KR20130090738A

KR20130090738A - 발린의 연속적 분리를 위한 장치 및 이를 이용한 발린의 연속적 분리 방법

Info

Publication number: KR20130090738A
Application number: KR1020120125739A
Authority: KR
Inventors: 이종호; 강승훈; 유재헌; 김유신; 문성용; 남희근; 박찬훈
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2012-02-06
Filing date: 2012-11-07
Publication date: 2013-08-14
Also published as: HUE055656T2; CN104203903A; MY171770A; IN2014MN01764A; EP2812309B1; EP2812309A1; EP2812309A4; CN104203903B; US20130204040A1; WO2013119034A1; ES2882617T3; JP2018024679A; JP2015506958A; BR112014019488B1; KR101449808B1; BR112014019488A2

Abstract

본 발명은 류신과 이소류신 등의 아미노산을 포함하는 혼합물로부터 발린을 연속적으로 분리하는 장치 및 이를 이용한 발린의 연속적 분리방법에 관한 것으로, 류신과 이소류신 등의 아미노산을 포함하는 혼합물로부터 높은 순도와 수율로 발린을 연속적으로 분리할 수 있다.

Description

발린의 연속적 분리를 위한 장치 및 이를 이용한 발린의 연속적 분리 방법{An apparatus for continuous separation of valine and a method for continuous separation of valine using the same}

본 발명은 발린의 연속적 분리를 위한 장치 및 이를 이용한 발린의 연속적 분리 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 류신과 이소류신 등의 아미노산을 포함하는 혼합물로부터 발린을 연속적으로 분리하기 위한 장치 및 이를 이용한 발린의 연속적 분리 방법에 관한 것이다.

발린(valine)은 HO₂CCH(NH₂)CH(CH₃)₂의 화학식을 갖는 L-아미노산으로서, 의약품과 화장품의 주요 원료 중의 하나로 사용되고 동물사료에서도 중요한 성분 중 하나이다. 이러한 이유로 발린에 대한 시장의 관심은 날로 커지고 있는 상황이다.

발린 생산과정은 주로 코리네박테리움(Corynebacterium)의 발효를 통해 이루어지고 있다. 이와 관련하여 주목할 사항은 발효 과정 중 발린 뿐만 아니라 기타 불순물들도 함께 얻어진다는 점이다. 이들 불순물들에는 염(salt), 알라닌(alanine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine) 등이 있으며, 이러한 불순물들은 모두 발린으로부터 분리되어야 한다.

종래 사용되는 발린의 분리방법으로는 이온배제 크로마토그래피(일본특허공개 제1987-255453호), 침전제를 이용한 결정화 방법(일본특허공개 제1996-333312호, 일본특허공개 제1998-237030호 및 미국특허 제6,072,083호), 화학반응법(미국특허 제4,263,450호) 등이 있다. 그러나, 상기 분리방법들 중, 이온배제 크로마토그래피 방법은 류신, 이소류신과 같은 아미노산의 분리가 어렵고 폐수 발생량이 많으며 결정화 등의 후처리 공정이 추가로 필요하다는 단점이 있고, 침전제를 이용한 결정화 방법은 침전제를 제거하기 위한 공정이 필요하므로 공정이 복잡해지고 정제를 위한 후처리 공정이 추가로 필요하다는 단점이 있으며, 화학반응법은 농축 및 가수분해 공정이 필요하므로 공정이 복잡하고 용매를 다량 사용하므로 이를 회수하기 위해 후처리 공정에 많은 설비를 필요로 하므로 정제 공정의 비용이 상승한다는 단점이 있다.

한편, 크로마토그래피 분리 공정은 흡착제에 기반을 둔 분리 공정으로 여러 바이오 제품의 분리 정제 단계에 광범위하게 사용되고 있으며, 그 운용 방식에 따라 크게 회분식(batch) 크로마토그래피 공정과 연속식 유사 이동층(simulated moving bed, SMB) 크로마토그래피 공정으로 구분된다. 이중 후자에 해당되는 SMB 공정은 1961년에 미국의 UOP사에서 석유화학제품의 분리를 위해 최초 개발한 공정으로서, 그 성능과 분리 효율이 회분식 공정에 비해 월등히 뛰어난 것으로 보고되고 있다. 이러한 SMB 공정의 우위성으로 인하여 비단 석유화학 제품의 분리정제뿐만 아니라, 당 물질, 키랄 화합물, 바이오 제품, 의약품 등의 고부가 제품들의 분리정제로까지 확대되어 사용되어 왔다.

종래 대부분의 SMB 공정들은 도 1에 기재된 바와 같이, 네 개의 zone(컬럼)과 네 개의 port가 배치되어 있는 구조를 가지고 있으며(four-zone SMB), 네 개의 포트들 중 분리대상 혼합물 포트(Feed)와 탈착제 포트(Desorbent)를 통하여 분리대상 혼합물과 용매(탈착제)가 각각 주입된다. 아울러 라피네이트 포트(Raffinate)와 추출물 포트(Extract)를 통하여 흡착력이 약한 물질과 강한 물질이 분리되어 얻어지게 된다. 이와 같은 일련의 분리대상 혼합물과 용매 주입 그리고 두 성분의 회수가 연속적으로 일어나도록 하기 위해, 네 개의 포트가 일정한 시간 간격(switching time)으로 용매가 흘러가는 방향을 따라 움직이게 된다.

그러나, 상기 four-zone SMB 공정은 최소 네 개의 컬럼을 필요로 한다. 일반적으로 각 컬럼 당 고가의 밸브가 필요하고 또한 고가의 흡착제가 사용되기 때문에 가급적이면 컬럼의 개수를 최소화하는 것이 바람직하다.

이에 따라, 도 2에 나타낸 바와 같은 3개의 크로마토그라피 구간을 갖는 SMB(three-zone SMB) 공정이 도입된 바 있다. 세 개의 구간을 사용하기 때문에 최소 컬럼 수를 네 개에서 세 개로 줄일 수 있다. 아울러 네 개의 포트의 위치는 기존의 4개의 크로마토그라피 구간을 갖는 SMB 구조와 동일하게 배치된다.

그러나, 상기 three-zone SMB 공정에서 발린과 같이 흡착력이 약하여 빠르게 이동하는 low-affinity 성분은 도 2의 라피네이트 포트를 통하여 회수되는데, 도 2와 같이 라피네이트에 대한 농축 구간(enrichment zone)이 없기 때문에 과도한 희석이 불가피하게 된다. 즉, 회수된 발린의 농도가 분리대상 혼합물 중의 발린 농도에 비해 낮아지므로, SMB 분리 공정에 이어지는 후처리 공정의 운용비용이 상승하는 부작용이 발생한다. 따라서 이러한 부작용을 극복할 수 있는 새로운 시스템의 three-zone SMB 공정의 적용이 필요하다.

이에 본 발명자는 상기와 같은 점을 감안하여 연구하던 중 유사 이동층 크로마토그래피 공정을 이용한 장치를 통하여, 류신과 이소류신 등의 아미노산을 포함하는 혼합물로부터 효율적으로 발린을 연속적으로 분리할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 류신과 이소류신 등의 아미노산을 포함하는 혼합물로부터 발린을 연속적으로 분리하는 장치 및 이를 이용한 발린의 연속적 분리 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 도 4a 내지 도 4c에서 도시되는 바와 같이, 본 발명에서 발린의 분리를 위해 사용하는 장치는 탈착제 포트(D), 분리대상 혼합물 포트(F), 라피네이트 포트(R), 추출물 포트(E), 3개의 로터리 밸브(10, 20, 30), 및 각각의 로터리 밸브(10, 20, 30)와 연결되는 3개의 크로마토그라피 구간(40, 50, 60)을 포함한다.

