리딘, 알파-벤질피롤리딘, 알파-시클로헥실피롤리딘, 모르폴린, 피페리딘, 2-메틸피페리딘, N,N-디메틸히드록실아민 및 N-C1-4 알킬아닐린으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이때 N-C1-4 알킬아닐린 중 C1-4 알킬은 선형 또는 분지형이며, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸 및 이소부틸로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게 상기 C1-4 알킬은 에틸이다.
용매 (b) 로서, 반응물을 용해할 수 있는 임의의 불활성 용매가 사용될 수 있다.
바람직하게, 용매 (b) 는 디메틸 술폭시드 (DMSO), 디옥산, 테트라히드로푸란 (THF), 1-메틸-2-피롤리돈 (NMP), N,N-디메틸포름아미드 (DMF), N,N-디메틸아세트아미드 (DMA), 피리딘, 디클로로메탄 (DCM), 디클로로에탄 (DCE), 클로로포름, 디옥산, 테트라히드로피란, 에틸 아세테이트, 톨루엔, 아세토니트릴 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더욱 바람직하게, 용매 (b) 는 NMP, DMF, THF 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게, 단계 (b) 는 0 내지 50℃, 더욱 바람직하게 5 내지 30℃, 보다 더욱 바람직하게 15 내지 25℃ 의 온도에서 수행된다.
바람직하게, 단계 (b) 는 대기압에서 수행된다.
바람직하게, 단계 (b) 에 대한 반응 시간은 1 분 내지 1 시간, 더욱 바람직하게는 1 분 내지 30 분, 보다 더욱 바람직하게는 5 분 내지 15 분이다.
단계 (b) 의 상기 설명에서 용어 "부"는 달리 명시되지 않는 한, 식 (II-H) 의 화합물인 처리된 물질의 중량부 인자인 것을 의미한다.
바람직하게, 5 내지 20 부, 더욱 바람직하게 5 내지 15 부의 용매가 사용된다.
바람직하게, 염기 (b) 의 양은 30 내지 1 중량%, 더욱 바람직하게는 15 내지 2 중량%, 보다 더욱 바람직하게는 10 내지 5 중량% (상기 중량% 는 식 (II-H) 의 화합물의 총 중량을 기준으로 함) 이다.
본 발명의 추가 대상은, 식 (II-PG2) 의 화합물 (이때 식 (II-PG2) 의 화합물은 상기 및 이의 바람직한 구현예에서 정의된 바와 같음) 의 제조 방법 (D) 로,
이 방법은, 식 (II-PG2) 의 화합물의 PEP-C 의 아미노산 (PEP-C 의 C-말단 아미노산 제외) 의 식 (II-XaaC(1)) 의 화합물로의, 수지에 부착된 C-말단 아미노산의 N-말단의 탈보호화, 다음 아미노산의 커플링, 더 많은 아미노산이 커플링되어야하는 경우, 상기에 따라 커플링된 아미노산의 N-말단의 탈보호화 등과 같은 반복적인 SPPS 사이클의 필수적이면서 통상적인 단계를 포함하고,
SPPS 를 Xaa(1) 의 N-말단을 탈보호화하고, PEP-C 의 C-말단에서 제 2 의 위치의 아미노산의 커플링으로 출발하며 (이때 PEP-C 의 C-말단에서 제 2 위치의 상기 아미노산은 식 PGXaaC(2) - XaaC(2) - OH 를 가짐); 및
PEP-C 서열에 따라 식 PGXaaC(iippcc) - XaaC(iippcc) - OH (iippcc 는 3 내지 (pc-1) 의 정수임) 의 임의의 다음 아미노산으로 연속해서 SPPS 를 지속하고 (pc 가 3 이상인 경우); 및
SPPS 를 PEP-C 의 N-말단의 첨가로 종료 (상기 N-말단 아미노산은 식 PGXaaC(pc) - XaaC(pc) - OH 임) 하는, 통상적인 고체 상 펩티드 합성 SPPS 방법에 의한 순차적인 첨가를 특징으로 한다;
이때,
PGXaaC(pc), PGXaaC, XaaC, pc, PEP-C, HG, n, SG, PG2, Xaa1, Xaa2 및 ResinA 는 상기 및 이의 바람직한 구현예에서 동일한 정의를 갖고;
PGXaaC(1), PGXaaC(2) 및 PGXaaC(iippcc) 에서, 지수 (1), (2) 및 (iippcc) 는 PEP-C 의 각 아미노산 잔기 XaaC 의 아미노기의 보호기로서 각 PGXaaC 를 정의하고;
XaaC(1), XaaC(2) 및 XaaC(iippcc) 에서, 지수 (1), (2) 및 (iippcc) 는 PEP-C 의 각 아미노산 잔기 XaaC 로서 각 XaaC 를 정의하고;
단, PGXaaC(1), PGXaaC(2) 및 임의의 PGXaaC(iippcc) 는 PG2 와 상이한 보호기이고, 이는 Xaa2 에서부터 PG2 를 절단하는데 필요한 것과 상이한 반응 조건 하에서 절단가능하고,
또한, 단, PGXaaC(1) 을 절단하는데 사용된 반응 조건, 상기 2 차 아미노산의 N-말단 보호기 PGXaaC(2) 를 절단하는데 사용된 반응 조건 및 상기 다음 아미노산의 임의의 N-말단 보호기 PGXaaC(iippcc) 를 절단하는데 사용된 반응 조건은 Xaa2 로부터 PG2 를 절단하지 않고;
추가로, 단, Xaa1 과 ResinA 와의 결합은 SPPS 동안 절단되지 않는 유형의 것이다.
바람직하게, 임의의 XaaC 가 측쇄 PG 를 갖는 경우, 임의의 PGXaaC 는, 임의의 측쇄 보호화 XaaC 에서부터 임의의 측쇄 PG 를 절단하지 않으면서 아미노산 XaaC 에서부터 임의의 PGXaaC 가 절단될 수 있게 하는 절단성 유형 보호기의 것이 선택된다.
따라서, PGXaaC(1) 및 PGXaaC(2) 는 동일 또는 상이하고, 서로 독립적으로 SPPS 에 통상 사용된 N-말단 보호기이고, 각각 PEP-C 의 아미노산 XaaC(1) 및 XaaC(2) 의 N-말단 보호기이며, 여기에 PEP-C 의 다음 아미노산이 SPPS 에 의해 첨가되는 것으로, 이는 염기성 절단 유형 보호기, 산 절단 유형 보호기 및 환원성 절단 유형 보호기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
pc 가 2 인 경우, PEP-C 는 디펩티딜 라디칼이고, 식 PGXaaC(2) - XaaC(2) - OH 를 갖는 PEP-C 의 C-말단에서부터 제 2 위치의 상기 아미노산은 PGXaaC(pc) - XaaC(pc) - OH 와 상동이고, 상기 아미노산 PGXaaC(iippcc) - XaaC(iippcc) - OH 은 사용되지 않는다.
빌딩 블록으로서 단지 개개의 아미노산을 이용하는 것 대신에, 또한 올리고펩티드, 바람직하게 디- 또는 트리펩티드, 더욱 바람직하게 디펩티드가 SPPS 에서 빌딩 블록으로서 사용될 수 있다. 이는 예를 들어 슈도프롤린이 측쇄 보호기로서 사용되는 경우에 공지되어 있고, 이 경우에서, 통상적으로 각 디펩티드가 빌딩 블록으로서 SPPS 에 사용된다.
바람직하게, PG2 는 Fmoc 또는 Alloc 이고,
PGXaaC(1), PGXaaC(2) 및 임의의 PGXaaC(iippcc) 는 Boc 이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, PG2 는 Boc, Trt, Mtt, Mmt, Ddz 및 Alloc 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 및
PGXaaC(1), PGXaaC(2) 및 임의의 PGXaaC(iippcc) 는 Fmoc 이다.
더욱 바람직하게, PG2 는 Trt, Boc 또는 Alloc 이고,
PGXaaC(1), PGXaaC(2) 및 임의의 PGXaaC(iippcc) 는 Fmoc 이고,
보다 더욱 바람직하게, PG2 는 Trt 또는 Alloc 이고, 및
PGXaaC(1), PGXaaC(2) 및 임의의 PGXaaC(iippcc) 는 Fmoc 이다.
SPPS 에 대한 전형적인 반응 조건 및 매개변수 및 시약 및 표준 프로토콜은 당업계, 예를 들어 문헌 Lloyd-Williams et al., "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins", CRC Press, 1997, 또는 Chan et al., "Fmoc solid phase peptide synthesis", Oxford University Press, 2000 에 공지되어 있다.
SPPS 는 펩티드 화학에서 공지된 표준 방법에 의해 수행될 수 있다. 통상, SPPS 에서, 아미노산은 C-말단에서 N-말단으로 첨가된다. 따라서, 목적하는 펩티드 단편의 C-말단에 근접한 펩티드기 또는 C-말단 아미노산이 고체 지지체, 수지에 첨가되는 제 1 의 것이다. 이는 C-말단의 카르복시기를 수지 지지체 상의 상보적 관능기에 반응시킴으로써 발생되는데, 상기 N-말단 아미노기는 통상 원하지 않는 부반응을 방지하기 위해 보호기에 의해 보호되어 있다. 첨가되는 임의의 아미노산 또는 펩티드기가 측쇄 상에 반응성 기를 갖는 경우, 이들은 또한 바람직하지 않은 부반응을 회피하기 위해 보호기에 의해 보호된다. 제 1 의 아미노산 또는 펩티드 단편을 고체 지지체 상에 커플링한 후, N-말단 보호기가 제거되고, 그 다음에 N-말단 보호화 아미노산 또는 펩티드 단편이 제 1 의 것에 커플링된다. 이후, N-말단 보호기의 제거 및 커플링의 연속적인 사이클에서, 아미노산 또는 펩티드기가 이전에 신장된 펩티딜 라디칼에 목적하는 펩티딜 라디칼이 형성될 때까지 연속적으로 부착된다. 그에 따라 고체 상 합성의 생성물은 고체 지지체에 결합된 펩티딜 라디칼이다.
SPPS 에 대한 다양한 고체 지지체가 공지되어 있다. 바람직하게, 고체 지지체는, 폴리아미드, 폴리술파미드, 치환된 폴리에틸렌, 폴리에틸렌글리콜, 폐놀계 수지, 다당류 또는 폴리스티렌과 같은 하나 이상의 중합체, 공중합체, 또는 중합체들의 조합으로 만들어진 수지를 포함한다.
고체 지지체는 펩티드 합성에서 사용된 용매에 충분히 불용성 및 불활성이어야 한다.
고체 지지체는 전형적으로, 관능기를 갖는 링크 부분을 포함하는데, 여기에 제 1 의 아미노산 또는 제 1 의 펩티드가 먼저 커플링된다. 펩티딜 라디칼은 지지체로부터 펩티드를 방출하는 적절한 반응 조건 하에서 고체 지지체로부터 절단된다. 적절한 고체 지지체는 광-절단성, 산 절단성, 바람직하게는 TFA 또는 HF 에 의함, 플루오라이드 이온 절단성, 환원성 절단성, 바람직하게는 Pd(O) 촉매반응에 의함; 친핵적 절단성 또는 라디칼에 의한 절단성인 링커를 가질 수 있다. 바람직하게, 고체 지지체의 링크 부분은, 펩티드의 측쇄 보호기가 제거되지 않게 하는 조건 하에서 펩티딜 라디칼이 절단될 수 있게 하거나, 또는 펩티드의 측쇄 보호기가 동시에 및 완전히 제거되는 조건 하에서 펩티딜 라디칼이 절단되게 선택된다.
바람직하게, SPPS 는 산 절단성 고체 지지체로 수행되고, 더욱 바람직하게 고체 지지체의 링크 부분은 트리틸기, 예컨대 염소화 트리틸 수지, 바람직하게 2-클로로트리틸 클로라이드 (2-CTC) 수지, 또는 4-메틸트리틸 클로라이드 수지, 4-메톡시트리틸 클로라이드 수지, 4-아미노부탄올-올 2-클로로트리틸 수지, 4-아미노메틸벤조일-2-클로로트리틸 수지, 3-아미노프로판-l-올 2-클로로트리틸 수지, 브로모아세트산 2-클로로트리틸 수지, 시아노아세트산 2-클로로트리틸 수지, 4-시아노벤조산 2-클로로트리틸 수지, 글리시놀-2-클로로트리틸 수지, 프로피온 2-클로로트리틸 수지, 에틸렌글리콜-2-클로로트리틸 수지, N-Fmoc 히드록실아민 2-클로로트리틸 수지 또는 히드라진 2-클로로트리틸 수지를 포함한다.
기타 바람직한 고체 지지체는 폴리스티렌 수지, 또는 C-말단 카르복시기를 결합하는 관능기를 갖는 스티렌 및 디비닐벤젠의 공중합체 기재 수지, 바람직하게 Wang 수지 (4-히드록시메틸페닐옥시메틸 고착기를 갖는 스티렌 및 디비닐벤젠의 공중합체를 포함함), 추가 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산 수지와 같은 수지이다.
바람직한 수지는 Wang, (2-CTC) 및 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시 부티르산 수지이다.
고체 상 합성을 위한 수지를 제조하기 위해, 수지는 하나 이상의 적당한 용매로 예비 세정될 수 있다.
SPPS 에 바람직하게 사용된 용매로서, HSSPS 하에서 상기에서 언급된 바람직한 용매가 또한 SPPS 에서 사용될 수 있다. 더욱 바람직한 용매는 NMP, DMF, DCM 그 혼합물이다.
더욱 바람직한 혼합물은 체적비가 9: 1 내지 1 : 9, 더욱 바람직하게는 4 : 1 내지 1 : 4 인 DMF : DCM 이다.
SPPS 는 바람직하지 않은 부반응을 피하도록 측쇄 보호기로 보호된, 반응성 관능기를 갖는 아미노산의 임의 측쇄로 수행되는 것이 바람직하다. 측쇄 보호기의 성질 및 용도도 또한 당업계에 익히 공지되어 있다.
측쇄-보호기의 선택은 각종 인자, 예를 들어 수행되는 합성법, 펩티드가 적용되는 프로세싱 및 목적하는 중간체 생성물 또는 최종 생성물에 좌우될 수 있다. 측쇄 보호기의 성질은 또한 아미노산 그 자체의 성질에 좌우된다. 일반적으로, 측쇄 보호기는 고체 상 합성 동안 알파-아미노기의 탈보호화 동안 제거되지 않는 것으로 선택된다. 따라서, 알파 아미노기의 보호기 및 임의의 측쇄 보호기는 통상 동일하지 않고, 바람직하게 이들은 직교계를 나타낸다. 용어 "직교계"는 문헌 [Baranay, G., and Merrifield, R.B., JACS, 1977, 99, 22, 7363-7365] 에서 정의된다.
측쇄 보호기의 예에는 아세틸 (Ac), 벤조일 (Bz), tert-부틸 (tBu), 트리페닐메틸 (Trt), 테트라히드로피라닐, 벤질 에테르 (Bzl), 2,6-디클로로벤질 에테르 (DCB), tert-부톡시카르보닐 (Boc), 4-니트로벤젠술포닐 (Ns), p-톨루엔술포닐 (Tos), 펜타메틸디히드로벤조흐란-5-술포닐 (Pbf), 1,2-디메틸-인돌-3-술포닐 (MIS), 아다만틸옥시카르보닐, 잔틸 (Xan), 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, tert-부틸 에스테르 (OtBu), 벤질옥시카르보닐 (Z), 2-클로로벤질옥시카르보닐(2-Cl-Z), tert-아밀옥시카르보닐 (Aoc), 방향족 또는 지방족 우레탄 유형 보호기, 광 불안정 기, 예컨대 니트로 베라트릴옥시카르보닐 (NVOC); 및 플루오라이드 불안정성 기, 예컨대 트리메틸실릴옥시카르보닐 (TEOC) 가 포함된다.
바람직한 측쇄기는 tBu, Trt, Boc, Tos, Pbf, OtBu 및 Z 이다.
바람직하게, 측쇄 보호기로 통상 사용된 관능기 포함 아미노산은 Arg(Pbf), Asp(OtBu), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc) 및 Tyr(tBu) 이고, Arg 는 또한 측쇄 보호기 없이 때때로 사용된다.
예를 들어, Fmoc-Arg(Pbf)-OH 는 식 (ARG-PBF) 을 갖는다.
N-말단 보호기는 성장하는 펩티드 사슬로 첨가되는 다음 아미노산의 첨가 이전에 탈보화 반응에서 제거되나, 펩티드가 지지체로부터 절단되는 경우 유지될 수 있다. N-말단 보호기의 선택은 각종 인자, 예를 들어 수행되는 합성 유형 및 목적하는 중간체 생성물 또는 최종 생성물에 좌우될 수 있다.
아미노-말단 보호기의 예에는 하기가 포함된다:
(1) 아실-유형 보호기, 예컨대 포르밀, 아크릴릴 (Acr), 벤조일 (Bz) 및 아세틸 (Ac);
(2) 방향족 우레탄-유형 보호기, 예컨대 벤질옥시카르보닐 Z 및 치환된 Z, 예컨대 p-클로로벤질옥시카르보닐, p 니트로벤질옥시카르보닐, p-브로모벤질옥시카르보닐, p-메톡시벤질옥시카르보닐;
(3) 지방족 보호기, 예컨대 t-부틸옥시카르보닐 (Boc), 2-페닐프로필 (2)-옥시카르보닐 (Poc), 2-(4-바이페닐릴)-프로필 (2) 옥시카르보닐 (Bpoc), 디이소프로필메톡시카르보닐, 이소프로필옥시카르보닐, 에톡시카르보닐, 알릴옥시카르보닐 (Alloc);
(4) 시클로알킬 우레탄-유형 보호기, 예컨대 9-플루오레닐-메틸옥시카르보닐 (Fmoc), 시클로펜틸옥시카르보닐, 아만틸옥시카르보닐, 및 시클로헥실옥시카르보닐;
(5) 티오우레탄 유형 보호기, 예컨대 페닐티오카르보닐.
바람직한 N-말단 보호기는 Fmoc, Bpoc, Poc 및 Boc 이다.
수지로부터 보호화 상태의 생성 펩티드를 절단하는 것이 약 산성 절단제를 이용하여 수행하는 것보다 비교적 간단하다는 점을 고려할 때 Fmoc 또는 Fmoc-유사 화학이 고체 상 펩티드 합성에 있어서 매우 바람직하다. 이런 종류의 절단 반응은 생성된 부산물, 불순도 등 측면에서 비교적 깔끔하다.
더욱이, N-말단의 Fmoc 보호기는 상술된 측쇄 보호기와 매우 잘 맞아 직교계를 나타낸다.
SPPS 에서 커플링은 커플링 시약으로, 바람직하게는 3차 염기의 존재 하에서, 추가 바람직하게는 커플링 부가제의 존재하에서 통상 수행되는데, 추가 바람직하게는 상기 커플링 시약 및 임의의 기타 화합물이 상술된 바와 같은 SPPS 용매 중에 용해되는 것이다.
SPPS 및 HSPPS 에 대한 반응 조건 및 반응 시약은 종종 유사하다.
SPPS 에 사용된 전형적인 커플링 시약은 포스포늄 및 우로늄 염, 혼합 무수물, 카르보디이미드, 기타 아실화제, 예컨대 활성화 에스테르 또는 산 할로게나이드 및 활성화 벤조트리아진 유도체이다.
포스포늄 및 우로늄 염은 바람직하게 상술된 바와 같은 HSPPS 에 사용된 것이다.
혼합 무수물은 예를 들어 프로판 인산 무수물 (T3P) 이다.
카르보디이미드 커플링 시약은 바람직하게 상술된 바와 같은 HSPPS 에 사용된 것이다.
활성화 에스테르는 예를 들어 이소부틸-클로로포르메이트 (ICBF) 이다.
활성화 벤조트리아진 유도체는 예를 들어 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온 (DEPBT) 이다.
3차 아민은 바람직하게 상술된 HSPPS 에 사용된 것들 중 하나이다.
SPPS 에 사용된 커플링 부가제는 상술된 HSPPS 에 사용된 것이다.
