JP2015506958A - バリンの連続分離のための装置及びそれを用いたバリンの連続分離方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、擬似移動層クロマトグラフィー工程を行う装置により、ロイシンやイソロイシンなどのアミノ酸を含む混合物から高純度及び高収率でバリンを連続して分離することができる。
1)モデルベースデザインアプローチ
新たな分離システムにおける連続工程を開発する上で最優先で考慮すべき事項が2つある。まず、開発期間中に要する費用と期間の最小化である。次に、開発される工程の最適状態が維持され、最大の生産性と最大の分離効率が得られる条件でなければならない。これら2つの条件をどちらも満たすためには、詳細モデル(detailed model)に基づく吸着及び物質伝達現象を正確に把握しなければならず、また、関連する様々なパラメータ値を得なければならない。このような詳細モデル及びパラメータに基づく工程設計のアプローチ方法をモデルベースデザインアプローチ(model-based design approach)という。本発明においても、このようなアプローチ方法によりバリンの連続分離を行うSMB工程を開発した。
モデルベースデザインアプローチの核心となる段階の1つがコンピュータシミュレーションである。これは、カラム内の各成分の吸着及び物質伝達現象に対する詳細モデル式を数値解析的方法で解いてその解を得る過程をいう。このような数値解析的方法は膨大な計算量を要するので、コンピュータを用いて行う。
モデルベースデザインアプローチにおいてコンピュータシミュレーションと共に核心的な役割を果たすものとしてSMB最適化ツールがある。このツールは、開発されるSMB工程の最適運転条件を得るために用いられる。この最適化ツールの製作のために優先的に必要なのが最適化アルゴリズムである。現在まで、SMBなどの複雑な形態の工程最適化においては、統計学的理論に立脚した遺伝子アルゴリズムが最も効率的であることが知られている(非特許文献2)。
1)材料
分離対象混合物を構成する3つのアミノ酸成分のうち、バリンとロイシンはFlukaから購入し、イソロイシンはSigmaから購入した。アミノ酸を溶解するために用いた水は3次脱イオン蒸留水(Distilled Deionized Water, DDW)であり、Milli−Q system(Millipore)により得た。実験に用いた吸着剤は、Amberchrom CG161C(Rohm & haas)、Amberlite CG71C(Sigma Aldrich)、DIAION SK1B(Mitsubishi Chemical)、Amberlite XAD−7HP(Sigma Aldrich)である。HPLC濃度分析に用いたメタノールは、Burdick & Jackson Co.(Muskegon, MI)から購入した。
シングルカラム実験装置
吸着剤の選定実験には、Young−Lin SP930DポンプとYoung−Lin UV730D検出器を用いた。この2つの装置の制御及びデータ処理は、Autochro−3000ソフトウェアにより行った。各吸着剤で充填されたカラム内にアミノ酸パルスを注入する際に用いたインジェクターはRheodyne 7725iインジェクターであり、注入量は100μlとした。
図4に示す装置を自主的に組み立てて用いた。完成したSMB実験装置における脱着剤の流量速度と分離対象混合物の流量速度はYoung−Lin SP930Dポンプを用いてそれぞれ制御し、ラフィネート流量速度はIsmatec MCP−CPF ISM 919ポンプを用いて制御した。4つのポートが周期的に移動する効果を得るために、ST Valco ロータリーバルブ(VICI, Houston, TX)を用いた。図4a〜図4cは前記ST valveの作動模式図である。実験に用いたValco ロータリーバルブはLabview 8.0 ソフトウェアにより自動制御した。
SMB実験により回収された物質の濃度測定のためにHPLC濃度分析装置を用いた。分析用カラムとしては、Waters Symmetry C−18 カラム(250×4.6mmID, particle size 5μm)を用いた。HPLC濃度分析に関する全てのデータの収集は、Waters Millenniumソフトウェアを用いて処理した。Waters 515 HPLCポンプを用いて移動相の流量速度を制御した。濃度分析のためのサンプルは、Rheodyne 9725iインジェクターを用いて分析用カラム内に注入し、注入量は20μlとした。試料の検出はWaters 996 PDA検出器を用いた。
1)実験方法
バリンからロイシンとイソロイシンを分離する可能性のある4種類の通常の吸着剤、例えば、Amberchrom CG161C(Rohm & haas)、Amberlite CG71C(Sigma Aldrich)、DIAION SK1B(Mitsubishi Chemical)、Amberlite XAD−7HP(Sigma Aldrich)を用いて、最も適する吸着剤を選定するための実験を一連のパルステスト方式で行った。