3개의 로터리 밸브(10, 20, 30)는 각각 3개의 연결 포트(10a, 10b, 10c)(20a, 20b, 20c)(30a, 30b, 30c)를 구비하는데, 로터리 밸브(10, 20, 30)의 회전에 따라 각각의 로터리 밸브(10, 20, 30)의 어느 하나의 연결 포트만이 개방됨으로써 탈착제 포트(D), 분리대상 혼합물 포트(F), 라피네이트 포트(R), 추출물 포트(E)와 유체소통된다.

달리 표현하면, 탈착제 포트(D), 분리대상 혼합물 포트(F), 라피네이트 포트(R), 추출물 포트(E)에 연결되는 유로는 각각 3개의 분기점을 가지고, 이에 따라 3개의 로터리 밸브(10, 20, 30)와 모두 연결되어 있으며, 이후 어느 하나의 연결 포트가 개방됨에 따라 특정 로터리 밸브에 연결된다.

이하에서는 구체적인 작동 방식을 설명한다.

도 3은 본 발명에서 사용하는 3개의 크로마토그라피 구간을 갖는 유사 이동층(three-zone SMB) 공정의 구조를 간략히 도식화한 것이다. 도 3을 통해 알 수 있는 바와 같이, 포트의 배치 순서가 탈착제 포트, 분리대상 혼합물 포트, 라피네이트 포트, 추출물 포트의 순서로 되어 있어 라피네이트 농도의 희석을 방지해 줄 수 있는 농축 구간의 운용이 가능하다. 이로 인해 종래 three-zone SMB의 문제점인 라피네이트 농도의 저하를 예방할 수 있는 장점을 갖는다. 또한, 탈착제 포트와 분리대상 혼합물 포트가 컬럼 하나를 통하여 연결되어 있는 구조를 가지고 있어, 용매의 사용량을 줄일 수 있는 장점도 있다.

또한, 본 발명에서는 도 4와 같은 공정이 연속적으로 이루어지는 장치를 제공한다. 도 4a는 제 1 위치의 장치, 도 4b는 제 2 위치의 장치, 도 4c는 제 3 위치의 장치를 도시한다. 제 1, 2, 3 위치는 연속적으로 순환된다. 즉, 본 발명에 따른 장치는 제 1 위치, 제 2 위치, 제 3 위치 순서로 작동한 후 다시 제 1 위치로 회귀하는 방식이다.

특정 위치로의 설정은 로터리 밸브(10, 20, 30)의 회전에 의해 이루어진다. 즉, 로터리 밸브(10, 20, 30)의 제 1 연결 포트(10a, 20a, 30a)가 개방됨으로써 제 1 위치로 설정되고, 로터리 밸브(10, 20, 30)가 회전함으로써 제 2 연결 포트(10b, 20b, 30b)가 개방됨으로써 제 2 위치로 설정되고, 다시 로터리 밸브(10, 20, 30)가 회전함으로써 제 3 연결 포트(10c, 20c, 30c)가 개방됨으로써 제 3 위치로 설정된다. 로터리 밸브(10, 20, 30)가 다시 회전하면 다시 제 1 위치로 설정된다.

한편, 이하에서는 이해를 위하여 일부의 연결 포트(10a, 20b, 30c)는 유입 포트(10a-1, 20b-1, 30c-a)와 유출 포트(10a-2, 20b-2, 30c-2)로 구분하여 도시하고 설명한다.

도 4a에 도시되는 제 1 위치에서는 로터리 밸브(10, 20, 30)의 제 1 연결 포트(10a, 20a, 30a)만 개방되고 제 2 연결 포트(10b, 20b, 30b) 및 제 3 연결 포트(10c, 20c, 30c)는 폐쇄된다.

제 1 위치에서, 탈착제 포트(D)는 제 1 로터리 밸브(10)와 연결되고, 분리대상 혼합물 포트(F)는 제 2 로터리 밸브(20)와 연결되고, 라피네이트 포트(R)는 제 3 로터리 밸브(30)와 연결되고, 추출물 포트(E)는 제 1 로터리 밸브(10)와 연결된다.

이에 따라, 탈착제 포트(D)로부터 유입되는 탈착제는 제 1 로터리 밸브(10) 및 제 1 크로마토그라피 구간(40)을 통과한 후 제 2 로터리 밸브(20)로 유입된다.

분리대상 혼합물 포트(F)로부터 유입되는 분리대상 혼합물은 제 1 크로마토그라피 구간(40)을 통과한 탈착제와 함께 제 2 로터리 밸브(20)로 유입되고, 제 2 크로마토그라피 구간(50)을 통과한다.

본 발명에서 분리대상 혼합물은 발린을 포함하고 있으며, 불순물로 염(salt), 알라닌(alanine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine) 등을 포함하고 있다. 제 2 크로마토그라피 구간(50)을 통과한 후 유동 속도의 차이로 인하여 분리대상 혼합물의 분리 작용이 이루어진다. 발린은 다른 불순물에 비하여 흡착력이 약해 빠르게 이동하는 low-affinity 성분에 해당된다. 따라서, 이후 분리대상 혼합물은 발린과 나머지 물질로 분리되며 각각 시간의 차이를 두고 제 3 로터리 밸브(30)에 유입된다.

이중 분리하고자 하였던 발린은 라피네이트 포트(R)를 통하여 유출되나, 나머지 물질은 제 3 크로마토그라피 구간(60)을 통과하고 다시 제 1 로터리 밸브(10)를 통과함으로써 추출물 포트(E)로 유출된다.

소정의 시간(즉, 로터리 밸브의 회전 시간 간격)이 지나면 로터리 밸브(10, 20, 30)가 회전하여 도 4b에 도시되는 제 2 위치로 변경된다. 소정의 시간의 기준은 아래에서 후술한다.

도 4b에 도시되는 제 2 위치에서는 로터리 밸브(10, 20, 30)의 제 2 연결 포트(10b, 20b, 30b)만 개방되고, 제 1 연결 포트(10a, 20a, 30a) 및 제 3 연결 포트(10c, 20c, 30c)는 폐쇄된다.

제 1 위치와 비교해보면, 제 2 위치에서는 포트들(D, F, R, E)과 연결되는 로터리 밸브(10, 20, 30)들이 하나씩 이동된다.

즉, 제 2 위치에서, 탈착제 포트(D)는 제 2 로터리 밸브(20)와 연결되고, 분리대상 혼합물 포트(F)는 제 3 로터리 밸브(30)와 연결되고, 라피네이트 포트(R)는 제 1 로터리 밸브(40)와 연결되고, 추출물 포트(E)는 제 2 로터리 밸브(20)와 연결된다.

이에 따라, 탈착제 포트(D)로부터 유입되는 탈착제는 제 2 로터리 밸브(20) 및 제 2 크로마토그라피 구간(50)을 통과한 후 제 3 로터리 밸브(30)로 유입된다.

분리대상 혼합물 포트(F)로부터 유입되는 분리대상 혼합물은 제 2 크로마토그라피 구간(50)을 통과한 탈착제와 함께 제 3 로터리 밸브(30)로 유입되고, 제 3 크로마토그라피 구간(60)을 통과한다.

그런데, 이 시점은 도 4a에서 도시되었던 제 1 위치에서 유입되었던 분리대상 혼합물 중 나머지 물질은 유동 속도의 차이로 인하여 아직 제 3 로터리 밸브(30)에 유입되지 못한 시점이다. 이러한 상황이 이루어지도록, 전술한 로터리 밸브의 회전 시간 간격이 조정된다.

따라서, 제 2 위치에서 제 3 로터리 밸브(30)에 유입된 분리대상 혼합물은 제 3 크로마토그라피 구간(60)을 통과한 후 유동 속도의 차이로 인하여 분리대상 혼합물의 분리 작용이 이루어져 발린과 나머지 물질로 분리되는데, 분리하고자 하였던 발린은 제 1 로터리 밸브(10)를 통하여 라피네이트 포트(R)를 통하여 유출되는 반면, 나머지 물질은 제 1 위치에서 분리되었으나 아직 제 3 로터리 밸브(30)에 유입되지 못하였던 나머지 물질과 합쳐져서 보다 효과적으로 제 2 로터리 밸브(20)를 통과한 후 추출물 포트(E)에 유입된다.