사용된 제 2 및 후속의 아미노산의 양은 수지 지지체에 대한 제 1 커플링 반응에 의해 달성된 로딩 인자에 대해 통상 1 내지 3 mol 당량, 바람직하게 1.3 내지 3 mol 당량, 더욱 바람직하게 1.5 내지 3 mol 당량이다.
바람직하게, SPPS 는 0 내지 50℃, 더욱 바람직하게 5 내지 30℃, 보다 더욱 바람직하게 15 내지 25℃ 의 온도에서 수행된다.
바람직하게, SPPS 는 대기압에서 수행된다.
바람직하게, SPPS 반응 시간은 15 분 내지 20 시간, 더욱 바람직하게 30 분 내지 5 시간, 보다 더욱 바람직하게 30 분 내지 2 시간이다.
SPPS 의 반응 조건의 상기 기술에서 용어 "부"는 달리 기술되지 않는 한 고체 지지체 물질의 중량부 인자를 의미한다.
바람직하게, 1 내지 30 부, 더욱 바람직하게 5 내지 10 부의 용매가 사용된다.
바람직하게, 0.9 내지 5 mol 당량, 더욱 바람직하게 1 내지 1.5 mol 당량의 커플링 시약이 사용되며, 상기 mol 당량은 반응성 C-말단 카르복시기의 SPPS 의 경우, 반응성 카르복시기 mol 기준이다.
바람직하게, 0.1 내지 5 mol 당량, 더욱 바람직하게 0.5 내지 1.5 mol 당량의 커플링 부가제가 사용되고, 이때 mol 당량은 커플링 시약 mol 기준이다.
바람직하게, 1 내지 10 mol 당량, 더욱 바람직하게 2 내지 3 mol 당량의 3차 아민이 사용되고, 이때 mol 당량은 커플링 시약 mol 기준이다.
이들 SPPS 조건은 일반 조건으로, 이는 카르복시기 포함 빌딩 블록을 아미노기 포함 반응 파트너에 커플링하는데 적용된다. SPPS 의 경우, 카르복시기 포함 빌딩 블록은 커플링되는 N-말단 보호화 아미노산이고, 아미노기 포함 반응 파트너는, C-말단 아미노산 또는 성장하는 펩티드 사슬로, 이는 지지체 물질에 연결된다.
이는, 카르복시기 포함 빌딩 블록의 사용량이 통상 아미노기 포함 반응 파트너 1 mol 에 대해 1 내지 3 mol 당량, 바람직하게는 1.3 내지 3 mol 당량, 더욱 바람직하게는 1.5 내지 3 mol 당량인 것을 의미한다.
본 발명의 추가 대상은 식 (II-XaaC(1)) 의 화합물 (식 (II-XaaC(1)) 의 화합물은 상기 및 이의 바람직한 구현예에서 정의된 바와 같음) 의 제조 방법(E) 으로서, 하기 식 (I-HG) 의 화합물에 아미노산 PGXaaC(1)-XaaC(1)-OH 의 커플링을 특징으로 한다:
[식 중,
(3) 으로 표시된 수소는 HG 의 비보호화 관능기의 수소이고;
PGXaa(1), XaaC(1), PGXaaC, XaaC, HG, n, SG, PG2, Xaa1, Xaa2 및 ResinA 는 상기에서 및 이의 바람직한 구현예에서와 동일한 정의를 가짐].
식 (I-HG) 의 경우, 상기 HG 의 정의 중 임의의 것에서 (*) 는 현재 식 (I-HG) 에서 (3) 으로 나타낸 수소와 HG 간 결합을 의미한다.
방법 (E) 는 상기 정의된 단계 (i) 와 유사하다.
HG 가 식 (HGF-I) 의 핸들기 (T1-1 이 NH 인 경우), 식 (HGF-II) 의 핸들기, 식 (HGF-III) 의 핸들기 및 식 (HGF-VI) 의 핸들기로 이루어진 군으로부터 선택된 핸들기인 경우; (3) 으로 표시된 수소는 HG 의 말단 질소에 연결되고, 방법 (E) 에 대한 반응 조건 및 매개 변수 및 시약 및 표준 프로토콜은 바람직하게 SPPS 에서 상기 기재된 것이고;
카르복시기 포함 빌딩 블록은 아미노산 PGXaaC(1)-XaaC(1)-OH 이고, 아미노기 포함 반응 파트너는 식 (I-HG) 의 화합물이며, 이는 지지체 물질에 연결된다.
HG 가 식 (HGF-I) 의 핸들기 (T1-1 가 O 인 경우), 식 (HGF-IV) 의 핸들기 및 식 (HGF-V) 의 핸들기로 이루어진 군으로부터 선택된 핸들기인 경우,
(3) 으로 표시된 수소는 HG 의 말단 산소와 연결되고, 및
바람직하게 방법 (E) 에 따른 커플링은, 하나 이상의 커플링 시약 (E-OH) 를 이용해 용매 (E-OH) 중에서 이용하는 방법 (E-OH) 에 따라 수행되고, 바람직하게는 하나 이상의 커플링 부가제 (E-OH) 의 존재 하에서 수행된다.
바람직한 커플링 시약 (E-OH) 은 카르보디이미드 커플링 시약 (E-OH) 이다.
카르보디이미드 커플링 시약 (E-OH) 은 바람직하게는 디이소프로필-카르보디이미드 (DIC), 디시클로헥실-카르보디이미드 (DCC) 및 수용성 카르보디이미드 (WSCDI), 예컨대 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 커플링 시약 (E-OH) 은 DIC 이다.
커플링 부가제 (E-OH) 는 바람직하게는 DMAP 또는 활성화 에스테르를 형성할 수 있는 친핵성 히드록시 화합물, 더 바람직하게는 산성의 친핵성 N-히드록시 관능기를 갖는 친핵성 히드록시 화합물 (이때, N 은 이미드임) 이거나, 또는 N-아실 또는 N-아릴 치환된 트리아제노이며, 이때 트리아제노 유형 커플링 부가제는 바람직하게는 N-히드록시-벤조트리아졸 유도체 (또는 1-히드록시-벤조트리아졸 유도체) 또는 N-히드록시벤조트리아진 유도체이다. 상기 커플링 부가제 (E-OH) 가 WO 94/07910 및 EP 410 182 에 기재되어 있다. 이들이 또한 스캐빈저로서 작용하기 때문에, 또한 스캐빈저로 칭한다.
바람직한 커플링 부가제 (E-OH) 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
DMAP, N-히드록시-숙신이미드 (HOSu), 6-클로로-1-히드록시-벤조트리아졸 (Cl-HOBt), N-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HOOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt), 1-히드록시-벤조트리아졸 (HOBt) 및 에틸 2-시아노-2-히드록시이미노아세테이트 (CHA).
CHA 는 상표명 OXYMAPURE® 하에 입수가능하다. CHA 는, 벤조트리아졸-기재 스캐빈저와 비교시 라세미화가 보다 억제되기 때문에 효과적인 스캐빈저임이 입증되었다. 추가로, CHA 는, 예를 들어 HOBt 또는 Cl-HOBt 보다 덜 폭발성이어서 그 취급이 유리하고, 추가적 이점으로서 커플링 진행이 반응 혼합물의 색 변화로 시각적으로 모니터링될 수 있다.
바람직하게는, DMAP 는 커플링 부가제 (E-OH) 로서 사용된다.
용매로서, 임의의 불활성 액체 용매 (E-OH) 가 사용될 수 있다.
바람직한 용매 (E-OH) 는 디메틸 술폭시드 (DMSO), 디옥산, 테트라히드로푸란 (THF), 1-메틸-2-피롤리돈 (NMP), N,N-디메틸포름아미드 (DMF), N,N-디메틸아세트아미드 (DMA), 피리딘, 디클로로메탄 (DCM), 디클로로에탄 (DCE), 클로로포름, 디옥산, 테트라히드로피란, 에틸 아세테이트, 톨루엔, 아세토니트릴 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더 바람직한 용매 (E-OH) 는 NMP, DMF, DCM 및 그 혼합물이다.
바람직하게는, 방법(E-OH) 에 따른 커플링을 0 내지 50℃, 더 바람직하게는 5 내지 30℃, 훨씬 더 바람직하게는 15 내지 25℃ 의 온도에서 수행한다.
바람직하게는, 방법(E-OH) 에 따른 커플링을 대기압에서 수행한다.
바람직하게는, 방법(E-OH) 에 따른 커플링을 위한 반응 시간은 15 분 내지 20 시간, 더 바람직하게는 30 분 내지 5 시간, 훨씬 더 바람직하게는 30 분 내지 2 시간이다.
방법(E-OH) 에 따른 커플링의 반응 조건의 상기 설명에서의 용어 "부" 는 달리 언급되지 않는 한 수합된 고체 지지체 물질의 중량부 인자인 것을 의미한다.
바람직하게는, 1 내지 30 부, 더 바람직하게는 5 내지 10 부의 용매 (E-OH) 를 방법(E-OH) 에 따른 커플링에 사용한다.
바람직하게는, 0.1 내지 5 mol 당량, 더 바람직하게는 1 내지 1.5 mol 당량의 커플링 시약 (E-OH) 을 방법(E-OH) 에 따른 커플링에 사용하며, mol 당량은 HG 의 반응성 기의 mol 을 기준으로 한다.
바람직하게는, 0.1 내지 5 mol 당량, 더 바람직하게는 0.5 내지 1.5 mol 당량의 커플링 부가제 (E-OH) 를 방법(E-OH) 에 따른 커플링에 사용하며, mol 당량은 커플링 시약 (E-OH) 의 mol 을 기준으로 한다.
방법(E) 및 방법(E-OH) 각각에서, 바람직하게는 0.1 내지 5 mol 당량, 더 바람직하게는 1 내지 1.5 mol 당량의 PGXaaC(1)-XaaC(1)-OH 를 사용하며, mol 당량은 HG 의 반응성 기의 mol 을 기준으로 한다.
PGXaaC(1)-XaaC(1)-OH 의 커플링 이후에 비반응성으로 남아있는 HG 의 반응성 기는 바람직하게는 캡핑되며, 바람직하게는 캡핑은 아세트산 무수물로 수행된다.
방법(E-OH) 에 대한 이들 조건은 일반적인 조건이며, 이는 반응 파트너를 포함하는 OH 또는 SH 기의 빌딩 블록을 포함하는 카르복시기에의 커플링에 적용가능하다. 방법(E-OH) 의 경우에, 빌딩 블록을 포함하는 카르복시기는 아미노산 PGXaaC(1)-XaaC(1)-OH 이고, 반응 파트너를 포함하는 OH 또는 SH 기는 식 (I-HG) 의 화합물이다.
본 발명의 추가 대상은 식 (I-HG) 의 화합물의 제조를 위한 방법(F) 이며 (식 (I-HG) 의 화합물은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음), 상기 방법(F) 는 n 이 0 인 경우의 단계 (F1A) 를 포함하거나; 또는 방법(F) 는 n 이 1 인 경우의 단계 (F3A) 및 단계 (F3B) 로, 단계 (F3B) 가 단계 (F3A) 이후에 수행되는 것을 포함하거나; 또는 방법(F) 는 단계 (F4) 를 포함하며 (n 은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음); 이때 단계 (F3A) 는 하기 식 (I-PG2) 의 화합물:
[식 중,
PG2, Xaa1, Xaa2 및 ResinA 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기와 동일한 정의를 갖고;
(4) 로 나타내는 H 는 FG 의 수소이며, FG 는 또한 상기 정의된 바와 같은 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음];
과 화합물 SGroup 과의 커플링 반응 (F3A-Coup) 으로 하기 식 (I-SG) 의 화합물:
[식 중,
SG, PG2, Xaa1, Xaa2 및 ResinA 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기와 동일한 정의를 갖고;
(5) 로 나타내는 H 는 반응성 관능기 SGroup-FunSiteN 의 수소임]
을 제공하는 것을 포함하며; 이때 화합물 SGroup 은 2 개의 반응성 관능기 SGroup-FunSiteN 및 SGroup-FunSiteC 를 갖는 펩티드 화학에 사용되는 종래의 빌딩 블록이며, 반응성 관능기 SGroup-FunSiteN 은 OH, SH 또는 NH2 이고 펩티드 합성에서의 아미노산 빌딩 블록의 관능적 유사 알파 아미노기로서 사용되고 적합한 보호기 PGSG 에 의해 보호될 수 있고, 반응성 관능기 SGroup-FunSiteC 는 펩티드 합성에서의 아미노산 빌딩 블록의 관능적 유사 카르복실산 기로 사용되며;
PGSG 는 펩티드의 N-말단 또는 아미노산의 알파 아미노기를 보호하기 위한 펩티드 화학에 종래 사용되는 보호기이고 염기 절단가능한 유형 보호기, 산 절단가능한 유형 보호기 및 환원성 절단가능한 유형 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
화합물 SGroup 은 SG 의 전구체이고 (SG 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음);
화합물 SGroup 의 반응성 관능기 SGroup-FunSiteN 이 보호기 PGSG 에 의해 보호되는 경우에, 단계 (F3A) 이후의 연속적 단계 (F-ConC) 에서 PGSG 는 SG 로부터 절단되고;
단, PGSG 는 PG2 와 상이하고, PGSG 는 Xaa2 로부터 PG2 를 절단하는데 필요한 것들과 상이한 반응 조건 하에 절단가능하고,
추가로 단, PGSG 를 절단하는데 사용되는 반응 조건은 Xaa2 로부터 PG2 를 절단하지 않고;
추가로 단, 단계 (F-ConC) 에서 PGSG 를 절단하는데 사용되는 반응 조건은 ResinA 로부터 Xaa1 을 절단하지 않고;
단계 (F3B) 는 식 (I-SG) 의 화합물과 화합물 HGroup 과의 커플링 반응 (F3B-Coup) 이며;
화합물 HGroup 은 2 개의 반응성 관능기 HGroup-FunSiteN 및 HGroup-FunSiteC 를 갖는 펩티드 화학에 사용되는 종래의 빌딩 블록이며, 반응성 관능기 HGroup-FunSiteN 은 OH, SH 또는 NH2 이고 펩티드 합성에서의 아미노산 빌딩 블록의 관능적 유사 알파 아미노기로서 사용되고 적합한 보호기 PGHG 에 의해 보호될 수 있고, 반응성 관능기 HGroup-FunSiteC 는 펩티드 합성에서의 아미노산 빌딩 블록의 관능적 유사 카르복실산 기로서 사용되며;
PGHG 는 펩티드의 N-말단 또는 아미노산의 알파 아미노기를 보호하기 위한 펩티드 화학에 종래 사용되는보호기이고 염기 절단가능한 유형 보호기, 산 절단가능한 유형 보호기 및 환원성 절단가능한 유형 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
화합물 HGroup 은 HG 의 전구체이고 (HG 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음);
단계 (F1A) 는 식 (I-PG2) 의 화합물과 화합물 HGroup 과의 커플링 반응 (F1A-Coup) 를 포함하고 (화합물 HGroup 은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음),
화합물 HGroup 의 반응성 관능기 HGroup-FunSiteN 이 보호기 PGHG 에 의해 보호되는 경우에, 단계 (F3B) 또는 단계 (F1A) 이후의 연속적 단계 (F-ConA) 에서 PGHG 는 HG 로부터 절단되고;
단, PGHG 는 PG2 와 상이한 보호기이고, PGHG 는 Xaa2 로부터 PG2 를 절단하는데 필요한 것들과 상이한 반응 조건 하에 절단가능하고,
추가로 단, PGHG 를 절단하는데 사용되는 반응 조건은 Xaa2 로부터 PG2 를 절단하지 않고;
추가로 단, 단계 (F-ConA) 에서 PGHG 를 절단하는데 사용되는 반응 조건은 ResinA 로부터 Xaa1 을 절단하지 않고;
단계 (F4) 는 하기 식 (pDKP) 의 화합물:
[식 중,
HG, n, SG, PG2, Xaa1 및 Xaa2 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기와 동일한 정의를 가짐]
과 ResinA 와의 커플링 반응을 포함하고 (ResinA 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기와 동일한 정의를 가짐);
반응성 관능기 HGroup-FunSiteN 이 OH 또는 SH 인 경우, H-PGHG 는 수소이고;
반응성 관능기 HGroup-FunSiteN 이 NH2 인 경우, H-PGHG 는 보호기 PGHG 이고 (PGHG 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음);
H-PGHG 가 PGHG 인 경우에, 반응 F4 이후의 연속적 단계 (F-ConB) 에서 PGHG 는 HG 로부터 절단되고;
단, PGHG 는 PG2 와 상이하고, PGHG 는 Xaa2 로부터 PG2 를 절단하는데 필요한 것들과 상이한 반응 조건 하에 절단가능하고,
추가로 단, PGHG 를 절단하는데 사용되는 반응 조건은 Xaa2 로부터 PG2 를 절단하지 않고;
추가로 단, 단계 (F-ConB) 에서 PGHG 를 절단하는데 사용되는 반응 조건은 ResinA 로부터 Xaa1 을 절단하지 않는다.
식 (pDKP) 의 화합물은 Xaa1 의 유리 카르복실산 기에서 C-말단으로 종결된다.
화합물 HGroup 은 방법(DKP-L-ResinA) 또는 방법(DKP-L) 에서 빌딩 블록으로서 사용되는 상기 언급된 HG 의 구현예이다.
화합물 SGroup 은 방법(DKP-L-ResinA) 또는 방법(DKP-L) 에서 빌딩 블록으로서 사용되는 상기 언급된 SG 의 구현예이다.
하기 식 (DKP-L-ResinA-F) 의 화합물 및 식 (I-HG) 의 화합물은 상기 정의된 DKP-L-ResinA 의 구현예이다:
[식 중, H-PGHG, HG, SG, n, PG2, Xaa2, Xaa1 및 ResinA 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음].
식 (DKP-L-ResinA-F) 의 화합물은 임의로는 연속적 단계 (F-ConA) 또는 (F-ConC) 를 갖는 반응 F1 또는 F3 의 생성물, 또는 임의로는 연속적 단계 (F-ConB) 를 갖는 반응 F4 의 생성물이다.
식 (pDKP) 의 화합물은 상기 정의된 DKP-L 의 구현예이다.
식 (I-PG2) 의 화합물 및 식 (I-SG) 의 화합물은 상기 정의된 방법(DKP-L-ResinA) 의 중간체의 구현예이다.
단계 (F3A) 의 경우 또는 단계 (F1A) 의 경우 (FG 가 NH2 임), 커플링 반응 (F3A-Coup) 또는 커플링 반응 (F1A-Coup) 는 바람직하게는 또한 모든 기재된 바람직한 구현예와 함께 SPPS 에 대해 상기 기재된 바와 같은 반응 조건 및 파라미터 및 시약 및 프로토콜하에 수행되고, 이때 빌딩 블록을 포함하는 언급된 카르복시기는 각각 화합물 SGroup 또는 화합물 HGroup 이고, 반응 파트너를 포함하는 아미노기는 식 (I-PG2) 의 화합물이다.
단계 (F3A) 의 경우 또는 단계 (F1A) 의 경우 (FG 는 OH 또는 SH 임), 커플링 반응 (F3A-Coup) 또는 커플링 반응 (F1A-Coup) 는 바람직하게는 방법(E-OH) 에 대해 상기 기재된 바와 같은 반응 조건 및 파라미터 및 시약 및 프로토콜하에 수행되며, 이때 빌딩 블록을 포함하는 카르복시기는 각각 화합물 SGroup 또는 화합물 HGroup 이고, 반응 파트너를 포함하는 OH 또는 SH 기는 식 (I-PG2) 의 화합물이다.
단계 (F3B) 의 경우 (반응성 관능기 SGroup-FunSiteN 은 NH2 임), 커플링 반응 (F3B-Coup) 는 바람직하게는 또한 모든 기재된 바람직한 구현예와 함께 SPPS 에 대해 상기 기재된 바와 같은 반응 조건 및 파라미터 및 시약 및 프로토콜하에 수행되며, 이때 빌딩 블록을 포함하는 언급된 카르복시기는 화합물 HGroup 이고, 반응 파트너를 포함하는 아미노기는 식 (I-SG) 의 화합물이다.
