KR20130118900A

KR20130118900A - 가르시놀의 간 보호적 활성

Info

Publication number: KR20130118900A
Application number: KR1020137014741A
Authority: KR
Inventors: 무하메드 마제에드; 사랑 바니
Original assignee: 무하메드 마제에드
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2011-12-29
Publication date: 2013-10-30
Also published as: EP2658374A4; EP2658374B1; PL2658374T3; DK2658374T3; US20130281544A1; JP5980228B2; JP2014502621A; WO2012092430A1; CA2851663A1; RU2585245C2; PT2658374E; EP2658374A1; RU2013130918A; CA2851663C; NZ609878A; AU2011352073B2; AU2011352073A1

Abstract

본 발명은 가르시놀의 간 보호적 잠재력을 개시한다.

Description

가르시놀의 간 보호적 활성{HEPATOPROTECTANT ACTIVITY OF GARCINOL}

이 출원은 2010년 12월 30일에 제출된 임시특허출원 제61/428643호의 정규출원이다.

일반적으로 본 발명은 간 독성(hepatotoxicity; hepatic toxicity) 관리를 위한 약물에 관한 것이다. 더 자세하게는, 가르시놀(garcinol)의 간 보호적 잠재력(hepatoprotective potential)에 관한 것이다.

용어 "간 독성"은 일반적으로 간 손상을 유발하는 화학물질을 말한다. 이러한 손상은 간이 체내의 화학물질 제거 및 변형의 선천적 기능을 이행할 때 주로 발생한다.

위장 관 및 비장(spleen)과 간의 밀접한 연관성은 전체적인 정맥 시스템을 통하여, 대사적 기능의 일부로서, 순환하는 약물(drug) 때문에 독성의 영향력을 더 악화시킨다.

Nilesh Mehta et al (Drug-Induced Hepatotoxicity- Medscape REFERENCE-Drugs, Diseases and Procedures)는 특이한(idiosyncratic)은 약물반응의 75%가 간 이식(transplantation) 또는 죽음을 이끈다고 보고한다. 동일한 권위자들은 또한 미국 내 급성 간 부전(acute liver failure)의 대략 2000 경우가 해마다 발생하며, 그러한 경우의 50%가 약물의 효과로 여겨진다고 보고한다. 그 권위자들은 약물로 유발된 간 독성(drug induced hepatotoxicity)에 기초하는 병리생리학적 기작을 더 밝힌다. 이들은 다음을 포함한다;

(i) 약물과 세포 내의 단백질의 공유적 결합 및 ATP 수준의 감소 때문에 초래된 액틴 미세섬유(actin fibril) 분해에 따르는 간 세포 파열(disruption).

(ii) 담즙 분비 중지를 유발하는 정상 담즙 분비를 방지하는 수송 펌프의, 약물로 유발된 반응억제(Drug induced blockage of transport pumps preventing normal bile excretion to cause cholestasis).

(iii) p-450 효소에 약물이 결합함에 따라 매개된 면역 반응.

(iv) TNF-α간 세포의 세포자살을 매개하였다(TNF-αmediated apoptosis of hepatocytes).

(v) 베타-산화 에너지 생성 기작 내의 NAD 및 FAD의, 약물로 유발된 억제에 의하여 야기된 감소된 ATP 생성에 기인한 미토콘드리아의 파열(Mitochondrial disruption due to decreased ATP production brought about by the drug induced inhibition of NAD and FAD in the beta-oxidation energy production mechanism).

(vi) 독성 기작으로 유발된 담관(bile duct) 손상.

(vii) 내장 내 알코올 풍부한 환경에 번식하는 그램 음성 박테리아의 세포 벽의 지질다당류 파편의 내재화를 이끄는, 에탄올로 유발된 간 손상 초기 동안에, 브로윅-쿱퍼 세포와 같은 간 세포 타입 및 톨-유사 수용기 4(TLR4) 와 그것의 CD14 같은 수용기들의 활성(Activation of liver cell types like the Browicz-Kuppfer cells and receptors like toll-like receptor 4 (TLR4) and CD14 thereof during early ethanol induced liver damage, leading to internalization of the lipopolysaccaride fraction of the cell walls of gram negative bacteria that flourish in the gut in an alcohol rich environment). 그런 다음에 이는 간 내 성상세포(stellate cells)로 들어가는 수퍼산화물(superoxides) 및 TNF-α같은 전-염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokaines)의 활성을 이끄며, 콜라겐 함성, 섬유증(fibrosis) 및 결국 간경변(liver cirrhosis)를 이끈다.

진행하는 치료적(예방적 및 예방제 모두(both preventive and prophylactic)) 수단으로서 간 보호는, 앞서 말한 바와 같이 간 손상을 초래하는 전술한 기작의 하나 또는 그 이상의 상호작용이 있는 상태에서 매우 큰 중요성을 맡고 있다. 그러한 상태들은,

(i) 간 내의 지방을 나타내는 비알콜성 지방간(Nonalcoholic steatohepatitis; NASH)을 포함하며, 그로 인한 염증으로 이어진다. 비록 알코올성 간 질환과 유사하지만, 이는 비-알코올성 사람들 또는 매우 적은 알코올을 소비하는 사람들에게 발생한다. NASH는 섬유증(fibrosis) 또는 이어서 생명을 위협하는 간경변을 이끌며 느린 방식으로 악화되거나 또는 스스로 퇴행할 수 있다는 의미에서 불가사의 하다. 게다가, 생활 스타일 관리 방법을 제외하고는 이러한 상태를 위한 어떠한 치료도 존재하지 않는다.

(ii) 습관적이고 장기적인 소비에서 비롯한 알코올 남용;

(iii) 암을 위한 화학요법;

(iv) 간 손상 또는 염증의 징후 및 신호 없이 간 내에 지방 축적이 있는 비-알코올성 지방 간 질환과 같은 상태;

(v) 바이러스로 유발된 급성 또는 만성 간염으로, 후자의 상태는 섬유증 및 생명을 위협하는 간경변/간 암을 이끌 수 있는 상태인, 것들을 포함한다.

가르시나 종(Garcinia sp.) 과일 껍질에서 분리되는 가르시놀은 항-산화제 및 화학 보호 제제(chemo protective agent)로 당해 기술분야에 알려져 있다(Tanaka, T. et.al. Prevention of colonic aberrant crypt foci by dietary feeding of garcinol in male F3444 rats. Carcinogenesis, June 2000: 21 (6): 1183-9).

가르시놀 또는 아이소가르시놀(isogarcinol)은 메티실린 내성 황색 포도 구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)에 대한 항박테리아성 활성이 평가되었다 (Linuma M et al, Antibacterial activity of some Garcinia benzophenone derivatives against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Biol Pharm Bull 1996 February; 19(2): 311-4).