上記結果を図5に示す。図5に示すように、Amberchrom CG161C吸着剤を除く他の吸着剤は、バリンの選択的分離が難しいことが確認された。上記結果から、バリンを分離するためのSMB工程の構築には、Amberchrom CG161C吸着剤が最も適することが確認された。
1)実験方法
前記実施例1で選定したAmberchrom−CG161C吸着剤の空隙率を測定した。まず、前記吸着剤をカラムに充填し、その後粒子間空隙率(inter-particle porosity)(eb)を測定する実験を行った。実施例1と同様の方式で行ったが、実施例1とは異なり、分離しようとする分離対象物質の代わりに粒子間空隙率の測定に適したトレーサー分子をカラム内に注入した。用いたトレーサー分子はブルーデキストランであり、注入濃度は1g/Lとし、流量は4ml/分とし、注入量は500μlとした。
上記実験の結果、カラムの粒子間空隙率の値は0.391であった。重要な情報の一つである粒子内空隙率は文献に報告されている値を用いたが、この値は0.737である(非特許文献3)。
吸着係数の測定
1)実験方法
分離対象混合物の各成分に該当するバリン、ロイシン、イソロイシンの基礎パラメータの測定のために階段式フロンタルテスト(multiple frontal test)を行った。階段式フロンタルテストは、分離しようとする各物質の吸着平衡データを得て、そのデータに基づいて吸着モデル式を作成すると共に関連吸着パラメータを決定するために行われる実験である。
図7に示すように、バリン、ロイシン、イソロイシンの全てがAmberchrom CG161C相で線形吸着関係を示す。よって、各アミノ酸成分を線形吸着モデル式にフィッティングし、そこから線形吸着係数を決定した。決定した吸着係数の値を下記表1に示す。
1)実験方法
吸着係数と共にもう一つの重要な基礎パラメータといえる物質伝達係数を下記の方法で決定した。
前述したように決定された分子拡散率と粒子内拡散率の値を下記表1に示す。
1)実験方法
前記実施例3で決定された基礎パラメータ値の検証のために、混合物フロンタル実験を行った。この実験においては、実施例3とは異なり、3つのアミノ酸を全て含む混合物溶液を分離対象混合物として用いてフロンタル実験を行った。
図8に示すように、実験データとシミュレーション結果が一致することが確認された。これは、実施例3で決定された基礎パラメータ値は、純粋な成分のときだけでなく、混合物状態においても、各アミノ酸のカラム内の挙動を説明することができることを意味する。また、各アミノ酸間の相互作用がほとんどないことを意味する。
最適化過程で重点を置いたのは、目標分離対象物質であるバリンの高純度と高収率を保持しつつバリンの生産性を最大化することである。ここで、バリンの生産性は下記式のように定義される。
バリンの生産性(Productivity)=Qraf×Craf,valine
(上記式において、Qrafはラフィネートポートにおける流量速度を意味し、Craf,valineはラフィネートポートにおけるバリンの濃度を意味する。)
Subject to Valine purity=98%
Valine yield=98%
Fixed variables Qdes=5mL/分
Cfeed for each component=5g/L
LC=21.7cm,dC=2.5cm
(上記式において、QfeedとQdesは分離対象混合物の流量速度と脱着剤の流量速度をそれぞれ意味し、tswはスイッチングタイムを意味する。)
こうして得られたデータを用いて、本発明によるバリンの連続分離装置でバリンを分離し、その収率と純度を次のように測定した。
図4に示す装置と、前記実施例5で得られた最適化条件を用いてSMB実験を行った。カラムはAmberchrom CG161Cを用いた。
図9の(a)に示すように、ラフィネート溶液内のほとんどの成分がバリンであり、不純物に該当するロイシンとイソロイシンはほとんど存在しないことが確認された。これは、バリンの純度が非常に高く維持されていることを意味する。また、図9の(b)に示すように、抽出物濃度分析の結果においてほとんどの成分がロイシンとイソロイシンであり、検出されたバリンの量は無視できるほど少ないことが確認された。これは、抽出物ポートにおけるバリンの損失が非常に少ないことを意味する。
上記実験と同様の方法で実際の発酵混合物を用いて実験を行った。
Subject to Valine yield=97%
Leucine removal efficiency=90%
Fixed variables Qdes=6mL/分
LC=21.7cm,dC=2.5cm
Column configuration=1−1−2
(上記式において、QfeedとQdesは分離対象混合物の流量速度と脱着剤の流量速度をそれぞれ意味し、tswはスイッチングタイムを意味する。)
F:フィードポート
R:ラフィネートポート
F:抽出物ポート
10,20,30:ロータリーバルブ
40,50,60:クロマトグラフィーゾーン
10a,10b,10c,20a,20b,20c,30a,30b,30c:連結ポート