단계 (F3B) 의 경우 (반응성 관능기 SGroup-FunSiteN 은 OH 또는 SH 임), 커플링 반응 (F3B-Coup) 는 바람직하게는 방법(E-OH) 에 대해 상기 기재된 바와 같은 반응 조건 및 파라미터 및 시약 및 프로토콜하에 수행되며, 이때 빌딩 블록을 포함하는 카르복시기는 화합물 HGroup 이고, 반응 파트너를 포함하는 OH 또는 SH 기는 식 (I-SG) 의 화합물이다.
식 (pDKP) 의 화합물에서, Xaa1 의 카르복실산 기는 비보호된다. Xaa1 의 상기 비보호된 카르복실산 기를 단계 (F4) 에서 ResinA 의 비보호된 관능기와 반응시킨다. 따라서, 단계 (F4) 에서의 커플링 반응은 아미노산의 수지, 즉 고체 지지체에의 종래의 커플링 반응과 유사하다. 아미노산의 고체 지지체에의 커플링은 공지된 반응이고, 따라서 단계 (F4) 에서의 커플링 반응의 파라미터 및 반응 조건이 공지되어 있다.
바람직하게는, 식 (pDKP) 의 화합물의 Xaa1 의 카르복실산 기에 커플링되는 ResinA 의 관능기가 NH2 기인 경우, 단계 (F4) 에서의 커플링 반응은 바람직하게는 또한 모든 기재된 바람직한 구현예와 함께 SPPS 에 대해 상기 기재된 바와 같은 반응 조건 및 파라미터 및 시약 및 프로토콜하에 수행되며, 이때 빌딩 블록을 포함하는 언급된 카르복시기는 식 (pDKP) 의 화합물이고, 반응 파트너를 포함하는 아미노기는 ResinA 이다.
바람직하게는, 식 (pDKP) 의 화합물의 Xaa1 의 카르복실산 기에 커플링되는 ResinA 의 관능기가 OH 또는 SH 인 경우, 단계 (F4) 에서의 커플링 반응은 바람직하게는 방법(E-OH) 에 대해 상기 기재된 바와 같은 반응 조건 및 파라미터 및 시약 및 프로토콜하에 수행되며, 이때 빌딩 블록을 포함하는 언급된 카르복시기는 식 (pDKP) 의 화합물이고, 반응 파트너를 포함하는 OH 또는 SH 기는 ResinA 이다.
바람직하게는, PG2 는 Fmoc 또는 Alloc 이고, 가능한 PGHG 또는 PGSG 는 Boc 이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, PG2 는 Boc, Trt, Mtt, Mmt, Ddz 및 Alloc 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가능한 PGHG 또는 PGSG 는 Fmoc 이다.
더 바람직하게는, PG2 는 Trt, Boc 또는 Alloc 이고, 가능한 PGHG 또는 PGSG 는 Fmoc 이다.
훨씬 더 바람직하게는, PG2 는 Trt 또는 Alloc 이고, 가능한 PGHG 또는 PGSG 는 Fmoc 이다.
방법(DKP-L-ResinA) 의 맥락상 상기 설명된 바와 같이, 화합물 SGroup 은 SG 의 전구체이고 (SG 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음), 2 개의 반응성 관능기 SGroup-FunSiteN 및 SGroup-FunSiteC 를 갖는다. 반응성 관능기 SGroup-FunSiteN 은 바람직하게는 OH 또는 NH2, 더 바람직하게는 NH2 이다. 반응성 관능기 SGroup-FunSiteN 은 연결기 CG-SG (CG-SG 는 -O-, -S- 또는 -N(H)- 임) 로서 보호 또는 커플링된 상태로 존재한다.
반응성 관능기 SGroup-FunSiteC 는 비보호될 수 있거나, 또는 사전활성화될 수 있고, 각각의 커플링 반응에서의 커플링 부위이다. 바람직하게는, 비보호되는 경우에는 반응성 관능기 SGroup-FunSiteC 는 카르복실산 기이거나, 또는 사전활성화 카르복실산 기이다. 상기 커플링 반응 이후, 반응성 관능기 SGroup-FunSiteN 의 임의의 보호기를 절단하여 반응성 관능기 SGroup-FunSiteN 을 다음 커플링 반응에 이용가능하게 한다.
반응성 관능기 SGroup-FunSiteC 가 사전활성화 카르복실산 기인 경우, 사전활성화는 바람직하게는 펩티드 화학에서 통상적인 방식이다. 예를 들어, 재활성화 카르복실산 기를 N-히드록시숙신이미드 또는 펜타 플로우로 페놀과의 그 에스테르 형태로 사용한다.
화합물 SGroup 및 SG 각각은 한정되고 별개의 수의 에틸에녹시드 단위를 포함할 수 있거나, 또는 PEG 사슬이 동일한 사슬 길이의 개별 분자의 후속적 분리 없이 에틸렌 산화물의 중합에 의해 합성되는 경우, 상기 경우에서와 같이 분포된 에틸렌 산화물 단위를 포함할 수 있다. 분포의 경우에, 화합물 SGroup, 및 이로 인해 간접적으로 또한 SG 는 에틸렌 산화물 단위의 별개의 수에 의해서가 아니라 대신에 그 평균 분자량에 의해 명시된다. 바람직하게는, 화합물 SGroup 의 분자량은 1500 내지 5000, 바람직하게는 1500 내지 4000, 더 바람직하게는 1500 내지 3500 이다.
바람직하게는, PGSG 는 Alloc, Fmoc, Mmt 또는 Z 이다.
바람직하게는, 화합물 SGroup 은 화합물 SGroup1, SGroup2, SGroup3, SGroup4, SGroup5, SGroup6, SGroup7 또는 SGroup8 이며;
화합물 SGroup1 은 식 (SG-I) 의 화합물이며, 이때 식 (SG-I) 에서 Fmoc 는 (***) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, OH 는 (****) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, 바람직하게는 m1 은 3 이고;
화합물 SGroup2 는 식 (SG-II) 의 화합물이며, 이때 식 (SG-II) 에서 Z, Fmoc 또는 Alloc 는 (***) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, OH 는 (****) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, 바람직하게는 m5 는 2 이고;
화합물 SGroup3 은 식 (SG-II) 의 화합물이며, 이때 식 (SG-II) 에서 Boc 또는 Fmoc 는 (***) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, OH 는 (****) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, 바람직하게는 m5 는 1 이고;
화합물 SGroup4 는 식 (SG-III) 의 화합물이며, 이때 식 (SG-III) 에서 Boc 는 (***) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, OH 는 (****) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, 바람직하게는 m6 및 m7 은 2 이고;
화합물 SGroup5 는 식 (SG-IV) 의 화합물이며, 이때 식 (SG-IV) 에서 Mmt 또는 Boc 는 (***) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, OH 는 (****) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, 바람직하게는 m9 는 4, 8, 12 또는 27 이고; 특히 Boc 및 m9 의 조합은 4, 8, 12 또는 27 이거나; 또는 Mmt 및 m9 의 조합은 4 이고;
화합물 SGroup6 은 식 (SG-V) 의 화합물이며, 이때 식 (SG-V) 에서 Boc 또는 Fmoc 는 (***) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, OH 는 (****) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, 바람직하게는 m10 은 1 이거나, 또는 분자량은 1500 내지 3500, 더 바람직하게는 3000 이고; 특히 Fmoc 와 m10, 또는 Boc 와의 조합은 1 이고, 분자량은 1500 내지 3500, 더 바람직하게는 3000 이고;
화합물 SGroup7 은 식 (SG-VI) 의 화합물이며, 이때 식 (SG-VI) 에서 Boc 는 (***) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, Br 은 (****) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, 바람직하게는 m11 은 3 이고;
화합물 SGroup8 은 식 (SG-VII) 의 화합물이며, 이때 식 (SG-VII) 에서 Boc 또는 Fmoc 는 (***) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, OH 또는 N-히드록시숙신이미드는 (****) 로 나타내는 결합을 통해 연결되고, 바람직하게는 분자량은 1500 내지 3500, 더 바람직하게는 3000 이고; 바람직하게는 Boc 및 OH 또는 N-히드록시숙신이미드, 또는 Fmoc 및 N-히드록시숙신이미드이다.
(****) 로 나타내는 결합을 통해 연결되는 OH 는 SGroup 을 만들고, 카르복실산 기 또는 OH 를 또한 상기 추가로 약술된 바와 같이 그 사전활성화 형태로 사용할 수 있다.
예시로서, 화합물 SGroup 이 Alloc 을 갖는 화합물 SGroup1 또는 SGroup2 인 경우, 식 (I-SG) 의 화합물은 각각 하기 식 (I-SGroup1-Fmoc) 또는 (I-SGroup2-Alloc) 의 화합물이다;
[식 중,
m1, m5, PG2, Xaa1, Xaa2 및 ResinA 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기와 동일한 정의를 가짐].
화합물 HGroup 은 HG 의 전구체이고 (HG 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음), 방법(DKP-L-ResinA) 의 맥락상 상기 설명된 바와 같이 2 개의 반응성 관능기 HGroup-FunSiteN 및 HGroup-FunSiteC 를 갖는다. 반응성 관능기 HGroup-FunSiteN 은 바람직하게는 OH 또는 NH2, 더 바람직하게는 NH2 이다. 반응성 관능기 HGroup-FunSiteN 은 연결기 CG-HG (CG-HG 는 -O-, -S- 또는 -N(H)- 임) 로서 보호 또는 커플링된 상태로 존재한다.
반응성 관능기 HGroup-FunSiteC 는 통상적으로 비보호되고, 각각의 커플링 반응에서의 커플링 부위이다. 바람직하게는, 반응성 관능기 HGroup-FunSiteC 는 카르복실산 기이다. 상기 커플링 반응 이후, 반응성 관능기 HGroup-FunSiteN 의 임의의 보호기를 절단하여 반응성 관능기 HGroup-FunSiteN 을 다음 커플링 반응에 이용가능하게 한다.
바람직하게는, 화합물 HGroup 은 식 (HGroupF-I) 의 화합물, 식 (HGroupF-II) 의 화합물, 식 (HGroupF-III) 의 화합물, 식 (HGroupF-IV) 의 화합물, 식 (HGroupF-V) 의 화합물 및 식 (HGroupF-VI) 의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[식 중,
R1, R2, R3, R4, R10 및 R11 은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같고,
s1-1, s2, s3, s4 및 s6 은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같고,
s5-1 은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같고,
s1-2, s5-2 및 s5-3 은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같고,
T1-1 은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같고,
T1-2 및 T5-1 은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같고;
H-PGHG 는, 화합물 HGroup 이 T1-1 이 O 인 경우의 식 (HGroupF-I) 의 화합물, 식 (HGroupF-IV) 의 화합물 및 식 (HGroupF-V) 의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 경우에 수소이고;
H-PGHG 는, 화합물 HGroup 이 T1-1 이 NH 인 경우의 식 (HGroupF-I) 의 화합물, 식 (HGroupF-II) 의 화합물, 식 (HGroupF-III) 의 화합물 및 식 (HGroupF-VI) 의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 경우에 보호기 PGHG 임].
화합물 HGroup 이 HG 유래인 경우 (HG 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음),
HG 의 상기 설명 중 어느 하나에서의 (*) 은, 화합물 HGroup 의 경우에 HG 가, T1-1 이 O 인 경우의 식 (HGF-I) 의 핸들기, 식 (HGF-IV) 의 핸들기 및 식 (HGF-V) 의 핸들기로 이루어진 군으로부터 선택되는 핸들기인 경우에 HG 및 수소 사이의 결합을 나타내고;
HG 의 상기 설명 중 어느 하나에서의 (*) 은 화합물 HGroup 의 경우에 HG 가, T1-1 이 NH 인 경우의 식 (HGF-I) 의 핸들기, 식 (HGF-II) 의 핸들기, 식 (HGF-III) 의 핸들기 및 식 (HGF-VI) 의 핸들기로 이루어진 군으로부터 선택되는 핸들기인 경우에 HG 및 보호기 PGHG 사이의 결합을 나타내고;
HG 의 상기 설명 중 어느 하나에서의 (**) 은 화합물 HGroup 의 경우에 HG 및 OH 사이의 결합을 나타낸다.
상기는, HG 의 상기 설명 중 어느 하나에서의 (*) 이 화합물 HGroup 의 경우에 HG 및 보호기 PGHG 사이의 결합을 나타내는 경우, 보호 PGHG 가 화합물 HGroup 의 커플링 이후 HG 로부터 절단되는 것을 의미한다.
따라서, 특히 바람직한 화합물 HGroup 은 식 (HG-Ia) 의 화합물, 식 (HG-Ib) 의 화합물, 식 (HG-Ic) 의 화합물, 식 (HG-Id) 의 화합물, 식 (HG-II) 의 화합물, 식 (HG-III) 의 화합물, 식 (HG-IVa) 의 화합물, 식 (HG-IVb) 의 화합물, 식 (HG-Va) 의 화합물, 식 (HG-Vb) 의 화합물 및 식 (HG-VI) 의 화합물로 이루어진 군으로부터 유래되며; PGHG 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같다.
Xaa2 잔기의 측쇄의 보호기는 PG2 와 상이하고, Xaa2 로부터 PG2 를 절단하는데 필요한 것들과 상이하고, ResinA 로부터 Xaa1 을 절단하는데 필요한 것들과 상이한 반응 하에 절단가능하다.
본 발명의 추가 대상은 하기 식 (pDKP-CPG) 의 화합물로부터 보호기 CPG 의 절단 반응 (pDKP-Cleav) 을 특징으로 하는, 식 (pDKP) 의 화합물의 제조를 위한 방법(G) 이다 (식 (pDKP) 의 화합물은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음);
[식 중,
H-PGHG, HG, n, SG, PG2, Xaa1 및 Xaa2 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기와 동일한 정의를 갖고;
CPG 는 펩티드의 C-말단 또는 아미노산의 카르복실산 기의 보호를 위한 펩티드 화학에 종래 사용되는보호기이고, 염기 절단가능한 유형 보호기, 산 절단가능한 유형 보호기 및 환원성 절단가능한 유형 보호기로 이루어진 군으로부터 선택되고;
단, 보호기 CPG 는 PG2 와 상이한 보호기이고, CPG 는 Xaa2 로부터 PG2 를 절단하는데 필요한 것들과 상이한 반응 조건 하에 절단가능하고,
단, 보호기 CPG 를 절단하는데 사용되는 반응 조건은 Xaa2 로부터 PG2 를 절단하지 않고;
H-PGHG 가 보호기 PGHG 인 경우에,
단, 보호기 CPG 는 PGHG 와 상이한 보호기이고, CPG 는 HG 로부터 PGHG 를 절단하는데 필요한 것들과 상이한 반응 조건 하에 절단가능하고,
단, 보호기 CPG 를 절단하는데 사용되는 반응 조건은 HG 로부터 PGHG 를 절단하지 않음].
CPG 는 C-PG 의 구현예이다.
식 (pDKP-CPG) 의 화합물은 상기 정의된 DKP-L 의 구현예이다.
바람직하게는, CPG 는 알릴 에스테르, Bzl (벤질, Bn 으로도 축약됨) 에스테르, Fm (9-플루오레닐메틸) 에스테르, Me (메틸) 에스테르, Et (에틸) 에스테르, Trt (트리페닐메틸 또는 트리틸 또는 Tr) 에스테르, tBu 에스테르 및 SiEt3 (트리에틸실릴 에스테르 또는 TES) 으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 보호기 CPG 가 염기 절단가능한 유형 보호기인 경우, 보호기 CPG 는 Fm, Me 및 Et 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보호기 CPG 가 산 절단가능한 유형 보호기인 경우, 보호기 CPG 는 Trt, tBu 및 SiEt3 으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
보호기 CPG 가 환원성 절단가능한 유형 보호기인 경우, 보호기 CPG 는 알릴 및 Bzl 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더 바람직하게는, CPG 는 Trt 또는 Bzl 이다.
바람직하게는, PG2 는 Fmoc 이고,
CPG 는 알릴이고;
바람직하게는, 가능한 PGHG 는 Boc 이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, PG2 는 Alloc 이고,
CPG 는 Fmoc 이고;
바람직하게는, 가능한 PGHG 는 tBu, Trt, Mtt, Mmt 및 Ddz 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, PG2 는 tBu, Trt, Cl-Trt, Mtt, Mmt 및 Ddz 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
CPG 는 알릴이고;
바람직하게는, 가능한 PGHG 는 Fmoc 이다.
더 바람직하게는, PG2 는 Trt 이고,
CPG 는 알릴이고;
바람직하게는, 가능한 PGHG 는 Fmoc 이다.
본 발명의 추가 대상은 식 (pDKP-CPG) 의 화합물의 제조를 위한 방법(H) 로 (식 (pDKP-CPG) 의 화합물은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음), 상기 방법(H) 는 n 이 0 인 경우의 단계 (H1A) 를 포함하거나; 또는 방법(H) 는 n 이 1 인 경우의 단계 (H3A) 및 단계 (H3B) 로, 단계 (H3B) 가 단계 (H3A) 이후에 수행되는 것을 포함하며 (n 은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음);
이때 단계 (H3A) 는 하기 식 (pDKP-PG2) 의 화합물:
[식 중,
PG2, Xaa1, Xaa2 및 CPG 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기와 동일한 정의를 갖고;
(6) 으로 나타내는 H 는 FG 의 수소이며, FG 는 또한 상기 정의된 바와 같은 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음]
과 화합물 SGroup 과의 커플링 반응 (H3A-Coup) 으로 (화합물 SGroup 은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음) 하기 식 (pDKP-SG) 의 화합물:
[식 중,
SG, PG2, Xaa1, Xaa2 및 CPG 는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기와 동일한 정의를 갖고;
(7) 로 나타내는 H 는 반응성 관능기 SGroup-FunSiteN 의 수소임];
을 제공하며;
화합물 SGroup 의 반응성 관능기 SGroup-FunSiteN 이 보호기 PGSG 에 의해 보호되는 경우에, 단계 (H3A) 이후의 연속적 단계 (H-ConC) 에서 보호 PGSG 는 SG 로부터 절단되고;
단, 보호기 PGSG 는 PG2 와 상이한 보호기이고, PGSG 는 Xaa2 로부터 PG2 를 절단하는데 필요한 것들과 상이한 반응 조건 하에 절단가능하고,
추가로 단, 보호기 PGSG 를 절단하는데 사용되는 반응 조건은 Xaa2 로부터 PG2 를 절단하지 않고,
추가로 단, 단계 (H-ConC) 에서 보호기 PGSG 를 절단하는데 사용되는 반응 조건은 ResinA 로부터 Xaa1 을 절단하지 않고;
단계 (H3B) 는 식 (pDKP-SG) 의 화합물과 화합물 HGroup 과의 커플링 반응 (H3B-Coup) 이고 (화합물 HGroup 은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음);
단계 (H1A) 는 식 (pDKP-PG2) 의 화합물과 화합물 HGroup 과의 커플링 반응 (H1A-Coup) 이고 (화합물 HGroup 은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음);
화합물 HGroup 의 반응성 관능기 HGroup-FunSiteN 이 보호기 PGHG 에 의해 보호되는 경우, 단계 (H3B) 또는 단계 (H1A) 이후의 연속적 단계 (H-ConA) 에서, 보호 PGHG 는 HG 로부터 절단되고;
단, 보호기 PGHG 는 PG2 와 상이한 보호기이고, PGHG 는 Xaa2 로부터 PG2 를 절단하는데 필요한 것들과 상이한 반응 조건 하에 절단가능하고;
추가로 단, 보호기 PGHG 를 절단하는데 사용되는 반응 조건은 Xaa2 로부터 PG2 를 절단하지 않고;
추가로 단, 단계 (H-ConA) 에서 보호기 PGHG 를 절단하는데 사용되는 반응 조건은 ResinA 로부터 Xaa1 을 절단하지 않는다.
방법(H) 가 상기 정의된 방법(DKP-L) 에 포함된다.
식 (pDKP-PG2) 의 화합물 및 식 (pDKP-SG) 의 화합물은 상기 정의된 방법(DKP-L) 의 중간체의 구현예이다.