체내 및 체외 모두에서(both in vitro and in vivo) 히스톤 아세틸전이효소(histone acetyltransferases; HATs)의 강력한 반응억제제로서의 가르시놀의 역할은 Tapas et al in 2004에 의해 보고되었다(“Polyisoprenylated Benzophenone, Garcinol, a Natural Histone Acetyl transferase Inhibitor, Represses Chromatin Transcription and Alters Global GeneExpression”, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 279, No. 32, Issue of August 6, pp.33716-3726, 2004).

본 발명자들은, 위의 본원에서 강조된 하나 또는 그 이상의 병리생리학적 효과의 조절을 통하여 분자의 간보호적 활성을 나타내는 가르시놀의 의학적 잠재력을 더 추가하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 간 독성과 관련된 생화학적 표지(marker)들을 조절하여 가르시놀의 효과를 연구하도록 노력해왔다.

도 1 은 독성(CCl₄)으로 유발된 간 독성 동물 모델로부터 간 균질현탁액(homogenates) 내 TGF-beta 1 발현(pg/ml) 상에서 가르시놀의 다른 투여량 효과의 도식적 표현을 나타낸다. 수치는 평균 ± SE, n = 6); P 값*: <0.001로 표현된다.
도 2 는 독성(CCl₄)으로 유발된 간 독성 동물 모델로부터 간 균질현탁액 내 내피세포 부착 분자 1(Inter-Cellular Adhesion Molecule 1; ICAM-1 또는 CD52) 발현(pg/ml) 상에서 가르시놀의 다른 투여량 효과의 도식적 표현을 나타낸다. 수치는 평균 ± SE, n = 6); P 값*: <0.001로 표현된다.
도 3 은 독성(CCl₄)으로 유발된 간 독성 동물 모델로부터 간 균질현탁액 내 C-반응 단백질(C-reactive protein) 발현(pg/ml) 상에서 가르시놀의 다른 투여량 효과의 도식적 표현을 나타낸다. 수치는 평균 ± SE, n = 6); P 값*: <0.001로 표현된다.
도 4 는 독성(CCl₄)으로 유발된 간 독성 동물 모델로부터 채취된 혈액(blood drawn) 내 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor-α; TNF-α) 상에서 가르시놀의 다른 투여량 효과의 도식적 표현(유동적인 혈구계산 연구; flow cytometric studies)을 나타낸다.
도 5 는 독성(CCl₄)으로 유발된 간 독성 동물 모델로부터 채취된 혈액 내 인터루킨-2(Interleukin-2; IL-2) 상에서 가르시놀의 다른 투여량 효과의 도식적 표현(유동적인 혈구계산 연구)을 나타낸다.
도 6 은 독성(CCl₄)으로 유발된 간 독성 동물 모델로부터 채취된 혈액 내 인터루킨-4(Interleukin-4; IL-4) 상에서 가르시놀의 다른 투여량 효과의 도식적 표현을 나타낸다.
도 7 은 약물(파라세타몰)로 유발된 유도 간 독성 동물 모델로부터 간 균질현탁액 내 TGF-beta 1 발현(pg/ml) 상에서 가르시놀의 다른 투여량 효과의 도식적 표현을 나타낸다. 수치는 평균 ± SE, n = 6); P 값*: <0.01., **: <0.001., GC : Garcinol; APAP : 파라세타몰로 표현된다.
도 8 은 약물(파라세타몰)로 유발된 간 독성 동물 모델로부터 간 균질현탁액 내 내피세포 부착 분자 1(Inter-Cellular Adhesion Molecule 1; ICAM-1 또는 CD52) 발현(pg/ml) 상에서 가르시놀의 다른 투여량 효과의 도식적 표현을 나타낸다. 수치는 평균 ± SE, n = 6); P 값*: <0.01., **: <0.001., GC : Garcinol; APAP : 파라세타몰로 표현된다.
도 9 는 약물(파라세타몰)로 유발된 간 독성 동물 모델로부터 채취된 혈액 내 종양괴사인자(TNF-α) 상에서 가르시놀의 다른 투여량 효과의 도식적 표현(유동적인 혈구계산 연구)을 나타낸다.
도 10 은 알코올(에틸알코올)로 유발된 간 독성 동물 모델의 혈청 내 종양괴사인자(TNF-α) 및 인터루킨-1β (Interleukin-1β; IL-1β)상에서 가르시놀의 다른 투여량 효과의 도식적 표현(유동적인 혈구계산 연구)을 나타낸다. 수치는 평균 ± SE, n = 6); P 값*: <0.01., **: <0.001., GC : Garcinol로 표현된다.
도 11 은 알코올(에틸알코올)로 유발된 간 독성 동물 모델의 혈청 내 인터루킨-12 (Interleukin-12; IL-12)상에서 가르시놀의 다른 투여량 효과의 도식적 표현(유동적인 혈구계산 연구)을 나타낸다.
도 12 는 간 보호 제제로 알려진 실리마린(Silymarin)과 비교하여 Hep G2 간암세포라인 내 가르시놀의 세포독성의 잠재력(% 세포독성; cytotoxicity)의 도식적 표현을 나타낸다.
도 13 은 Hep G2 간암세포라인 내 간 보호 제제로 알려진 실리마린과 비교하여 가르시놀의 간보호 효과의 도식적 표현을 나타낸다.

발명의 요약

본 발명은 간 보호제로서 가르시놀의 잠재성을 개시한다. 가르시놀의 효과적인 농도의 존재 내에서 Hep-2 세포 배양의 보호가 증명되어왔다. 또한 독성-CCl₄로 유발된, 약물-파라세타몰(drug-Paracetamol)로 유발된 및 알코올로 유발된 간 독성(toxin-CCl4 induced, drug-Paracetamol induced and alcohol induced hepatoxicity)의 동물 모델 내 생화학적 표지의 조절이 매개된 가르시놀이 증명되었다.

