KR20130123302A - 중합에 의한 ｄｎａ 염기서열화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 물리적 조작에 의해 핵산 염기서열을 결정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 포크와 분자의 한 말단 간의 물리적 간격을 측정함으로써 주형 상의 복제 포크 배치의 정확한 결정에 기초한다. 이는 복제의 멈춤 또는 차단이 발생하는 부위의 물리적 위치를 결정하게 하고, 이로부터 핵산의 염기서열에 대한 정보를 추론한다.

Description

중합에 의한 ＤＮＡ 염기서열화 방법{METHOD OF DNA SEQUENCING BY POLYMERISATION}
본 발명은 핵산, DNA 또는 RNA의 염기서열(sequence)을 결정하기 위한 신속한 방법에 관한 것으로, 이는 특히 알려지지 않은 핵산의 염기서열화에, 또는 대안적으로 진단을 위한 특정한 핵산 염기서열의 검출에 유용하다.
오늘날, 핵산 염기서열의 결정은 분자 생물학의 핵심이다. 예를 들어, 폭넓은 범위의 생명 현상이 고-수율의 DNA 염기서열화, 예를 들어 유전 변이, RNA 발현, 단백질-DNA 상호작용, 및 염색체 입체구조(chromosome conformation)에 의해 평가될 수 있다[예를 들어, Mitreva & Mardis, Methods Mol Biol., 533: 153-87, 2009; Mardis, Genome Med., 1(4): 40, 2009; Cloonan 외, Nat Methods, 5(7): 613-619, 2008; Valouev 외, Genome Res., 18(7): 1051-63, 2008; Valouev 외, Nat Methods., 5(9): 829-34, 2008; Orscheln 외, Clin Infect Dis., 49(4): 536-42, 2009; Walter 외, Proc Natl Acad Sci U S A., 106(31): 12950-5, 2009; Mardis 외, N Engl J Med., 361(11): 1058-66, 2009; Hutchinson, Nucl . Acids Res., 35(18): 6227-6237, 2007 참조].
또한, 생리적 샘플에서 특정한 DNA 염기서열의 존재를 입증하는 것은 현재, 예를 들어 박테리아가 항생물질 내성을 발달시킬 확률, 유전적 기형, 유전자 변형과 연계된 암의 위험들, 및 바이러스 감염, 예를 들어 HIV 또는 간염 바이러스와 연계된 감염을 식별하기 위한 진단 방법들의 주요한 개발 라인을 구성한다[예를 들어, Zhang 외, Nature, 358: 591-593, 1992; Turner 외, J Bacteriol, 176(12): 3708-3722, 1994; Weston 외, Infection and Immunity, 77(7): 2840-2848, 2009 참조].
핵산 염기서열화는 오늘날 주로 생어(Sanger) 생화학의 모세관-기반 반자동 구현을 이용하여 수행된다. 고전적 방법으로는 관심 DNA의 증폭 단계, 및 이어서 형광 표지된 디디옥시뉴클레오티드(ddNTP)의 결합에 의해 프라이머 신장법(primer extension)의 각 라운드가 확률적으로 종결되는 '사이클 시퀀싱(cycle sequencing)' 단계를 포함한다. 염기서열은 모세관-기반 폴리머 겔에서의 말단-표지된 외가닥 연장 생성물(single-stranded, end-labelled extension products)의 고-분해능 전기영동 분리에 의해 결정된다. 96 또는 384 개의 독립적인 모세관들에서의 동시 전기영동이 제한된 레벨의 병렬화(parallelization)를 제공한다.
저-비용 염기서열화를 위한 높은 요구로 인해, 염기서열화 과정을 병렬화하여 동시에 수천 또는 수백만의 염기서열들을 생성하는 고-수율 염기서열화 기술들이 개발되었다[Shendure & Ji, Nat Biotechnol., 26(10): 1135-45, 2008]. 고-수율 염기서열화 기술들은 표준 염료-종결자(dye-terminator) 방법들을 이용하여 가능한 것 이상으로 DNA 염기서열화의 비용을 낮추도록 의도된다. 현재 이러한 매우 높은 수율은 생어의 염기서열화에 비해 개별적인 판독들의 정확성 및 길이를 상당히 희생하여 달성된다.
이러한 신규한 방법들의 예시들은 454 및 솔렉사(Solexa) 기술들을 포함한다. 이 기술들은 대장균(E.coli) 또는 여하한의 숙주 세포에서의 클로닝 없이 전체 게놈의 샷건 시퀀싱(shotgun sequencing)을 허용한다. 비드의 표면 상에 캡처된 짧은 어댑터-부착 DNA 단편(short, adaptor-flanked DNA fragment)들의 라이브러리들이 유제 PCR에 의해 증폭된다. DNA 중합효소에 의한 프라임된 합성(primed synthesis)을 이용하여 염기서열화가 수행된다. ['파이로시퀀싱(pyrosequencing)'이라고도 알려진] 454 방법에서, 어레이는 4 개의 dNTP 각각으로 연속하여 표현되며, 결합량은 배출된 피로인산의 발광 검출(luminometric detection)에 의해 모니터링된다. 이 방법과 솔렉사의 중요한 차이는, 솔렉사는 사슬-종결 뉴클레오티드(chain-terminating nucleotides)를 이용한다는 것이다. 종결 염기 상의 형광 표지가 차단되지 않은 3' 말단을 남기도록 제거되어, 사슬 종결을 위한 가역 과정을 구성할 수 있다. SOLiD 기술은 클론에 의하여 증폭된 라이브러리 템플릿(clonally-amplified library template) 내에서 어댑터 염기서열과 혼성화(hybridize)된 시퀀싱 프라이머(sequencing primer)에 대한 형광 표지된 이염기 탐침(di-base probe)들의 결찰(ligation)에 의존한다. 이염기 탐침의 특이성은 각각의 결찰 반응에서 제 1 및 제 2 염기 모두 조사(interrogate)함으로써 달성된다. 결찰, 검출 및 절단(cleavage)의 다수 사이클이 수행되며, 이때 사이클의 수는 최후 판독 길이를 결정한다. 모두 증폭의 제 1 단계를 필요로 하는 3 개의 앞선 기술들과 대조적으로, 헬리코스 플랫폼(Helicos platform)은 단일 DNA 분자들의 염기서열화를 허용한다. 이 기술은 합성에 의한 염기서열화를 통해 단일 DNA 분자들을 직접 조사하기 위해 형광 뉴클레오티드 결합의 고감도 검출 시스템의 사용에 기초한다.
이러한 방법들은, 예를 들어 미국 특허 제 4,882,127호; 미국 특허 제 4,849,077호; 미국 특허 제 7,556,922호; 미국 특허 제 6,723,513호; PCT 특허 출원 WO 03/066896호; PCT 특허 출원 WO 2007111924호; 미국 특허 출원 US 2008/0020392호; PCT 특허 출원 WO 2006/084132호; 미국 특허 출원 US 2009/0186349호; 미국 특허 출원 US 2009/0181860호; 미국 특허 출원 US 2009/0181385호; 미국 특허 출원 US 2006/0275782호; 유럽 특허 EP-B1-1141399; Shendure & Ji, Nat Biotechnol., 26(10): 1135-45, 2008; Pihlak 외, Nat Biotechnol., 26(6): 676-684, 2008; Fuller 외, Nature Biotechnol., 27(11): 1013-1023, 2009; Mardis, Genome Med., 1(4): 40, 2009; Metzker, Nature Rev . Genet., 11(1): 31-46, 2010에서 설명된다.
하지만, 개발된 모든 방법들은 현재까지도 심각한 단점들을 갖는다. 특히, 이들은 모두 표지된 뉴클레오티드(예를 들어, 형광)를 이용하므로, 전체 비용을 심하게 증가시키는데 기여한다. 또한, 하나(헬리코스 플랫폼)를 제외한 이 신규한 방법들 모두 염기서열화에 앞서 타겟 염기서열의 증폭을 필요로 하며, 이는 한편으로는 시간 소모적이고, 다른 한편으로는 오차 확률을 증가시키며, 오염되기가 매우 쉽다. 또한, 생화학보다는 기계적 기술들을 수반하는 방법들은 감도가 부족하다[Maier 외, Proc . Natl ., Acad . Sci . U.S.A., 97(22): 12002-12007, 2000; Wuite 외, Nature, 404(6773): 103-106, 2000; US 2010/0035252]. 따라서, 여전히 단일 분자들의 염기서열화를 허용하는 신규한 고감도 방법이 필요하다.
본 발명은 물리적 조작에 의해 핵산 염기서열을 결정하는 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 방법은 복제의 멈춤(pause)이 발생하는 부위의 물리적 위치를 결정하는 단계, 및 그로부터 핵산의 염기서열에 대한 정보를 추론하는 단계를 포함한다.
물리적 기술 및 전자적 처리에 기초한 본 발명에 따른 방법은 화학적이거나 생화학적인 현재의 접근법들과 상이하다. 그 장점은 매우 많다:
1) 이는 단일 분자의 염기서열화를 허용하므로, (예를 들어, PCR에 의한) 앞선 증폭 단계를 필요로 하지 않는다.
2) (형광기 또는 몇몇 다른 기들을 갖는) 표지된 뉴클레오티드보다 훨씬 덜 비싼 표준 핵산 분자들이 사용되기 때문에, 종래의 방법들보다 훨씬 더 적은 비용이 든다.
3) 이중-가닥 핵산 분자의 두 말단들 간의 간격을 측정함으로써 이중-가닥 핵산을 따라 새로 합성된 상보적 가닥(complementary strand)의 (bp에서의) 배치(localization)를 결정하는 것이 가능하다.