Xaa2 잔기의 측쇄의 보호기는 PG2 와 상이하고, Xaa2 로부터 PG2 를 절단하는데 필요한 것들과 상이하고 Xaa1 로부터 CPG 를 절단하는데 필요한 것들과 상이한 조건 하에 절단가능하다.
바람직하게는, 상기 정의된 방법은 연속적으로 수행되고, 방법(B) 는 방법(C) 이후에 수행되고, 방법(C) 는 방법(D) 이후에 수행되고, 방법(D) 는 방법(E) 이후에 수행되고, 방법(E) 는 방법(F) 이후에 수행되고; 방법(G) 는 임의로는 방법(F) 이전에 수행되고, 방법(H) 는 방법(G) 이전에 수행되고; 상기 정의된 각각의 화합물은 상기 경우에 식 (III-H) 의 화합물의 상기 순서의 제조 방법에서의 중간체이다.
본 발명의 추가 대상은 하기 방법이다:
1. 식 (III-H) 의 화합물을 방법(B) 에 의해 제조하는 방법(A);
2. 식 (III-H) 의 화합물을 방법(B) 에 의해 제조하고;
방법(B) 의 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물을 방법(C) 에 의해 제조하는 방법(A);
3. 식 (III-H) 의 화합물을 방법(B) 에 의해 제조하고;
방법(B) 의 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물을 방법(C) 에 의해 제조하고;
방법(C) 의 식 (II-PG2) 의 화합물을 방법(D) 에 의해 제조하는 방법(A);
4. 식 (III-H) 의 화합물을 방법(B) 에 의해 제조하고;
방법(B) 의 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물을 방법(C) 에 의해 제조하고;
방법(C) 의 식 (II-PG2) 의 화합물을 방법(D) 에 의해 제조하고;
방법(D) 의 식 (II-XaaC(1)) 의 화합물을 방법(E) 에 의해 제조하는 방법(A);
5. 식 (III-H) 의 화합물을 방법(B) 에 의해 제조하고;
방법(B) 의 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물을 방법(C) 에 의해 제조하고;
방법(C) 의 식 (II-PG2) 의 화합물을 방법(D) 에 의해 제조하고;
방법(D) 의 식 (II-XaaC(1)) 의 화합물을 방법(E) 에 의해 제조하고;
방법(E) 의 식 (I-HG) 의 화합물을 방법(F) 에 의해 제조하는 방법(A);
6. 식 (III-H) 의 화합물을 방법(B) 에 의해 제조하고;
방법(B) 의 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물을 방법(C) 에 의해 제조하고;
방법(C) 의 식 (II-PG2) 의 화합물을 방법(D) 에 의해 제조하고;
방법(D) 의 식 (II-XaaC(1)) 의 화합물을 방법(E) 에 의해 제조하고;
방법(E) 의 식 (I-HG) 의 화합물을 방법(F) 에 의해 제조하고;
방법(F) 의 식 (pDKP) 의 화합물을 방법(G) 에 의해 제조하는 방법(A);
7. 식 (III-H) 의 화합물을 방법(B) 에 의해 제조하고;
방법(B) 의 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물을 방법(C) 에 의해 제조하고;
방법(C) 의 식 (II-PG2) 의 화합물을 방법(D) 에 의해 제조하고;
방법(D) 의 식 (II-XaaC(1)) 의 화합물을 방법(E) 에 의해 제조하고;
방법(E) 의 식 (I-HG) 의 화합물을 방법(F) 에 의해 제조하고;
방법(F) 의 식 (pDKP) 의 화합물을 방법(G) 에 의해 제조하고;
방법(G) 의 식 (pDKP-CPG) 의 화합물을 방법(H) 에 의해 제조하는 방법(A).
방법(A) 는 방법(PEP-HSPPS) 의 단계 (ii-pep) 의 구현예이다.
방법(B) 는 바람직하게는 방법(C-PEP) 에 포함된다.
방법(C) 의 단계 (b) 는 방법(C-PEP) 의 단계 (iii) 의 구현예이다.
방법(C) 의 단계 (a) 는 방법(C-PEP) 의 단계 (iii) 의 바람직한 구현예에 포함된다.
방법(D) 는 방법(C-PEP) 의 단계 (ii) 의 구현예이다.
방법(E) 는 방법(C-PEP) 의 단계 (i) 의 구현예이다.
방법(F) 의 단계 (F4) 는 방법(X2) 의 구현예이다.
방법(F) 의 단계 (F3A) 는 방법(X1) 의 단계 (X1-iii) 의 구현예이다.
방법(F) 의 단계 (F3B) 는 방법(X1) 의 단계 (X1-iv) 의 구현예이다.
방법(F) 의 단계 (F1A) 는 방법(X1) 의 단계 (X1-iv) 의 구현예이다.
방법(G) 는 방법(DKP-L) 의 구현예이다.
방법(DKP-L) 의 단계 (DKP-L-i), 임의 단계 (DKP-L-ii) 및 단계 (DKP-L-iii) 이 연속적으로 수행되는 경우, 방법(H) 의 단계 (H1) 은 단계 (DKP-L-i) 의 구현예이고, 방법(H) 의 단계 (H3A) 및 (H3B) 는 단계 (DKP-L-ii) 및 (DKP-L-iii) 의 구현예이다.
따라서, 본 발명의 추가 대상은 하기 방법이다:
(a) 단계 (ii-pep) 가 방법(A) 인 방법(PEP-HSPPS);
(b) 방법(B) 를 포함하는 방법(C-PEP);
(c) 단계 (iii) 이 방법(C) 의 단계 (b) 를 포함하는 방법(C-PEP);
(d) 단계 (iii) 이 방법(C) 의 단계 (a) 를 포함하는 방법(C-PEP);
(e) 단계 (ii) 가 방법(D) 를 포함하는 방법(C-PEP);
(f) 단계 (i) 이 방법(E) 를 포함하는 방법(C-PEP);
(g) 방법(X2) 가 방법(F) 의 단계 (F4) 를 포함하는 방법(DKP-L-ResinA);
(h) 방법(X1) 의 단계 (X1-iii) 이 방법(F) 의 단계 (F3A) 를 포함하는 방법(DKP-L-ResinA);
(i) 방법(X1) 의 단계 (X1-iv) 가 방법(F) 의 단계 (F3B) 를 포함하는 방법(DKP-L-ResinA);
(j) 방법(X1) 의 단계 (X1-iv) 가 방법(F) 의 단계 (F1A) 를 포함하는 방법(DKP-L-ResinA);
(k) 방법(G) 를 포함하는 방법(DKP-L);
(l) 단계 (DKP-L-i), 임의 단계 (DKP-L-ii) 및 단계 (DKP-L-iii) 이 연속적으로 수행되고, 단계 (DKP-L-i) 이 방법(H) 의 단계 (H1) 을 포함하고, 단계 (DKP-L-ii) 및 (DKP-L-iii) 이 방법(H) 의 단계 (H3A) 및 (H3B) 를 포함하는 방법(DKP-L).
본 발명의 추가 대상은 식 (III-H) 의 화합물, 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물, 식 (II-PG2) 의 화합물, 식 (II-H) 의 화합물, 식 (II-XaaC(1)) 의 화합물, 식 (I-HG) 의 화합물, 식 (I-SG) 의 화합물, 식 (pDKP) 의 화합물, 식 (pDKP-CPG) 의 화합물 및 식 (pDKP-SG) 의 화합물이다 (식 (III-H) 의 화합물, 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물, 식 (II-PG2) 의 화합물, 식 (II-H) 의 화합물, 식 (II-XaaC(1)) 의 화합물, 식 (I-HG) 의 화합물, 식 (I-SG) 의 화합물, 식 (pDKP) 의 화합물, 식 (pDKP-CPG) 의 화합물 및 식 (pDKP-SG) 의 화합물은 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음).
식 (I-HG) 의 화합물은 DKP-L-ResinA 의 하나의 구현예이다.
식 (I-PG2) 의 화합물은 공지된 화합물이고, 종래의 SPPS 이후 Xaa2 잔기의 측쇄를 탈보호시켜 제조될 수 있다.
식 (pDKP-PG2) 의 화합물은 공지된 화합물이고, N-말단 및 측쇄 보호된 아미노산 PG2-Xaa2 와 C-말단 보호된 아미노산 Xaa1-CPG 와의 종래의 커플링 이후 Xaa2 잔기의 측쇄를 탈보호시켜 제조될 수 있다.
본 발명의 추가 대상은 하기이다:
(u1) 펩티드 화학;
펩티드 제조; 또는
펩티드의 제조 방법; 또는
펩티드의 제조 방법의 단계; 또는
펩티드 커플링 반응; 또는
펩티드의 제조를 위한 SPPS; 또는
펩티드의 제조를 위한 HSPPS 에서의
식 (III-H) 의 화합물, 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물, 식 (II-PG2) 의 화합물, 식 (II-H) 의 화합물, 식 (II-XaaC(1)) 의 화합물, 식 (I-HG) 의 화합물, 식 (I-SG) 의 화합물, 식 (pDKP) 의 화합물, 식 (pDKP-CPG) 의 화합물 및 식 (pDKP-SG) 의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물의 용도; 또는 DKP-PG 형성 연결제로서의 식 (pDKP) 의 화합물 또는 식 (pDKP-CPG) 의 화합물의 용도;
(u2) 식 (III-H) 의 화합물의 제조를 위한, 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물의 용도;
(u3) 식 (II-H) 의 화합물 또는 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물의 제조를 위한, 식 (II-PG2) 의 화합물의 용도;
(u4) 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물의 제조를 위한, 식 (II-H) 의 화합물의 용도;
(u5) 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물의 제조를 위한, 식 (II-XaaC(1)) 의 화합물의 용도;
(u6) 식 (II-XaaC(1)) 의 화합물의 제조를 위한, 식 (I-HG) 의 화합물의 용도;
(u7) 식 (I-HG) 의 화합물의 제조를 위한, 식 (I-SG) 의 화합물의 용도;
(u8) 식 (I-HG) 의 화합물의 제조를 위한, 식 (pDKP) 의 화합물의 용도;
(u9) 식 (pDKP) 의 화합물의 제조를 위한, 식 (pDKP-CPG) 의 화합물의 용도;
(u9) 식 (pDKP-CPG 의 화합물의 제조를 위한, 식 (pDKP-SG) 의 화합물의 용도;
(u10) 식 (pDKP-SG) 의 화합물의 제조 또는 식 (pDKP-CPG) 의 화합물의 제조를 위한, 식 (pDKP-PG2) 의 화합물의 용도;
(u11) 식 (I-SG) 의 화합물의 제조 또는 식 (I-HG) 의 화합물의 제조를 위한, 식 (I-PG2) 의 화합물의 용도;
(u12) 식 (III-H) 의 화합물의 제조에서의 또는 그의 제조를 위한, 식 (III-PGXaaC(pc)) 의 화합물, 식 (II-PG2) 의 화합물, 식 (II-H) 의 화합물, 식 (II-XaaC(1)) 의 화합물, 식 (I-HG) 의 화합물, 식 (I-SG) 의 화합물, 식 (pDKP) 의 화합물, 식 (pDKP-CPG) 의 화합물 및 식 (pDKP-SG) 의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물의 용도;
(u13) 보호기로서, 바람직하게는 펩티드 화학에서의 보호기로서, 바람직하게는 C-말단 보호기로서의 식 (III-res) 의 잔기 또는 잔기 DKP-PG 의 용도 (이들 화합물 및 잔기는 또한 모든 그 바람직한 구현예와 함께 상기 정의된 바와 같음).
본 발명은 하나의 단일 단계로 SPPS 로의 그 제조 및 그 C-말단 보호 이후의 지지성 수지로부터의 목적하는 펩티드의 C-말단 단편의 절단을 가능하게 하고, 상기는 종래의 2 개의 단계 절차, 즉 첫 번째로 지지성 수지로부터의 절단 및 두 번째로는 C-말단의 보호와 비교시, 보다 완전한 반응 및/또는 보다 적은 목적하지 않은 부반응으로 인한 고수율을 위해 추가의 공정 단계, 반응 시간, 시약 및 장비가 필요하지 않으며, 즉 전체 절차가 보다 신속하고 경제적이고, 보호된 펩티드가 때로는 유기 용매 중에 매우 잘 용해되지 않으므로 용해성 문제가 거의 없고, 펩티드의 에피머화의 위험이 거의 없다.
또한, 펩티드 아미드의 하이브리드 합성을 위해, 본 발명은 개별적 단계로 우선 C-말단으로부터 위치 2 의 아미노산으로 개시함으로 C-말단 단편을 제조하고, C-말단으로부터 위치 1 의 아미노산을 첨가하는 것과 같은 다중 단계 접근법을 생략하는, C-말단 단편의 제조 방법에 대해 제공한다. 상기 방법은 측쇄 보호기의 부분 손실을 방지하고, 아미노 카르복사미드의 커플링으로 인한 펩티드의 에피머화의 위험을 방지하고, 공정 단계, 시간, 시약 및 장비가 덜 필요하고, 이로 인해 상기 방법은 보다 완전한 반응, 보다 적은 공정 단계 및 보다 적은 원치않는 부반응으로 인해 고수율을 갖는다.
본 발명의 추가적 이점은 HSHSPPS 에서 Rink 아미드 핸들을 사용하는 것이다. 통상적으로, Rink 아미드 핸들 개질된 수지로부터 SPPS 이후에 펩티드를 절단하는 경우, 펩티드의 측쇄의 전체 탈보호가 동시에 발생하고, 이로 인해 Rink 아미드 핸들은 통상적으로 HSHSPPS 에 사용되지 않는다. 본 발명으로 인해, Rink 아미드 핸들은 C-말단 DKP 링커 기에 남아 있고, 이로써 펩티드 단편은 HSPPS 에서 C-말단 단편으로서 사용가능해지고, C-말단 링커 기를 포함하는 Rink 아미드 핸들은 최종적으로 표적 펩티드를 제공하는 최종 단계에서 측쇄 보호기와 함께 절단된다.
본 발명의 방법의 또 다른 이점은 C-말단으로서 아미드를 갖는, HSPPS 에 사용되는 측쇄 보호된 단편 C-PEP 의 제조 가능성이다. 상기 펩티드는 통상적으로 Sieber 핸들을 포함하는 Sieber 아미드 수지를 사용해 제조된다. Sieber 아미드 수지를 사용하는 경우의 특별한 절단 조건은 측쇄 탈보호 없이 수지로부터 펩티드를 절단할 필요가 있는 반면, 통상적 절단 조건은 또한 Sieber 아미드 수지의 경우에 측쇄 일부의 적어도 부분 탈보호를 유도한다. Sieber 핸들이 링커에서 핸들기 HG 로서 사용되고 링커의 핸들기로부터의 펩티드의 절단은 HSHSPPS 에서 매우 최종적 단계로 연기되고 글로벌 탈보호 조건 하에 수행될 수 있기 때문에, 그 C-말단에 아미드를 갖는 단편 C-PEP 의 제조를 위한 본 발명의 방법을 사용하는 경우, Sieber 핸들의 적용가능성이 확대되는 반면, HSPPS 에서 C-말단 단편으로서 사용되는 펩티드 단편을 포함하는 DKP 링커 기를 제공하는 수지로부터의 필요한 절단은 측쇄 보호기를 절단할 것들과 상이한 조건 하에 수행되고, DKP 링커 기의 동시 발생으로 수지로부터의 링커의 절단에 사용되는 이들 조건은 Sieber 핸들 부분으로부터의 펩티드의 절단 또는 측쇄 탈보호 모두를 유도하지 않는다. 상기는 특이적 절단 조건을 필요로 하지 않으면서 측쇄 보호된 펩티드 단편 합성에 있어서 Sieber 핸들의 사용 범위를 확대한다.
Xaa1 이 식 (HypX) 의 화합물인 경우, DKP 링커 기를 포함하는 펩티딜 단편의 용해도를 식 (Sub-R8) 의 R8 에 대한 용해도 향상 치환기를 사용해 매우 향상시킬 수 있고, 따라서 장쇄 아미노산을 갖는 C-말단 단편을 사용하는 HSPPS 가, 필요하다면 수많은 아미노산 잔기를 갖는 표적 펩티드가 수많은 단편으로부터 합성되는 경우 가능해지고, DKP 링커 기를 포함하는 제 1 C-말단 단편은 반복적 HSPPS 에 의해 연속적 PEP-N 단편에 연속적으로 커플링된다.
나아가, 스패이서 기 SG 의 사용 가능성은 HSPPS 에서 단편 C-PEP 의 보다 높은 용해도를 위해 제공될 수 있고, 따라서 장쇄 아미노산을 갖는 C-말단 단편을 사용하는 HSPPS 가, 필요하다면 수많은 아미노산 잔기를 갖는 표적 펩티드가 수많은 단편으로부터 합성되는 경우 가능해지고, DKP 링커 기를 포함하는 제 1 C-말단 단편은 반복적 HSPPS 에 의해 연속적 PEP-N 단편에 연속적으로 커플링된다.
나아가, 스패이서 기 SG 는 고체 지지체로부터 벗어나 SPPS 동안에 아미노산 빌딩 블록이 연속적으로 커플링되는 N-말단인 반응 중심을 공간적으로 제거하고, 이로 인해 용해된 시약, 부가제, 아미노산 빌딩 블록 등에 대한 반응 중심의 접근성이 매우 개선된다.
실시예
약어 및 원료
달리 언급되지 않는 한, 하기 약어 및 원료는 하기와 같이 사용되었다.
Ac 아세틸
ACN 아세토니트릴
CTC 수지 2-클로로트리틸 클로라이드 수지 (비드 (bead), 100 내지 200 메시 (상기 메시는 "American Society for Testing and Materials international (ASTM international)" 에 따라 측정됨), 1.57 mmol/g, "mmol/g" 은 "mmol 활성 부위 / g 수지" 를 의미함)
DBF-부가물 1-(9H-플루오렌-9-일메틸)피페리딘
DCM 디클로로메탄
DIEA 디이소프로필에틸아민
DIPE 디이소프로필 에테르
DIPCDI N,N'-디이소프로필카르보디이미드
DMAP 4-디메틸아미노피리딘
DMB 1,3-디메톡시벤젠
DMF N,N-디메틸포름아미드
eq 당량
eq 는 달리 언급되지 않는 한, 수지의 반응 부위의 몰에 대한 몰-당량을 의미한다.
Fmoc-Rink-OH 4'-{(R,S)-알파-[l-(9-플루오레닐)메톡시카르보닐아미노]-2,4-디메톡시벤질}-페녹시아세트산, 또한 소위 p-{(R,S)-a-[l-(9H-플루오렌-9-일)-메톡시포름아미도]-2,4-디메톡시벤질}-페녹시아세트산, 또한 Fmoc-Rink 아미드 핸들 (hand1e) 로 지칭
Fmoc-Rink-OH 는 화학식 (HG-Ia) 의 핸들기이며, 식 중 (*) 로 표시되는 결합은 Fmoc 의 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기에 연결되고, (**) 로 표시되는 결합은 OH 에 연결된다.
Fmoc-Rink-OH 는 PGHG 가 Fmoc 인 화학식 (HGroup-Ia) 의 화합물이다.
Fmoc-Ramage-OH [R,S]-2-{[5-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐아미노)-디벤조[a,d]시클로헵탄-2-일]옥시}-아세트산, 또한 Fmoc-Suberol, CAS 212783-75-0, 또한 소위 Fmoc-Ramage 핸들로 지칭
Fmoc-Ramage-OH 는 화학식 (HG-VI) 의 핸들기이며, 식 중 (*) 로 표시되는 결합은 Fmoc 의 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐에 연결되고, (**) 로 표시되는 결합은 OH 에 연결된다.
Fmoc-Ramage-OH 는 PGHG 가 Fmoc 인 화학식 (HGroup-VI) 의 화합물이다.
Fmoc-TTDS-OH [N-1[9-플루오레닐메톡시카르보닐]-1,13-디아미노-4,7, 10-트리옥사트리데칸-숙시남산, CAS 172089-14-4
TTDS 는 화학식 (SG-I) 의 스페이서 (spacer) 기이며, 식 중 m1 은 3 이다.
Fmoc-TTDS-OH 는 화합물 SGroup1 이며, 식 중 m1 은 3 이다.