상세한 설명(도 1-13)-선호되는 구현예

가장 바람직한 실시예에서, 본 발명은 포유류 간세포 보호의 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 가르시놀의 유효 농도로 포유류 간세포를 접하게 하는 단계를 포함한다. 더 자세하게는 상기 가르시놀의 유효 농도는 약 0.78 μg/ml 내지 약 6.25 μg/ml(도 12 및 13)이다. 가장 바람직한 대체 실시예에서, 본 발명은 간 보호를 제공하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 가르시놀의 치료적인 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 주입하는 단계를 포함한다. 더 자세하게는 상기 대상은 포유류이다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 간 손상(간 독성; hepatotoxicity)의 포유류 모델 내 사이토카인 발현의 증가된 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 모델에 가르시놀의 유효량을 주입시키는 단계를 포함한다(도 1, 4, 5, 6, 7, 9,10 및 11). 자세한 실시예에서, 상기 사이토카인은 형질전환 생장 인자 G-β1(Transforming Growth Factor G-β1; TGF- β1), 종양 괴사 인자-α(Tumor Necrosis Factor-α), 인터루킨-2(Interleukin-2, IL-2), 인터루킨-4(Interleukin-4, IL-4) 및 인터루킨-12(Interleukin-12, IL-12)이다. 다른 자세한 실시예에서, 포유류 모델 내 간 독성은 독소(toxin), 약물 또는 에틸알코올에 의해 유발될 수 있다. 자세한 대체 실시예에서, 간 손상은 독소, 약물 및 에틸알코올의 조합에 의해 유발될 수 있다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 독소 및/또는 약물에 의해 유발된 간 손상(간 독성)의 포유류 모델 내 부착 분자 발현의 증가된 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 모델에 가르시놀의 유효량을 주입시키는 단계를 포함한다(도 2 및 8), 자세한 실시예에서, 상기 부착 분자는 내피세포 부착 분자-1(ICAM-1 또는 CD52)이다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 간 손상(간 독성)의 포유류 모델 내 담즙 색소(bile pigme) 및/또는 간 효소(liver enzymes)의 높아진 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 모델에 가르시놀의 유효량을 주입시키는 단계를 포함한다. 자세한 실시예에서, 상기 간 효소는 알라닌 트랜스아미네이즈(Alanine Transaminase), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈(Aspartate aminotransferase) 및 알카라인 포스파테이즈(Alkaline phosphatase)이다(표 3, 4 및 5). 또 다른 자세한 실시예에서, 상기 담즙 색소는 빌리루빈(bilirubin)이다. 다른 자세한 실시예에서, 포유류 모델 내 간 손상은 독소, 약물 또는 에틸알코올에 의해 유발될 수 있다. 자세한 대체 실시예에서 간 손상은 독소, 약물 및 에틸알코올의 조합에 의해 유발될 수 있다.

간 보호제(hepatoprotectant)로서 가르시놀의 잠재적인 치료적 수치는 본원에서 아래에 밝혀진 실시예들을 통하여 이해될 수 있다.

실시예 1

가르시놀의 급성 경구 안전성(Acute Oral Safety of Garcinol) : 관찰하는 2주에 이르기까지 쥐들 내에서 2000 mg/kg. p. o.에 이르기까지 사망자가 없는 것이 관찰되었다. 상기 연구된 파라미터 및 관찰을 기록한 것이 표 1에 포함되어있다(OECD Guidelines for Testing of Chemicals. Guideline 423, Acute Oral Toxicity - Acute Toxic Class Method, Adopted, (1996). Organization for Economic Cooperation and Development).

가르시놀의 급성 경구 안전성 상에서 연구된 파라미터
일반적 행동	진피
공격성: 무 두려움: 무 수동적: 무 일반적 움직임: 정상 일반적인 운동성 활동량: 정상	블랜칭(Blanching): 무 충혈: 무 청색증: 무
중추신경계	일반적 관찰
자극: 무 작업 능력: 정상 미진(Tremors): 무 간대성 경련: 무	근육 약화: 무 타액분비: 정상 입모: 무 설사증: 무
호흡계	반사작용
호흡 속도: 정상 호흡 깊이: 정상	각막: 효과 없음 귓바퀴(Pinnal): 효과 없음
자율신경계	음식 및 물 (섭취/배출)
작업 능력: 정상 Atexia: 무 호흡 속도: 정상 설사증: 무	배설물: 정상 요배설량: 정상

실시예 2

랫(rats) 내 카본 테트라클로라이드(carbon tetrachloride)로 유발된 간 손상의 간 균질현탁액 내 TGF-β1, ICAM-1 및 CRP 상에서 가르시놀(GC)의 다른 양의 효과

실험에 사용된 동물 : 수컷 위스터 랫(Male Wistar Rats).

동물의 무게 : 140 내지 160 그램

연구에 사용된 가르시놀(GC)의 양 : 1.25, 2.5, 5, 10 mg/kg p.o.

표준 약물 : 실리마린(silymarin) 50mg/kg p.o.

과정 : 간 손상(Liver injury)이 액상 파라핀(5배 희석)과 섞인 카본 테트라클로라이드(CCl4)의 주입에 의해 유발되었다. CCl₄ 단일 투여량 1 ml/kg, p.o.이 동물에 주어졌고, 다른 시간 간격으로 가르시놀의 주입이 이어졌다(표 2). [(i) Bramanti G, Murmann W, Pierini P and Comporti M (1978). Effect of cicloxilic acid on CCl4-induced liver injury. Drug Research 28: 1112-1217. (ii) B Singh, A K Saxena, B K Chandan, K K Anand (1998). Hepatoprotective activity of Verbenalin on experimental liver damage in rodents. Fitoterapia LXIX 2: 135-140. (iii) B.K. Chandan, A.K. Sharma, K.K. Anand Boerhaavia diffusa: A study of its hepatoprotective activity. Journal of Ethnopharmacology Volume 31, Issue 3, March 1991, Pages 299-307].

CCl4 및 가르시놀 주입의 날짜와 시간 스케쥴의 세부항목을 제공한다.
독소/약물 ( GC ) 주입의 날짜와 시간 스케쥴	처리	독소 주입 후 시간 경과
1 일 10 A.M. 4 P.M.	CCl₄ GC	0h CCl₄ 후6h
2 일 10 A.M.	GC	CCl₄후24h
3 일 10 A.M. 12 낮	GC 샘플들 수집 (간 & 혈액)	CCl₄후48h 검사 물질의 마지막 처리 후 CCl₄/2h 후 50h

간 조직은 폴리트론(polytron)으로 얼음 위에서 균질화 되었으며, 균질현탁액은 15분 동안 5000g에서 원심분리되었다. 상층액의 부분표본(Aliquots of the supernatant)이 분리되었으며, 생화학적 분석에 사용되었다. 상층액은 사이토카인 분석까지 -80℃에서 보관되었다. TGFβ, ICAM-1, C-반응 단백질(CRP)이, 제조업자 지시에 따라 샌드위치 및 경쟁적 ELISA 기법(sandwich and competitive ELISA technique)에 기초하는, 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 측정되었다. 모든 사이토카인 농도는, 표준 곡선으로부터 삽입에 의한 ELISA 플레이트 판독기 상에서 450nm의 비색적(colorimetric) 측정에 의하여 수행되었다. [(i) Magari K, Miyata S, Ohkubo Y, Mutoh S, (2004). Inflammatory cytokine levels in paw tissues during development of rat collagen-induced arthritis: Effect of FK506, an inhibitor of T cell activation. Inflammation Research. 53: 469-474 (Magari et al., 2004); and (ii) Modulation of Th1/Th2 cytokines and inflammatory mediators by hydroxychavicol in adjuvant induced arthritic tissues. Anjali Pandey , Sarang Bani, Prabhu Dutt, Krishna Avtar Suri. Cytokine 49 (2010) 114-121]

결과 : 가르시놀은 랫 내 카본 테트라클로라이드로 유발된 간 손상의 결과인 급성 간염과 관련된 TGFβ (FIG 1) ICAM-1 (FIG 2), C-반응 단백질(CRP)의 증가된 수준을 억제하였다(도 3).