4) 일 실시예에서, 이는 한 중합에서 가닥을 따라 주어진 뉴클레오티드의 위치를 결정하는 실행(run)을 허용한다.
5) 측정은 초 시간-척도로 주기적으로 반복될 수 있으며, 이에 따라 양성 오류(false positive)(중합효소의 거짓 멈춤)가 제거되고, 통계가 개선되며, 기기 드리프트(instrumental drift)가 상당히 감소된다.
6) 실험은 동일한 분자로 여러 번 반복되어, 통계 및 측정의 신뢰도를 개선할 수 있는데, 이는 복제 단계 후 (예를 들어, 헬리카제 또는 엑소뉴클레아제 활성을 이용하거나, 힘 또는 이온 강도를 감소시킴으로써) 새로 합성된 외가닥 핵산이 이탈(eject)될 수 있기 때문이다. 이는 각각의 분자가 서로 독립적으로 조작될 수 있기 때문에, 다양한 이중-가닥 핵산 분자들의 병렬 염기서열화를 허용한다.
7) 새로운 가닥을 합성하기 위해 수정되지 않은 효소가 사용될 수 있으며, 이는 염료-연결자(dye-linker)를 절단하도록 중합효소에 부위-특이적 돌연변이를 도입하거나, 한 측에 효소를 결합하거나, 또는 양자점으로 이를 수정하는 제 3 세대 단일 분자 염기서열화에 비해 관련 비용들을 낮추고 오차율을 개선한다.
본 발명은 복제가 멈추거나 차단되는 부위들의 염기서열화된 핵산 분자에 대한 물리적 배치에 기초하여 핵산 염기서열을 결정하는 방법에 관한 것이다.
'핵산 염기서열을 결정'한다는 것은, 본 명세서에서 핵산 내 염기들의 실제 천이(succession)뿐만 아니라, 두 개의 상이한 핵산 분자들의 염기서열들 간의 차이의 검출 또는 핵산 분자 내의 특정 염기서열의 검출과 같은 핵산 염기서열에 대한 몇몇 정보를 직접 또는 간접적으로 획득하게 하는 모든 활동들을 해독한다는 것을 의미한다.
핵산 염기서열을 결정하는 대부분의 방법은 진행적 중합효소에 의한 새로운 가닥의 프라임된 합성에 의존한다. 이 방법들에서는, 프라이머가 이중-가닥 핵산 주형의 가닥들 중 하나에 혼성화되고; 새로운 가닥은 중합효소에 의해 프라이머로부터 합성되며; 합성은 특정한 부위들에서 멈추거나 차단되고; 중합 시 이 멈춤 또는 차단의 검출이 상기 핵산의 염기서열에 대한 정보를 제공한다.
이제, 본 발명에 따라 이중-가닥 핵산의 염기서열에 대한 정보를 얻기 위해 이 차단과 연계된 물리적 파라미터들을 활용할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 더 정확하게는, 복제 멈춤 또는 차단이 발생하는 부위를 상기 이중-가닥 핵산 분자 상에 물리적으로 위치시키는 것이 가능하다는 것을 발견하였으며; 이때 멈춤 또는 차단의 특정한 물리적 위치는 상기 이중-가닥 핵산의 염기서열에 대한 정보를 제공한다.
본 발명은 부분적으로 변성된 이중-가닥 핵산 분자가 장력을 받는 경우, 상기 분자의 두 말단들 간의 물리적 간격을 측정하는 것이 가능하다는 관찰로부터 기인한다. 합성에 의한 염기서열화 과정에서, 복제 포크의 진행은 이중-가닥 핵산 분자의 풀림(unwinding)과 연계되어, 포크에서 연결(join)되는 두 자유 말단들을 남긴다. 복제가 특정한 부위에서 차단되는 경우, 이중-가닥 핵산 분자는 복제 포크의 앞에서는 두 가닥들이 여전히 어닐링(anneal)되고 있는 한편, 포크 뒤의 두 개의 모가닥(parental strands)은 분리되어 있는 입체구조에서 차단된다. 이제, 상기 이중-가닥 핵산 분자가 장력을 받는 경우, 상기 이중-가닥 핵산 분자의 두 분리된 말단들 간의 물리적 간격을 측정하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 이때, 상기 간격으로부터 복제의 멈춤 또는 차단이 발생하는 부위의 상기 이중-가닥 핵산 분자 상의 물리적 위치가 추론되어, 상기 이중-가닥 핵산 분자의 염기서열에 대한 몇몇 정보를 유도할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 핵산 염기서열을 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은:
a) 상기 핵산 염기서열에 대응하는 이중-가닥 핵산 분자를 변성시키는 단계;
b) 상기 변성된 이중-가닥 핵산 분자와 외가닥 핵산 분자("프라이머")를 혼성화하는 단계;
c) b)에서 얻어진 혼성화된 프라이머/이중-가닥 핵산 분자에 장력을 가하는 단계;
d) 복제 시 적어도 1 이상의 멈춤을 초래하는 조건에서, 중합효소로 b)에서 얻어진 혼성화된 프라이머/이중-가닥 핵산 분자를 배양하는 단계; 및
e) 이중-가닥 핵산의 한 말단에 대해 복제 시 상기 멈춤의 위치를 결정하는 단계를 포함한다.
'변성'은 본 명세서에서 상기 가닥들 간의 대부분의 수소 결합들이 끊어지는 경우를 발생시키는 이중-가닥 핵산 분자의 가닥 분리의 과정을 의미한다. 변성 과정은 변성된 핵산 분자를 산출하며, 이는 본 명세서에서 이중-가닥 핵산 분자의 변성으로부터 발생하는 2 개의 분리된 상보적 가닥을 의미한다. '복원'은 본 명세서에서 2 개의 분리된 상보적 가닥이 혼성화를 통해 이중 나선으로 재형성하는 과정을 칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, '혼성화'는 단일 혼성체(single hybrid)로의 핵산의 2 이상의 상보적 가닥들 간의 비-공유 염기서열-특이적 상호작용을 확립하는 과정이다.
핵산을 변성시킬 여러 가능성이 당업자에게 알려져 있다. 가장 바람직한 방식에서, 두 가닥들은 이들에게 물리적 힘을 가함으로써 분리된다. 예를 들어, 상기 이중-가닥 핵산의 자유 말단들이 당겨서 떨어질 수 있으며, 이에 따라 접합된 염기(paired base)들 간의 모든 결합이 깨지고 이중-가닥 핵산이 열린다(open).
이 형태의 염기서열 결정 방법에서는, 이중-가닥 DNA의 자유 말단들[즉, 운반체(support)에 부착되지 않은 말단들]이 당겨서 떨어지기 전에 공유결합 또는 준(quasi)-공유결합으로 서로 연결되도록 배열되는 것이 리페어링(re-pairing)을 용이하게 하기 위해 유리할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 이중-가닥 핵산 분자는 헤어핀(hairpin)이다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 한 가닥의 5' 말단은 다른 가닥의 3' 말단에 공유결합으로 직접 연결된다. 본 발명과 관련하여 이중-가닥 핵산을 도표로 나타내는 것이 바람직한 경우, 이를 열려 있는(또는 닫혀 있는) "지퍼(zip fastener)"로 비유할 수 있다: 이중-가닥 핵산의 변성은 지퍼를 여는 것(unzipping)이고, 복원은 다시 지퍼를 닫는 것(rezipping)이다.
본 발명의 외가닥 핵산은 특히, 천연 또는 수정된 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "디옥시리보핵산" 및 "DNA"라는 용어들은 디옥시리보뉴클레오티드로 구성된 중합체를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "리보핵산" 및 "RNA"라는 용어들은 리보뉴클레오티드로 구성된 중합체를 의미한다. 또한, 상기 외가닥 핵산은 리보스 부분(ribose moiety)이 2' 산소 및 4' 탄소를 연결하는 추가 가교(extra bridge)로 수정되는 뉴클레오티드인 잠금 핵산(locked nucleic acid: LNA), 또는 백본(backbone)이 펩티드 결합에 의해 링크된 반복적인 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위(unit)들로 구성되는 펩티드 핵산(PNA)과 같은 수정된 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
본 발명은 여하한 타입의 이중-가닥 핵산에 적용된다. 주로 이중-가닥 핵산은 DNA일 것이지만, 본 발명은 완벽히 접합되거나 완벽히 접합되지 않은 외가닥 DNA-외가닥 DNA 듀플렉스(duplex), 또는 대안적으로 완벽히 접합되거나 완벽히 접합되지 않은 외가닥 DNA-외가닥 RNA 듀플렉스, 또는 완벽히 접합되거나 완벽히 접합되지 않은 외가닥 RNA-외가닥 RNA 듀플렉스에도 적용된다는 것을 이해한다. 또한, 듀플렉스는 상이한 기원의 샘플들로부터 얻어진 2 개의 외가닥들의 적어도 부분적인 리페어링으로 구성될 수 있다. 최종적으로, 본 발명은 단독 외가닥 DNA의 이차 구조 또는 단독 외가닥 RNA의 이차 구조에도 적용된다.