HMPA 4-히드록시메틸페녹시아세트산, CAS 68858-21-9
HMPA 는 화학식 (HG-IVa) 의 핸들기이며, 식 중 (*) 및 (**) 로 표시되는 결합은 OH 에 연결된다.
HMPA 는 화학식 (HGroup-IVa) 의 화합물이다.
HCTU 2-(6-클로로-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸암모늄 헥사플루오로포스페이트
HMPS 수지 히드록시메틸폴리스티렌 수지 (비드, 100 내지 200 메시 (상기 메시는 "American Society for Testing and Materials international (ASTM international)" 에 따라 측정됨, 0.98 mmol/g, "mmol/g" 은 "mmol 활성 부위 / g 수지" 를 의미함)
HOBt 1-히드록시벤조트리아졸 (물 함량 약 12% (w/w))
min 분
MW 분자량
Oxyma 에틸 2-시아노-2-(히드록시이미노)아세테이트
PVDF 폴리비닐리덴 플루오라이드
RP-HPLC 역상 고성능 액체 크로마토그래피
RP-HPLC-ESMS 역상 고성능 액체 크로마토그래피 전자분무 질량 분광계
수지 로딩 (loading) 수지의 g 당 펩티드의 mmol
RT 실온
s 초
서열 약어:
T20 Ac[T20-1-36]NH2 (본 서열은 CAS 159519-65-0 로 등록되어 있음)
T20C H[T20-27-36]NH2
BocT20N Boc[T20-17-26]OH
HT20N H[T20-17-26]OH
HT20F H[T20-17-36]NH2
TIS 트리이소프로필실란
UV 자외선
상기 서열 목록은 서열 대 서열의 약어로 연결되어 있다.
예컨대, [T20-1-36] 은 아미노산 잔기 1 내지 36 으로 이루어진 T20 펩티드의 서열로, 여기서 왼쪽의 숫자는 N-말단 아미노산 잔기를 나타내고, 오른쪽 숫자는 C-말단 아미노산 잔기를 나타낸다.
방법 설명
A) 수지 로딩의 결정
수지 로딩은 290 nm 에서 UV 흡광도를 측정하는 Fmoc 기 측정에 따라 정량화하였다. UV 흡광도 측정은 Shimadzu UV-Vis 기록 (recording) 분광광도계 (UV-2501 PC) 상에서 수행하였다.
단계 1 Fmoc 기 탈보호로부터 용액의 수집:
Fmoc 기를 실시예에 기재된 바와 같이 제거하였다. VA-ml 유리 메스플라스크 A 에, Fmoc 기 탈보호로부터 수득한 용액을 수집하였다. 상기 VA-ml 유리 메스플라스크 A 를 DMF 로 완전히 충전하였다.
단계 2 UV 측정용 희석 용액:
VA-ml 유리 메스플라스크 A 로부터의 VC-ml 분취액을 또 다른 VB-ml 유리 메스플라스크 B 로 옮긴 후, 이를 DMF 로 완전히 충전하였다. 3 가지 상이한 희석 VB-ml 용액을 제조하고, 290 nm 에서 UV 분광법에 따라 측정하여, 대표되는 흡광도 값을 얻었다.
단계 3 UV 분광광도법에 의한 정량화:
1 cm 경로 길이의 UV 석영 셀을 DMF (표준 용액) 으로 충전하고, 290 nm (디벤조풀벤의 최대 흡광도 파장) 에서 분광광도계 내에 위치시켜 0 으로 맞추었다. 상기 UV 셀을 희석 용액 B 로 2 번 세정한 후, 상기 용액으로 충전하고, 이의 흡광도를 290 nm 에서 측정하였다.
마지막으로, 수지 로딩을 하기 방정식에 따라 계산하였다:
A290: 측정된 흡광도 값
셀 길이: 1 (cm)
VA: 유리 메스플라스크 A 의 부피 (ml)
VB: 유리 메스플라스크 B 의 부피 (ml)
VC: A 에서 B 로 옮겨진 분취액 부피 (ml)
엡실론290: 290 nm 에서의 디벤조풀벤의 몰 흡광 계수; 5800 M-1cm-1
B) RP-HPLC 및 RP-HPLC-ESMS 분석에 의한 특징화
B1) RP-HPLC 분석
RP-HPLC 분석을 분리 모듈 (Waters 2695), 자동 주입기 (Waters 717 오토 샘플러) 및 UV 포토다이오드 어레이 검출기 (Waters 2998) 를 포함하는 Waters 기기 상에서 수행하였고, 각각의 경우에 있어서 특정화된, 이동상 B 의 이동상 A 로의 선형 구배를 사용하였다.
단계 1 샘플 제조:
이동상 A: 수성 TFA 0.045% (v/v)
이동상 B: ACN 중의 TFA 0.036% (v/v)
0.5 내지 1 mg 범위의 특정량의 샘플을 H20/ACN (1:1, (v/v)) 의 혼합물 약 0.5 내지 1 ml 중에 용해시키고, 상기 용액을 기공 크기 0.45 ㎛, 직경 4 mm 의 PVDF 소수성 여과기를 통해 여과하였다.
단계 2 크로마토그래피 조건:
컬럼: SunFire C18, 3.5 ㎛, 4.6 x 100 mm
오븐: 실온 (RT)
유속: 1.0 ml/분
검출 파장: 220 nm
구배 실행 시간: 8 분
구배 조성: 실시예에서 구체화된 바와 같은 이동상 B x 내지 y % (v/v)
주입 전에, 상기 컬럼을 초기 조건에서 3 분 동안 유지시키고, 각각의 실행 후, 상기 컬럼을 ACN 으로 3 분 동안 세정하였다.
단계 3 크로마토그래피 프로파일 분석:
모든 크로마토그래피 피크 영역의 측정값은 상기 합성으로부터의 생성물과 관련되어 있었다. 이러한 영역 비율을 예상되는 생성물의 순도의 백분율 (%) 로서 채택하였다.
B2) RP-HPLC-ESMS 분석
RP-HPLC-ESMS 분석을 분리 모듈 (Waters 2695), 자동 주입기 (Waters 717 오토 샘플러) 및 UV 포토다이오드 어레이 검출기 (Waters 2998) 를 포함하는 Waters Micromass ZQ 분광계 상에서 수행하였고, 이동상 B 의 이동상 A 로의 선형 구배를 사용하였다.
단계 1 샘플 제조:
이동상 A: 수성 포름산 0.1% (v/v)
이동상 B: ACN 중의 포름산 0.07% (v/v)
0.5 내지 1 mg 범위의 특정량의 샘플을 H20/ACN (1:1, (v/v)) 의 혼합물 약 0.5 내지 1 ml 중에 용해시키고, 상기 용액을 기공 크기 0.45 ㎛, 직경 4 mm 의 PVDF 소수성 여과기를 통해 여과하였다.
단계 2 크로마토그래피-질량 분광법 조건:
컬럼: SunFire C18, 3.5 ㎛, 2.1 x 100 mm
오븐: 실온
유속: 0.3 ml/분
검출 파장: 220 nm
구배 실행 시간: 8 분
구배 조성: 실시예에서 구체화된 바와 같은 이동상 B x 내지 y % (v/v)
질량 범위 m/z (양이온 모드): 500 내지 2500 Da
주입 전에, 상기 컬럼을 초기 조건에서 3 분 동안 유지시키고, 각각의 실행 후, 상기 컬럼을 ACN 으로 3 분 동안 세정하였다.
단계 3 크로마토그래피-질량 분광법 분석
각각의 피크에 대한 UV 및 MS 스펙트럼을 분석하여, 각각의 피크에 대한 분자의 이온 질량을 결정하였다.
B3) RP-HPLC 분석
RP-HPLC 분석을 분리 모듈, 자동 주입기 및 UV 포토다이오드 어레이 검출기를 포함하는 Agilent 1100 Series 기기 상에서, 이동상 C 및 D 의 구배로 수행하였다.
단계 1 샘플 제조:
이동상 D: 수성 TFA 0.1% v/v
이동상 C: ACN 중의 TFA 0.085% (v/v)
0.5 내지 1 mg 범위의 특정량의 샘플을 H20/ACN (1:2, (v/v)) 의 혼합물 약 0.5 내지 1 ml 중에 용해시켰다.
단계 2 크로마토그래피 조건
컬럼: Waters X-Terra MS C18, 3.5 ㎛, 4.6 x 150 mm
오븐: 35℃
유속: 1.0 ml/분
검출 파장: 220 nm
구배 실행 시간: 25 분
구배 조성: 이동상 C 10 내지 97% (v/v)
주입 전에, 상기 컬럼을 초기 조건에서 2 분 동안 유지시키고, 각각의 실행 후, 상기 컬럼을 2 분 동안 세정하였다.
단계 3 크로마토그래피 프로파일 분석:
모든 크로마토그래피 피크 영역의 측정값은 상기 합성으로부터의 생성물과 관련되어 있었다. 이러한 영역 비율을 예상되는 생성물의 순도의 백분율 (%) 로서 채택하였다.
B4) RP-HPLC-ESMS 분석
RP-HPLC-ESMS 분석을 Waters 2690 상에서 수행하였고, 이동상 B 의 이동상 A 로의 구배를 사용하였다.
단계 1 샘플 제조:
이동상 A: 수성 트리플루오로아세트산 0.1% (v/v)
이동상 B: ACN 중의 트리플루오로아세트산 0.085% (v/v)
0.5 내지 1 mg 범위의 특정량의 샘플을 H20/ACN (1:1, (v/v)) 의 혼합물 약 0.5 내지 1 ml 중에 용해시키고, 상기 용액을 기공 크기 0.45 ㎛, 직경 4 mm 의 PVDF 소수성 여과기를 통해 여과하였다.
단계 2 크로마토그래피-질량 분광법 조건:
컬럼: Waters XTerra MS C18; 150 x 4.6 mm
오븐: 35℃
유속: 1 ml/분
검출 파장: 220 nm
실행 시간: 30 분
구배 조성: 20 분 동안 이동상 B 10 내지 97 % (v/v), 2 분 동안 이동상 B 97 % (v/v), 1 분 동안 이동상 B 97 내지 10 % (v/v), 7 분 동안 이동상 B 10 % (v/v)
주입 전에, 상기 컬럼을 초기 조건에서 3 분 동안 유지시키고, 각각의 실행 후, 상기 컬럼을 ACN 으로 3 분 동안 세정하였다.
단계 3 크로마토그래피-질량 분광법 분석
각각의 피크에 대한 UV 및 MS 스펙트럼을 분석하여, 각각의 피크에 대한 분자의 이온 질량을 결정하였다.
질량 범위 m/z (양이온 모드): 500 내지 2500 Da
C) 닌하이드린 (ninhydrin) 시험
시약 용액의 제조
시약 용액 A: 페놀 (40 g) 을 EtOH (10 ml) 중에 용해시켰다. 물 (100 ml) 중의 KCN (65 mg) 의 용액을 피리딘 (닌하이드린을 통해 새로 증류된 것, 100 ml) 에 첨가하였다. 두 가지 용액을 모두 45 분 동안 혼상식 (mixed-bed) 이온 교환 수지와 함께 교반하고, 여과하고, 혼합하였다.
시약 용액 B: 무수 EtOH (50 ml) 중의 닌하이드린 (2.5 g) 의 용액을 제조하고, 내광성 (light-proof) 용기 내에서, 바람직하게는 불활성 분위기 하에서 보존하였다.
실험 절차
수지를 DCM 으로 세정하고, 1 내지 5 mg 을 작은 유리 튜브에 옮겼다. 상기 튜브에, 6 방울의 시약 용액 A 및 2 방울의 B 를 첨가하였다. 그 후, 상기 튜브를 100℃ 에서 3 분 동안 가열하였다.
음성 시험 (유리 1 차 아민의 부재): 황색 용액 및 천연색 수지 비드.
양성 시험 (유리 1 차 아민의 존재): 진한 청색 또는 보라색 용액 및 수지 비드.
D) 클로라닐 (chloranil) 시험
시약 용액의 제조
시약 용액: 톨루엔 (100 ml) 중의 클로라닐 (4.1 g) 의 용액을 제조하였다.
실험 절차
아세톤 (1 ml) 의 작은 유리 튜브에, 1 방울의 시약 용액 및 1 방울의 시험 용액을 첨가하였다. 그 후, 상기 튜브를 10 초 동안 혼합하였다.
음성 시험 (피페리딘의 부재): 무색 내지 연황색.
양성 시험 (피페리딘의 존재): 청색 또는 보라색.
실시예
1:
디케토피페라진기
형성
디펩티딜
링커를 통해 수지 (0.1
mmol
규모)
에의
부착을 사용하는
T20C 의
SPPS
SPPS 는 수작업으로 수행하였다.
Fmoc-gr-rem 방법 (Fmoc-기-제거)
하기 실시예에서, Fmoc 기를 하기 절차에 따라 제거하였다:
수지를, 실시예 1 내지 3 및 실시예 7 에 대하여 DMF 중의 피페리딘 20% (v/v) 로 처리하고 (1 x 1 분, 2 x 10 분; 각각 3 ml), 실시예 4 내지 6 에 대하여 각각 150 ml 로 처리한 후:
실시예 1 내지 3 및 실시예 7 에 대하여 DMF 로 세정하고 (5 x 1 분; 각각 3 ml),
실시예 4 내지 6 에 대하여 DMF 로 연속 세정하고 (600 ml), 클로라닐 시험 방법 D 를 적용하였다.
실시예
1.1
디케토피페라진기
형성
디펩티딜
링커의 수지에의 부착
a) HMPS 수지의 전처리
HMPS 수지 (106.2 mg) 를 DCM (5 x 1 분; 각각 3 ml) 및 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 로 실온에서 팽윤시킨 후, 여과하였다.
b)
수지 상의
디케토피페라진기
형성
디펩티딜
링커의 제 1 아미노산 (D-Pro) 의 도입
DCM/DMF (15:1 (v/v), 2.5 ml) 중의 Fmoc-D-Pro-OH (135 mg, 4 당량) 및 DIPCDI (31 ㎕, 2 당량) 를 실시예 1.1a) 에 따라 제조된 수지에 첨가하였다. 그 후, DCM (0.5 ml) 중의 DMAP (4.9 mg, 0.4 당량) 를 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 정치시켰다. Fmoc-D-Pro-OH 의 혼입을 상기 절차에 따라 다시 한번 수행하였다. 앞선 2 시간의 커플링 후, 상기 수지를 DCM (5 x 1 분; 각각 3 ml) 및 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 로 세정하였다. 그 후, 상기 수지를 DMF (2.5 ml) 중의 아세트산 무수물 (47 ㎕, 5 당량) 및 DIEA (85 ㎕, 5 당량) 를 사용하여 실온에서 30 분 동안 캡핑하였다. 캡핑 후, 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 및 DCM (5 x 1 분; 각각 3 ml) 으로 세정하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 Fmoc-gr-rem 방법에 따라 제거하였다.
0.95 mmol/g 의 수지 로딩을 UV 정량화 (방법 설명 A; VA: 100 ml, VB: 10 ml 및 VC: 1.6 ml) 에 따라 결정하였다. 따라, 106.2 mg 의 HMPS 수지는 0.1 mmol 의 활성 부위를 나타내었다.
c) 디케토피페라진기 형성 디펩티딜 링커의 제 2 아미노산 (L-Lys) 의 도입
DMF (2 ml) 중의 Trt-L-Lys(Fmoc)-OH (198 mg, 3 당량), HOBt (50 mg, 3 당량) 및 DIPCDI (50 ㎕, 3 당량) 의 혼합물을 실온에서 5 분 동안 진탕한 후, 실시예 1.1b) 에 따라 제조된 수지에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 정치시켰다. 닌하이드린 시험 (방법 C) 에 따라 재커플링이 요구되지 않았다. 그 후, 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 및 DCM (5 x 1 분; 각각 3 ml) 으로 세정하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 Fmoc-gr-rem 방법에 따라 제거하였다.
d) Rink 아미드 핸들의 혼입
DMF (2 ml) 중의 Fmoc-Rink-OH (175 mg, 3 당량), HOBt (50 mg, 3 당량) 및 PCDI (50 ㎕, 3 당량) 를 실온에서 5 분 동안 진탕한 후, 실시예 1.1c) 에 따라 제조된 수지에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 정치시켰다. 닌하이드린 시험 (방법 C) 에 따라 재커플링이 요구되지 않았다. 앞선 1 시간의 커플링 후, 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 및 DCM (5 x 1 분; 각각 3 ml) 으로 세정하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 Fmoc-gr-rem 방법에 따라 제거하였다.
실시예 1.2
SPPS 에 의한 T20C
각각의 아미노산을 반응 사이클에서 반응시켰다. 하나의 아미노산의 혼입을 위한 1 회 반응 사이클의 반응 단계는, 하기 반응 사이클 설명 (i) 또는 (ii) 에 따른다.
a) 반응 사이클 설명 (i)
DMF (2 ml) 중의 Fmoc-Xaa-OH (3 당량), HCTU (140 mg, 3 당량) 및 DIEA (1 10 ㎕, 6 당량) 의 혼합물을 실온에서 30 초 동안 진탕한 후, 연장 서열에서의 선행 단계에 따라 제조된 수지에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 정치시켰다. 닌하이드린 시험 (방법 C) 에 따라 재커플링이 요구되지 않았다. 그 후, 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 및 DCM (5 x 1 분; 각각 3 ml) 으로 세정하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 Fmoc-gr-rem 방법에 따라 제거하였다.
b) 반응 사이클 설명 (ii)
DMF (2 ml) 중의 Fmoc-Xaa-OH (3 당량), HCTU (140 mg, 3 당량), DIEA (110 ㎕, 6 당량) 의 혼합물을 실온에서 30 초 동안 진탕한 후, 연장 서열에서의 선행 단계에 따라 제조된 수지에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 정치시켰다. DMF (2 ml) 중의 Fmoc-Xaa-OH (3 당량), HCTU (140 mg, 3 당량), DIEA (110 ㎕, 6 당량) 의 혼합물을 사용하여 재커플링을 수행하였다. 상기 혼합물을 실온에서 30 초 동안 진탕한 후, 상기 수지에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 정치시켰다. 그 후, 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 로 세정하고, 상기 수지를 DMF (2.5 ml) 중의 아세트산 무수물 (47 ㎕, 5 당량) 및 DIEA (85 ㎕, 5 당량) 를 사용하여 실온에서 15 분 동안 캡핑하였다. 그 후, 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 및 DCM (5 x 1 분; 각각 3 ml) 으로 세정하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 Fmoc-gr-rem 방법에 따라 제거하였다.
c) 연장 서열
제 1 아미노산, Fmoc-36Phe-OH 을 실시예 1.ld) 에 따라 제조된, 디케토피페라진기 형성 디펩티딜 링커 및 Rink 아미드 핸들기를 포함하는 수지에 커플링한 후, 하기의 아미노산을 연장 서열에서의 선행 단계에서 제조된, 아미노산 / 펩티드 Rink 아미드 핸들기 포함 수지에 커플링하였다. 아미노산의 혼입 서열은 하기와 같았다:
실시예 1.3
분석 - Rink 아미드 핸들기로부터 T20C 의 절단
실시예 1.2 에 따라 제조된 소량의 펩티딜-수지 (5 mg) 를 95% (v/v) TFA, 2.5% (v/v) TIS 및 2.5% (v/v) H20 로 이루어진 혼합물 1 ml 로 실온에서 1 시간 동안 처리하여, Rink 아미드 핸들기로부터 제거하였다. 상기 펩티드를 83% 의 순도로 수득하였다 (RP-HPLC, 방법 설명 B1, 이동상 B 25 내지 50).
실시예
1.4a
디케토피페라진기
형성
디펩티딜
링커의 L-
Lys 의
Trt
보호기 제거, C-말단 보호기를 포함하는
디케토피페라진
잔기의
형성 및 수지로부터의 절단
제 1 단계에서, 실시예 1.2 에 따라 제조된 펩티딜-수지 (15 mg) 를 DCM (2 ml) 중의 TFA 0.2% (v/v) 로 실온에서 2 x 5 분 동안 처리하여, 디케토피페라진기 형성 디펩티딜 링커의 L-Lys 의 Trt 보호기를 제거하였다. 그 후, 제 2 단계에서, Trt 보호된 펩티딜-수지로부터의 수득물을 DCM 중의 DIEA 5% (v/v) (2 ml) 로 실온에서 2 x 5 분 동안 세정하여 중화시켰다.