소정의 시간이 지나면 로터리 밸브(10, 20, 30)가 회전하여 도 4c에 도시되는 제 3 위치로 변경된다.

도 4c에 도시되는 제 3 위치에서는 로터리 밸브(10, 20, 30)의 제 3 연결 포트(10c, 20c, 30c)만 개방되고, 제 1 연결 포트(10a, 20a, 30a) 및 제 2 연결 포트(10b, 20b, 30b)는 폐쇄된다.

제 2 위치와 비교해보면, 제 3 위치에서는 포트들(D, F, R, E)과 연결되는 로터리 밸브(10, 20, 30)들이 하나씩 이동된다.

제 1, 2 위치에서 설명한 것과 마찬가지로, 분리대상 혼합물 포트(F)로부터 유입되는 분리대상 혼합물은 제 3 크로마토그라피 구간(60)을 통과한 탈착제와 함께 제 1 로터리 밸브(10)로 유입되고, 제 1 크로마토그라피 구간(40)을 통과하는데, 이 시점은 도 4b에서 도시되었던 제 2 위치에서 유입되었던 분리대상 혼합물 중 나머지 물질이 유동 속도의 차이로 인하여 아직 제 2 로터리 밸브(20)에 유입되지 못한 시점이기에 역시 함께 합쳐져서 제 3 로터리 밸브(30)를 통과한 후 추출물 포트(E)에 유입된다.

분리대상 혼합물 중 분리하고자 하였던 발린은 제 2 로터리 밸브(20)를 통과한 후 라피네이트 포트(R)로 분리된다.

소정의 시간이 지나면 로터리 밸브(10, 20, 30)가 회전하여 다시 도 4a에 도시되는 제 1 위치로 변경되고, 위의 과정이 연속적으로 진행된다.

본 발명에서, 상기 제1, 제2 및 제3 크로마토그라피 구간에 사용되는 흡착제는 다공성 고분자 레진이 사용될 수 있으며, 바람직하게는, 불용성 폴리스틸렌 다이비닐벤젠 고분자(insoluble polystyrene divinylbenzene polymer) 물질로 이루어진 레진이 사용될 수 있다. 상기 레진은 표면적이 넓고, 고유의 공극분포 및 공극용적분포(pore size and volume distribution)을 가지고 있어, 다양한 물질, 특히 약제학적 화합물의 정제에 유용하게 사용될 수 있다. 구체적인 예로는 Amberchrom CG161(Rohm & haas) 또는 Chromalite PCG Series (Purolite) 등이 사용될 수 있다. 상기 상업적으로 이용되는 레진의 입자 지름은 10-300 ㎛이 있으며, 표면적은 700~900 ㎡/g이고, 기공의 크기는 100~200 Å, 공극용적분포는 0.7~1.5 ml/g이고, 균등계수(uniformity coefficient)는 2 미만이다.

상기 분리대상 혼합물은 발린 및 발린과 함께 분지쇄 아미노산에 포함되는 이소류신 또는 류신을 포함하는 혼합물로, 바람직하게는 미생물 발효를 통해 수득한 발린 발효액일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 정제된 발린, 이소류신 및 류신을 인위적으로 혼합한 혼합액 및 미생물 발효로 수득한 발린 발효액을 이용하였다. 이는, 미생물 발효시, 발린만 생산되는 경우는 거의 없고, 대부분 이소류신 및 류신이 함께 생산되기 때문이다.

본 발명에 따른 발린의 연속적 분리 장치에 의하여, 분리대상 혼합물 중 분리하고자 하였던 발린은 라피네이트 포트(R)를 통해 유출되고, 나머지 물질은 유동 속도의 차이뿐만 아니라 로터리 밸브(10, 20, 30)의 회전에 의하여 보다 효과적으로 분리되어 추출물 포트(E)를 통해 유출되며, 발린을 연속적으로 분리할 수 있다.

또한, 본 발명의 발린의 연속적 분리 장치의 제어에 있어, 탈착제 포트(D), 분리대상 혼합물 포트(F) 및 라피네이트 포트(R)의 유속량을 조절하고, 이와 함께 로터리 밸브의 회전속도(switching time)를 조절하여 제어할 수 있다. 상기 각 포트의 유속량은 컬럼의 intrinsic parameter(흡착계수, 물질전달계수, 공극율, 물질 환경 등)을 고려하여 조절할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 발린의 연속적 분리 장치를 이용하여 발린을 연속적으로 분리하는 방법에 있어서, 상기 탈착제 포트로 탈착제를 유입하고, 상기 분리대상 혼합물 포트로 발린을 포함하는 혼합물을 유입하고, 상기 라피네이트 포트로부터 발린을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발린의 연속적 분리방법을 제공한다. 상기 탈착제는 물인 것이 바람직하다. 또한, 상기 방법으로 회수된 발린의 순도는 90% 내지 99%인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에 따른 발린의 연속적 분리 장치를 통하여, 발린, 류신 및 이소류신을 포함하는 분리대상 혼합물을 분리한 결과, 회수된 발린의 수율은 약 98% 이상, 순도는 약 98% 이상으로, 발린을 효과적으로 분리할 수 있음을 확인하였다.

본 발명은 유사 이동층 크로마토그래피 공정을 이용한 장치를 통하여, 류신과 이소류신 등의 아미노산을 포함하는 혼합물로부터 높은 순도와 수율로 발린을 연속적으로 분리할 수 있다.

도 1은 종래 4개의 크로마토그라피 구간을 갖는 유사 이동층(four-zone SMB) 크로마토그래피 공정의 구조를 간략히 도식화한 것이다.
도 2는 종래 3개의 크로마토그라피 구간을 갖는 SMB(three-zone SMB) 공정의 구조를 간략히 도식화한 것이다.
도 3은 본 발명에서 사용하는 3개의 크로마토그라피 구간을 갖는 유사 이동층(three-zone SMB) 공정의 구조를 간략히 도식화한 것으로서 종래의 three-zone SMB와 차별화된 포트 배치 방식에 기초하여 개발된 공정 구조이다.
도 4는 본 발명에서 사용하는 three-zone SMB 공정을 위한 장치의 모식도이다. 도 4a, 4b 및 4c는 각각 로터리 밸브의 회전에 따른 각 구간의 연결을 나타낸다.
도 5는 흡착제 선정을 위한 펄스 테스트 결과를 나타낸 것이다. 이때, (a)는 Amberchrom CG161C, (b)는 Amberlite CG71C, (c)는 DIAION SK1B, (d)는 Amberlite XAD-7HP에 대한 결과이다.
도 6은 Amberchrom CG161C 흡착제에 대한 계단식 프론탈 테스트의 결과를 나타낸 것이다. 이때, (a)는 이소류신, (b)는 류신, (c)는 발린에 대한 결과이다.
도 7은 Amberchrom CG161C 흡착제상에서의 흡착 평형 데이터(q vs. C)를 나타낸다. 이때, (a)는 발린, (b)는 류신, (c)는 이소류신에 대한 데이터이다.
도 8은 혼합물 프론탈 실험 데이터와 시뮬레이션 결과의 비교한 것이다. 이때, (a)는 류신, (b)는 이소류신, (c)는 발린에 대한 결과 비교이다.
도 9는 SMB 실험 결과로서, SMB 배출 포트를 통하여 나가는 유출 용액에 대한 HPLC 농도분석 결과를 나타낸 것이다. 이때, (a)는 라피네이트 농도분석 결과, (b)는 추출물 농도분석 결과이다.
도 10은 SMB 실험으로부터 얻은 샘플에 대한 HPLC raw data 크로마토그램이다. 이때, (a)는 분리대상 혼합물, (b)는 라피네이트, (c)는 추출물의 크로마토그램이다.
도 11은 SMB 실험 결과로서, 컬럼 프로파일(60.5 step)을 나타낸 것이다. 이때, 검은색 실선은 발린의 시뮬레이션 결과, 회색 실선은 이소류신의 시뮬레이션 결과, 검은색 점선은 류신의 시뮬레이션 결과, 녹색 원은 발린의 실험 결과, 적색 사각형은 이소류신의 실험 결과, 청색 다이아몬드는 류신의 실험 결과이다.
도 12는 Chromalite PCG-600 흡착제를 바탕으로 진행된 SMB 실험 결과로서, 라피네이트 포트를 통하여 나가는 유출 용액에 대한 HPLC 농도분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 Chromalite PCG-600 흡착제를 바탕으로 진행된 SMB 실험 결과로서, 추출물 포트를 통하여 나가는 유출 용액에 대한 HPLC 농도분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 Chromalite PCG-600 흡착제를 바탕으로 진행된 SMB 실험 결과로서, 컬럼 프로파일(44.5 step)을 나타낸 것이다. 이때, 파란색 실선은 발린의 시뮬레이션 결과, 빨간색 실선은 류신의 시뮬레이션 결과, 파란색 원은 발린의 실험 결과, 빨간색 세모는 류신의 실험 결과이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