전형적인 구성에서, 이중-가닥 핵산 분자들은 특히 2 개의 고체 기판(예를 들어, 현미경 슬라이드, 마이크로피펫, 마이크로입자) 상에 고정될 수 있다. 말단들 중 하나는 표면에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있는 한편, 다른 말단은 이동가능한 표면에 직접 또는 간접적으로 부착된다. 이 실시예에서, 운반체들이 멀리 이동되는 경우, 이중-가닥 핵산의 두 말단 모두에 장력이 가해진다. 장력이 임계값보다 높은 경우, 두 가닥들은 분리되고 핵산 분자는 변성된다. 가해지는 장력은 바람직하게는 15 pN이거나 그 이상이고; 이는 더 바람직하게는 16 pN이거나 그 이상이며; 이는 훨씬 더 바람직하게는 17 pN이거나 그 이상이고; 매우 바람직한 실시형태에서, 이는 18 pN이거나 그 이상이다. 이 힘은 온도, 뉴클레오티드 타입, 및 완충제에 따라 변할 수 있지만, 당업자라면 두 가닥들의 분리를 얻기 위해 이 파라미터들에 대하여 상기 힘을 쉽게 맞출 것이다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 이중-가닥 핵산은 임계값보다 높은 장력을 가함으로써 변성된다. 외가닥 핵산("프라이머")과 변성된 이중-가닥 핵산을 배양하는 것은 상기 외가닥 프라이머의 혼성화를 초래한다. 바람직하게는, 외가닥 핵산 분자의 염기서열은 이중-가닥 핵산 분자의 염기서열의 적어도 일부와 상보적이다.
장력이 중간값 정도까지 감소되는 경우, 변성된 이중-가닥 핵산의 두 가닥들은 다시 혼성화될 수 있다. 상기 두 가닥들의 재혼성화(rehybridization)를 얻기 위해, 10 내지 12 pN의 장력이 가해지고; 더 바람직하게는, 이는 12 pN이며; 훨씬 더 바람직하게는, 이는 11 pN이고; 훨씬 더 바람직하게는, 이는 10 pN이다.
본 발명에 따르면, 중합효소 활성은 이 조건들의 장력 하에서 작용하여, 새로운 가닥으로의 뉴클레오티드 결합에 의한 프라이머 연장을 유도한다.
가장 바람직하게는, 이중-가닥 핵산은 헤어핀이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, '헤어핀'은 한 가닥의 5' 말단이 비접합 루프(unpaired loop)를 통해 다른 가닥의 3' 말단에 물리적으로 링크되는 이중 나선을 의미한다. 상기 물리적 링크는 공유결합이거나 공유결합이 아닐 수 있다. 바람직하게는, 상기 물리적 링크는 공유결합이다. 따라서, 헤어핀은 이중-가닥 줄기 및 비접합 외가닥 루프로 구성된다. 헤어핀에서, 루프에 관여하지 않은 두 가닥들의 말단들은 자유이며, 이에 따라 당겨서 떨어질 수 있다. 이는 이중-가닥 핵산의 비접합(unpairing)을 유도하고, 이에 따라 변성된 이중-가닥 핵산 분자를 산출한다. 임계값보다 높은 힘으로 상기 핵산 분자의 각 말단을 당김으로써, 헤어핀 이중-가닥 핵산 분자를 완전히 여는 것이 가능하다. 분자에 가해지는 장력이 중간값으로 감소되는 경우, 핵산 분자는 자가-재혼성화(self-rehybridize)하여 헤어핀을 재형성한다. 이 중간 장력 하에서, 차단이 발생할 때까지 효소의 중합효소 활성에 의해 새로운 가닥이 생성된다. 본 발명에 따르면, 이중-가닥 핵산의 한 말단에 대해 복제 시 상기 차단의 위치를 결정하는 것은 상기 이중-가닥 핵산의 염기서열에 대한 정보를 제공한다.
헤어핀을 이용하는 것은, 특히 접합 및 비접합의 사이클들을 수행하고, 이에 따라 신호/잡음 비를 개선할 수 있게 한다.
본 발명의 목적을 위해, 루프는 0 내지 60 뉴클레오티드에 포함된 여하한의 길이로 이루어질 수 있다. 안정적인 헤어핀을 형성하기 위해서는, 적어도 약 4 내지 5 뉴클레오티드의 루프 구역이 요구되는 것으로 여겨진다. 하지만, 훨씬 더 짧은 길이의 루프들로 본 발명을 수행하는 것도 가능하다. 실제로, 본 발명의 몇몇 실시예들에서 루프가 0 뉴클레오티드로 구성되는 헤어핀을 이용하는 것이 유리할 수 있다는 것을 발견하였다. 이 경우, 한 가닥의 3' 말단은 다른 가닥의 5' 말단에 직접 물리적으로 링크된다. 이중-가닥 핵산의 자유 말단들이 함께 연결되게 하는 기술들이 알려져 있으며, 일부는 아래에서 더 상세하게 설명될 것이다.
차단의 결정은, 본 명세서에서 차단과 연계된 물리적 파라미터들의 결정을 의미한다. 이 파라미터들 중 가장 유용한 것은 이중-가닥 핵산 분자 상의 차단 위치이며, 상기 위치는 새로 합성된 외가닥에서 최후 결합된 뉴클레오티드의 위치에 대응한다. 실제로, 복원 시 멈춤이 발생하는 신장된(stretched) 이중-가닥 핵산 상의 위치가 정확하게 결정될 수 있다는 것을 발견하였다: 헤어핀의 사용에서 당업자는 변성/복원 과정 동안 언제라도 헤어핀의 두 자유 말단들 간의 물리적 간격을 결정할 수 있다.
'자유 말단'은, 본 명세서에서 다른 가닥의 맨 끝에 공유결합으로 링크되지 않은 한 가닥의 말단을 의미한다; 앞서 설명된 바와 같이, 이 자유 말단들은 각각 상이한 표면에 결합될 수 있다. 예를 들어, 이 표면들 중 하나는 이동가능할 수 있는 한편, 다른 표면은 움직이지 않을 수 있다. 따라서, 당업자라면 헤어핀 이중-가닥 핵산의 자유 말단들 간의 간격을 측정하기 위해, 단순히 두 표면들 간의 간격을 측정할 수 있다는 것을 알아차릴 것이다.
이 간격은 헤어핀 분자가 완전히 변성되는 경우에 최대[앞서 언급된 임계값보다 높은 힘(Fopen)에서 zhigh]인데, 이는 이때 헤어핀 핵산이 완전히 연장되기 때문이다; 이는 상기 헤어핀 분자가 완전히 복원되는 경우에 최소[앞서 언급된 중간값에 대응하는 힘(Ftest)에서 zlow]이다. 외가닥 핵산이 동일한 탄력 특성들을 갖도록 동일한 힘(Ftest)에서 모든 길이 비교를 수행하는 것이 유리하다. 당업자는 루프 연결(loop closing)의 지연을 이용하여 zhigh(Ftest)를 측정할 수 있다.
복제가 특정한 부위에서 차단되는 경우, 이중-가닥 핵산 분자는 복제 포크의 앞에서는 두 가닥들이 여전히 어닐링되고 있는 한편, 포크 뒤의 두 모가닥은 분리되어 있는 입체구조에서 차단된다. 복제 과정이 일시적이거나 영구적으로 멈추는 경우 두 자유 말단들 간의 간격은 측정될 수 있다: 예상대로, 이 간격(z)은 zhigh 내지 zlow(z는 모두 F = Ftest로 측정됨)에 포함된다. 복제 포크가 멈추거나 차단되는 지점의 헤어핀 분자 상의 배치에 따라 간격(z)이 변한다는 것이 바로 분명하다. 상기 복제 포크가 헤어핀의 자유 말단들 가까이에 위치되는 염기서열에서 멈추는 경우, 간격(zpause)은 최소일 것이다.
반면에, 상기 복제 포크가 비접합 루프에 가까운 헤어핀의 일부분에 대응하는 염기서열에서 차단되는 경우, 간격(z)은 최대일 것이다(도 1). 멈춤은 장력(Ftest) 하에 헤어핀의 중합효소 유도 풀림 동안 관찰될 수 있다. 복제가 차단될 때까지 이것이 힘(Fopen)(이에 대해 헤어핀이 열림)에서 진행되는 경우, 복제 차단은 가닥들이 차단 지점까지 다시 닫게 하는(rezip) Ftest로 힘을 감소시킬 때 관찰될 수 있다.
이중-가닥 핵산 분자 상의 물리적 간격을 다수 염기들과 정확히 연관시키는 것이 가능하다. 예를 들어, 1 nm의 간격은 10 pN의 힘을 받는 핵산에서 2 개의 뉴클레오티드(1 bp)에 의해 이르는 간격에 대응한다. 힘에 대한 정확한 교정(calibration)은 외가닥 핵산의 탄성에 의해 주어진다.
그러므로, 단순히 장력 하에 이중-가닥 핵산 분자의 두 자유 말단들 간의 간격을 측정함으로써, 복원이 차단되는 곳을 정확히 결정하는 것이 가능하다.