제 1 단계 후, RP-HPLC 분석에서는 수지 또는 Rink 아미드 핸들기로부터 절단된 임의의 펩티드가 나타나지 않았고, 제 2 단계 후, DKP 링커 기를 포함하는 펩티딜-수지가 관찰되지 않았다 (방법 설명 B1, 이동상 B 5 내지 100).
제 2 단계 후, 제 2 단계로부터의 펩티딜 수지를 THF 중의 피페리딘 5% (v/v) 로 실온에서 처리하여 (5 x 5 분, 각각 2 ml), C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기를 포함하는 펩티드를 수득하였다.
THF 를 진공 하에서 증발시켜 제거하고, C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기를 포함하는 상기 수득한 펩티드를 RP-HPLC-ESMS (각각, 방법 설명 B2, 이동상 B 80 내지 100, [(M+2H)/2]2+: 1308.0, 이때 M 은 DKP 링커 기를 포함하는 T20C 의 분자량임) 에 따라 분석하였다. 예상되는 생성물을 Rink 아미드 핸들기 때문에 라세미 혼합물로서 수득하였고, 측정된 분자량은 이론적으로 예상되는 질량에 상응하였다.
어느 정도의 디케토피페라진기 형성 디펩티딜 링커가 상기 수지 상에 남아있는지를 정량화하기 위하여, 상기 수지를 95% (v/v) TFA, 2.5% (v/v) TIS 및 2.5% (v/v) H20 로 이루어진 혼합물 2 ml 로 실온에서 1 시간 동안 처리하였다. RP-HLPC 분석은 상기 수지에 남아있는 디케토피페라진기 형성 디펩티딜 링커가 1% 미만임을 나타내었다 (방법 설명 B1, 이동상 B 5 내지 100).
실시예 1.4b
제 2 단계 후, 실시예 1.4a 에서와 같이 상기 수지를 THF 중의 피페리딘 5% (v/v) 로 실온에서 (5 x 5 분, 각각 2 ml) 처리한 것이 아니라, DMF 중의 피페리딘 5% (v/v) 로 실온에서 (5 x 5 분, 각각 2 ml) 처리하여 C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기를 포함하는 펩티드를 수득하였다는 유일한 차이를 제외하고는, 실시예 1.4a 를 반복하였다. DMF 를 톨루엔 (5 x 3 ml) 과 함께 진공 하에서 동시증발시켜 제거하였다.
실시예 1.4c
제 2 단계 후, 실시예 1.4a 에서와 같이 상기 수지를 THF 중의 피페리딘 5% (v/v) 로 실온에서 (5 x 5 분, 각각 2 ml) 처리한 것이 아니라, THF 중의 피롤리딘 5% (v/v) 로 실온에서 (5 x 5 분, 각각 2 ml) 처리하여 C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기를 포함하는 펩티드를 수득하였다는 유일한 차이를 제외하고는, 실시예 1.4a 를 반복하였다.
실시예 1.4d
제 2 단계 후, 실시예 1.4a 에서와 같이 상기 수지를 THF 중의 피페리딘 5% (v/v) 로 실온에서 (5 x 5 분, 각각 2 ml) 처리한 것이 아니라, THF 중의 피롤리딘 5% (v/v) 로 실온에서 (5 x 5 분, 각각 2 ml) 처리하여 C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기를 포함하는 펩티드를 수득하였다는 유일한 차이를 제외하고는, 실시예 1.4a 를 반복하였다. DMF 를 톨루엔 (5 x 3 ml) 과 함께 진공 하에서 동시증발시켜 제거하였다.
실시예 1.4b, 1.4c 및 1.4d 모두에서, 실시예 1.4a 에서와 같은 RP-HPLC-ESMS 분석 및 상기 수지 상에 잔여분으로서 남아있는 디케토피페라진기 형성 디펩티딜 링커의 측정에 대한 동일한 분석 결과가 수득되었다.
실시예
2: 수지에의 부착으로서 C-말단 보호기를 포함하는
디케토피페라진
잔기
(5
mmol
규모) 를 사용하는
T20C 의
SPPS
SPPS 는 수작업으로 수행하였다.
실시예
2.1
디케토피페라진기
형성
디펩티딜
링커의
HMPS
수지에의 부착
a) HMPS 수지의 전처리
HMPS 수지 (5.0977 g) 를 DCM (5 x 1 분; 각각 50 ml) 및 DMF (5 x 1 분; 각각 50 ml) 로 실온에서 팽윤시킨 후, 여과하였다.
b)
수지 상의
디케토피페라진기
형성
디펩티딜
링커의 제 1 아미노산 (D-Pro) 의 도입
DCM/DMF (15:1 (v/v), 100 ml) 중의 Fmoc-D-Pro-OH (6.6 g, 4 당량) 및 DIPCDI (1.5 ml, 2 당량) 를 실시예 2.1a) 에 따라 제조된 수지에 첨가하였다. 그 후, DCM (5 ml) 중의 DMAP (245 mg, 0.4 당량) 을 첨가하고, 실온에서 16 시간 동안 정치시켰다. 제 1 아미노산을 DCM/DMF (15:1 (v/v), 100 ml) 중의 Fmoc-D-Pro-OH (6.6 g, 4 당량) 및 DIPCDI (1.5 ml, 2 당량) 를 사용하여 5 시간 동안 실온에서 재커플링하였다. 커플링 후, 상기 수지를 DCM (5 x 1 분; 각각 50 ml) 및 DMF (5 x 1 분; 각각 50 ml) 로 세정하였다. 그 후, 상기 수지를 DMF (50 ml) 중의 아세트산 무수물 (2.4 ml, 5 당량) 및 DIEA (4.4 ml, 5 당량) 를 사용하여 실온에서 1 시간 동안 캡핑하였다. 캡핑 후, 상기 수지를 DCM (5 x 1 분; 각각 50 ml) 및 DMF (5 x 1 분; 각각 50 ml) 로 세정하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 피페리딘/DMF (20% (v/v), 1 x 1 분, 2 x 10 분; 각각 50 ml) 로 처리하여 제거하였다.
0.98 mmol/g 의 수지 로딩을 UV 정량화 (방법 설명 A; VA: 250 ml, VB: 50 ml 및 VC: 0.44 ml) 에 따라 결정하였다. 따라, 5.0977 g 의 HMPS 수지는 5.0 mmol 의 활성 부위를 나타내었다.
c)
디케토피페라진기
형성
디펩티딜
링커의 제 2 아미노산 (L-
Lys
) 의 도입
DMF (100 ml) 중의 Trt-Lys(Fmoc)-OH (9.2 g, 3 당량), HOBt (2.3 g, 3 당량) 및 DIPCDI (2.3 ml, 3 당량) 의 혼합물을 실온에서 5 분 동안 진탕한 후, 실시예 2.1b) 에 따라 제조된 수지에 첨가한 후, 상기 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 정치시켰다. 닌하이드린 시험 (방법 C) 에 따라 재커플링이 요구되지 않았다. 그 후 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 50 ml) 및 DCM (5 x 1 분; 각각 50 ml) 으로 세정하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 피페리딘/DMF (20% (v/v), 1 x 1 분, 2 x 10 분; 각각 50 ml) 로 처리하여 제거하였다.
d) Rink 아미드 핸들기의 도입
DMF (100 ml) 중의 Fmoc-Rink-OH (7.9 g, 3 당량), HOBt (2.3 g, 3 당량) 및 DIPCDI (2.3 ml, 3 당량) 의 혼합물을 실온에서 5 분 동안 진탕한 후, 실시예 2.1c) 에 따라 제조된 수지에 첨가한 후, 실온에서 16 시간 동안 정치시켰다. 닌하이드린 시험 (방법 C) 에 따라 재커플링이 요구되지 않았다. 그 후, 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 50 ml) 및 DCM (5 x 1 분; 각각 50 ml) 으로 세정하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 피페리딘/DMF (20% (v/v), 1 x 1 분, 2 x 10 분; 각각 100 ml) 로 처리하여 제거하였다.
실시예 2.2
SPPS 에 의한 T20C
각각의 아미노산을 반응 사이클에서 반응시켰다. 하나의 아미노산의 혼입을 위한 1 회 반응 사이클의 반응 단계는, 하기 반응 사이클 설명 (iii) 또는 (iv) 에 따른다.
a) 반응 사이클 설명 (iii)
DMF (100 ml) 중의 Fmoc-Xaa-OH (3 당량), HCTU (6.2 g, 3 당량), DIEA (5.2 ml, 6 당량) 의 혼합물을 실온에서 30 초 동안 진탕한 후, 연장 서열에서의 선행 단계에 따라 제조된 수지에 첨가하였다. 그 후, 상기 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 정치시켰다. 닌하이드린 시험 (방법 C) 에 따라 재커플링이 요구되지 않았다. 그 후 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 100 ml) 및 DCM (5 x 1 분; 각각 100 ml) 으로 세정하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 피페리딘/DMF (20% (v/v), 1 x 1 분, 2 x 10 분; 각각 100 ml) 로 처리하여 제거하였다.
b) 반응 사이클 설명 (iv)
DMF (100 ml) 중의 Fmoc-Xaa-OH (3 당량), HOBt (2.3 g, 3 당량), DIPCDI (2.3 ml, 3 당량) 의 혼합물을 실온에서 5 분 동안 진탕하고, 연장 서열에서의 선행 단계에 따라 제조된 수지에 첨가한 후, 실온에서 16 시간 동안 정치시켰다. DMF (100 ml) 중의 Fmoc-Xaa-OH (3 당량), HCTU (6.2 g, 3 당량), DIEA (5.2 ml, 6 당량) 의 혼합물을 사용하여 재커플링을 수행하였다. 상기 혼합물을 실온에서 30 초 동안 진탕한 후, 상기 수지에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 정치시켰다. 그 후, 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 100 ml) 로 세정하고, 상기 수지를 DMF (100 ml) 중의 아세트산 무수물 (2.4 ml, 5 당량), DIEA (4.4 ml, 5 당량) 를 사용하여 실온에서 1 시간 동안 캡핑하였다. 그 후, 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 100 ml) 및 DCM (5 x 1 분; 각각 100 ml) 으로 세정하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 피페리딘/DMF (20% (v/v), 1 x 1 분, 2 x 10 분; 각각 100 ml) 로 처리하여 제거하였다.
c) 연장 서열
제 1 아미노산, Fmoc-36Phe-OH 을 실시예 2.1d) 에 따라 제조된, Rink 아미드 핸들기 및 디케토피페라진기 형성 디펩티딜 링커 포함 수지에 커플링한 후, 하기의 아미노산을 연장 서열에서의 해당 선행 단계에서 제조된, 상기 수득한 아미노산 / 펩티드 Rink 아미드 핸들기 및 디케토피페라진기 형성 디펩티딜 링커 포함 수지에 커플링하였다. 아미노산의 혼입 서열은 하기 표 c1) 에 제시된 바와 같았다:
실시예 2.3
분석 - Rink 아미드 핸들기로부터 T20C 의 절단
실시예 2.2 에 따라 제조된 소량의 펩티딜-수지 (5 mg) 를 95% (v/v) TFA, 2.5% (v/v) TIS 및 2.5% (v/v) H20 의 혼합물 1 ml 로 실온에서 1 시간 동안 처리하여, Rink 아미드 핸들기로부터 제거하였다. RP-HPLC 분석에 따라 결정된 바와 같이, 상기 펩티드를 72% 의 순도로 수득하였다 (방법 설명 B1, 이동상 B 25 내지 50).
실시예
2.4
디케토피페라진기
형성
디펩티딜
링커의 L-
Lys 의
Trt
보호기 제거,
C-말단 보호기를 포함하는
디케토피페라진
잔기의
형성 및 수지로부터의 절단
C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기의 형성 및 상기 수지 (1.57 g) 로부터 실시예 2.2 에 따라 제조된 펩티드 단편의 절단을 실시예 1.4a 에 기재된 바와 같은 유사한 방식으로, 펩티딜-수지의 더 많은 양에 따라 적용된 시약 및 용매의 양을 사용하여 수행하였다:
a) Trt 기 탈보호
DCM 중의 TFA 0.5% (v/v) (2 x 5 분; 각각 20 ml).
b) 중화
DMF 중의 DIEA 5% (v/v) (2 x 5 분; 각각 20 ml).
c)
DKP
링커 기 형성
THF 중의 피페리딘 5% (v/v) (5 x 5 분; 각각 20 ml).
THF 를 진공 하에서 제거하고, 상기 수득한 미정제물을 사전 냉각된 (4℃) Et20 (50 ml x 3) 로 세정하였다. C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기를 포함하는 T20C 642.5 mg 을 수득하였다.
실시예
3:
HT20F 의
제조: a)
BocT20N 의
SPPS
, b) C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진
잔기를
포함하는
T20C 와의
HSPPS
커플링, 및 c) 전체적인
탈보호
C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기를 포함하는 T20C 를 실시예 2.4 에 따라 수득하였다.
실시예 3.1
SPPS 에 의한 BocT20N
BocT20N 의 SPPS 를 선형 Fmoc SPPS 에 따라 수작업으로 수행하였다. 단지 마지막 Glu 아미노산만이 Boc 보호된 Boc-Glu(tBu)-OH 이었다.
a) CTC 수지의 전처리
CTC 수지 (5.0054 g) 를 DCM (5 x 1 분; 각각 50 ml) 및 DMF (5 x 1 분; 각각 50 ml) 로 실온에서 팽윤시킨 후, 여과하였다.
b) CTC 수지 상의 제 1 아미노산 (L-Leu) 의 도입:
DCM (50 ml) 중의 Fmoc-26Leu-OH (1.8 g, 1 당량), DIEA (8.7 ml, 10 당량) 를 실시예 3.1a) 에 따라 제조된 수지에 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 정치시켰다. 그 후, 상기 수지를 MeOH (0.8 ㎕/mg 수지; 4 ml) 로 실온에서 15 분 동안 처리하여, 상기 수지를 캡핑하였다. 캡핑 후, 상기 수지를 DCM (5 x 1 분; 각각 50 ml) 및 DMF (5 x 1 분; 각각 50 ml) 로 세정하였다. 그 후, 상기 수지를 피페리딘/DMF (20% (v/v), 1 x 1 분, 2 x 10 분; 각각 50 ml) 로 처리하여, 상기 Fmoc 기를 제거하였다.
Fmoc-Leu-OH 혼입 후, 0.89 mmol/g 의 수지 로딩을 UV 정량화 (방법 설명 A; VA: 250 ml, VB: 50 ml 및 VC: 0.34 ml) 에 따라 결정하였다.
c) SPPS 에 의한 BocT20N
각각의 아미노산을 반응 사이클에서 반응시켰다. 하나의 아미노산의 혼입을 위한 1 회 반응 사이클의 반응 단계는, 하기 반응 사이클 설명 (v) 에 따른다.
c1) 반응 사이클 설명 (v)
DMF (표 c2 에 제시된 바와 같은 V1 ml) 중의 Fmoc-Xaa-OH (3 당량), Oxyma (1.9 g, 3 당량), DIPCDI (2.3 ml, 3 당량) 의 혼합물을 실온에서 5 분 동안 진탕한 후, 연장 서열에서의 선행 단계에 따라 제조된 수지에 첨가하였다. 그 후 상기 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 정치시켰다. 닌하이드린 시험 (방법 C) 에 따라 재커플링이 요구되지 않았다. 그 후, 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 표 c2 에 제시된 바와 같은 V2 ml) 및 DCM (5 x 1 분; 표 c2 에 제시된 바와 같은 V2 ml) 으로 세정하였다.
그 후, 상기 수지를 피페리딘/DMF (20% (v/v), 1 x 1 분, 2 x 10 분; 표 c2 에 제시된 바와 같은 V3 ml) 로 처리하여, 상기 Fmoc 기를 제거하였다.
c2) 연장 서열
제 2 아미노산, Fmoc-25Glu(tBu)-OH 을 실시예 3.1b) 에 따라 제조된 수지에 반응 사이클 설명 (v) 에 따라 커플링한 후, 상기 아미노산을 연장 사이클의 선행 단계에서 제조된, 상기 수득한 아미노산 / 펩티딜 CTC-수지에 반응 사이클 설명 (v) 에 따라 커플링하였다. 아미노산의 혼입 서열은 하기 표 c2) 에 제시된 바와 같았다:
실시예 3.2
분석 - CTC 수지로부터 HT20N 의 절단
실시예 3.1c2) 에 따라 제조된 펩티딜-수지 (5 mg) 를 95% (v/v) TFA, 2.5% (v/v) TIS 및 2.5% (v/v) H20 로 이루어진 혼합물 1 ml 로 실온에서 1 시간 동안 처리하여, CTC 수지로부터 펩티드를 절단하고, 아미노산 잔기를 완전히 탈보호하였다. RP-HPLC (방법 설명 B1, 이동상 B 5 내지 100) 에 따라 결정된 바와 같이, HT20N 를 85.7% 의 순도로 수득하였다. 상기 펩티드를 RP-HPLC-ESMS (방법 설명 B2, 이동상 B 5 내지 100, [M+H]+: 1244.7, 이때 M 은 완전히 보호된 HT20N 에 해당함) 에 따라 분석하였다.
실시예 3.3
측쇄 보호된 BocT20N
실시예 3.1c2) 에 따라 제조된 펩티딜 수지 (1.094 g) 를 DCM 중의 TFA 1% (v/v) 로 (5 x 1 분; 각각 50 ml) 실온에서 처리하고, 5 개의 모든 혼합물을 H20 (20 ml) 에 부었다. 그 후, 상기 수성 혼합물을 증발시키고, 상기 미정제물을 동결건조하였다. 완전히 측쇄 보호된 BocT20N 을 수득하였고 (510 mg), 이를 RP-HPLC-ESMS (방법 설명 B2, 이동상 B 95 내지 100, [M+H]+: 2153.8) 에 따라 분석하였다.
상기 완전히 측쇄 보호된 BocT20N 의 부분적인 탈보호는 RP-HPLC-ESMS (방법 설명 B1, 이동상 B 50 내지 100) 에 따라 관찰되지 않았다. RP-HPLC 는 하나의 피크를 나타내었고, 순도는 85.7% (방법 설명 B2, 이동상 B 95 내지 100) 였다.
실시예 3.4
HSPPS 에 의한 HT20F
a) C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기를 포함하는 T20C 와 BocT20N 사이의 HSPPS 커플링
실시예 3.3 에 따라 제조된 측쇄 보호된 BocT20N (10 mg, 4.6 μmol) 및 HOBt (2.2 mg, 3 당량) 를 DCM (350 ㎕) 중에 용해시키고, DIPCDI (2.2 ㎕, 3 당량) 를 상기 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 5 분 동안 진탕하였다. 상기 혼합물을 실시예 2.4 에 따라 제조된, DCM (350 ㎕) 중의 C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기를 포함하는 T20C 의 용액 (12 mg, 4.6 μmol) 에 첨가하였다. 상기 수득한 혼합물 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 상기 커플링을 RP-HPLC 분석 (방법 설명 B1,이동상 B 95 내지 100) 에 따라 모니터링하고, 총 전환을 16 시간 후에 관찰하였다.
용매를 진공 하에서 증발시켜, C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기에 C-말단으로 연결된 단편 Boc[T20-17-36] 을 수득하였다.
b) 전체적인 탈보호에 의한 HT20F
실시예 3.4a) 에 따라 제조된, C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기에 C-말단으로 연결된 단편 Boc[T20-17-36] (1 mg) 을 92.5% (v/v) TFA, 2.5% (v/v) TIS 및 5% (v/v) DMB 의 혼합물 1 ml 로 실온에서 1 시간 동안 처리하였다. Trp 잔기의 측쇄 상의 상기 수득한 N-카르복시기를 제거하기 위하여, 수성 NH3 0.5% (v/v) (1 ml) 를 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 정치시켜, RP-HPLC (방법 설명 B1, 이동상 B 30 내지 40) 에 따라 결정된 바와 같이, 완전히 보호된 HT20F 를 60.2% 의 순도로 수득하였다. RP-HPLC-ESMS 는 표적 펩티드를 나타내었다 ([(M+2H)/2]2+: 1290.0, 이때 M 은 HT20F 의 분자량임, 방법 설명 B2, 이동상 B 30 내지 40).