실시예 3

랫 내 카본 테트라클로라이드로 유발된 간 손상의 혈액 내 TNF-α, IL-2 및 IL-4 상에서 가르시놀(GC)의 다른 투여량의 효과

실험에 사용된 동물 : 수컷 위스터 랫(Male Wistar Rats).

동물의 무게 : 140내지 160 그램

연구에 사용된 가르시놀(GC)의 양 : 1.25, 2.5, 5, 10 mg/kg p.o.

표준 약물 : 실리마린(silymarin) 50mg/kg p.o.

과정 : 간 손상이 액상 파라핀(5배 희석)과 섞인 카본 테트라클로라이드(CCl4)의 주입에 의해 유발되었다. CCl4의 단일 투여량 1 ml/kg, p.o.이 동물에 주어졌고, 다른 시간 간격으로 가르시놀의 주입이 이어졌다(전술한 표 2를 참고하라). [(i) Bramanti G, Murmann W, Pierini P and Comporti M (1978). Effect of cicloxilic acid on CCl4-induced liver injury. Drug Research 28: 1112-1217. (ii) B Singh, A K Saxena, B K Chandan, K K Anand (1998). Hepatoprotective activity of Verbenalin on experimental liver damage in rodents. Fitoterapia LXIX 2: 135-140. (iii) B.K. Chandan, A.K. Sharma, K.K. Anand Boerhaavia diffusa: A study of its hepatoprotective activity. Journal of Ethnopharmacology, Volume 31, Issue 3, March 1991, Pages 299-307].

상기 동물들은 역-궤도적으로(retro-orbitally) 출혈되었으며, 혈액은 EDTA-코팅된 튜브 내에 PE-표지된 안티-랫 TNF-알파(PE-labeled anti-rat TNF-alpha), IL-2 및 IL-4 단일클론 항체 발현을 위해 수집되었다. 분석은 플로우 사이토메터(flow cytometer; BD-FACS CANTO II) 상에서 행하여졌다. 이들 형광색소-표지된(fluorochrome-labeled) 단일클론 항체는 전혈(whole blood)의 100 μl에 바로 추가되었으며, 그 다음에 반응물을 용해시키는 전혈을 사용하여 용해되었다. 최종 원심분리에 이어서, 샘플은 인산-완충 식염수(phosphate-buffered saline, pH 7.4)내에 재부유되었으며(resuspended), 플로우 사이토메터 상에서 바로 분석되었다. 형광색소 트리거(trigger)는 상기 경우들을 수집하기 위하여 PE(FL2) 파라미터 상에서 설정되었다. [(i) Bani S, Kaul A, Khan B, Ahmad SF, Suri KA, Gupta BD, Satti NK, Qazi GN, (2006).Suppression of T lymphocyte activity by lupeol isolated from Crataeva religiosa. Phytotherapy Research; 20(4): 279-287. And (ii) Bani S, Kaul A, Khan B, Ahmad SF, Suri KA, Satti NK, (2005). Immunosuppressive properties of an ethyl acetate fraction from Euphorbia royleana. Journal of Ethnopharmacology; 99: 185-192].

결과 : 가르시놀(GC)은, 랫 내 카본 테트라클로라이드로 유발된 간 손상의 혈액 내 발현된 TNF-α (도 4), IL-2 (도 5) 및 IL-4 (도 6)의 반응억제에 의해 표지된 T-세포 면역 반응의 반응억제를 복용량에 기반하여 초래하였다.

실시예 4

랫 내 카본 테트라클로라이드로 유발된 간 손상 내 빌리루빈 및 혈청 효소 알라닌 트랜스아미네이즈(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈(AST) 및 알카라인 포스파테이즈(ALP)상에서 가르시놀(GC)의 다른 투여량의 효과

실험에 사용된 동물 : 수컷 위스터 랫(Male Wistar Rats).

동물의 무게 : 140내지 160 그램

연구에 사용된 가르시놀(GC)의 양 : 1.25, 2.5, 5, 10 mg/kg p.o.

표준 약물 : 실리마린(silymarin) 50mg/kg p.o.

과정 : 간 손상이 액상 파라핀(5배 희석)과 섞인 카본 테트라클로라이드(CCl4)의 주입에 의해 유발되었다. CCl4의 단일 투여량1ml/kg, p.o.이 동물에 주어졌고, 다른 시간 간격으로 가르시놀의 주입이 이어졌다(표 2). [(i) Bramanti G, Murmann W, Pierini P and Comporti M (1978). Effect of cicloxilic acid on CCl4-induced liver injury. Drug Research 28: 1112-1217. (ii) B Singh, A K Saxena, B K Chandan, K K Anand (1998). Hepatoprotective activity of Verbenalin on experimental liver damage in rodents. Fitoterapia LXIX 2: 135-140. (iii) B.K. Chandan, A.K. Sharma, K.K. Anand Boerhaavia diffusa: A study of its hepatoprotective activity. Journal of Ethnopharmacology, Volume 31, Issue 3, March 1991, Pages 299-307].

실험적 동물의 역-궤도 층(retro-orbital plexus)으로부터 혈액이 수집되었으며, 어떠한 안티-응고제(anti-coagulant)도 추가되지 않았다. 혈액은 1시간 동안 상온에 놓아두었다. 그런 다음에, 원심분리되었으며, 깨끗한 혈청이 분리되었다. 상기 혈청은 그런 다음에 분석을 위해 보관되었다. 참고문헌 : (Magari et al., 2004).

혈청 생화학 I (ASPARTATE AMINOTRANSFERASE and ALANINE AMINOTRANSFERASE), 참고문헌: Ritman S, Frankel S, (1957). A colorimeteric method for the determination of serum glutamic oxaloacetic and glutamic pyruvic transaminases. American Journal of Clinical Pathology; 28: 56-63.

과정 : 시험 및 대조군 샘플으로부터 수집된, 혈청의 0.2 ml이 완충용액의 1.0 ml와 섞였으며, 중탕으로 37 ℃에서 60분 동안 인큐베이트되었다. 크로모겐(chromogen) 용액의 1.0 ml의 추가 이후에, 상기 샘플들은 계속하여 상기 반응을 위해 20분 동안 상온에서 유지되었으며, 10 ml NaOH가 추가되었다. 광학 밀도(optical density)는 5분 후에 546 nm에서 붉은색이었다. 크로모겐 용액의 추가 이후에, 혈청이 블랭크(blank)에 추가되었다.

혈청 생화학 Ⅱ (ALKALINE PHOSPHATASE), 참고문헌: Klaus Walter and Schutt C. (1974). Acid and alkaline phosphatase in serum. In: Methods of Enzymatic Analysis.Eds. Hans Ulrich Bergmeyer, Verlag ChemieWeinheim,Academic press, Inc. New York, 2nd Edition, Vol.2, pp. 855-64.