따라서, 일 실시예에서 본 발명의 방법은 핵산 염기서열을 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은:
a) 상기 핵산 염기서열에 대응하는 이중-가닥 핵산 분자를 변성시키는 단계;
b) 상기 변성된 이중-가닥 핵산 분자와 외가닥 핵산 분자("프라이머")를 혼성화하는 단계;
c) b)에서 얻어진 혼성화된 프라이머/이중-가닥 핵산 분자에 장력을 가하는 단계;
d) 복제 시 적어도 1 이상의 멈춤을 초래하는 조건에서, 중합효소로 b)에서 얻어진 혼성화된 프라이머/이중-가닥 핵산 분자를 배양하는 단계; 및
e) 이중-가닥 핵산의 한 말단에 대해 복제 시 상기 멈춤의 위치를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 이중-가닥 분자의 두 말단들 간의 간격은 복제 과정이 차단되는 경우에 결정된다. 바람직하게는, 상기 분자의 두 말단들 간의 간격은 분자가 완전히 변성되는 경우에 결정된다. 더 바람직하게는, 두 간격들이 비교되고 차단의 위치가 결정된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "중합효소"는 뉴클레오티드의 중합(즉, 중합효소 활성)에 촉매 작용하는 효소를 칭한다. 일반적으로, 효소는 폴리뉴클레오티드 주형 염기서열에 어닐링된 프라이머의 3' 말단에서 합성을 개시할 것이며, 주형 가닥의 5' 말단을 향해 진행할 것이다. "DNA 중합효소"는 디옥시뉴클레오티드의 중합에 촉매 작용하는 한편, "RNA 중합효소"는 리보뉴클레오티드의 중합에 촉매 작용한다. 본 발명에 따른 중합효소는 진행적 중합효소이거나 비-진행적 중합효소이다. 진행적 효소는 변성된 이중-가닥 핵산 주형 상의 반응의 다수 라운드들에 촉매 작용하는 한편, 효소는 상기 주형에 결합된 채로 유지된다. 본 명세서에서 이해되는 바와 같이, 중합효소는 진행적일 것이며, 즉 적어도 25 개의 뉴클레오티드, 적어도 50 개의 뉴클레오티드, 적어도 100 개의 뉴클레오티드, 통상적으로는 적어도 500 개의 뉴클레오티드에 대해 변성된 이중-가닥 핵산 주형에 결합된 채로 유지될 것이며, 적어도 1000 개 또는 그보다 많은 뉴클레오티드에 대해 진행적일 수 있다. 본 발명에 따른 중합효소는 RNA-의존성 RNA 중합효소, DNA-의존성 RNA 중합효소, DNA-의존성 DNA 중합효소, RNA-의존성 DNA 중합효소(역전사효소) 등을 포함한다. 이러한 많은 효소들이 당업계에 알려져 있다. 본 발명에 따르면, 상기 중합효소는 이중-가닥 핵산 주형에 가해지는 힘이 중간값, 즉 10 내지 12 pN에 포함되거나, 헤어핀이 완전히 펼쳐지는(unfolded) 높은 힘들인 경우에 핵산을 합성시킬 수 있다.
바람직하게는, 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소가 본 발명의 방법에서 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "3'-5' 엑소뉴클레아제 활성"은 DNA 중합체의 3' 말단으로부터 합성된 뉴클레오티드를 제거하는 효소의 능력을 칭한다.
이러한 효소들의 예시는, 예를 들어 T4 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, DEEP VENT DNA 중합효소, 대장균 중합효소 Ⅲ, Phi29 DNA 중합효소, 대장균 DNA 중합효소 I, 대장균 DNA 중합효소 I, 클레노우 단편(Klenow Fragment), Phusion® High Fidelity DNA 중합효소, Phusion® Hot Start High Fidelity DNA 중합효소, Phire® Hot Start DNA 중합효소, 9°Nm DNA 중합효소, Herpes Simplex Virus Type 1 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 중합효소는 이중-가닥 핵산 분자에 가해지는 힘을 최소값 아래로 감소시킴으로써, 중합효소-활성 모드로부터 3'-5' 엑소뉴클레아제-활성 모드로 전환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 최소값은 7 pN이고; 더 바람직하게는, 상기 최소값은 6 pN이며; 훨씬 더 바람직하게는, 상기 최소값은 5 pN이다.
훨씬 더 바람직하게는, 상기 중합효소는 중간 장력 하에, 예를 들어 10 내지 12 pN의 힘이 이중-가닥 헤어핀에 가해지는 경우에 가닥 치환 활성(strand displacement activity)을 추가로 갖는다. "가닥 치환"은, 본 명세서에서 중합효소가 합성 동안 하류 핵산(downstream nucleic acid)을 치환하는 능력을 의미한다. 특히, 시험관 조건들 즉 이중-가닥 주형에 장력이 가해지지 않는 조건들에서 어떠한 가닥 치환 활성도 갖지 않는 것으로 알려져 있는 T4 DNA 중합효소 및 T7 DNA 중합효소가, 이중-가닥 헤어핀이 10 pN 이상의 힘을 받는 경우의 중합 시 하류 핵산을 제거할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, T4 DNA 중합효소 및 T7 DNA 중합효소는 본 발명의 방법을 수행하기에 특히 적절하다. "T4 DNA 중합효소" 및 "T7 DNA 중합효소"는, 본 명세서에서 단합체 효소 및 전효소를 칭한다.
본 발명에 따른 방법은 복제 과정 시 적어도 하나의 멈춤을 초래하는 조건들 하에서 수행되는 복제 단계를 포함한다.
바람직하게는, 이중-가닥 핵산 분자는 복제 단계 시 장력에 따른다. 더 바람직하게는, 상기 장력은 중간값 정도이며, 즉 상기 장력은 10 내지 12 pN에 포함된다. 상기 멈춤은 당업자에게 알려진 여하한의 수단에 의해 야기될 수 있다. 새로운 가닥의 합성이 차단되는 합성에 의한 염기서열화 방법이 당업계에서 폭넓게 사용되어 왔다. 이러한 여하한의 방법은 본 발명의 목적에 맞게 구성될 수 있다. 예를 들어, 중합효소는 뉴클레오티드-선택성의 진행적 효소일 수 있으며, 이는 특정한 뉴클레오티드에 대해 효소의 진행적 움직임의 비율이 변하는(rate-altering) 반응 혼합에서 변성된 이중-가닥 핵산 주형과 접촉한다. 예를 들어, 상기 반응 혼합은 염기들 중 하나가 매우 낮은 농도로 존재하는 디옥시-뉴클레오티드(dNTP)의 풀(pool)을 포함한다. 그 경우, 중합효소가 상기 뉴클레오티드의 보체와 접할 때마다, 이는 낮은 농도의 뉴클레오티드가 제 위치로 확산할 때까지 멈춤을한다. 따라서, 분자에 따른 멈춤을 위치들은 합성된 가닥에서 부족한 뉴클레오티드의 위치들을 드러내고, 당업자로 하여금 염기서열에서 대응하는 염기의 위치를 식별하게 한다(Greenleaf and Block, Science, 313: 801, 200; 미국 특허 제 7,556,922호).
대안적으로, DNA에서 발견된 정상 디옥시뉴클레오티드(dNTPs)에 추가하여 디디옥시뉴클레오티드(ddNTPs)를 사용하는 것이 가능하다. 디디옥시뉴클레오티드는 하이드록실기(OH) 대신에 3' 탄소 상에 수소기를 포함하는 것을 제외하고는 뉴클레오티드와 본질적으로 동일하다. 염기서열로 결합된 경우의 이 수정된 뉴클레오티드는 또 다른 뉴클레오티드의 추가를 방지한다. 이는, 인산디에스테르 결합이 디디옥시뉴클레오티드와 다음에 오는 뉴클레오티드 사이에 형성될 수 없기 때문에 발생하며, 이에 따라 DNA 사슬이 종결된다. 그러므로, 하나의 ddNTP의 결합은 상기 ddNTP 이후에 뉴클레오티드가 추가될 수 없기 때문에 중합효소 반응을 중지시킬 것이다. 이에 따라, 분자에 따른 차단 위치가 합성된 가닥에서 ddNTP의 결합 위치를 드러내고, 당업자로 하여금 염기서열에서 대응하는 염기의 위치를 식별하게 한다. 이때, 각각의 멈춤을 또는 차단 위치는 본 발명의 방법에 의해, 즉 분자의 두 자유 말단들 간의 물리적 간격을 측정함으로써 결정될 수 있다. 또한, ddNTP 대신에 뉴클레오시드 3인산(NTP)을 사용하는 것도 가능하다. 차이점은, 하나의 NTP의 결합이 본 명세서에 언급된 제 1 제안예와 유사한 패턴을 발생시키는 중합효소의 과정을 일시적으로만 멈춤을시킨다는 것이다.
본 발명의 방법은 알려지지 않은 핵산의 직접적인 염기서열화에 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 알려진 외가닥 핵산(프라이머)으로부터 헤어핀 가닥들 중 하나에 상보적인 증가한 연장의 염기서열을 합성하기 위해 진행적 효소가 사용되어, 중간 정도의 장력(예를 들어, 5 내지 13 pN의 범위) 하에 유지되는 이중-가닥 헤어핀을 효과적으로 푼다. 이 실시예에서, 중합은 외가닥 프라이머의 존재 하에 힘을 Fopen까지 일시적으로 증가시킴으로써 이중-가닥 헤어핀을 여는 것에 의하여 개시된다. Fopen는 이중-가닥 헤어핀을 완전히 여는데 필요한 임계값보다 높은 장력이다. 이는 이중-가닥 헤어핀에 대한 프라이머의 혼성화에서 유도된다. 다음 단계에서, 힘은 중합효소가 (가닥 치환 모드이든 아니든) 새로운 가닥을 합성할 수 있도록 Felongation(≤Fopen)으로 설정된다. Felongation은 바람직하게는 Fopen(이중-가닥 헤어핀을 완전히 여는데 필요한 임계값)보다 낮은 중간 장력에 설정되며, 상기 중간 장력은 중합효소에 의한 복제를 허용한다. 바람직하게는, 상기 중간값은 10 내지 12 pN에 포함된다. Felongation와 동일한 장력 하에서, 중합효소는 멈춤을 또는 차단이 발생할 때까지 지속적인 비율로 새로운 가닥을 합성한다. 따라서, 효소 활성은 연장된 상보적인 외가닥 핵산 분자의 생산으로 이어진다.