실시예
4:
SPPS
에 의한 화학식 (
ex
-4) 의 화합물의 제조
a) CTC 수지의 전처리
CTC 수지 (20.4 g) 를 DCM (1 시간; 200 ml) 으로 실온에서 팽윤시킨 후, 여과하였다.
b) CTC 수지 상의 제 1 아미노산 (Fmoc-Ala-OH) 의 도입
DCM (160 ml) 중의 Fmoc-Ala-OH (12.65 g, 1.2 당량), DIEA (14.90 g, 3.6 당량) 를 실시예 4a) 에 따라 제조된 수지에 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 정치시킨 후, 여과하였다. 상기 수지를 DIEA/MeOH (10% (v/v), 200 ml) 및 DMF (40 ml) 로 실온에서 1 시간 동안 처리한 후, 여과하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 Fmoc-gr-rem 방법에 따라 제거하였다. Fmoc-Ala-OH 혼입 후, 0.97 mmol/g 의 수지 로딩을 계산하였다.
c1) SPPS 에 의한 아미노산의 혼입
실시예 4.b) 에 따라 제조된 수지에서 출발하여, 각각의 아미노산, 각각 1. Fmoc-His(Trt)-OH 및 2. Fmoc-Tyr(tBu)-OH 를 반응 사이클 설명 실시예 4 c2) 에 따라 혼입하였다.
c2) 사이클 설명
DMF (103 g) 중의 해당 Fmoc-Xaa-OH (1.5 당량), HOBt (9.2 g, 2.25 당량), DIPCDI (9.31 ml, 2.25 당량) 의 혼합물을 실온에서 5 분 동안 교반하고, 실시예 4 b) 에 따라 제조된 수지에 첨가한 후, 실온에서 45 분 동안 정치시켰다. 그 후 DIPCDI (4.66 ml, 1.25 당량) 를 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 45 분 동안 정치시켰다. 닌하이드린 시험 (방법 C) 에 따라 재커플링이 요구되지 않았다. 상기 수지를 DMF (3 x 5 분; 각각 110 ml) 로 세정하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 Fmoc-gr-rem 방법에 따라 제거하였다. 모든 피페리딘을 클로라닐 시험 (방법 D) 에 따라 제거하였다.
d) 수지로부터의 절단
실시예 4 c1) 에 따라 제조된 수지를 DCM 중의 TFA 2% (w/w) (4 x 15 분; 각각 150 g) 로 약 10℃ 에서 세정하였다. 그 후, 상기 수지를 EtOH/DCM (20% (w/w), 3 x 3 분; 각각 120 g) 로 실온 10℃ 에서 세정하였다. 상기 조합 용액을 EtOH 와 함께 감압 하에서 동시증발시켜 농축시켰다 (1 x 40 g).
e) 단리
실시예 4d) 에 따라 수득한 용액 (107.60 g) 에, 물 (800 g) 을 첨가하였다. 상기 수득한 혼합물을 여과하고, 고체를 물 (3 x 3 분; 각각 80 g) 및 DIPE (3 x 2 분; 각각 120 ml) 로 세정하였다.
상기 고체를 30℃ 에서 감압 하에서 건조시켜, 화학식 (ex-4) 의 화합물 20.80 g 을 RP-HPLC (방법 B3) 에 따라 결정된 바와 같이, 94.7% 순도의 백색 분말로서 수득하였다.
실시예
5:
디케토피페라진기
형성
디펩티딜
링커의
HMPS
수지에의 부착, Ramage
핸들기의
사용 및 화학식 (
ex
-5i) 의 화합물의 제조
a) HMPS 수지의 전처리
HMPS 수지 (5.0 g) 를 DCM (5 x 1 분; 각각 150 ml) 및 DMF (5 x 1 분; 각각 150 ml) 로 팽윤시켰다.
b) 수지 상의 제 1 아미노산의 도입
DCM/DMF (15: 1 (v/v), 125 ml) 중의 해당 아미노산 (N(Me)Phe-OH 또는 Fmoc-D-Pro-OH) 및 DIPCDI (2.43 g, 3.5 당량) 를 실시예 5a) 에 따라 제조된 수지에 첨가하였다. 그 후, DCM (25 ml) 중의 DMAP (0.27 g, 0.4 당량) 를 첨가하고, 실온에서 3 또는 4 시간 동안 정치시켰다. 상기 수지를 DCM (5 x 1 분; 각각 150 ml) 및 DMF (5 x 1 분; 각각 150 ml) 로 세정하였다. 그 후, 상기 수지를 DMF (125 ml) 중의 아세트산 무수물 (2.81 g, 5 당량) 및 DIEA (3.56 g, 5 당량) 를 사용하여 실온에서 30 분 동안 캡핑하였다. 캡핑 후, 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 150 ml) 로 세정하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 Fmoc-gr-rem 방법에 따라 제거하였다. 1.10 mmol/g 의 수지 로딩을 계산하였고, 이에 따라 5.0 g 의 HMPS 수지는 5.5 mmol 의 활성 부위를 나타내었다.
b1) Xaa 가 N(Me)Phe-OH (4.86 g, 2.2 당량) 이고, 실온에서 4 시간 동안 정치시키는 실시예 5 b) 에 따른 절차.
b2) Xaa 가 Fmoc-D-Pro-OH (7.45 g, 4.0 당량) 이고, 실온에서 3 시간 동안 정치시키는 실시예 5 b) 에 따른 절차.
c) 제 2 아미노산의 도입
DMF (100 ml) 중의 Trt-Lys(Fmoc)-OH (11.26 g, 2 당량), HOBt (4.24 g, 3 당량) 및 DIPCDI (3.49 g, 3 당량) 의 혼합물을 실온에서 5 분 동안 교반한 후, 실시예 5 b1) 에 따라 제조된 수지에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 17 시간 동안 교반하였다.
그 후, 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 150 ml) 로 세정하고, 상기 Fmoc 기 Fmoc-gr-rem 기를 방법에 따라 제거하였다.
d) SPPS 에 의한 아미노산의 혼입
실시예 5 c) 에 따라 제조된 수지에서 출발하여, 상기 핸들기 및 해당 아미노산, 즉 1. Fmoc-Ramage-OH, 2. Fmoc-Leu-OH, 3. Fmoc-Ala-OH 및 4. Fmoc-Phe-OH 를 반응 사이클 설명 (vi) 에 따라 혼입하였다.
e) 반응 사이클 설명 (vi)
DMF (100 ml) 중의 상기 핸들기 또는 각각의 아미노산 Fmoc-Xaa-OH (2 당량), HOBt (4.24 g, 3 당량), DIPCDI (3.49 g, 3 당량) 의 혼합물을 실온에서 5 분 동안 교반한 후, 실시예 5 c) (핸들기의 경우) 및 d) (아미노산의 경우) 에 따라 제조된 수지에 각각 첨가한 후, 실온에서 1 시간 동안 정치시켰다. 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 150 ml) 로 세정하고, Xaa 가 Fmoc-Phe-OH 인 경우, 추가의 DCM (5 x 1 분; 각각 150 ml) 으로 세정하였다. Xaa 가 Fmoc-Ala-OH 인 경우, 상기 수지를 추가로 DMF (1 x 1 분; 150 ml) 로 실온에서 세정하였다. 상기 Fmoc 기를 마지막 Xaa, Fmoc-Phe-OH 를 제외하고, Fmoc-gr-rem 방법에 따라 제거하였다.
f) 분석 - 상기 핸들기 및 상기 수지로부터 펩티드의 절단
실시예 5 d)에 따라 수득한 소량의 수지 (5 mg) 를 95% (v/v) TFA, 2.5% (v/v) TIS 및 2.5% (v/v) 물의 혼합물 1 ml 로 실온에서 1 시간 동안 처리하였다. 화학식 (ex-5f) 의 화합물을 RP-HPLC (HPLC-방법 B3) 분석에 따라 결정된 바와 같이, 86.4% 의 순도로 수득하였다.
g) 링커의 L-
Lys 의
Trt
보호기 제거, C-말단 보호기를 포함하는
디케토피페라진
잔기의
형성 및 수지로부터의 절단
C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기의 형성 및 실시예 5d) 에 따라 제조된 수지로부터 DKP-펩티드의 절단을 실시예 1.4a 에 기재된 바와 유사한 방식으로, 펩티딜-수지의 양에 따라 적용된 시약 및 용매를 사용하여 수행하였다:
g1) Trt 기 탈보호
실시예 5 d) 에 따라 제조된 화합물을 DCM 중의 TFA 0.2% (v/v) (2 x 5 분, 각각 100 ml) 로 처리하였다.
g2) 중화
그 후, DCM 중의 DIEA 5% (v/v) (2 x 5 분; 각각 100 ml) 및 DCM (2 x 1 분; 각각 50 ml) 으로 처리하였다. HPLC 를 사용하여 상기 액체상에 남아있는 생성물이 없다는 것을 확인하였다 (HPLC-방법 B3).
g3) C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기의 형성 및 수지로부터의 절단
그 후, THF 중의 피페리딘 5% (v/v) (5 x 5 분, 각각 100 ml) 로 처리하였다. 그 후, 상기 수지를 THF (3 x 1 분; 각각 100 ml) 로 세정하였다. HPLC 를 사용하여 상기 조합한 액체상에 생성물이 존재하지 않는다는 것을 확인하였다 (HPLC-방법 B3).
THF 를 톨루엔 (3 x 150 ml) 과 함께 진공 하에서 동시증발시켜 제거하였다. 혼합물 DBF-부가물 및 화학식 (ex-5g4) 의 화합물의 혼합물 1.96 g 을 백색 고체로서 수득하였다. 방법 B4 에 따라 예상 질량을 제공하였다.
g4) DBF-부가물 제거
실시예 5 g3) 에 따라 제조된 백색 고체를 DIPE (1 x 2 분, 50 ml; 3 x 2 분, 각각 10 ml) 로 세정하였다. 화학식 (ex-5g4) 의 화합물 223.7 mg 을 백색 고체로서 수득하였다.
h) 분석 - C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기로부터 펩티드의 절단
실시예 5 g4) 에 따라 제조된 소량의 화학식 (ex-5g4) 의 화합물 (5 mg) 을 95% (v/v) TFA, 2.5% (v/v) TIS 및 2.5% (v/v) 물의 혼합물 1 ml 로 실온에서 1 시간 동안 처리하여 보호하였다. 화학식 (ex-5h) 의 화합물을 수득하였고, 상기 구조를 RP-HLPC 분석 방법 B3 에 따라 확인하였다.
i) HSPPS 에 의한 화학식 (ex-4) 의 화합물과 화학식 (ex-5g4) 의 화합물의 커플링
DCM (2 ml) 중의, 실시예 4 에 따라 제조된 화학식 (ex-4) 의 화합물 (84 mg, 1 당량), HOBt (53 mg, 3.2 당량) 및 DIPCDI (53 ㎕, 3.1 당량) 의 혼합물을 실온에서 15 분 동안 교반하고, DCM (1 ml) 중의 실시예 5 g4) 에 따라 제조된 화학식 (ex-5g4) 의 화합물 (100 mg, 1.1 당량) 의 용액에 첨가한 후, 상기 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 커플링을 HPLC 방법 B3 에 따라 모니터링하였다.
상기 반응 혼합물을 수성 포화 NaHC03 (2 x 40 ml), 1M KHS04 수용액 (2 x 40 ml) 및 수성 포화 NaCl (2 x 40 ml) 로 세정하였다.
상기 유기상을 MgS04 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜, 화학식 (ex-5i) 의 화합물 328.5 mg 을 RP-HPLC 분석 (방법 설명 B4) 에 따라 결정된 바와 같이, Ramage 핸들기의 카이랄성에 의해 야기된 2 개의 부분입체이성질체 때문에 각각 26.8 % 및 28.2% 의 2 개의 피크로 이루어진, 55% 순도의 오일로서 수득하였다.
실시예 6: 디케토피페라진기 형성 디펩티딜 링커의 HMPS 수지에의 부착. 화학식 ( ex -6 e3 - d1 ), ( ex -6 e3 - d2 ), ( ex -6 f1 ) 및 ( ex -6 f1 ) 의 화합물의 제조
a) 제 2 아미노산 L-Lys 의 도입
DMF (100 ml) 중의 Trt-Lys(Fmoc)-OH (10.08 g, 2 당량), HOBt (3.79 g, 3 당량) 및 DIPCDI (3.12 g, 3 당량) 의 혼합물을 실온에서 5 분 동안 교반한 후, 실시예 5 b2) 에 따라 제조된 수지에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 17 시간 동안 교반하였다.
그 후, 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 150 ml) 로 세정하고, 상기 Fmoc 기를 Fmoc-gr-rem 방법에 따라 제거하였다.
b) SPPS 에 의한 핸들기, 스페이서기 및 아미노산의 도입
상기 핸들기, 스페이서기 및 각각의 아미노산을 반응 사이클에서 반응시켰다. 하나의 아미노산의 혼입을 위한 1 회 반응 사이클의 반응 단계는, 하기 반응 사이클 설명 (vii) 에 따른다.
c) 연장 서열 d1) 및 d2) 에 대한 반응 사이클 설명 (vii)
연장 서열에 따라 각각의 시간에, DMF (100 ml) 중의, d1) 의 경우 Fmoc-TTDS-OH 를 제공하는 스페이서기, Fmoc-Rink-OH 또는 해당 Fmoc-Xaa-OH 를 제공하는 핸들기, HOBt (3.79 g, 3 당량) 및 DIPCDI (3.12 g, 3 당량) 의 혼합물을 실온에서 5 분 동안 교반한 후, 우선 실시예 6a) 에 따라 제조된 수지 및 그 후 연장 서열에서의 선행 단계에서 제조된 수지에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 1 내지 4 시간 동안 교반하였다. 그 후, 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 150 ml, Fmoc-Xaa-OH 가 Fmoc-Ala-OH 인 경우, 5 x 대신 6 x) 로 세정하고, 상기 Fmoc 기를 Fmoc-gr-rem 방법에 따라 제거하였다.
해당 연장 서열 d1) 또는 d2) 의 마지막 Fmoc-Xaa-OH 의 Fmoc 기 제거 바로 직전에, 소량의 수득한 펩티딜-수지 (5 mg) 를 95% (v/v) TFA, 2.5% (v/v) TIS 및 2.5% (v/v) H20 로 이루어진 혼합물 1 ml 로 실온에서 1 시간 동안 처리하여, Rink 아미드 핸들기로부터 절단하였다. 화학식 (ex-6c-d1) 의 화합물을 46.7% 의 순도로 연장 서열 d1) 에 따라 수득하였고, 화학식 (ex-6c-d2) 의 화합물을 65.4% 의 순도로 연장 서열 d2) 에 따라 수득하였다 (RP-HPLC, 방법 설명 B3).
d) SPPS 에 의한 아미노산의 혼입
아미노산의 혼입 서열은 하기와 같았다:
e)
디케토피페라진기
형성
디펩티딜
링커의 L-
Lys 의
Trt
보호기 제거, C-말단 보호기를 포함하는
디케토피페라진
잔기의
형성 및 수지로부터의 절단
C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기의 형성 및 각각 실시예 6 d1) 및 6 d2) 와 조합된, 실시예 6 c) 에 따라 제조된 수지로부터 DKP -펩티드의 절단을 실시예 1.4a 에 기재된 바와 같은 유사한 방식으로, 펩티딜-수지의 양에 따라 적용된 시약 및 용매의 양을 사용하여 수행하였다:
e1) Trt 기 탈보호
각각 실시예 6 d1) 및 6 d2) 와 조합된, 실시예 6 c) 에 따라 제조된 화합물을 DCM 중의 TFA 0.2% (v/v) 로 처리하였다 (2 x 5 분, 각각 100 ml).
e2) 중화
그 후, DCM 중의 DIEA 5% (v/v) (2 x 5 분; 각각 100 ml), DCM (2 x 1 분; 각각 100 ml) 및 THF (2 x 1 분; 각각 100 ml) 로 처리하였다.
e3) C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기의 형성 및 수지로부터의 절단
실시예 5 g3) 의 절차에 따라 처리하였다. 실시예 6 d1) 으로부터의 출발 물질인 경우, 화학식 (ex-6e3-d1) 의 화합물 0.83 g 의 오일 및 실시예 6 d2) 로부터의 출발 물질인 경우, 화학식 (ex-6e3-d2) 의 화합물 2.03 g 의 오일을 수득하였다.
f1) HSPPS 에 의한 화학식 (ex-4) 의 화합물과 화학식 (ex-6e3-d1) 의 화합물의 커플링
DCM (5 ml) 중의 실시예 4 에 따라 제조된 화학식 (ex-4) 의 화합물 (255 mg, 1 당량), HOBt (160 mg, 3 당량) 및 DIPCDI (161 ㎕, 3 당량) 의 혼합물을 실온에서 60 분 동안 교반하고, DCM (1 ml) 중의 실시예 6e3) 에 따라 제조된 화학식 (ex-6e3-d1) 의 화합물 (401 mg, 1.0 당량) 의 용액에 첨가한 후, 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 상기 커플링을 HPLC 방법 B3 에 따라 모니터링하였다. 상기 반응 혼합물을 수성 포화 NaHC03 (2 x 40 ml), 1M KHS04 수용액 (2 x 40 ml) 및 수성 포화 NaCl (2 x 40 ml) 로 세정하였다. 상기 유기상을 MgS04 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜, 화학식 (ex-6f1) 의 화합물 368.5 mg 을 오일로서 수득하였다.
f2) HSPPS 에 의한 화학식 (ex-4) 의 화합물의 화학식 (ex-6e3-d2) 의 화합물에의 첨가
DCM (5 ml) 중의 실시예 4 에 따라 제조된 화학식 (ex-4) 의 화합물 (295 mg, 1 당량), HOBt (190 mg, 3 당량) 및 DIPCDI (188 ㎕, 3 당량) 의 혼합물을 20 분 동안 실온에서 교반하고, DCM (1 ml) 중의 실시예 6e3) 에 따라 제조된 화학식 (ex-6e3-d2) 의 화합물 (502 mg, 1.0 당량) 의 용액에 첨가한 후, 실온에서 3.5 시간 동안 교반하였다. 상기 커플링을 HPLC 방법 B3 에 따라 모니터링하였다.
상기 반응 혼합물을 수성 포화 NaHC03 (2 x 40 ml), 1M KHS04 수용액 (2 x 40 ml) 및 수성 포화 NaCl (2 x 40 ml) 로 세정하였다. 상기 유기상을 MgS04 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜, 화학식 (ex-6f2) 의 화합물 372.8 mg 을 오일로서 수득하였다.
실시예
7:
핸들기
HMPA 의
사용. 화학식 (
ex
-7
h3
) 의 화합물의 제조.
a) HMPS 수지의 전처리
HMPS 수지 (103.6 mg) 를 DCM (5 x 1 분; 각각 3 ml) 및 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 로 실온에서 팽윤시킨 후, 여과하였다.
b)
수지 상의
디케토피페라진기
형성
디펩티딜
링커의 제 1 아미노산 (D-Pro) 의 도입
DCM/DMF (15:1 (v/v), 2.5 ml) 중의 Fmoc-D-Pro-OH (132 mg, 4 당량) 및 DIPCDI (30 ㎕, 2 당량) 를 실시예 7a) 에 따라 제조된 수지에 첨가하였다. 그 후, DCM (0.5 ml) 중의 DMAP (4.8 mg, 0.4 당량) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 정치시켰다. 제 1 아미노산을 DCM/DMF (15:1 (v/v), 2.5 ml) 중의 Fmoc-D-Pro-OH (132 mg, 4 당량) 및 DIPCDI (30 ㎕, 2 당량) 를 사용하여 실온에서 16 시간 동안 재커플링하였다. 커플링 후, 상기 수지를 DCM (5 x 1 분; 각각 3 ml) 및 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 로 세정하였다. 그 후, 상기 수지를 DMF (2.5 ml) 중의 아세트산 무수물 (46 ㎕, 5 당량) 및 DIEA (86 ㎕, 5 당량) 를 사용하여 실온에서 30 분 동안 캡핑하였다. 캡핑 후, 상기 수지를 DCM (5 x 1 분; 각각 3 ml) 및 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 로 세정하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 Fmoc-gr-rem 방법에 따라 제거하였다.