과정 : 알카라인 포스파테이즈 활성 측정은 알칼리성 조건하에서 p-니트로페놀 포스파이트(p-nitrophenol phosphate)을 가수분해하는 효소의 활성에 기반한다. 쪼개진 생성물 p-니트로페놀은 알칼리성 조건에서 노란색이며, 400 내지 420 nm에서 측정된다(Klaus and Schutt, 1974). 각각 '테스트' 및 '대조군' 내에 혈청 및 증류수(0.1 ml)의 추가에 이어서 완충된 기질의 2.0 ml이 '테스트', '대조군' 및 '블랭크' 튜브 내에 넣어졌으며, 25 ℃에서 30분 동안 중탕에서 인큐베이트 되었다. 인큐베이션 후에 수산화나트륨(0.25 N, 2 ml) 이 모든 튜브에 추가되었으며, '대조군' 표시된 튜브에 혈청(0.1 ml)이 이어졌다. 형성된 노란색이 블랭크에 대하여 410 nm에서 분광 광도적으로(spectrophotometrically) 측정되었다.

혈청 생화학 Ⅲ [BILIRUBIN (BRBN)], 참고문헌: Malloy H T and Evelyn K A (1937). The determination of bilirubin with photoelectric colorimeter. Journal of Biological Chemistry 119: 481-490.

과정 : 혈청 빌리루빈이 말로이와 이블린 방법(method of Malloy and Evelyn (1937))으로 측정되었다. '테스트' 및 '대조군' 표시된 테스트 튜브의 두 세트 내에, 혈청(0.2 ml) 및 증류수(1.8 ml)가 추가되었다. '테스트' 및 '표준' 표시된 튜브에 디아조 시약(diazo reagent)(0.5 ml)이 추가되었다. '대조군' 및 '블랭크' 표시된 테스트 튜브에 디아조 블랭크(0.5 ml)가 추가되었다. 마지막으로 메탄올(2.5 ml)이 각각 테스트 튜브로 추가되었다. 상기 튜브들은 섞였으며, 어두운 곳에 30분 동안 놓아두었다. 상기 튜브들은 10분 후에 540 nm에서 판독되었다.

결과 : 가르시놀은, 랫 내 카본 테트라클로라이드로 유발된 간 손상 내 빌리루빈 및 혈청 효소 알라닌 트랜스아미네이즈(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈(AST) 및 알카라인 포스파테이즈(ALP)의 증가된 수준을 감소시켰다(표 3).

랫 내 카본 테트라클로라이드로 유발된 간 손상 내 빌리루빈, ALT, AST 및 ALP 상에서 가르시놀의 효과
혈청 파라미터들
처리	투여량(mg/kg)	ALT ㎛ol/min/lt	AST ㎛ol/min/lt	ALP ㎛ol/min/lt	빌리루빈 mg%	평균 보호%
매개체(Vehicle)	-	110.30±13.70	107.70±14.00	30.90±0.72	0.40±0.05	-
매개체 + CCl₄	-	1460.03±78.30	878.10±41.52	87.99±3.35	1.17±0.07	-
GC+ CCl₄	1.25	1272.50±109.19 (12.84)	746.81±36.93 (14.95)	78.49±6.58 (10.79)	1.03±0.04 (11.96)	12.63
GC+ CCl₄	2.50	1027.07±68.26* (29.65)	646.90±50.53* (26.32)	70.32±3.89* (20.08)	0.89±0.05** (23.93)	24.99
GC+ CCl₄	5.00	828.59±46.56** (43.24)	500.66±49.22** (42.98)	59.19±4.45** (32.73)	0.78±0.04** (33.33)	38.07
GC+ CCl₄	10.00	891.36±45.72** (38.94)	522.43±57.50** (40.50)	59.70±3.69** (32.15)	0.75±0.04** (35.89)	36.87
실리마린 + CCl₄	50	744.76±40.16** (48.99)	460.76±25.60** (47.52)	49.84±2.80** (43.35)	0.64±0.04** (48.71)	47.14
(수치는 평균±SE, n = 6) ; 괄호안의 퍼센트 변화 ; P 값 * : < 0.01; ** : <0.001. (ALT) 알라닌 트랜스아미네이즈; (AST) 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈; (ALP) 알카라인 포스파테이즈.

실시예 5

랫 내 파라세타몰로 유발된 간 손상의 간 균질현탁액 내 TGF-베타 1 및 ICAM-1 발현 상에서 가르시놀(GC)의 다른 투여량의 효과

실험에 사용된 동물 : 수컷 위스터 랫(Male Wistar Rats).

동물의 무게 : 140내지 160 그램

연구에 사용된 가르시놀(GC)의 양 : 1.25, 2.5, 5, 10 mg/kg p.o.

표준 약물 : 실리마린(silymarin) 50mg/kg p.o.

과정 : 실험적 동물들은 7일 동안 파라세타몰(400 mg/kg 몸무게)을 구강으로 받아들였다. 약물 처리된 그룹으로부터의 동물들은 7일 동안 테스트 약물 가르시놀의 등급별 투여량과 함께 물에 용해된 파라세타물 400 mg/kg (몸무게)를 구강으로 받아들였다. 표준 그룹 동물들은 7일 동안 표준 약물 실리마린의 50 mg/kg (몸무게) 및 파라세타물 400 mg/kg (몸무게)를 받아들였고, 표준 대조군으로 역할을 하였다. [N.Kanchana and A.Mohamed Sadiq, Hepatoprotective effect of Plumbago zeylanica on paracetamol induced liver toxicity in rats, Int J Pharm Pharm Sci, Vol 3, Issue1, 151-154 (2011)].

실험적 동물들로부터 간 조직은 폴리트론으로 얼음 위에서 균질화되었으며, 15분 동안 5000g에서 원심분리되었다. 상층액의 부분 표본이 분리되었으며, 생화학적 분석에 사용되었다. 상층액은 사이토카인 분석까지 -80℃에서 보관되었다. TGFβ 및 ICAM-1이, 제조업자 지시에 따라 샌드위치 및 경쟁적 ELISA 기법(sandwich and competitive ELISA technique)에 기초하는, 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 측정되었다. 모든 사이토카인 농도는, 표준 곡선으로부터 삽입에 의한 ELISA 플레이트 판독기 상에서 450nm의 비색적(colorimetric) 측정에 의하여 수행되었다. [(i) Magari K, Miyata S, Ohkubo Y, Mutoh S, (2004). Inflammatory cytokine levels in paw tissues during development of rat collagen-induced arthritis: Effect of FK506, an inhibitor of T cell activation. Inflammation Research. 53: 469-474 (Magari et al., 2004); and (ii) Modulation of Th1/Th2 cytokines and inflammatory mediators by hydroxychavicol in adjuvant induced arthritic tissues. Anjali Pandey , Sarang Bani, Prabhu Dutt, Krishna Avtar Suri. Cytokine 49 (2010) 114-121].

결과 : 가르시놀은, 랫 내 파라세타몰로 유발된 급성 간염과 관련된 간 내 TGF-베타 및 ICAM-1의 증가된 수준의 반응억제를 투여량 의존적으로 초래하였다(도 7 및 도 8).