가닥 치환 구성에서, 상기 중합효소는 헤어핀에 가해지는 힘을 조정함으로써 두 작용 모드들, 즉 엑소뉴클레아제 활성과 신장(elongation) 사이에서 전환될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 신장 과정은 중합효소가 루프에 도달하기 전에 중지된다. 이는 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 통상적이지 않은 염기를 갖는 몇몇 뉴클레오티드를 루프의 앞에 삽입하는 것이 중합효소를 중지시킬 것이다. 동일한 효과가 루프 바로 전에 위치된 단백질의 이중-가닥 결합 도메인을 이용하여 달성될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 신장 과정이 차단된 후 헤어핀 분자에 가해진 힘(Fexo)은 최소값, 예를 들어 5 pN 아래로 감소된다. 이는 중합효소로 하여금 엑소뉴클레아제 활성으로 전환하게 하고, 막 합성된 가닥을 분해한다. 이 과정은 전체 가닥이 완전히 분해되는 경우에 중지된다. 대안적으로, 분해 과정은 효소가 멎게 되는 경우, 예를 들어 프라이머에서 수정된 뉴클레오티드와 같은 장애물을 만나는 경우에 중지된다. 이러한 경우, 새로 합성된 가닥을 분출(eject)하도록 효소를 사용할 필요가 있을 수 있다. 적절한 효소들의 예시로서, 예를 들어 UVrD 헬리카제, recBCD 헬리카제, 대장균 UvrD 헬리카제, Tte-UvrD 헬리카제, T7 Gp4 헬리카제, RecBCD 헬리카제, DnaB 헬리카제, MCM 헬리카제, Rep 헬리카제, RecQ 헬리카제, PcrA 헬리카제, T4 UvsW 헬리카제, SV40 거대 T 항원 헬리카제, 포진 바이러스 헬리카제, 효모 Sgs1 헬리카제, DEAH_ATP-의존성 헬리카제, 및 유두종 바이러스 헬리카제 E1 단백질 및 그 동족체를 포함한 헬리카제, 및 뱀독 포스포디에스테라아제, 비장 포스포디에스테라아제, Bal-31 뉴클레아제, 대장균 엑소뉴클레아제 I, 대장균 엑소뉴클레아제 Ⅶ, 녹두 뉴클레아제, S1 뉴클레아제, 대장균 DNA 중합효소 1의 엑소뉴클레아제 활성, DNA 중합효소 1의 클레노우 단편의 엑소뉴클레아제 활성, T4 DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성, T7 DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성, Taq DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성, DEEP VENT DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성, 대장균 엑소뉴클레아제 Ⅲ, λ 엑소뉴클레아제 및 VENTR DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성을 포함한 엑소뉴클레아제를 인용할 수 있다.
막 합성된 가닥의 분해는, 예를 들어 ddNTP 또는 NTP를 결합시키는 경우에 중지하거나 드문 뉴클레오티드의 보체와 접할 때마다 멈춤을하는 중합효소를 이용하여 전체 과정, 즉 임계치 예를 들어 10 pN보다 높은 장력 하에서의 가닥의 합성을 반복할 기회를 제공한다. 프라이머가 분해 단계 시 배출된 경우, 프라이머가 혼성화될 수 있도록 헤어핀을 열고 다시 닫는 단계에 의해 합성이 진행될 것이다. 10 pN 이상으로 힘을 증가시키면, 신장 모드로 중합효소를 다시 전환할 것이고, 새로운 멈춤을 패턴이 기록될 수 있다. 따라서, 합성/분해 사이클을 반복하는 것은 동일한 드문 뉴클레오티드로 여러 멈춤을 패턴들을 기록할 수 있게 한다. 이는 개선된 신호/잡음 비를 유도하여, 오차가 보다 적은 더 높은 퀄리티의 염기서열 획득을 허용한다. 대안적으로, 복제 단계는 ddNTP의 존재 하에 헤어핀이 완전히 열리는 높은 힘에서 처리될 수 있다. 그 경우, ddNTP 결합로부터 발생한 차단은 Ftest로 힘을 낮출 때 검출될 수 있다.
일단 충분한 통계 자료가 기록되면, 부족한 또 다른 뉴클레오티드 또는 또 다른 ddNTP으로 절차가 반복된다. 각 뉴클레오티드로 상기 절차가 반복된 후, 가닥 내 모든 뉴클레오티드의 위치가 함께 컴파일(compile)되고, 이에 따라 본래 이중-가닥 핵산 분자의 완전한 염기서열이 산출된다.
본 발명의 방법의 구현은, 특히 단일-분자 레벨에서 실시간 핵산 상호작용을 탐침하도록 설계된 디바이스들의 존재에 의해 가능해질 수 있었다. 이러한 디바이스는, 예를 들어 미국 특허 제 7,052,650호 및 제 7,244,391호에서 설명된다. 여기에 설명된 장치는 자기 트랩(magnetic traps)을 이용하여 미크론-크기의 초상자성 비드(superparamagnetic bead)에 피코뉴턴 스케일의 힘을 가한다. 간명하게는, 상기 장치는 광학 현미경, 자석 및 PC를 포함한다. 이중-가닥 핵산 분자들은 한 말단에서의 다수 지점들에서 부동 요소(motionless element), 예를 들어 표면에 고정되고, 다른 말단에서 이동가능한 표면, 이 경우에는 자기 비드에 고정된다. 자석들은 비드에 작용하기 위해 제공된다. 특히, 자석들은 표면으로부터 비드를 당기기 위해 사용될 수 있다. 하지만, 본 발명의 방법의 구현은 상기의 장치로 제한되지 않는다. 본 발명의 방법을 구현하기 위해, 이를 완전히 연장시킨 다음 이중-가닥 핵산의 분자를 다시 접고(refold), 이와 동시에 상기 분자의 연장을 모니터링할 수 있는 여하한의 디바이스가 사용될 수 있다. 예를 들어, 광학 족집게(optical tweezer)들이 사용될 수 있다; 하지만, 광학 족집게들은 이전 힘 교정을 필요로 하며, 높은 수율 측정들에 대해 쉽게 병렬화되지 않는다. 또 다른 단점들로는 핵산의 총 비틀림 제어의 부족, 및 혼성화 조건들을 변경시킬 수 있는 포커스된 레이저에 의해 발생할 수 있는 용액의 국부적 가열이 있다.
이중-가닥 핵산은 적당한 비드들(예를 들어, 스트렙타아비딘 코팅된 비드들)의 용액에서 수 분 동안 배양되며, 이는 그 표지된(예를 들어, 비오틴) 말단들 중 하나에 의해 비드들에 결합된다. 비드들은 광학 족집게들이 이후 조작을 위해 사용되는 경우 투명할 수 있으며, 또는 조작을 위해 자기 트랩 또는 족집게들을 이용하는 경우에는 자성을 띨 수 있다.
비드-핵산 조립체는 유체 챔버 내에 주입되며, 그 표면은 분자의 다른 표지된 말단을 결합시키도록 처리되었다[예를 들어, 안티-Dig(anti-Dig)로 코팅된 표면은 핵산의 Dig-표지된 말단(Dig-labeled end)을 결합시킴]. 따라서, 비드들은 핵산 헤어핀을 통해 표면에 고정된다(도 1a 참조). 그 후, 표면과 비드의 간격은 당업자에게 알려진 다양한 수단들에 의해 모니터링되며; 예를 들어, 이 간격을 추론하기 위해 카메라 상의 이들 이미지의 회절 링들이 사용될 수 있거나, 이 간격을 측정하기 위해 에바네센트 모드(evanescent mode)로 조명될 때 이들이 산란하는(또는 형광에 의해 방출하는) 광 세기가 사용될 수 있다. 대안적으로, 고정 표면 상의 센서에 대한 이 간격을 추론하기 위해, (GMR 또는 Hall 센서들과 같은 자기 센서를 이용하여) 이들이 생성하는 자기장이 측정될 수 있다.
표면에 비드들을 고정하는 핵산 분자를 당기기 위해 다양한 기술들이 개시되었다. 하나는 포커스된 레이저 빔의 광을 이용하여 초점 부근에 투명한 비드를 트랩(trap)시키는 기술이다. 고정 표면에 대한 빔의 상대적인 이동(relative translation)에 의하여, 테더링 분자에 힘을 가할 수 있다(통상적인 광학 족집게 분석). 그 평형 위치로부터의 비드의 변위(displacement)에 비례하는 가해진 힘은, 테더링 분자에 일정한 힘을 가하기 위해 트랩핑 빔(trapping beam)에 대한 피드백 루프를 필요로 한다.
비드에 일정한 힘을 가하기 위해, 비드 주위의 유동에 의해 생성된 유체역학 항력(hydrodynamic drag)의 이용이 설명되었지만, 이는 통상적으로 낮은 공간 정확성(> 100 nm)을 산출한다. 바람직한 실시예는 앞서 설명된 바와 같이 핵산 헤어핀에 의해 표면에 고정된 초상자성 비드들을 당기기 위해 자기 트랩을 이용한다. 이 구성에서는, 샘플 위에 배치된 작은 자석들이 고정된 비드에 일정한 힘을 가하는데 사용되며, 그 위치는 [유체역학 항력으로 인한 소산(dissipation) 및 당기는 힘에 따라] < 1 nm 정확성으로 결정될 수 있다.
매 경우마다, 약 16 pN보다 큰 힘으로 비드들을 당김으로써 테더링 헤어핀이 기계적으로 완전히 열릴 수 있다는 것을 알 수 있다. 분자의 장력을 약 11 pN 아래로 감소시키면, 헤어핀이 자발적으로 다시 닫힐 수 있다[지퍼를 여는 전이(unzipping transition)는 이력현상(hysteretic)을 통해 가역적임]. 열리는(unzipped) 단계 동안 (단백질, 또는 DNA, RNA, LNA 또는 PNA의 상보적 올리고뉴클레오티드들과 같은) 용액 내 몇몇 분자들이 신장된 외가닥 핵산과 결합한 경우, 이 분자들은 힘이 11 pN 아래로 낮춰질 때 헤어핀이 다시 닫히는 것을 차단할 것이다. 따라서, 분석의 원리는 두 힘: 즉, 헤어핀을 멈춤을 큰 힘(Fopen)과 다시 닫히는 것을 허용하고 일시적인 차단에서 분자의 연장을 측정하는데 사용되는 더 작은 힘(Ftest) 사이에서 전환하는 것이다. 차단 위치는 전체 연장과 차단된 것 사이의 선형 관계에 의한 염기서열과 관련된다.