접근방법: 발린 정제의 크로마토그래피 적용을 위한 탐색

1) Model-based design approach

새로운 분리 시스템에 대한 연속 공정을 개발할 때에 최우선적으로 고려되는 사항이 두 가지가 있다. 첫째는 개발기간 동안 소요되는 비용과 기간의 최소화이다. 둘째는 개발되는 공정의 최적 상태를 유지하여 최대의 생산성과 최대의 분리효율을 제공하는 조건이어야 한다. 이 두 가지 조건을 모두 다 충족시키기 위해서는 상세 모델(detailed model)에 기초한 흡착 및 물질전달 현상을 정확하게 파악하고 있어야 하고 아울러 관련된 여러 파라미터 값을 얻어야만 한다. 이러한 상세 모델 및 파라미터에 기초한 공정 설계의 접근 방법을 model-based design approach라고 한다. 본 발명 또한 이러한 접근 방법에 따라 발린의 연속적 분리를 수행하는 SMB 공정을 개발하였다.

2) 컴퓨터 시뮬레이션

Model-based design approach의 핵심적인 단계 중의 하나가 컴퓨터 시뮬레이션이다. 이는 컬럼 내 각 성분의 흡착 및 물질전달 현상들에 대한 상세 모델식을 수치 해석적 방법으로 풀어 그 해를 얻는 과정을 일컫는다. 이와 같은 수치 해석적 방법은 방대한 양의 계산량을 요구하므로 컴퓨터를 이용하여 수행하게 된다.

시뮬레이션에 사용되는 컬럼 모델식에는 여러 종류가 있는데 그 중에서 정확성과 효율성을 고려하여 lumped mass-transfer model(Kang, S.H. et al., Process Biochem., 2010, 45, 1468-1476)을 본 발명의 시뮬레이션 모델로 결정하였다. Lumped mass-transfer model에 기반을 둔 컴퓨터 시뮬레이션은 각 아미노산 성분들의 기초 파라미터의 측정과 검증뿐만 아니라 SMB 공정의 분리 효율 검증에도 활용되었다. 더 나아가 이 모델식은 SMB 최적화 전산 도구의 제작에도 사용하였다.

3) SMB 최적화 도구

Model-based design approach에서 컴퓨터 시뮬레이션에 이어 또 하나의 핵심적인 역할을 하는 것은 SMB 최적화 전산 도구이다. 이 도구는 개발될 SMB 공정의 최적 운전조건(optimal operating conditions)을 얻는 데에 사용된다. 이 최적화 도구의 제작을 위해 우선적으로 필요한 것이 최적화 알고리즘(optimization algorithm)이다. 현재까지 SMB와 같이 복잡한 형태의 공정 최적화에 있어서는 통계학적 이론(stochastic theory)에 입각한 유전자 알고리즘이 가장 효율적인 것으로 알려져 있다(Lee, K.B. et al., AIChE J., 2008, 54, 2852-2871).

본 발명에서도 발린의 연속분리 공정의 최적화를 위해 유전자 알고리즘에 기반을 둔 SMB 최적화 전산 프로그램을 구축하였다. 유전자 알고리즘 자체도 그동안 여러 차례의 발전을 거듭해 왔는데, 본 발명의 최적화 도구 제작 단계에서는 가장 최신의 유전자 알고리즘이라 할 수 있는 NSGA-II-JG 알고리즘(Lee, K.B. et al., AIChE J., 2008, 54, 2852-2871)을 기본 알고리즘으로 채택하였다.

SMB 최적화 도구의 제작 방법은 Excel 소프트웨어 내에 설치된 VBA(visual basic application) 언어를 이용하여 최적화 알고리즘을 코딩(coding)하였으며, 이를 통해 NSGA-II-JG 알고리즘과 상세 모델식의 계산이 동시에 수행되도록 하였다.

실험의 준비

1) 재료

분리대상 혼합물을 구성하는 세 아미노산 성분 중 발린과 류신은 Fluka에서 구입하였고 이소류신은 Sigma에서 구입하였다. 아미노산을 용해시키기 위하여 사용된 물은 3차 증류수(Distilled Deionized Water, DDW)로 Milli-Q system(Millipore)을 통하여 얻었다. 실험에 사용된 흡착제로는 Amberchrom CG161C(Rohm & haas), Amberlite CG71C(Sigma Aldrich), DIAION SK1B(Mitsubishi Chemical), Amberlite XAD-7HP(Sigma Aldrich)를 사용하였다. HPLC 농도분석에 사용된 메탄올은 Burdick & Jackson Co.(Muskegon, MI)에서 구입하였다.

흡착제 선정 실험 및 각 물질의 기초 파라미터 측정 실험에 사용된 유리 재질의 omnifit column은 Biochemical Fluidics Co.(Boonton, NJ)에서 구입하였으며 전자 실험의 경우 11.6 cm 길이와 1.5 cm 지름의 컬럼을 사용하였고 후자 실험의 경우에는 21.7 cm 길이와 2.5 cm 지름의 컬럼을 사용하였다.

2) 장치

- 단일컬럼 실험 장치

흡착제 선정 실험에는 Young-Lin SP930D pump와 Young-Lin UV730D detector가 사용되었다. 이 두 장치의 제어 및 데이터 처리는 Autochro-3000 소프트웨어에 의해 이루어졌다. 각 흡착제로 충진된 컬럼 내로 아미노산 펄스를 주입할 때에 사용된 injector는 Rheodyne 7725i injector이었으며 injection volume은 100 ㎕였다.

흡착제 선정이 완료된 후 수행된 각 아미노산의 기초 파라미터 측정실험에서는 FPLC P-920 pump와 Waters 486 UV detector, 그리고 Amersham FPLC collector (Frac-900)가 사용되었다. 각 세부 장치들의 제어와 데이터 수집은 Unicorn 5.1 소프트웨어를 통하여 이루어졌다.

- 발린의 연속적 분리를 위한 three-zone SMB 장치

도 4와 같은 장치를 자체 조립하여 사용하였다. 완성된 SMB 실험 장치의 탈착제 유량 속도와 분리대상 혼합물 유량 속도는 Young-Lin SP930D pump를 이용하여 각각 제어하였으며 라피네이트 유량 속도는 Ismatec MCP-CPF ISM 919 pump를 이용하여 제어하였다. 네 개의 포트가 주기적으로 이동하는 효과를 발생시키기 위해 ST Valco rotary valve(VICI, Houston, TX)를 사용하였다. 상기 ST valve의 작동 모식도를 도 4a 내지 4c에 나타내었다. 실험에 사용된 Valco rotary valve는 Labview 8.0 software를 통하여 자동 제어하였다.