실시예 6

랫 내 파라세타몰(아세틸-파라-아미노페놀-APAP)로 유발된 간 손상 내 혈청 효소 알라닌 트랜스아미네이즈(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈(AST) 및 알카라인 포스파테이즈(ALP)상에서 가르시놀(GC)의 다른 투여량의 효과

실험에 사용된 동물 : 수컷 위스터 랫(Male Wistar Rats).

동물의 무게 : 140내지 160 그램

연구에 사용된 가르시놀(GC)의 양 : 1.25, 2.5, 5, 10 mg/kg p.o.

표준 약물 : 실리마린(silymarin) 50mg/kg p.o.

실험적 동물의 역-궤도 층(retro-orbital plexus)으로부터 혈액이 수집되었으며, 어떠한 안티-응고제(anti-coagulant)도 추가되지 않았다. 혈액은 1시간 동안 상온에 놓아두었다. 그런 다음에, 그것은 원심분리되었으며, 깨끗한 혈청이 분리되었다. 상기 혈청은 그런 다음에 분석을 위해 보관되었다. 참고문헌 : (Magari et al., 2004).

과정 : 시험 및 대조군 샘플으로부터 수집된, 혈청의 0.2 ml이 완충용액의 1.0 ml와 섞였으며, 중탕으로 37 ℃에서 60분 동안 인큐베이트되었다. 크로모겐(chromogen) 용액의 1.0 ml의 추가 이후에, 상기 샘플들은 계속하여 상기 반응을 위해 20분 동안 상온에서 유지되었으며, 10 ml NaOH가 추가되었다. 광학 밀도(optical density)는 5분 후에 546 nm에서 붉은색 이었다. 크로모겐 용액의 추가 이후에, 혈청이 블랭크(blank)에 추가되었다.

과정 : 혈청 빌리루빈이 말로이와 이블린 방법(method of Malloy and Evelyn (1937))으로 측정되었다. '테스트' 및 '대조군' 표시된 테스트 튜브의 두 세트 내에, 혈청(0.2 ml) 및 증류수(1.8 ml)가 추가되었다. '테스트' 및 '표준' 표시된 튜브에 디아조 시약(diazo reagent)(0.5 ml)이 추가되었다. '대조군' 및 '블랭크' 표시된 테스트 튜브에 디아조 블랭크(0.5 ml)가 추가되었다. 마지막으로 메탄올(2.5 ml)이 각각 테스트 튜브로 추가되었다. 상기 튜브들은 섞였으며, 어두운 곳에 30분 동안 놓아두었다. 상기 튜브들은 10분 후에 540 nm 에서 판독되었다.

결과 : 가르시놀은, 랫 내 파라세타몰로 유발된 간 손상 내 빌리루빈 및 혈청 효소 알라닌 트랜스아미네이즈(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈(AST) 및 알카라인 포스파테이즈(ALP)의 증가된 수준을 감소시켰다(표 3).

랫 내 파라세타몰로 유발된 간 손상 내 빌리루빈, ALT, AST 및 ALP 상에서 가르시놀의 효과
혈청 파라미터들
처리	투여량 (mg/kg)	ALT(㎛ol min/lt)	AST(㎛ol min/lt)	ALP(㎛ol min/lt)	평균 보호%
매개체	-	98.32±5.20	117.49±8.26	21.42±2.04	-
매개체+APAP	-	1102.10±46.98	839.79±59.17	40.54±3.61	-
GC+APAP	1.25	862.97±53.38 (21.69)	761.61±43.96 (9.30)	37.21±3.44 (8.21)	13.06
GC+APAP	2.50	808.64±38.55* (26.62)	650.88±35.84* (22.49)	34.28±1.98 (15.44)	21.51
GC+APAP	5.00	661.67±51.40** (39.96)	463.41±38.56** (44.81)	30.74±2.05** (24.17)	36.31
GC+APAP	10.00	590.22±50.98** (46.44)	536.39±44.13** (36.12)	33.60±1.93* (17.11)	33.22
실리마린+ APAP	50	377.04±14.44** (65.78)	379.64±23.22** (54.79)	26.90±2.24** (33.64)	51.40
(수치는 평균±SE , n = 6); 괄호안의 *퍼센트 변화; P 값 : < 0.01; : <0.001. ( ALT ) 알라닌 트랜스아미네이즈 ; ( AST ) 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈 ; (ALP) 알카라인 포스파테이즈

실시예 7

랫 내 파라세타몰로 유발된 간 손상의 혈액 내 TNF-α 상에서 가르시놀(GC)의 다른 투여량의 효과

실험에 사용된 동물 : 수컷 위스터 랫(Male Wistar Rats).

동물의 무게 : 140내지 160 그램

연구에 사용된 가르시놀(GC)의 양 : 1.25, 2.5, 5, 10 mg/kg p.o.

표준 약물 : 실리마린(silymarin) 50mg/kg p.o.

상기 동물들은 역-궤도적으로(retro-orbitally) 출혈되었으며, 혈액은 PE-표지된 안티-랫 TNF-알파(PE-labeled anti-rat TNF-alpha) 단일클론 항체 발현의 측정을 위해 EDTA-코팅된 튜브 내에 수집되었다. 분석은 플로우 사이토메터(BD-FACS CANTO II) 상에서 행하여졌다. 이들 형광색소-표지된 단일클론 항체는 전혈의 100μl에 바로 추가되었으며, 그 다음에 반응물을 용해시키는 전혈을 사용하여 용해되었다. 최종 원심분리에 이어서, 샘플은 인산-완충 식염수( pH 7.4)내에 재부유되었으며(resuspended), 플로우 사이토메터 상에서 바로 분석되었다. 형광색소 트리거는 상기 경우들을 수집하기 위하여 PE(FL2) 파라미터 상에서 설정되었다. [(i) Bani S, Kaul A, Khan B, Ahmad SF, Suri KA, Gupta BD, Satti NK, Qazi GN, (2006).Suppression of T lymphocyte activity by lupeol isolated from Crataeva religiosa. Phytotherapy Research; 20(4): 279-287. And (ii) Bani S, Kaul A, Khan B, Ahmad SF, Suri KA, Satti NK, (2005). Immunosuppressive properties of an ethyl acetate fraction from Euphorbia royleana. Journal of Ethnopharmacology; 99: 185-192].

결과 : 도 9는, 가르시놀이 약물(파라세타몰)로 유발된 간 손상에 의해 초래된 급성 간염 내에 발생하는 간 내 TNF-α의 증가된 수준의 투여량 의존적 감소를 초래한다는 것을 보여준다.

실시예 8

알코올(에틸알코올-EtOH)로 유발된 간 독성 동물 모델의 혈청 내 종양괴사인자(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β) 및 IL-12 상에서 가르시놀(GC)의 다른 투여량의 효과

실험에 사용된 동물 : 수컷 위스터 랫(Male Wistar Rats).

동물의 무게 : 140내지 160 그램

연구에 사용된 가르시놀(GC)의 양 : 1.25, 2.5, 5, 10 mg/kg p.o.