최적의 정확성을 위해, 전체 연장은 테스트 힘(Ftest)에서 측정되는 것이 바람직하다. 이는 일단 힘이 Fopen으로부터 Ftest로 감소되면, 다시 접는데 몇 분의 1초(fraction of a second)를 필요로 하도록 헤어핀 루프를 설계함으로써 달성된다.
표면들 또는 운반체들에 핵산들을 부착하기 위해, 해당 기술분야에 알려진 기술들 중 어느 하나를 이용할 수 있다. 본질적으로, 핵산은 운반체, 예를 들어 마이크로-비드에 직접 고정되며, 이는 예를 들어 핵산의 기능화된 말단과 반응할 수 있는 스트렙타아비딘, COOH기 등으로 이를 코팅함으로써 이 표면의 기능화(functionalization)에 관여한다.
이러한 방법들은 일반적으로 핵산, 특히 3' 및 5' 말단들을 기능화하는 것, 다시 말해 적절한 화학기(chemical group)들을 말단들에 접목하는 것을 필요로 한다. 또한, 작업의 종료 시에 가닥들이 분리되는 것을 방지하기 위하여 루프에 의해 분자의 다른 2 개의 자유 말단들을 연결하는 것이 바람직할 수 있으며, 적절하다면 이러한 작업은 반복될 수 있다. 이를 위해, 상이한 절차들이 채택될 수 있다.
가장 간단하게는, 합성 올리고뉴클레오티드들을 이용하여, 2 개의 상이한 전-처리된 표면들에 고정을 허용하는 2 개의 상이한 기능(예를 들어, 비오틴 및 아민)을 갖는 이중-가닥 핵산의 말단들 중 하나를 기능화하는 것이다. 다른 말단에서의 2 개의 가닥은 루프의 형태로 부분적으로 접합된 합성 뉴클레오티드를 이용하여 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 접합된 외가닥 핵산, 즉 헤어핀이 이중-가닥 핵산으로부터 생성된다. 이 방법의 장점은 (유전자 또는 염색체의 분별에 의해 얻어지는 바와 같이) 큰 핵산 단편들의 이종 개체를 기능화할 수 있는 능력을 갖는다는 점이며, 그 후 이는 동시에 분석될 수 있다. 이 경우, 핵산 샘플은 2 개(또는 그 이상)의 제한 효소들을 이용하여 분별되며, 이는 모든 단편들에 걸쳐 유사한 그 말단들에서 2 개의 상이한 제한 부위들로 하위개체(subpopulation)가 얻어질 수 있게 한다. 이는 2 개의 말단들이 (예를 들어, 그 말단에서 적절한 제한 부위를 점유한 루프의 형태로 올리고뉴클레오티드에 한 말단을 연결함으로써) 상이하게 처리될 수 있게 한다. 이 방법의 단점은 2 개의 인접한 작용기들 간에 입체 간섭(steric interference)이 있다는 것이며, 이는 표면들과의 결합을 어렵게 만들 수 있다. 이 문제를 해결하기 위해서는, 헤어핀 분자의 각 자유 말단에 염기들의 "스페이서(spacer)" 염기서열을 추가하는 것이 유리할 수 있으며, 그 후 그 말단에 작용기가 추가된다; 2 개의 스페이서 염기서열들은 비-상보적이며, 그 전용 표면(dedicated surface)에 결합하도록 충분한 공간을 각각의 작용기에 제공한다. 더 유리하게는, 각각의 스페이서 염기서열의 염기서열은 본 발명의 염기서열화 방법에서 알려진 염기서열의 외가닥 염기서열 프라이머들을 이용하기 위해 설계된다. 이중-가닥 핵산 분자들에 대한 루프 및/또는 스페이서들의 추가는 분자 생물학에서 보편적으로 사용되는 방법들 중 어느 하나에 따라 수행될 수 있다. 이 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있으므로, 여기서 자세히 설명하지 않기로 한다.
실제 고정 기술들에 관해서는, 다수의 기술이 존재하며, 이들은 상업적으로 이용가능한 전처리된 표면들에 고분자(단백질, DNA 등)를 고정하기 위한 기술들로부터 도출된다. 이 기술들의 대부분은 단백질의 카르복실(--COOH) 또는 아민(--NH2) 말단들과 반응할 수 있는 표면 공여기들(surfaces carrying groups)(--COOH, --NH2, --OH 등)에 대한 링크 단백질(면역글로불린) 및 면역학 테스트에 대해 개발되었다.
핵산의 공유결합 고정(covalent anchoring)은 분자의 5' 말단의 자유 인산염을 통해 직접적으로 달성될 수 있으며, 이는 공유 결합을 형성하기 위해 이차 아민[스트라스부르(Strasbourg)에서 Polylabo에 의해 판매되는 Covalink --NH 표면]과 반응한다. 또한, 아민기로 DNA를 기능화한 후, 단백질과 같이 진행하는 것이 가능하다.
또한, 스트렙타아비딘(Dynal 비드 등)으로 코팅된 표면들이 존재하며, 이는 스트렙타아비딘과 비오틴화된 DNA 분자 사이에 준-공유결합 고정을 허용한다. 마지막으로, (앞서 언급된 방법들에 의해) 디곡시제닌(digoxigenin)에 대해 지향된 항체를 표면에 접목시킴으로써, 디곡시제닌으로 기능화된 핵산이 여기에 고정될 수 있다. 이는 단지 다수의 가능한 고정 기술들의 일례를 나타낸다.
부착 및 고정 기술들 중에서, 예를 들어 셀룰로오스와 같은 고체 운반체에 DNA를 부착하기 위해 효소 결합을 이용하는 유럽 특허 EP 152 886에 개시된 기술들이 언급될 것이다.
유럽 특허 EP 146 815 또한 운반체에 DNA를 부착하는 다양한 방법들을 설명한다. 이와 유사하게, 특허 출원 WO 92/16659는 중합체를 이용하여 DNA를 부착하는 방법을 제안한다.
당연히, 핵산은 운반체에 직접 부착될 수 있지만, 필요하다면 특히 표면들의 영향을 제한하는 견지에서, 핵산은 예를 들어 유럽 특허 EP 329 198에 개시된 바와 같이 펩티드 또는 다른 성질의 불활성 아암(inert arm)의 말단에 부착될 수 있다.
본 발명의 실행은, 별도로 나타내지 않은 경우, 종래의 기술들 또는 해당 분야의 기술 내에 있는 단백질 화학, 분자 바이러스학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 및 약리학을 채택한다. 이러한 기술들은 문헌(Ausubel 외, Current Protocols in Molecular Biology, Eds., John Wiley & Sons, Inc. New York, 1995; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985; 및 Sambrook 외, Molecular cloning: A laboratory manual 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press - Cold Spring Harbor, NY, USA, 1989)에서 충분히 설명된다.
아래의 예시들은 본 발명의 다른 특징들 및 장점들이 쉽게 이해될 수 있도록 할 것이다.
도 1 헤어핀 DNA 상의 상보적 염기서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 혼성화의 검출 원리. 표면에 비드를 고정하는 헤어핀 DNA는 (a) 비드를 당기는 힘을 16 pN 이상의 값으로 증가시킴으로써 순간적으로 열린다(unzipped). 이 단계에서, 용액 내의 상보적 단편이 열린 DNA 헤어핀 상의 타겟과 혼성화되고, 이에 따라 (b) 힘이 초기 값으로 다시 감소될 때 헤어핀이 다시 닫히는 것(rezipping)을 방지한다. 헤어핀 재접힘은 다양한 지속기간을 갖지만 잘 정의된 연장들에서 발생하는 4 개의 플래토(plateau)를 나타낸다. 73.71 nm의 최고 플래토는 Ftest에서 완전히 열린 83 bp 헤어핀과 연계되는 한편, 최저 플래토는 완전히 다시 접힌 헤어핀에 대응한다. 2 개의 올리고가 용액 내에 배치되었기 때문에, 25.47 nm 및 35.17 nm의 2 개의 중간 플래토가 생긴다. 이 연장 변화(zhigh-z)로부터, 헤어핀을 따라 상보적 염기서열이 접합된 곳을 추론할 수 있다. 여기서 이들의 위치에 따라, 블록들은 그 예상 위치들 29 bp 및 40 bp에 거의 근사하게 위치 28.66 bp 및 39.60 bp와 일치한다. 플래토 위치들은 수 개의 열림/닫힘 사이클(여기서는 ~20 개의 사이클)로부터 얻어진 히스토그램에 가우시안을 피팅(fit)함으로써 더 우수하게 추산된다.