- HPLC 농도 분석 장치

SMB 실험을 통하여 회수된 물질의 농도 측정을 위해 HPLC 농도분석 장치를 사용하였다. 분석용 컬럼으로는 Waters Symmetry C-18 column(250 × 4.6 mm ID, particle size 5 ㎛)이 사용되었다. HPLC 농도분석과 관련된 모든 데이터의 수집은 Waters Millennium software를 사용하여 처리하였다. Waters 515 HPLC pump를 이용하여 이동상의 유량 속도를 제어하였다. 농도분석을 위한 샘플은 Rheodyne 9725i injector를 이용하여 분석용 컬럼 내로 주입되었으며 주입량(injection volume)은 20 ㎕이었다. 시료의 검출은 Waters 996 PDA detector를 사용하였다.

발린의 프론탈 실험으로부터 얻어진 샘플의 농도 분석에서는 Young-Lin SP930D pump와 Young-Lin UV730D detector가 사용되었다. Young-Lin pump와 detector의 제어 및 데이터 처리는 Autochro-3000 소프트웨어를 통해 이루어졌다. 실험으로부터 얻어진 샘플은 Rheodyne 7725i injector를 사용하여 분석용 컬럼 내로 주입되었으며 주입량은 20 ㎕이었다.

실시예 1: 발린의 분리에 적합한 흡착제의 선정

1) 실험방법

발린으로부터 류신과 이소류신을 분리해 낼 가능성이 있는 네 종류의 상용 흡착제인 Amberchrom CG161C(Rohm & haas), Amberlite CG71C(Sigma Aldrich), DIAION SK1B(Mitsubishi Chemical), Amberlite XAD-7HP(Sigma Aldrich)를 사용하여 가장 적합한 흡착제를 선정하기 위한 실험을 일련의 펄스 테스트 방식으로 수행하였다.

상기 펄스 테스트 실험의 조건은 다음과 같았다. 세 아미노산 각각의 농도는 2 g/L이었으며 주입량은 100 ㎕로 하였다. 이동상의 유량은 2 ㎖/min이었다.

2) 실험결과

상기 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, Amberchrom CG161C 흡착제를 제외한 다른 흡착제의 경우 발린의 선택적 분리가 어렵다는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 발린을 분리하기 위한 SMB 공정의 구축에 Amberchrom CG161C 흡착제가 가장 적합하다는 것이 확인하였다.

실시예 2: Amberchrom CG161C 컬럼의 공극률 측정

1) 실험방법

상기 실시예 1에서 선정된 Amberchrom-CG161C 흡착제의 공극률을 측정하였다. 먼저, 상기 흡착제를 컬럼에 충진 후 inter-particle porosity(e_b)를 측정하는 실험을 수행하였다. 실시예 1과 동일한 방식으로 수행되었으나, 실시예 1과 달리 분리하고자 하는 분리대상 물질 대신 inter-particle porosity 측정에 적합한 추적자 분자를 컬럼 내로 주입하였다. 사용된 추적자 분자는 blue dextran이었으며 주입 농도는 1 g/L, 유량은 4 ㎖/min이며, 주입량은 500 ㎕로 하였다.

2) 실험결과

상기 실험결과, 컬럼의 입자간 공극률(inter-particle porosity)의 값은 0.391이었다. 또 하나의 중요한 정보인 입자내 공극률(intra-particle porosity)는 문헌에 보고되어 있는 값을 사용하였으며 이 값은 0.737이다(Nam, H.G. et al., Process Biochem ., 2011, 46, 2044-2053).

실시예 3: Amberchrom CG161C 상에서의 발린, 류신, 이소류신의 기초 파라미터 측정

- 흡착 계수 측정

1) 실험방법

분리대상 혼합물의 각 성분에 해당되는 발린, 류신, 이소류신의 기초 파라미터 측정을 위해 계단식 프론탈 테스트를 수행하였다. 계단식 프론탈 테스트(multiple frontal test)는, 분리하고자 하는 각 물질들에 대한 흡착 평형 데이터를 얻고 그 데이터를 바탕으로 흡착 모델식 규명 및 관련 흡착 파라미터를 결정하기 위하여 수행되는 실험이다.

구체적으로, 계단식 프론탈 테스트는 두 대의 펌프를 이용하였으며 그 중 하나의 펌프에는 DDW, 다른 펌프에는 발린, 류신 또는 이소류신 용액으로 채웠다. 그 후 컬럼 내 흡착제상과 이동상간의 평형이 이루어질 때까지 발린, 류신 또는 이소류신 용액을 컬럼 내부로 계속 주입하였다. 평형상태에서는 흡착제 입자와 입자 사이에서의 농도와 흡착제 내부의 농도가 모두 컬럼 내로 주입되는 발린, 류신 또는 이소류신 용액의 농도와 동일하게 유지되므로 간단한 물질수지식을 세워 흡착제상에서의 흡착농도를 바로 규명할 수 있게 된다. 컬럼 내부의 농도가 평형을 이룬 후 분리대상 혼합물 용액의 비율을 이전 단계보다 더 높여 새로운 평형상태를 유지하도록 하였다. 다시 이 평형상태에 대해 물질수지식을 세워 흡착제상에서의 흡착 농도를 계산하였다. 이와 같은 계단식 프론탈 테스트를 진행하면서 각 아미노산 성분에 대한 step time은 펄스 테스트의 결과로부터 얻은 체류시간의 2~3배로 결정하였다.

아울러 각 아미노산 성분에 대한 계단식 프론탈 실험은 총 5 계단으로 하였으며, step time으로 발린의 경우 40분, 류신은 70분, 이소류신은 70분으로 설정하였다. 또한 모든 시료의 농도는 5 g/L, 유량은 4 ㎖/min로 일정하게 유지하였다. 류신과 이소류신은 UV detector에서 205 nm, 218 nm의 파장으로 실험을 진행하였다. 반면, 발린의 경우에는 류신과 이소류신 실험에서와 같은 on-line monitoring 방식이 아닌 direct HPLC analysis 방식(컬럼 유출액을 일일이 채취하여 그 농도를 HPLC 장치를 이용하여 분석하는 방식)을 채택하였다. HPLC 분석 조건은 10% 메탄올 수용액을 이동상으로 사용하였으며, 주입량 20 ㎕, 유량은 0.5 ㎖/min으로 하였다. 분석 전에 표준 용액을 사용하여 자체 검량선(calibration curve)를 확보하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었고, 이를 바탕으로 흡착 평형 데이터를 산출하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.

2) 실험결과

도 7에 나타난 바와 같이, 발린, 류신, 이소류신 모두 Amberchrom CG161C상에서 선형 흡착 관계를 나타내었다. 따라서, 각 아미노산 성분을 선형 흡착 모델식으로 fitting하여 그로부터 선형흡착계수를 결정하였다. 결정된 흡착계수의 값들을 하기 표 1에 나타내었다.

- 물질 전달 계수 측정

1) 실험방법

흡착계수와 함께 또 하나의 중요한 기초 파라미터라 할 수 있는 물질전달계수를 하기와 같은 방법으로 결정하였다.

먼저, 축방향 분산계수(axial dispersion coefficient)와 경막 물질전달 계수(film mass-transfer coefficient)는 Chung & Wen correlation(Chung, S. F. et al., AIChE J., 1968, 14, 857-866)과 Wilson & Geankopolis correlation(Wilson, E. J. et al., Ind . Eng . Chem . Fundam ., 1966, 5, 9-14)을 이용하여 각각 예측하였고, 분자 확산성(molecular diffusivity)은 Wilke & Chang correlation(Wilke, C.R. et al., AIChE J.. 1955, 1, 264-270)을 이용하여 계산하였다. 아울러, 입자내 확산성(intra-particle diffusivity)은 프론탈 실험 데이터와 lumped mass-transfer model에 기반을 둔 시뮬레이션 결과를 서로 fitting 해 가면서 결정하였다.