표준 약물 : 실리마린(silymarin) 50mg/kg p.o.

과정 : 180 내지 200g 무게가 나가는, 수컷 위스터 랫에게 0.5 내지 0.6 ml 에탄올이 구강으로 주어졌다. 에탄올의 초기 투여량은 6g/kg/하루 (최대 56% 알코올을 포함하는 용액)이었으며, 상기 투여량은 1주일 동안에 8g/kg/하루의 유지량으로 점진적으로 증가되어, 5주 이상 지속되었다. 모든 랫들은 처음부터 끝까지 6주 기간 동안 이용 가능한 규칙적인 표준 랫 먹이를 먹었다. 랫들은 1주일에 3번 무게가 재어졌다. [Guangjin Yuan, Zuojiong Gong *, Xiaorong Zhou, Pin Zhang, Xiaomei Sun and Xi Li. Epigallocatechin-3-Gallate Ameliorates Alcohol-Induced Liver Injury in Rats. Int. J. Mol. Sci. 2006, 7, 204-219].

알코올 처리된 실험적 동물들의 역-궤도 층으로부터 혈액이 수집되었으며, 사이토카인 측정을 위해 EDTA와 섞였다. 혈청을 수집하기 위하여 어떠한 안티-응고제도 혈액 내에 추가되지 않았으며, 이는 1시간 동안 상온에 놓여졌다. 상기 혈액은 그런 다음에 원심분리 되었으며, 깨끗한 혈청이 분리되었으며, 분석을 위해 보관되었다. TNF-α, IL-1β 및 IL-12가, 제조업자 지시에 따라 샌드위치 및 경쟁적 ELISA 기법(sandwich and competitive ELISA technique)에 기초하는, 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 측정되었다. 모든 사이토카인 농도는, 표준 곡선으로부터 삽입에 의한 ELISA 플레이트 판독기 상에서 450nm의 비색적(colorimetric) 측정에 의하여 수행되었다.

결과 : 가르시놀(GC)은, 에틸알코올 섭취로 유발된 위장 내의 그램 음성 박테리아의 LPS 활성 및 초과 성장에 의한 쿱퍼 세포의 TLR-4 활성에 의해 유발된 TNF-알파, 인터루킨-1베타 및 인터루킨-12(도 10 및 도 11)의 증가된 수준을 반응억제 하였다(Garcinol (GC) inhibited increased levels of TNF-alpha, Interleukin- 1 beta and Interleukin-12 (FIG 10 and FIG 11) induced by TLR-4 activation of Kupffer cells by LPS of gram negative bacteria in the gut the activation and excessive growth of which is due to ethyl alcohol intake).

실시예 9

알코올(에틸알코올-EtOH)로 유발된 간 독성 동물 모델의 혈청 내 혈청 효소 알라닌 트랜스아미네이즈(ALT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈(AST) 및 알카라인 포스파테이즈(ALP)상에서 가르시놀(GC)의 다른 투여량의 효과

실험에 사용된 동물 : 수컷 위스터 랫(Male Wistar Rats).

동물의 무게 : 140내지 160 그램

연구에 사용된 가르시놀(GC)의 양 : 1.25, 2.5, 5, 10 mg/kg p.o.

표준 약물 : 실리마린(silymarin) 50mg/kg p.o.

과정 : 180 내지 200g 무게가 나가는, 수컷 위스터 랫에게 0.5 내지 0.6 ml 에탄올이 구강으로 주어졌다. 에탄올의 초기 투여량은 6g/kg/하루 (최대 56% 알코올을 포함하는 용액)이었으며, 상기 투여량은 1주일 동안에 8g/kg/하루의 유지량으로 점진적으로 증가되어, 5주 이상 지속되었다. 모든 랫들은 처음부터 끝까지 6주 기간 동안 이용 가능한 규칙적인 표준 랫 먹이를 먹었다. 랫들은 1주일에 3번 무게가 재어졌다. [Guangjin Yuan, Zuojiong Gong *, Xiaorong Zhou, Pin Zhang, Xiaomei Sun and Xi Li. Epigallocatechin-3-Gallate Ameliorates Alcohol-Induced Liver Injury in Rats. Int. J. Mol. Sci. 2006, 7, 204-219]. 실험적 동물들의 역-궤도 층으로부터 혈액이 수집되었으며, 어떠한 안티-응고제도 혈액 내에 추가되지 않았다. 혈액은 1시간 동안 상온에 놓여졌다. 그런 다음에 그것은 원심분리되었으며, 깨끗한 혈청이 분리되었다. 상기 혈청은 그런 다음에 분석을 위해 보관되었다. 참고문헌: (Magari et al., 2004).

혈청 파라미터들
처리	Dose (mg/kg)	ALT(㎛ol min/lt)	AST(㎛ol min/lt)	ALP(㎛ol min/lt)	빌리루빈 mg%	평균 보호%
매개체	-	118.10±10.20	106.40±16.60	32.30±0.52	0.44±0.08	-
매개체+ EtOH	-	1820.08±42.80	1076.32±48.22	104.22±8.60	2.08±0.02	-
GC + EtOH	1.25	1320.40±52.20* (27.45)	858.80±32.64 (20.20)	88.68±8.58 (14.91)	1.94±0.02 (6.73)	17.32
GC + EtOH	2.50	1080.50±48.56** (40.63)	726.78±46.50* (32.47)	76.12±4.88* (26.96)	1.68±0.04* (19.23)	29.82
GC + EtOH	5.00	876.58±76.80** (51.83)	650.26±56.20** (39.58)	68.32±5.60** (34.44)	1.42±0.06** (31.73)	39.39
GC + EtOH	10.00	870.80±48.40** (52.15)	632.48±44.56** (41.23)	69.00±4.82** (33.79)	1.39±0.04** (33.65)	40.20
실리마린+ EtOH	50	854.88±38.46** (53.03)	662.70±38.40** (38.44)	66.54±6.30** (36.15)	1.34±0.02** (35.57)	40.79
(수치는 평균±SE , n = 6) ; 괄호안의 *퍼센트 변화; P 값 : < 0.01; : <0.001. ( ALT ) 알라닌 트랜스아미네이즈 ; ( AST ) 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈 ; ( ALP ) 알카라인 포스파테이즈

결과 : 가르시놀은, 에틸알코올로 유발된 간 독성 실험적 모델 내 ALT, AST, ALP 및 빌리루빈의 증가된 수준을 감소시켰다.