도 2 단일 분자 생어 염기서열화의 예시. 상용 완충제[5X Reaction Buffer: 335mM Tris-HCl(25℃에서 pH8.8), 33mM MgCl2, 5mM DTT, 84mM (NH4)2SO4, Fermentas; http://www.fermentas.com/en/products/all/modifying-enzymes/mesophilic-polymerases/ep006-t4-dna-polymerase]에서 T4 DNA 중합효소(dTNP = dGNP = dCNP = 500μM, dATP = 5μM, ddATP = 400μM, 클램프 및 클램프 로더)를 이용한 1.2 kbps 단일 분자 헤어핀 상의 합성의 실시간 기록. 높은 힘에서, 곡선의 피크는 헤어핀 샘플의 존재를 나타낸다. 중간 힘에서, 상승하는 곡선은 T4 DNA 중합효소에 의한 새로운 상보적 가닥의 진행적 합성을 나타내는 한편, 플래토는 하나의 ddNTP가 결합될 때 발생하는 멈춤을 나타낸다. 낮은 힘에서, 곡선의 하강 에지는 막 합성된 가닥을 제거하는 엑소뉴클레아제 활성을 나타낸다. 이 합성 및 엑소뉴클레아제 단계는 사이클들에서 반복될 수 있다.
도 3 불균형한 dNTP 농도에 기초한 염기서열화의 예시. 상용 완충제[5X Reaction Buffer: 335mM Tris-HCl(25℃에서 pH8.8), 33mM MgCl2, 5mM DTT, 84mM (NH4)2SO4, Fermentas; http://www.fermentas.com/en/products/all/modifying-enzymes/mesophilic-polymerases/ep006-t4-dna-polymerase]에서 T4 DNA 중합효소(dTNP = dGNP = dCNP = 33μM, dATP = 20nM, 클램프 및 클램프 로더)를 이용한 1.2 kbps 단일 분자 헤어핀 상의 합성의 실시간 기록. 높은 힘(~21 pN)에서, 곡선의 피크는 헤어핀 샘플의 존재를 나타내며 필요한 경우 프라이머를 혼성화하는데 사용될 수 있다. 중간 힘(~11.7 pN)에서, 곡선의 상승 에지는 T4 DNA 중합효소에 의한 새로운 상보적 가닥의 진행적 합성을 나타내는 한편, 일시적 멈춤은 dATP가 요구되는 시점들(presents)에 대응한다. 낮은 힘(~1.6 pN)에서, 하강은 T4 DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성의 활성화로 인한 새로 합성된 가닥의 절단을 나타낸다. 이 합성 및 절단 사이클은 반복가능하다.
도 4 헤어핀 상의 상보적 염기서열에 대한 불균형한 dNTP 농도에 기초한 염기서열화의 검출. 도 4a: 상용 완충제[5X Reaction Buffer: 335mM Tris-HCl(25℃에서 pH8.8), 33mM MgCl2, 5mM DTT, 84mM (NH4)2SO4, Fermentas; http://www.fermentas.com/en/products/all/modifying-enzymes/mesophilic-polymerases/ep006-t4-dna-polymerase]에서 T4 DNA 중합효소(dTNP = dGNP = dCNP = 33μM, dATP = 20nM, 클램프 및 클램프 로더)를 이용한 83 bp 단일 분자 헤어핀 상의 합성의 실시간 기록. 높은 힘(~21 pN)에서, 곡선의 피크는 헤어핀 샘플의 존재를 나타내며, 필요한 경우 프라이머를 혼성화하는데 사용될 수 있다. 중간 힘(~11.7 pN)에서, 곡선의 상승 에지는 T4 DNA 중합효소에 의한 새로운 상보적 가닥의 진행적 합성을 나타내는 한편, 일시적 멈춤은 dATP가 요구되는 시점들에 대응한다. 낮은 힘(~1.6 pN)에서, 하강은 T4 DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성의 활성화로 인한 새로 합성된 가닥의 절단을 나타낸다. 이 합성 및 절단 사이클은 반복가능하다. 이 일시적 멈춤들의 위치 히스토그램은 도 1에서 앞서 설명된 것과 유사하게 추론되며, 염기 호출(base call)들이 도시된다(화살표). 주형의 실제 염기서열은 도면의 우측에 나타낸다. 도 4b: 연장 변화를 측정하는 두 가지 방식이 존재한다. 첫째로, 기준으로서 Zzip을 사용할 수 있으며; 대안적으로, 기준으로서 헤어핀 루프의 위치를 사용할 수도 있다.
도 5 헤어핀 설계의 예시. 관심있는 DNA 단편은 [염기가 결여된 LNA 염기들(abasic and LNA bases)을 갖는] DNA 루프 및 2 개의 부분적으로 상보적인 DNA 단편들(말단에 비오틴을 갖는 ssDNA 하나, 및 맨 끝에 Dig를 갖는 dsDNA 하나)로 결찰되며, 이는 최종적으로 스트렙타아비딘(DYNAL)으로 덮인 초상자성 비드에 결합될 수 있는 헤어핀을 형성하는 한편, 유리 커버슬립에 대한 다른 끝은 안티-dig로 처리된다.
실험 예시들
DNA 준비
수십 개 내지 수천 개의 염기 쌍들로 구성된 크기 및 알려지지 않은 염기서열의 이중-가닥 (ds)DNA 단편은 그 끝들 중 하나에서 DNA 루프에 결찰된다. 그 다른 끝은 상이하게 코팅된 표면들에 그 두 가닥의 결합을 허용하는 dsDNA 단편에 결찰된다. 예를 들어, 한 가닥의 자유 3' 말단은 스트렙타아비딘 코팅된 비드들에 결합을 허용하는 비오틴으로 표지될 수 있는 반면, 반대쪽 가닥의 5' 말단은 안티-Dig 항체로 코팅된 표면들에 그 결합을 허용하는 디곡시제닌으로 표지될 수 있다. 이 말단-표지는 적절히 표지된 올리고뉴클레오티드들과의 혼성화, 또는 비오틴(또는 디그) 수정된 뉴클레오티드들을 추가하기 위한 말단전이효소(terminal transferase)의 이용과 같은 당업자에게 알려진 다양한 방식들로 수행될 수 있다.
힘 신장 장치
이 DNA 구성물은 적당한 비드들(예를 들어, 스트렙타아비딘 코팅된 비드들)의 용액에서 수 분 동안 배양되며, 이는 그 표지된(예를 들어, 비오틴) 말단들 중 하나에 의해 비드들에 결합된다. 비드들은 광학 족집게들이 이후 조작을 위해 사용되는 경우 투명할 수 있으며, 또는 조작을 위해 자기 트랩 또는 족집게들을 이용하는 경우에는 자성을 띨 수 있다.
비드-DNA 조립체는 유체 챔버 내에 주입되며, 그 표면은 분자의 다른 표지된 말단을 결합시키도록 처리되었다[예를 들어, 안티-Dig로 코팅된 표면은 DNA의 Dig-표지된 말단을 결합시킴]. 따라서, 비드들은 DNA-헤어핀을 통해 표면에 고정된다(도 1a 참조). 그 후, 표면에 대한 비드의 간격은 당업자에게 알려진 다양한 수단들에 의해 모니터링되며; 예를 들어, 이 간격을 추론하기 위해 카메라 상의 이들 이미지의 회절 링들이 이용될 수 있으며, 또는 이 간격을 측정하기 위해 에바네센트 모드로 조명될 때 이들이 산란하는(또는 형광에 의해 방출하는) 광 세기가 사용될 수 있다. 대안적으로, 고정 표면 상의 센서에 대한 이들의 간격을 추론하기 위해, (GMR 또는 Hall 센서들과 같은 자기 센서를 이용하여) 이들이 생성하는 자기장이 측정될 수 있다.
표면에 비드들을 고정하는 DNA 분자를 당기기 위해 다양한 기술들이 개시되었다. 바람직한 실시예는 앞서 설명된 바와 같이 DNA 헤어핀에 의해 표면에 고정된 초상자성 비드들을 당기기 위해 자기 트랩을 이용한다. 이 구성에서는, 샘플 위에 배치된 작은 자석들이 고정된 비드에 일정한 힘을 가하는데 사용되며, 그 위치는 [유체역학 항력으로 인한 소산 및 당기는 힘에 따라] < 1 nm 정확성으로 결정될 수 있다. 이 일련의 실험들에서, 미국 특허 제 7,052,650호 및 제 7,244,391호에 개시된 장치가 사용되었다. 또한, 달리 나타내지 않는다면, 여기에 보고된 실험들은 25mM Tris pH7.5, 150mM KAc, 10mM MgCl2, 0.2% BSA에서 수행되었다.
매 경우마다, 약 16 pN보다 큰 힘으로 비드들을 당김으로써 테더링 헤어핀이 기계적으로 완전히 열릴 수 있다. 분자의 장력을 약 11 pN 아래로 감소시키면, 헤어핀이 자발적으로 다시 닫힐 수 있다(re-zip)(지퍼를 여는 전이는 이력현상을 통해 가역적임). 열리는(unzipped) 단계 동안 (단백질, 또는 DNA, RNA, LNA 또는 PNA의 상보적 올리고뉴클레오티드들과 같은) 용액 내 분자가 신장된 외가닥 (ss)DNA와 결합한 경우, 이 분자는 힘이 11 pN 아래로 낮춰질 때 헤어핀이 다시 닫히는 것(rezipping)을 일시적으로 차단할 것이다. 따라서, 분석의 원리는 두 힘: 즉, 헤어핀을 여는 큰 힘(Fopen)과 다시 닫히는 것(re-zipping)을 허용하고 일시적인 차단에서 분자의 연장을 측정하는데 사용되는 더 작은 힘(Ftest) 사이에서 전환하는 것이다. 차단 위치는 전체 연장과 차단된 것 사이의 선형 관계에 의한 염기서열과 관련된다. 최적의 정확성을 위해, 전체 연장은 테스트 힘(Ftest)에서 측정되는 것이 바람직하다. 이는 일단 힘이 Fopen으로부터 Ftest로 감소되면, 다시 접는데 몇 분의 1초를 필요로 하도록 헤어핀 루프를 설계함으로써 달성된다.