2) 실험결과

상기 결정된 분자 확산성과 입자내 확산성의 값을 하기 표 1에 나타내었다.

	선형흡착계수	Intra-particle diffusivity (㎠/min)	Molecular diffusivity (㎠/min)
류신	5.527	5.40×10^-5	5.40×10^-4
이소류신	4.361	3.00×10^-4	4.35×10^-4
발린	0.926	3.00×10^-4	5.10×10^-4

상기에서 결정된 흡착 및 물질전달계수 값들의 적정성을 확인하기 위하여 이 값들을 대입한 모델 시뮬레이션 결과와 프론탈 실험 결과를 도 6과 같이 비교하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 시뮬레이션 결과와 실험 데이터가 잘 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기에서 결정된 기초 파라미터의 값이 추후 수행될 SMB 공정의 최적화에 충분히 활용될 수 있다.

실시예 4: 혼합물 프론탈 실험에 의한 기초 파라미터의 검증

1) 실험방법

상기 실시예 3에서 결정된 기초 파라미터 값의 검증을 위해 혼합물 프론탈 실험을 수행하였다. 이 실험에서는 상기 실시예 3과 달리 세 아미노산을 모두 포함하는 혼합물 용액을 분리대상 혼합물로 하여 프론탈 실험을 수행하였다.

아울러, 상기 실시예 3에서 결정된 기초 파라미터 값들과 혼합물 프론탈 실험 조건을 바탕으로 하여 모델 시뮬레이션을 수행하였다. 그리고 그 시뮬레이션 결과를 혼합물 프론탈 실험 데이터와 비교하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

2) 실험결과

도 8에 나타난 바와 같이, 실험 데이터와 시뮬레이션 결과가 잘 일치함을 확인할 수 있었다. 이는 상기 실시예 3에서 결정된 기초 파라미터 값들이 순수한 성분일 때만 아니라 혼합물 상태에서도 각 아미노산들의 컬럼 내 거동을 잘 설명해 줄 수 있다는 것을 의미한다. 나아가, 각 아미노산 간의 상호작용(interaction)이 거의 존재하지 않는다는 것을 의미한다.

실시예 5: 발린의 연속적 분리를 위한 공정의 최적화

최적화 과정에서 중점을 둔 사항은 목표 분리대상 물질인 발린의 고순도(high purity)와 고수율(high yield)을 보장하면서 발린의 생산성(productivity)을 극대화하는 것이다. 여기에서 발린의 생산성은 하기 식과 같이 정의된다.

- 발린의 생산성(Productivity) = Q_raf × C_raf _, _valine

(상기 식에서, Q_raf는 라피네이트 포트에서의 유량속도이며, C_raf _, _valine은 라피네이트 포트에서의 발린의 농도를 의미한다.)

발린의 생산성을 목적함수(objective function)로 설정하고, 발린의 순도와 수율은 제한조건(constraint)으로 설정하여 최적화 과정을 수행하였다. 구체적인 최적화 과정을 하기에 요약하였다.

Max J = Productivity [Q_feed, Q_raf, t_sw]

Subject to Valine purity = 98%

Valine yield = 98%

Fixed variables Q_des = 5 mL/min

C_feed for each component = 5 g/L

L_C = 21.7 cm, d_C = 2.5 cm

(상기 식에서, Q_feed와 Q_des는 각각 분리대상 혼합물 유량속도와 탈착제 유량속도를 각각 의미하며, t_sw는 스위칭 타임(switching time)을 의미한다.)

상기 식에 따라 본 발명의 three-zone SMB 장치를 사용한 발린 분리 공정을 최적화하기 위해 NSGA-II-JG 알고리즘에 기반을 둔 최적화 전산 프로그램을 자체 코딩하고, 상기 전산 프로그램을 Aspen simulator와 연결하여 해당 공정을 최적화 하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

Inlet and outlet flow rates (mL/min)	Q_feed	2.42
	Q_raf	2.71
	Q_ext	4.71
	Q_des	5.00
Zone flow rates (mL/min)	Q₁	5.00
	Q₂	7.42
	Q₃	4.71
Switching time (min)		21.33
Valine Purity (%)		98.0
Valine yield (%)		98.1

실시예 6: SMB 실험

상기에서 얻어진 데이터를 이용하여, 본 발명에 따른 발린의 연속적 분리 장치로 발린의 분리하여 이의 수율과 순도를 하기와 같이 측정하였다.

1) 실험방법

도 4에 도시된 바와 같은 장치와, 상기 실시예 5에서 도출한 최적화 조건을 사용하여 SMB 실험을 수행하였다. 컬럼은 Amberchrom CG161C을 사용하였다.

먼저, 실험을 시작하기 전에 컬럼의 연결부터 실시하였다. 이때 탈착제(물) 유량 속도를 2 ㎖/min으로 유지하고 다른 펌프의 작동을 중지시켰다. 각각의 밸브와 컬럼을 연결하였으며 이때 컬럼 내부로 공기가 들어가지 않도록 주의하였다. 컬럼의 모든 연결을 끝낸 후 탈착제 유량 속도를 목표치(target value)까지 증가시켰다. SMB 실험의 시작은 분리대상 혼합물 용액이 주입되는 시점부터이므로 분리대상 혼합물 펌프를 작동시키는 동시에 Labview 8.0 소프트웨어를 실행시켰다. Labview 8.0을 통하여 밸브의 switching과 switching time을 동시에 제어하였다.

SMB 실험은 주기적 정상 상태(cyclic steady state)에 충분히 도달될 때까지 진행하였다. 25번째 step 이후부터는 정상 상태에 도달됨을 확인하였다. 따라서 SMB 실험은 이보다 훨씬 더 많은 step인 60번째 step까지 진행하였다. SMB 실험이 진행되는 내내 매 step 마다 각 배출 포트에서 용출되는 용액의 농도를 HPLC 장치를 이용하여 분석하였다. 아울러 컬럼 프로파일의 확보를 위해 마지막 step에서 관련 샘플을 채취하였다. 이를 위해, SMB 실험이 60.5 step에 도달하였을 때에 구동되고 있는 모든 펌프들을 동시에 정지시켰다. 그리고 밸브와 연결되어 있는 컬럼의 아래 부분을 열어 컬럼에서 나오는 용액을 회수하여 그 농도를 분석하였다. HPLC 분석 조건은 10% 메탄올 수용액을 이동상으로 사용하였으며, 주입량 20 ㎕, 유량은 0.5 ㎖/min으로 하였다. 분석 전에 표준 용액을 사용하여 자체 검량선을 확보하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 10에서 (a)는 라피네이트 농도 분석 결과이고, (b)는 추출물 농도 분석 결과이다.

2) 실험결과

도 9a에 나타난 바와 같이, 라피네이트 용액 내 대부분의 성분이 발린이며 불순물에 해당되는 류신과 이소류신은 거의 존재하지 않음을 확인할 수 있었다. 이는 발린의 순도가 매우 높게 유지됨을 의미한다. 또한, 도 9b에 나타난 바와 같이, 추출물 농도 분석 결과에서 대부분의 성분이 류신과 이소류신이며, 검출되는 발린의 양은 무시할 만큼 적다는 것을 확인할 수 있었다. 이는 추출물 포트를 통한 발린의 손실이 매주 적다는 것을 의미한다.

또한, 상기 SMB 실험 진행과 함께 해당 SMB 공정에 대한 컴퓨터 시뮬레이션을 동시에 수행하였으며, 그 결과를 라피네이트와 추출물의 HPLC 농도분석 데이터와 직접 비교하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, 시뮬레이션 결과와 SMB 실험데이터가 잘 부합함을 알 수 있다.