실시예 10

간보호 제제로 알려진, 실리마린과 Hep G2 간암 세포라인 내 가르시놀의 세포독성의 잠재력(세포독성 %) 비교 (가르시놀 vs 실리마린-TabHles 6 및 7의 전반적인 간 보호적 효과, 도 12 및 도 13)

절차-세포독성을 확인하기 위하여 물질의 다양한 농도에서 성장된 HEP G2 세포가 얻어졌다. 상기 배지는 그런 다음에 서서히 꺼내어졌으며, 각 웰(well)로 MTT(150 mg/well)의 워킹 스톡 용액(working stock solution) 100 ml이 추가된다. 그런 다음에, 상기 플레이트는 알루미늄 호일로 더 감싸지고, 37 ℃에서 CO2 인큐베이터 내에서 4시간 동안 인큐베이트된다. 상기 플레이트는 그런 다음에 웰 당 PBS의 100 ml로 서서히 세척된다. 세척은, 세척되는 동안 세포의 손실, 벗겨짐 및 건조를 방지하기 위하여 배지를 꺼낸 후에 바로 행하여져야 한다. 웰 당 DMSO의 100 ml 내에 염료를 용해시킨다. 상기 플레이트는 5분 동안 흔들어지고, 플로우스터 옵티마(Fluostar optima, BMG) 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 492 nm에서 흡광도가 측정된다. 상기 흡광도는 세포 생존력(viability)에 정비례 할 것이다. 620 nm에서 판독하는 선택이 또한 채택될 수 있으며, 이는 샘플 내 세포 파편의 간섭을 제외한다. 상기 데이터는 흡광도에 대한 플로팅 세포 수를 도식화(plotting)함으로써 분석되어, 세포 증식 내 변화를 정량화한다. 테트라졸리움(tetrazolium) 감소 속도는 세포 증식의 속도에 비례적이다.

계산 :

샘플의 세포독성은 IC50 값으로 표현되며, 그 농도는 세포 성장의 50%를 억제한다.

% 세포독성 = E - T　　 X　100　　　　　　　　　　　　　　

　　　　　　　　　　　　　　　E

여기에서 , E = 샘플이 없는 경우 세포 생존력

　T = 샘플이 존재하는 경우 세포 생존력.

HEP G2 세포 내 가르시놀의 간 보호적 활성

IC ₅₀　　　 =　　　 13.33ug/ml

95%CL = 11.84 to　15.02ug/ml

HEP G2 세포 내 실리마린의 간 보호적 활성

IC 50　　　 =　　　 36.51ug/ml

95%CL = 32.18 내지　41.42ug/ml

IC₅₀ 수치가 낮을수록, 효능이 더 좋다.

Hep G2 세포라인 내 실리마린의 세포독성
농도(㎍/ ml )	% 세포독성
100.00	81.77
50.00	64.33
25.00	8.62
12.50	-7.46
6.25	-4.25
3.13	-11.27
1.56	-8.63
0.78	-8.31
0.39	2.34
S자형 용량 반응(가변 기울기)
하부	0
상부	100
IC₅₀	36.51 ㎍/ml
95% CL	32.18 내지 41.42 ㎍/ml
R²	0.9545

Hep G2 세포라인 내 가르시놀의 세포독성
농도(㎍/ ml )	% 세포독성
200.00	79.50
100.00	83.44
50.00	83.15
25.00	60.90
12.50	35.81
6.25	-1.94
3.13	-14.65
1.56	-12.09
0.78	-3.81
S자형 용량 반응(가변 기울기)
하부	0
상부	100
IC₅₀	13.33 ㎍/ml
95% CL	11.84 내지 15.02 ㎍/ml
R²	0.9756

결과 : 가르시놀은 더 낮은 농도(6.25 μg/ml 보다 낮은 수치)에서 실리마린과 유사한 비교적 간 보호적 효과를 나타낸다.

본 발명은 더 바람직한 실시예에 관하여 서술되었으나, 본 발명이 이에 한정되지 않는다는 점이 당해 기술의 숙련된 자들에 의해 명백하게 이해되어야 한다. 오히려, 본 발명의 범주는 오직 첨부된 청구항과 함께 해석되어야 한다.

Claims

포유류의 간세포를 가르시놀의 유효 농도로 접하게 하는 단계를 포함하는, 포유류의 간세포 보호 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 가르시놀의 유효 농도는 약 0.78 ㎍/ml 내지 약 6.25 ㎍/ml 인, 포유류의 간세포 보호 방법.
간 손상(간 독성)의 포유류 모델에 가르시놀의 유효량을 주입하는 단계를 포함하는, 상기 모델 내 사이토카인 발현의 증가된 수준을 감소시키는 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 사이토카인 내에 형질전환생장인자 G-β1(TGF-β1)가 있는, 사이토카인 발현의 증가된 수준을 감소시키는 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 사이토카인은 종양괴사인자-α인, 사이토카인 발현의 증가된 수준을 감소시키는 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 사이토카인은 인터루킨-2(IL-2)인, 사이토카인 발현의 증가된 수준을 감소시키는 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 사이토카인은 인터루킨-4(IL-4)인, 사이토카인 발현의 증가된 수준을 감소시키는 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 사이토카인은 인터루킨-12(IL-12)인, 사이토카인 발현의 증가된 수준을 감소시키는 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 간독성은 독소에 의해 유발된 것인, 사이토카인 발현의 증가된 수준을 감소시키는 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 간 독성은 약물에 의해 유발된 것인, 사이토카인 발현의 증가된 수준을 감소시키는 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 간 독성은 에틸 알코올에 의해 유발된 것인, 사이토카인 발현의 증가된 수준을 감소시키는 방법.
간 손상(간 독성)의 포유류 모델에 가르시놀의 유효량을 주입하는 단계를 포함하는, 상기 모델 내 부착 분자 발현의 증가된 수준을 감소시키는 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 부착 분자는 내피세포 부착 분자-1(ICAM-1 또는 CD52)인, 부착 분자 발현의 증가된 수준을 감소시키는 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 간 독성은 독소에 의해 유발된 것인, 부착 분자 발현의 증가된 수준을 감소시키는 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 간 독성은 약물에 의해 유발된 것인, 부착 분자 발현의 증가된 수준을 감소시키는 방법.
간 손상(간 독성)의 포유류 모델에 가르시놀의 유효량을 주입하는 단계를 포함하는, 상기 모델 내 담즙 색소 및/또는 간 효소의 높아진 수준을 감소시키는 방법.
제 16 항에 있어서,
상기 간 독성은 독소에 의해 유발된 것인, 담즙 색소 및/또는 간 효소의 높아진 수준을 감소시키는 방법.
제 16 항에 있어서,
상기 간 독성은 약물에 의해 유발된 것인, 담즙 색소 및/또는 간 효소의 높아진 수준을 감소시키는 방법.
제 16 항에 있어서,
상기 간 독성은 에틸 알코올에 의해 유발된 것인, 담즙 색소 및/또는 간 효소의 높아진 수준을 감소시키는 방법.
제 16 항에 있어서,
상기 간 효소는 알라닌 트랜스아미네이즈, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈 및 알카라인 포스파테이즈로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 담즙 색소 및/또는 간 효소의 높아진 수준을 감소시키는 방법.
제 16 항에 있어서,
상기 담즙 색소는 빌리루빈인, 담즙 색소 및/또는 간 효소의 높아진 수준을 감소시키는 방법.
가르시놀의 치료적인 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 주입하는 단계를 포함하는, 간세포 보호를 제공하는 방법.