올리고뉴클레오티드의 혼성화 위치는 염기쌍 분해로 측정될 수 있다
이 다시 닫히는 것(rezipping)의 멈춤들 중 하나의 멈춤 동안 DNA 분자의 연장(표면과 비드의 간격)을 측정함으로써, 나노미터의 정확성으로 차단의 위치를 결정하는 것이 가능하다[1 nm의 간격은 10 pN의 힘을 받는 ssDNA에서 2 개의 뉴클레오티드(1 bp)에 의해 이르는 간격에 대응함]. 지퍼를 여는 구성은 염기쌍에 대한 연장의 최대 비를 나타낸다(dsDNA에서, 상기 비는 bp당 단지 0.34 nm이다).
이 측정의 정확성은 2 개의 잡음 기여에 의해 제한된다:
· 측정 방법의 정확성,
· 비드의 브라운 운동.
상이한 기술들이 비드의 수직 위치를 측정하는데 사용될 수 있다. 가장 간단한 것 중 하나는 비디오 현미경(미국 특허 제 7,052,650호 및 제 7,244,391호)에 의존한다. 이 방법으로 얻어진 도 1의 결과, 통상적인 분해는 1초 평균에 대해 1 nm에 달한다. 분해능이 0.1 nm에 달하는 PSD 센서들을 이용한 레이저 조명(Greenleaf and Block, Science, 313: 801, 2006) 및 에바네센트 파 조명(Singh-Zocchi 외, Proc Natl Acad Sci U S A., 100(13): 7605-7610, 2003, Liu 외, Biophys J., 96(9): 3810-3821, 2009)과 같이, 더 우수한 분해를 갖는 다른 방법들이 입증되었다.
분해의 고유한 한계는 ssDNA 분자를 당기는 비드의 브라운 변동들에 의해 주어진다. <x2> = 4kBT Δf(6πηr)/k2 ssDNA(F), 이때 kssDNA(F)는 ssDNA 분자의 강성도(stiffness), kB는 볼츠만 상수, T는 절대 온도, η은 물의 점도, r은 비드의 반경, 그리고 Δf는 측정의 주파수 범위이다. kssDNA(F = 10 pN) = 0.05/Nb(N/m), 이때 Nb는 ssDNA의 염기들의 수이다. 84 bp 헤어핀에 대하여, 이는 1초(Δf= 1 Hz) 평균에 걸쳐 0.04 nm의 잡음을 유도한다. 도 1의 더 큰 잡음(σ~ 1 nm)은 고유한 변동들 때문이 아니라, 본질적으로 측정 디바이스로 인한 것이다. 고유한 브라운 잡음은 헤어핀의 크기에 따라 증가한다: 1200 bp 헤어핀은 1초 평균 시 0.6 nm의 잡음을 야기한다.
중합의 기계적 검출에 의한 진단 및 염기서열화
T4 DNA 중합효소는, 포크(Ftest)를 상당히 불안정하게 하도록 힘이 충분히 높은 경우에 DNA 헤어핀을 복제할 수 있다고 나타내었다. 고전적인 생어 염기서열화에서와 같이, 특정한 ddNTP의 결합은 T4 DNA 중합효소에 의한 신생 가닥(nascent strand)의 추가 신장을 막을 것이다. 본 발명의 방법에서는, 이 차단이 도 6에 나타낸 바와 같이 쉽게 식별될 수 있다. 힘을 낮추는 경우, T4 DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성이 활성화되고, 효소가 새로 합성된 가닥을 잘라낸다. 따라서, 합성 및 절단의 반복된 사이클들에 의하여, 분자(헤어핀)는 먼저 ddATP의 존재 하에 차단 위치들을 식별한 후, 다른 ddNTP들 각각, 즉 ddTTP, ddCTP 및 ddGTP의 존재 하에 차단 위치들을 식별함으로써 염기서열화될 수 있다.
이와 유사하게, 이중-가닥 헤어핀 분자는 4 개의 dNTP들 중 하나가 다른 것들에 비해 결핍(deficit)된 완충제에서 염기서열화될 수 있으며, 즉 이 dNTP는 다른 것들에 비해 매우 낮은 농도로 존재한다. 따라서, T4 DNA 중합효소가 중합 시 제한적 뉴클레오티드의 추가를 필요로 하는 위치에 도달할 때마다, 도 7에 예시된 바와 같이 일시적인 멈춤이 발생한다. 앞서 설명된 바와 같이, 새로 합성된 가닥은 힘을 낮춰, 효소의 엑소뉴클레아제 활성의 활성화를 유도함으로써 잘릴 수 있다. 따라서, 합성 및 절단의 반복된 사이클들에 의하여, 분자(헤어핀)는 먼저 (예를 들어) 낮은 농도의 dATP의 존재 하에 멈춤 위치들을 식별한 후, 다른 dNTP들 각각, 즉 dTTP, dCTP 및 dGTP의 저농도 하에 멈춤 위치들을 식별함으로써 염기서열화될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) ECOLE NORMALE SUPERIEURE <120> METHOD OF DNA SEQUENCING BY POLYMERISATION <130> 361995D28618 <140> PCT EP2011/058664 <141> 2011-05-26 <150> EP 10305563.8 <151> 2010-05-27 <150> US 61/377,621 <151> 2010-08-27 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 aactgaccaa acgtcggtgg g 21 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Hairpin stem sequence <400> 2 ggattcgcgg gtctct 16 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Hairpin loop sequence <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n stands for a base abasic <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n stands for a base abasic <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n stands for a base abasic <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n stands for a base abasic <400> 3 tcgcgcctga tcgtccactn tntntntagt ggacgatcag gc 42 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Hairpin stem sequence <400> 4 aggaagagac ccgcgaatcc cccaccgacg tttggtcagt t 41

Claims (18)

  1. 핵산 염기서열을 결정하는 방법에 있어서,
    상기 방법은:
    a) 상기 핵산 염기서열에 대응하는 이중-가닥 핵산 분자를 변성시키는 단계;
    b) 상기 변성된 이중-가닥 핵산 분자와 외가닥 핵산 분자["프라이머(primer)"]를 혼성화(hybridize)하는 단계;
    c) 단계 b)에서 얻어진 상기 혼성화된 프라이머/이중-가닥 핵산 분자에 장력을 가하는 단계;
    d) 복제 시 적어도 1 이상의 멈춤(pause)을 유도하는 조건들에서, 중합효소로 단계 b)에서 얻어진 상기 혼성화된 프라이머/이중-가닥 핵산 분자를 배양하는 단계; 및
    e) 상기 이중-가닥 핵산의 한 말단(end)에 대해 복제 시 상기 멈춤의 위치를 결정하는 단계를 포함하는 염기서열 결정 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 이중-가닥 핵산 분자는 헤어핀(hairpin)인 염기서열 결정 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 이중-가닥 핵산의 가닥들 중 하나의 적어도 1 이상의 염기들은 표면에 직접 또는 간접적으로 부착되고, 상기 이중-가닥 핵산의 다른 가닥의 적어도 1 이상의 염기들은 이동가능한 표면에 부착되는 염기서열 결정 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이중-가닥 핵산은 운반체(support)들을 멀리 이동시킴으로써 상기 단계 a)에서 변성되는 염기서열 결정 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 운반체들을 멀리 이동시킴으로써, 상기 이중-가닥 핵산 분자에 15 pN이거나 그 이상, 바람직하게는 17 pN이거나 그 이상, 더 바람직하게는 18 pN이거나 그 이상인 물리적 힘이 가해지는 염기서열 결정 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 c)의 장력은 12 pN 내지 10 pN에 포함되는 염기서열 결정 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    운반체에 부착되지 않은 상기 이중-가닥 핵산의 말단들은 공유결합으로 또는 비-공유결합으로(not covalently) 서로 물리적으로 링크(link)되는 염기서열 결정 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 a) 내지 상기 단계 e)는 (측정들을 누적하고, 신호/잡음 비를 증가시키도록) 여러 번 반복되는 염기서열 결정 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 e)는 상기 운반체에 부착되는 상기 이중-가닥 핵산 분자의 두 말단들 간의 간격(z)을 측정하는 단계를 포함하는 염기서열 결정 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 이중-가닥 핵산 분자가 변성되는 경우, 상기 운반체에 부착되는 상기 이중-가닥 핵산 분자의 두 말단들 간의 간격(zhigh)을 측정하는 단계를 더 포함하는 염기서열 결정 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    z 및 zhigh를 비교하는 단계; 및
    상기 멈춤의 위치를 결정하는 단계를 더 포함하는 염기서열 결정 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프라이머는 상기 중합효소의 활성에 의해 연장(extend)되고, 상기 연장 과정은 상기 중합효소가 상기 이중-가닥 핵산 분자의 루프에 도달하기 전에 중지되는 염기서열 결정 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이중-가닥 핵산 분자에 가해진 물리적 힘을 5 pN 또는 그보다 작게 감소시키는 단계를 더 포함하는 염기서열 결정 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성이 활성화되는 염기서열 결정 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    새로 합성된 가닥을 분해하는 단계를 더 포함하는 염기서열 결정 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 a) 내지 상기 단계 e)가 반복되는 염기서열 결정 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중합효소는 뉴클레오티드-선택성 효소(nucleotide-selective enzyme)이고, 상기 단계 d)의 조건들은 특정한 뉴클레오티드에 대해 효소의 진행적 움직임의 비율이 변하는(rate-altering) 반응 혼합(reaction mix)을 이용하는 것을 포함하는 염기서열 결정 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 d)의 조건들은 디옥시뉴클레오티드 이외에도, 디디옥시뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합을 이용하는 것을 포함하는 염기서열 결정 방법.
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