상기와 같은 SMB 실험에 의해 분리된 발린의 최종 순도와 수율의 정량적 측정을 위해 마지막 여섯 step 동안 얻은 유출 용액을 동일한 비율로 섞은 다음 이 용액에 대해 HPLC 농도 분석을 실시하였다. 분석된 농도 데이터를 바탕으로 하여 발린의 순도와 수율을 계산하였으며 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

	실험	시뮬레이션
수율(%)	98.25	98.01
순도(%)	97.50	98.03

상기 표 3과 도 9의 결과로부터, 본 발명의 Amberchrom CG161C를 이용한 SMB 공정이 발린의 연속적 분리와 고순도(high purity) 및 고수율(high yield)의 보장에 있어 매우 우수하다는 것을 확인할 수 있었다. 이에 대한 실험적인 입증 데이터로서 도 10에 HPLC 농도분석 원본 크로마토그램(HPLC raw data)을 나타내었다.

먼저, 분리대상 혼합물 용액에 대한 HPLC raw data(도 10a)에서는 세 아미노산 성분 모두 큰 크기의 peak를 나타내고 있다. 발린의 생산 포트에 해당되는 라피네이트 포트 유출액에 대한 HPLC raw data(도 10b)에서는 발린 성분만이 큰 크기의 peak를 선명히 보이고 있고 반면 이소류신의 peak는 아주 작은 크기를 나타내고 있고 류신의 peak는 거의 발견되지 않았다. 불순물만 얻도록 설정된 추출물 포트 유출액에 대한 HPLC raw data(도 10c)에서는 발린 성분의 peak는 거의 무시할 만하고 반면 나머지 두 아미노산 성분들은 큰 크기의 peak를 나타내고 있다. 이와 같은 일련의 HPLC raw data를 통해 본 발명에서 수행된 발린의 연속분리 SMB 실험이 성공적으로 수행되었음을 재차 확인할 수 있었다.

상기에서 언급한 라피네이트와 추출물에서의 농도 그래프 이외에 컬럼 프로파일 데이터 또한 중요한 SMB 실험 데이터 중의 하나이다. 이러한 이유로 컬럼 프로파일 데이터 확보에 필요한 샘플들을 최종 switching period의 한 가운데 시간 즉 60.5 step에서 채취하였다. 그리고 그 샘플 농도들을 분석한 후 그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 11에서 볼 수 있듯이 컬럼 프로파일 데이터 또한 시뮬레이션 결과와 잘 일치함을 확인할 수 있다. 이는 컬럼 프로파일 데이터 또한 SMB 실험이 잘 이루어졌음을 증명하게 되는 것이다. 다시 말해서 SMB 컬럼 내 각 아미노산 성분의 solute wave들이 발린의 고순도 및 고수율 분리에 최대한 유리하도록 분포되었다는 사실이 실험적으로 검증된 것이라 할 수 있다.

따라서, 지금까지 언급한 모든 SMB 실험 데이터(outlet port에서의 농도 그래프, 컬럼 프로파일)들을 통해, 본 발명의 Amberchrom CG161C를 이용한 SMB 공정이 산업적 규모의 발린 연속 분리 과정에 충분히 적용 가능하다는 점을 알 수 있었다.

위에서 언급한 SMB 공정은 Amberchrom CG161C 흡착제를 바탕으로 하여 최적화되었고 아울러 실험적으로 검증되었다. 이 흡착제 이외에 발린 분리에 효과가 검증된 Chromalite PCG-600에 바탕을 둔 SMB 공정 또한 최적화를 수행해 보았으며 이에 대한 실험도 실시하였다, 그 결과 Chromalite PCG-600 흡착제도 SMB 공정에 적용 시 발린의 연속적 분리에 충분히 활용 가능하다는 점을 확인하였다.

실시예 7: 실제 발효혼합물에서의 실험

앞선 실험과 유사한 방법으로 실제 발효혼합물을 이용하여 실험하였다.

실제 발효혼합물 내 발린과 류신 성분의 기초파라미터(흡착 및 물질전달계수)를 측정하기 위해 발효혼합물 용액을 Chromalite PCG600C resin으로 충진된 단일컬럼(single column) 내로 주입하면서 컬럼 유출물의 농도를 시간에 따라 측정하는 mixture frontal 실험을 수행하였다.

상기 실험으로부터 얻은 농도 프로파일 데이터와 inverse method를 이용하여 발린과 류신의 기초파라미터들을 결정하였으며, 그 결과를 표 4에 제시하였다.

	Linear isotherm parameter	Intra-particle diffusivity (㎠/min)	Molecular diffusivity (㎠/min)
발린	0.6065	1.20×10^-5	5.10×10^-4
류신	3.925	1.75×10^-5	5.40×10^-4

상기 표 4에 제시된 기초파라미터를 바탕으로 실제 발효혼합물로부터의 발린과 류신을 연속적으로 분리하는 PCG600C-SMB 공정을 최적 설계하였다. 이 SMB 공정 또한 본 발명의 새로운 포트 배치 순서에 기반을 두었으며, column configuration은 도 3에 나타낸 바와 같이 three-zone 구조를 채택하였다.

이와 같은 PCG600C-SMB 공정의 최적화 과정에서 중점을 둔 사항은 발린의 고수율(high yield)과 류신의 고제거율(high removal efficiency)을 보장하면서 발린의 생산성(productivity)을 극대화하는 것이다. 이러한 최적화 목표를 달성하기 위해 발린의 생산성을 목적함수(objective function)로 설정하고, 발린의 수율과 류신의 제거율은 제한조건(constraint)으로 설정하여 최적화 과정을 수행하였다. 구체적인 최적화 과정을 아래에 요약하였다. Q_des는 발린의 순도 및 수율을 증가시킬 수 있는 범위 내에서 조절된 값이다.

Max J = Productivity [Q_feed, Q_raf, t_sw]

Subject to Valine yield = 97%

Leucine removal efficiency = 90%

Fixed variables Q_des = 6 mL/min

L_C = 21.7 cm, d_C = 2.5 cm

Column configuration = 1 - 1 - 2

(상기 식에서 Q_feed와 Q_des는 각각 분리대상 혼합물 유량속도와 탈착제 유량속도를 의미하며, t_sw는 스위칭 타임(switching time)을 의미한다.)

상기 식에 따른 PCG600C-SMB 공정의 최적화 수행을 위해 NSGA-II-JG 알고리즘에 기반을 둔 최적화 전산 프로그램을 자체 코딩하고, 상기 전산 프로그램을 Aspen simulator와 연결하여 해당 공정을 최적화 하였다. 최적화 결과를 표 5에 제시하였다.

Inlet and outlet flow rates (mL/min)	Q_feed	3.27
	Q_raf	3.93
	Q_ext	5.34
	Q_des	6.00
Zone flow rates (mL/min)	Q₁	6.00
	Q₂	9.27
	Q₃	5.34
Switching time (min)		17.85

표 5의 최적화 결과를 실험적으로 검증하기 위해 PCG600C-SMB 공정 장치를 자체 조립하였다, 조립한 공정 장치의 모식도를 도 4에 제시하였다.

표 2의 최적화 결과와 도 4의 공정장치를 이용하여 실제 발효혼합물을 대상으로 하는 발린 분리 SMB 실험을 수행하였다. 이 실험에서 사용된 실제 발효혼합물 내 발린과 류신의 농도는 각각 71.8 g/L 과 0.742 g/L 이었다.

실제 발효혼합물을 대상으로 하는 발린 분리 SMB 실험의 결과를 도 12 내지 도 14에 나타내었다. 도 12의 raffinate effluent history 결과에 나타난 바와 같이, 발린의 고농도 회수가 시뮬레이션에서 예측한 수준대로 잘 이루어지고 있고 류신의 유출 농도 수준은 무시할 만큼 적었다. 도 13의 extract effluent history 결과에서 나타난 바와 같이, 류신이 시뮬레이션에서 예측한 수준대로 잘 제거되고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, extract port를 통한 발린의 손실은 매우 적음을 확인할 수 있다. 이와 같은 실험결과는 PCG600C-SMB 공정에 의한 발린과 류신의 연속적 분리에 있어 발린의 고수율과 류신의 고제거율이 충분히 보장될 수 있음을 의미하는 것이다.