0.98 mmol/g 의 수지 로딩을 UV 정량화 (방법 설명 A; VA: 100 ml, VB: 10 ml 및 VC: 1.4 ml) 에 따라 결정하였다.
c) 제 2 아미노산 (L-Dpr) 의 도입
DMF (2 ml) 중의 Trt-L-Dpr(Fmoc)-OH (173 mg, 3 당량), HOBt (47 mg, 3 당량) 및 DIPCDI (47 ㎕, 3 당량) 의 혼합물을 실온에서 5 분 동안 진탕한 후, 실시예 7b) 에 따라 제조된 수지에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 정치시켰다. 닌하이드린 시험 (방법 C) 에 따라 재커플링이 요구되지 않았다. 그 후 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 및 DCM (5 x 1 분; 각각 3 ml) 로 세정하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 Fmoc-gr-rem 방법에 따라 제거하였다.
d) HMPA 핸들기의 도입
DMF (2 ml) 중의 HMPA (55 mg, 3 당량), HOBt (47 mg, 3 당량) 및 DIPCDI (47 ㎕, 3 당량) 의 혼합물을 실시예 7c) 에 따라 제조된 수지에 첨가한 후, 실온에서 1 시간 동안 정치시켰다. 닌하이드린 시험 (방법 C) 에 따라 재커플링이 요구되지 않았다. 그 후, 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 및 DCM ( 5 x 1 분; 각각 3 ml) 로 세정하였다.
e) SPPS 에 의한 Fmoc-Xaa-OH 의 도입
실시예 7d) 에 따라 제조된 수지에서 출발하여, 1. Fmoc-Leu-OH 를 반응 사이클 설명 (viii) 에 따라 혼입한 후, 2. Fmoc-Ala-OH 및 3. Fmoc-Phe-OH 를 각각 반응 설명 (ix) 에 따라 혼입하였다.
f1) 반응 사이클 설명 (viii)
DCM/DMF (15: 1 (v/v), 2.5 ml) 중의 Fmoc-Leu-OH (144 mg, 4 당량) 및 DIPCDI (30 ㎕, 2 당량) 를 실시예 7d) 에 따라 제조된 수지에 첨가하였다. 그 후, DCM (0.5 ml) 중의 DMAP (4.8 mg, 0.4 당량) 를 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 정치시켰다. 상기 아미노산을 DCM/DMF (15: 1 (v/v), 2.5 ml) 중의 Fmoc-Leu-OH (144 mg, 4 당량) 및 DIPCDI (30 ㎕, 2 당량) 를 사용하여 실온에서 16 시간 동안 재커플링하였다. 커플링 후, 상기 수지를 DCM (5 x 1 분; 각각 3 ml) 및 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 로 세정하였다. 그 후, 상기 수지를 DMF (2.5 ml) 중의 아세트산 무수물 (46 ㎕, 5 당량) 및 DIEA (86 ㎕, 5 당량) 를 사용하여 실온에서 30 분 동안 캡핑하였다. 캡핑 후, 상기 수지를 DCM (5 x 1 분; 각각 3 ml) 및 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 로 세정하였다. 그 후, 상기 Fmoc 기를 Fmoc-gr-rem 방법에 따라 제거하였다. 0.94 mmol/g 의 수지 로딩을 UV 정량화(방법 설명 A; VA: 100 ml, VB: 10 ml 및 VC: 1.4 ml) 에 따라 결정하였다.
f2) 반응 사이클 설명 (ix)
DMF (2 ml) 중의 각각의 Fmoc-Xaa-OH (3 당량), HOBt (47 mg, 3 당량) 및 DIPCDI (47 ㎕, 3 당량) 의 혼합물을 수지에 첨가한 후, 실온에서 1 시간 동안 정치시켰다. 닌하이드린 시험 (방법 C) 에 따라 재커플링이 요구되지 않았다. 그 후 상기 수지를 DMF (5 x 1 분; 각각 3 ml) 및 DCM (5 x 1 분; 각각 3 ml) 로 세정하였다. 상기 Fmoc 기를 Fmoc-gr-rem 방법에 따라 제거하였다.
g) 분석 - 상기 핸들기 및 상기 수지로부터 펩티드의 절단
실시예 7e) 에 따라 수득한 소량의 수지 (5 mg) 를 95% (v/v) TFA, 2.5% (v/v) TIS 및 2.5% (v/v) 물의 혼합물 1 ml 로 실온에서 1 시간 동안 처리하였다. RP-HLPC 분석으로 Phe-Ala-Leu-NH2 를 확인하였다 (방법 설명 B1, 이동상 B 5 내지 100).
h)
디케토피페라진기
형성
디펩티딜
링커의 L-
Dpr 의
Trt
보호기 제거, C-말단 보호기를 포함하는
디케토피페라진
잔기의
형성 및 수지로부터의 절단
C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기의 형성 및 실시예 7e) 에 따라 제조된 수지의 DKP-펩티드의 절단을 실시예 1.4a 에 기재된 바와 같은 유사한 방식으로, 펩티딜-수지의 양에 따라 적용된 시약 및 용매의 양을 사용하여 수행하였다:
h1) Trt 기 탈보호
실시예 7 e) 에 따라 제조된 화합물을 DCM 중의 TFA 0.2% (v/v), TIS 2% (v/v) 로 처리하였다 (2 x 5 분, 각각 2 ml).
h2) 중화
DCM 중의 DIEA 5% (v/v) 로 처리하였다 (2 x 5 분; 각각 2 ml).
h3) C-말단 보호기를 포함하는 디케토피페라진 잔기의 형성 및 수지로부터의 절단
그 후, THF 중의 피페리딘 5% (v/v) 로 처리하였다 (2 x 5 분; 각각 2 ml).
THF 를 진공 하에서 증발시켜 제거하고, 수득한 화학식 (ex-7h3) 의 화합물을 RP-HPLC-ESMS (방법 설명 B2, 이동상 B 5 내지 100, [(M+H)/2]+: 679, 이때 M 은 화학식 (ex-7h3) 의 화합물의 분자량임) 에 따라 분석하였다.
서열 목록
프리
텍스트
<210> 1
<223> SEQ ID 1 은 [T20-1-36] 으로 축약됨
<210> 2
<223> SEQ ID 2 는 [T20-27-36] 으로 축약됨
<210> 3
<223> SEQ ID 3 은 [T20-17-26] 으로 축약됨
<210> 4
<223> SEQ ID 4 는 [T20-17-36] 으로 축약됨
<210> 5
<223> SEQ ID 5 는 식 (ex-5i) 및 (ex-6fl) 에 포함됨
<210> 6
<223> SEQ ID 6 은 식 (ex-6f2) 에 포함됨
<110> Lonza Ltd
<120> Diketopiperazine forming dipeptidyl linker
<130> LP2232PC00
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID 1 is abbreviated with [T20-1-36]
<400> 1
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln
1 5 10 15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
20 25 30
Trp Asn Trp Phe
35
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID 2 is abbreviated with [T20-27-36]
<400> 2
Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID 3 is abbreviated with [T20-17-26]
<400> 3
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu
1 5 10
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID 4 is abbreviated with [T20-17-36]
<400> 4
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
1 5 10 15
Trp Asn Trp Phe
20
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID 5 is comprised in formulae (ex-5i) and (ex-6f1)
<400> 5
Tyr His Ala Phe Ala Leu
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID 6 is comprised in formula (ex-6f2)
<400> 6
Tyr His Ala Tyr His Leu
1 5
Claims (12)
- 펩티드 C-PEP 의 제조를 위한 방법(C-PEP) 로서,
C-PEP 가 펩티딜 라디칼 PEP-C 를 포함하고, PEP-C 의 C-말단이 보호기 DKP-PG 에 의해 보호되고, DKP-PG 는 핸들기 HG, 임의로는 스페이서기 SG, 및 디케토피페라진 잔기 DKP 를 포함하고;
SG 가 펩티드 화학에서 통상 사용되는 스페이서기이고;
DKP 가 디펩티드 잔기 DPR 에서 유래한 디케토피페라진 잔기이고;
DPR 이 알파 아미노산 잔기 Xaa1 및 Xaa2 를 포함하고;
Xaa1 이 DPR 의 C-말단 아미노산 잔기이고;
Xaa2 가 DPR 의 N-말단 아미노산 잔기이고, Xaa2 가 측쇄를 갖고, 상기 측쇄가 관능기 FG 에 의해 치환되고;
PEP-C 가 XaaC(1) 을 통해 HG 에 연결되고;
XaaC 가 PEP-C 의 아미노산 잔기이고;
XaaC(1) 에서의 지수 (1) 이 PEP-C 의 C-말단 위치를 나타내고;
XaaC(1) 이 PEP-C 의 C-말단 아미노산 잔기이고;
HG 가 펩티드에서 2 개의 아미노산 잔기를 연결하는 아미드 결합을 절단하지 않는 조건 하에 HG 로부터 C-말단이 절단될 수 있게 하는, 펩티드의 C-말단을 고체상에 연결시키기 위한 고체상 펩티드 합성 SPPS 에서 통상 사용하는 핸들기이고;
HG 가 FG 에 직접 연결되거나, SG 가 존재하는 경우, HG 가 SG 에 연결되고 SG 가 FG 에 연결되고;
방법(C-PEP) 가 단계 (iii) 을 포함하고;
단계 (iii) 이 반응(INRIFO) 를 포함하고;
반응(INRIFO) 가 분자내 고리 형성 및 펩티드 PEP-C-DKP-L-ResinA 에서의 동시 절단 반응을 포함하는 반응이고;
PEP-C-DKP-L-ResinA 가 C-PEP 의 전구체이며 PEP-C 및 수지 DKP-L-ResinA 를 포함하고, 이때 PEP-C 가 DKP-L-ResinA 에 연결되고;
DKP-L-ResinA 가 ResinA 및 DKP-PG 형성 링커 DKP-L 을 포함하고, 이때 ResinA 가 DKP-L 에 연결되고,
ResinA 가 SPPS 에서 고체상으로서 통상 사용되는 수지이고,
DKP-L 이 HG, 임의로는 SG, 및 DPR 을 포함하고, 이때 Xaa1 의 카르복실산기인 DPR 의 C-말단 카르복실산기가 ResinA 에 연결되고;
반응(INRIFO) 에서의 분자내 고리 형성이 Xaa2 의 알파 아미노기인 DPR 의 N-말단 아미노기의, DPR 의 C-말단 카르복실산기와의 반응이며, 이에 따라 DKP 를 형성하고, 이에 따라 Xaa1 이 동시에 ResinA 로부터 절단되고 DKP-PG 가 형성되고;
HG 가, HG 와 XaaC(1) 사이의 결합이 반응(INRIFO) 동안 절단되지 않는 방식으로 선택되는 방법. - 제 1 항에 있어서, PEP-C 가 고체상 펩티드 합성 SPPS(PEP-C) 에 의해 단계 (iii) 전에 제조되고, ResinA 가, ResinA 와 Xaa1 사이의 결합이 SPPS(PEP-C) 동안 절단되지 않는 방식으로 선택되는 방법(C-PEP).
- DKP-PG 형성 링커 DKP-L 의 제조를 위한 방법(DKP-L) 로서,
방법(DKP-L) 이 단계 (DKP-L-i), 단계 (DKP-L-iii) 및 임의로는 단계 (DKP-L-ii) 를 포함하고;
단계 (DKP-L-i) 에서 Xaa2 가 Xaa1 에 커플링되고;
SG 가 DKP-L 에 존재하는 경우 임의의 단계 (DKP-L-ii) 에서 SG 가 Xaa2 에 커플링되고;
SG 가 DKP-L 에 존재하는 경우 단계 (DKP-L-iii) 에서 HG 가 SG 에 커플링되거나, Xaa2 에 커플링되고;
이때 DKP-PG, DKP-L, DKP, Xaa2, Xaa1, HG 및 SG 가 제 1 항에서 정의한 바와 같은 방법. - DKP-L-ResinA 의 제조를 위한 방법(DKP-L-ResinA) 로서,
방법(DKP-L-ResinA) 가 방법(X1) 또는 방법(X2) 이고;
방법(X1) 이 단계 (X1-i), 단계 (X1-ii), 단계 (X1-iv) 및 임의로는 단계 (X1-iii) 을 포함하고;
단계 (X1-i) 에서 아미노산 Xaa1 이 ResinA 에 커플링되고;
단계 (X1-ii) 에서 아미노산 Xaa2 가 Xaa1 에 커플링되고;
SG 가 DKP-L-ResinA 에 존재하는 경우 임의의 단계 (X1-iii) 에서 SG 가 Xaa2 의 측쇄에 커플링되고;
SG 가 DKP-L-ResinA 에 존재하는 경우 단계 (X1-iv) 에서 HG 가 SG 에 커플링되거나, Xaa2 에 커플링되고;
방법(X2) 가 단계 (X2-i) 을 포함하고;
단계 (X2-i) 에서 DPK-L 이 ResinA 에 커플링되고;
이때 DKP-L-ResinA, ResinA, DKP-PG, DKP-L, DKP, Xaa2, Xaa1, HG 및 SG 가 제 1 항에서 정의한 바와 같은 방법. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서:
HG 가 식 (HGF-I) 의 핸들기, 식 (HGF-II) 의 핸들기, 식 (HGF-III) 의 핸들기, 식 (HGF-IV) 의 핸들기, 식 (HGF-V) 의 핸들기 및 식 (HGF-VI) 의 핸들기로 이루어지는 군에서 선택되는 핸들기인 방법;
[식 중,
(*) 는 방법(C-PEP) 에서 PEP-C 의 C-말단의 C 원자, 및 HG 사이의 결합을 나타내거나,
방법(C-PEP) 에서 PEP-C 의 C-말단 아미노산 잔기가 측쇄를 가지며 상기 측쇄를 통해 HG 에 연결되는 경우, 방법(C-PEP) 에서 PEP-C 의 C-말단 아미노산 잔기의 측쇄, 및 HG 사이의 결합을 나타내고,
(**) 는 n 이 1 인 경우 HG 및 SG 사이의 결합을 나타내거나, n 이 0 인 경우 HG 및 FG 사이의 결합을 나타내고;
R1, R2, R3, R4, R10 및 R11 은 동일하거나 상이하며 수소 및 O-C1 -4 알킬로 이루어지는 군에서 서로 독립적으로 선택되고,
s1-1, s2, s3, s4 및 s6 은 동일하거나 상이하며 1, 2, 3 및 4 로 이루어지는 군에서 서로 독립적으로 선택되고,
s5-1 은 0, 1, 2, 3 또는 4 이고,
s1-2, s5-2 및 s5-3 은 동일하거나 상이하며 서로 독립적으로 0 또는 1 이고,
T1-1 은 O 또는 NH 이고,
T1-2 및 T5-1 은 O 이고;
이때 n, SG, FG, PEP-C 및 방법(C-PEP) 는 제 1 항에서 정의한 바와 같음]. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서:
SG 가 식 (SG-I) 의 스페이서기, 식 (SG-II) 의 스페이서기, 식 (SG-III) 의 스페이서기, 식 (SG-IV) 의 스페이서기 및 식 (SG-V) 의 스페이서기로 이루어지는 군에서 선택되는 스페이서기인 방법;
[식 중,
m1, m5, m6, m7, m9, m10, m11 및 m12 는 동일하거나 상이하며 서로 독립적으로 1 내지 500 의 정수이고;
m2, m3 및 m4 는 동일하거나 상이하며 서로 독립적으로 1, 2, 3 또는 4 이고,
(***) 은 n 이 1 인 경우 SG 에서 HG 로의 결합이고,
(****) 는 n 이 1 인 경우 SG 및 Xaa2 사이의 결합이고,
이때 HG, Xaa2 및 n 은 제 1 항에서 정의한 바와 같음]. - 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서:
Xaa1 이 자연 발생적 알파 아미노산 잔기, 알파-N-메틸아미노산 잔기, L-Hpr 잔기, D-Hpr 잔기, DL-Hpr 잔기, 2-(C1 -5-알킬)-D-아미노산 잔기, 2-(C1 -5-알킬)-L-아미노산 잔기, 2-(C1 -5-알킬)-DL-아미노산 잔기 및 식 (HypX) 의 화합물에서 유래한 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 방법;
[식 중,
X 는 O, S 또는 C(R13)R14 이고;
R5, R7, R12, R13 및 R14 는 동일하거나 상이하며 수소, C1 -4 알킬 및 O-R8 로 이루어지는 군에서 서로 독립적으로 선택되고;
R8 은 펩티드 화학에서 측쇄 보호에 통상 사용되는 보호기, 또는 식 (Sub-R8) 의 치환기임;
{식 중,
m8 은 1, 2, 3 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8 ,9 또는 10 이고;
R9 는 C1 -4 알킬임}]. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서:
Xaa2 가 L-Lys 잔기, D-Lys 잔기, DL-Lys 잔기, L-Orn 잔기, D-Orn 잔기, DL-Orn 잔기, L-4-아미노프롤린 잔기, D-4-아미노프롤린 잔기, DL-4-아미노프롤린 잔기, L-알파,감마-디아미노-부탄산 잔기, D-알파,감마-디아미노부탄산 잔기, DL-알파,감마-디아미노-부탄산 잔기, L-알파,베타-디아미노프로판산 잔기, D-알파,베타-디아미노-프로판산 잔기, DL-알파,베타-디아미노프로판산 잔기, L-Ser 잔기, D-Ser 잔기, DL-Ser 잔기, L-Thr 잔기, D-Thr 잔기, DL-Thr 잔기, L-Cys 잔기, D-Cys 잔기, DL-Cys 잔기, L-호모시스테인 잔기, D-호모시스테인 잔기, DL-호모시스테인 잔기, L-Asp 잔기, D-Asp 잔기, DL-Asp 잔기, L-Glu 잔기, D-Glu 잔기 및 DL-Glu 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 방법. - 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서:
ResinA 가 히드록시메틸폴리스티렌 (HMPS) 수지, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 계 수지, PEG 수지와 상이한 수지에 PEG 가 그래프트되는 수지, 폴리스티렌 수지, p-벤질옥시벤질 알코올 수지, 클로로메틸 폴리스티렌-디비닐벤젠 수지, 폴리(비닐 알코올)-그래프트-폴리(에틸렌 글리콜) (PVA-g-PEG) 수지로 이루어지는 군에서 선택되는 방법. - 펩티드 PEP 의 제조를 위한 방법(PEP-HSPPS) 로서,
방법(PEP-HSPPS) 가 단계 (i-pep) 및 단계 (ii-pep) 를 포함하고,
단계 (i-pep) 에서 펩티드 C-PEP 가 제 1 항에서 정의된 바와 같은 방법(C-PEP) 에 따라 제조된 후;
단계 (ii-pep) 에서, 단계 (i-PEP) 에서 수득한 C-PEP 가 균일 용액상 펩티드 합성 HSPPS 에 의해 N-말단 보호된 아미노산 또는 N-말단 보호된 펩티드 PEP-N 과 커플링되고;
이때 방법(C-PEP) 및 C-PEP 가 제 1 항에서 정의한 바와 같은 방법. - C-PEP, PEP-C-DKP-L-ResinA, DKP-L-ResinA 및 DKP-L 로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물로서; 이때 C-PEP, PEP-C-DKP-L-ResinA, DKP-L-ResinA 및 DKP-L 이 제 1 항에서 정의한 바와 같은 화합물.
- C-PEP, PEP-C-DKP-L-ResinA, DKP-L-ResinA 및 DKP-L 로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물의 펩티드 화학에 있어서의 용도; 또는 DKP-PG 형성 링커로서의 DKP-L 의 용도; 이때 C-PEP, PEP-C-DKP-L-ResinA, DKP-L-ResinA, DKP-L 및 DKP-PG 는 제 1 항에서 정의된 바와 같음.
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