도 12와 도 13의 effluent history 결과와 함께, 도 14의 컬럼프로파일 결과 또한 발린과 류신의 연속적 분리가 성공적으로 수행되고 있음을 잘 보여주고 있다. 도 14에 나타난 바와 같이, 각 컬럼 내 발린과 류신의 농도 분포가 발린의 고수율 회수와 류신의 고제거율 보장에 매우 유리하게 되어 있음을 확인할 수 있다. 이와 같은 결과로 실제 발효혼합물 내 발린의 99.7 %를 raffinate port를 통해서 회수할 수 있었고 그와 동시에 류신의 98.0 %를 extract port를 통해 제거할 수 있었다.

D: 탈착제 포트 F: 분리대상 혼합물 포트
R: 라피네이트 포트 E: 추출물 포트
10, 20, 30: 로터리 밸브
40, 50, 60: 크로마토그라피 구간
10a, 10b, 10c, 20a, 20b, 20c, 30a, 30b, 30c: 연결 포트

Claims

탈착제 포트(D);
분리대상 혼합물 포트(F);
라피네이트 포트(R);
추출물 포트(E);
상기 포트들(D, F, R, E)과 각각 선택적으로 연결되는 다수의 로터리 밸브(10, 20, 30); 및
상기 다수의 로터리 밸브(10, 20, 30)마다 각각 구비된 다수의 크로마토그라피 구간(40, 50, 60)을 포함하고,
상기 다수의 로터리 밸브(10, 20, 30)는 상호 연결되고,
상기 다수의 로터리 밸브(10, 20, 30)는 각각 다수의 연결 포트(10a, 10b, 10c)(20a, 20b, 20c)(30a, 30b, 30c)를 구비하며, 그리고
상기 다수의 로터리 밸브(10, 20, 30)가 회전함에 따라, 상기 다수의 연결 포트(10a, 10b, 10c)(20a, 20b, 20c)(30a, 30b, 30c) 중 어느 하나만 개방되고, 이에 따라 상기 포트들(D, F, R, E) 각각에 선택적으로 연결되는 어느 하나의 로터리 밸브(10, 20, 30)가 변경되는 것을 특징으로 하는,
발린의 연속적 분리 장치.
제1항에 있어서,
상기 다수의 로터리 밸브(10, 20, 30)는 소정의 시간 이후 회전하며,
상기 다수의 로터리 밸브(10, 20, 30)의 회전에 따라, 상기 포트들(D, F, R, E)에 연결되는 로터리 밸브(10, 20, 30)가 변경되는 것을 특징으로 하는,
발린의 연속적 분리 장치.
제2항에 있어서,
상기 다수의 로터리 밸브(10, 20, 30)는 상기 소정의 시간 이후 회전에 따라 제 1, 2 및 3 위치를 순환하도록 연속적으로 변경되며,
상기 제 1 위치에서 제 1 연결 포트(10a, 20a, 30a)가 개방되고,
상기 제 2 위치에서 제 2 연결 포트(10b, 20b, 30b)가 개방되며, 그리고
상기 제 3 위치에서 제 3 연결 포트(10c, 20c, 30c)가 개방되는 것을 특징으로 하는,
발린의 연속적 분리 장치.
제3항에 있어서,
상기 제 1 위치에서,
상기 탈착제 포트(D)는 제 1 로터리 밸브(10)의 제 1 연결 포트(10a)를 통해 제 1 크로마토그라피 구간(40)과 유체 소통하며,
상기 분리대상 혼합물 포트(F)는 제 2 로터리 밸브(20)의 제 2 연결 포트(20a)를 통해 제 2 크로마토그라피 구간(50)과 유체 소통하며,
상기 제 2 크로마토그라피 구간(50)은 제 3 로터리 밸브(30)의 제 3 연결 포트(30a)를 통해 상기 라피네이트 포트(R)와 유체 소통하며, 그리고
상기 추출물 포트(E)는 제 1 로터리 밸브(10)의 제 1 연결 포트(10a)를 통하여 제 3 크로마토그라피 구간(60)과 유체 소통하는 것을 특징으로 하는,
발린의 연속적 분리 장치.
제4항에 있어서,
상기 제 1 위치에서 상기 분리대상 혼합물 포트(F)를 통하여 유입된 분리대상 혼합물은 상기 제 2 크로마토그라피 구간(50)을 통과함에 따라 발린과 나머지 물질로 분리되며,
상기 제 1 위치에서 분리된 상기 발린은 상기 제 3 로터리 밸브(30)로 유입되어 상기 라피네이트 포트(R)를 통해 유출되고,
상기 제 1 위치에서 분리된 상기 나머지 물질은 상기 제 1 로터리 밸브(10)로 유입되어 상기 추출물 포트(E)를 통해 유출되는 것을 특징으로 하는,
발린의 연속적 분리 장치.
제5항에 있어서,
상기 소정의 시간은 상기 분리대상 혼합물에서 분리된 상기 발린이 상기 제 3 로터리 밸브(30)로 유입되지만, 상기 나머지 물질이 상기 제 3 로터리 밸브(30)에 유입되지 않는 시간인 것을 특징으로 하는,
발린의 연속적 분리 장치.
제6항에 있어서,
상기 로터리 밸브(10, 20, 30)가 상기 제 1 위치에서 상기 제 2 위치로 회전하면, 상기 분리대상 혼합물 포트(F)를 통하여 유입된 분리대상 혼합물은 상기 제 3 크로마토그라피 구간(60)을 통과함에 따라 발린과 나머지 물질로 분리되며,
상기 제 2 위치에서 분리된 상기 발린은 상기 제 1 로터리 밸브(10)로 유입되어 상기 라피네이트 포트(R)를 통해 유출되고,
상기 제 2 위치에서 분리된 상기 나머지 물질은 상기 제 1 위치에서 분리된 나머지 물질과 함께 상기 제 2 로터리 밸브(20)로 유입되어 상기 추출물 포트(E)를 통해 유출되는 것을 특징으로 하는,
발린의 연속적 분리 장치.
제1항에 있어서,
상기 다수의 로터리 밸브(10, 20, 30)는 연속적으로 회전함으로써 제 1, 2, 및 3 위치에서 교번적으로 변경되며, 그리고
상기 제 1, 2, 및 3 위치에서 상기 상기 포트들(D, F, R, E)이 연결되는 상기 로터리 밸브는 각각 상이한 것을 특징으로 하는,
발린의 연속적 분리 장치.
제8항에 있어서,
상기 분리대상 혼합물 포트(F)를 통해 유입된 분리대상 혼합물은 발린과 나머지 물질로 분리되며, 그리고
상기 다수의 로터리 밸브(10, 20, 30)가 위치를 변경하는 회전 간격은, 상기 발린은 어느 하나의 로터리 밸브에서 다른 하나의 로터리 밸브로 이동하되 상기 나머지 물질은 이동하지 않는 시간인 것을 특징으로 하는,
발린의 연속적 분리 장치.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 발린의 연속적 분리 장치를 이용하여 발린을 연속적으로 분리하는 방법에 있어서,
상기 탈착제 포트로 탈착제를 유입하고, 상기 분리대상 혼합물 포트로 발린을 포함하는 혼합물을 유입하고, 상기 라피네이트 포트로부터 발린을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발린의 연속적 분리방법.
제10항에 있어서, 상기 탈착제는 물인 것을 특징으로 하는 발린의 연속적 분리방법.
제10항에 있어서, 상기 회수된 발린의 순도는 90% 내지 99%인 것을 특징으로 하는 발린의 연속적 분리방법.