Claims (12)
- 脱着剤ポートDと、
フィードポートFと、
ラフィネートポートRと、
抽出物ポートEと、
前記ポート(D、F、R、E)とそれぞれ選択的に連結される複数のロータリーバルブ(10、20、30)と、
前記複数のロータリーバルブ(10、20、30)毎にそれぞれ備えられた複数のクロマトグラフィーゾーン(40、50、60)とを含み、
前記複数のロータリーバルブ(10、20、30)は互いに連結され、
前記複数のロータリーバルブ(10、20、30)は、それぞれ複数の連結ポート(10a、10b、10c)、(20a、20b、20c)、(30a、30b、30c)を備え、
前記複数のロータリーバルブ(10、20、30)が回転することにより、前記複数の連結ポート(10a、10b、10c)、(20a、20b、20c)、(30a、30b、30c)のいずれか1つのみ開放され、それに応じて前記ポート(D、F、R、E)のそれぞれに選択的に連結されるいずれか1つのロータリーバルブ(10、20、30)が切り替えらえることを特徴とするバリンの連続分離装置。 - 前記複数のロータリーバルブ(10、20、30)は、所定時間が経過すると回転し、
前記複数のロータリーバルブ(10、20、30)の回転により、前記ポート(D、F、R、E)に連結されるロータリーバルブ(10、20、30)が切り替えられることを特徴とする請求項1に記載のバリンの連続分離装置。 - 前記複数のロータリーバルブ(10、20、30)は、前記所定時間後の回転により第1、第2及び第3位置を循環するように連続して切り替えられ、
前記第1位置では、第1連結ポート(10a、20a、30a)が開放され、
前記第2位置では、第2連結ポート(10b、20b、30b)が開放され、
前記第3位置では、第3連結ポート(10c、20c、30c)が開放されることを特徴とする請求項2に記載のバリンの連続分離装置。 - 前記第1位置では、
前記脱着剤ポート脱着剤ポートDが第1ロータリーバルブ10の第1連結ポート10aを通過して第1クロマトグラフィーゾーン40に連通し、
前記フィードポートFが第2ロータリーバルブ20の第2連結ポート20aを通過して第2クロマトグラフィーゾーン50に連通し、
前記ラフィネートポートRが第3ロータリーバルブ30の第3連結ポート30aを通過して第3クロマトグラフィーゾーン60に連通し、
前記抽出物ポートEが第1ロータリーバルブ10の第1連結ポート10aを通過することを特徴とする請求項3に記載のバリンの連続分離装置。 - 前記第1位置で前記フィードポートFから流入した分離対象混合物は、前記第2クロマトグラフィーゾーン50を通過することによりバリンとその他の物質に分離され、
前記第1位置で分離された前記バリンは、前記第3ロータリーバルブ30に流入して前記ラフィネートポートRから流出し、
前記第1位置で分離された前記その他の物質は、前記第1ロータリーバルブ10に流入して前記抽出物ポートEから流出することを特徴とする請求項4に記載のバリンの連続分離装置。 - 前記所定時間は、前記分離対象混合物から分離された前記バリンが前記第3ロータリーバルブ30に流入し、前記その他の物質が前記第3ロータリーバルブ30に流入しない時間であることを特徴とする請求項5に記載のバリンの連続分離装置。
- 前記ロータリーバルブ(10、20、30)が前記第1位置から前記第2位置に回転すると、前記フィードポートFから流入した分離対象混合物は、前記第3クロマトグラフィーゾーン60を通過することによりバリンとその他の物質に分離され、
前記第2位置で分離された前記バリンは、前記第1ロータリーバルブ10に流入して前記ラフィネートポートRから流出し、
前記第2位置で分離された前記その他の物質は、前記第1位置で分離されたその他の物質と共に前記第2ロータリーバルブ10に流入し、前記抽出物ポートEから流出することを特徴とする請求項6に記載のバリンの連続分離装置。 - 前記複数のロータリーバルブ(10、20、30)は、連続して回転することにより第1、第2及び第3位置に交互に切り替えられ、
前記第1、第2及び第3位置で前記ポート(D、F、R、E)が連結される前記ロータリーバルブはそれぞれ異なることを特徴とする請求項1に記載のバリンの連続分離装置。 - 前記フィードポートFから流入した分離対象混合物は、バリンとその他の物質に分離され、
前記複数のロータリーバルブ(10、20、30)が位置を切り替える回転間隔が、前記バリンはいずれか1つのロータリーバルブから他のロータリーバルブに移動し、前記その他の物質は移動していない時間であることを特徴とする請求項8に記載のバリンの連続分離装置。 - 請求項1〜9のいずれか一項に記載のバリンの連続分離装置を用いてバリンを連続分離する方法において、
前記脱着剤ポートに脱着剤を注入し、前記フィードポートにバリンを含む混合物を流入して前記フラフィネートポートからバリンを回収する工程を含むことを特徴とするバリンの連続分離方法。 - 前記脱着剤が水であることを特徴とする請求項10に記載のバリンの連続分離方法。
- 前記回収されたバリンの純度が90%〜99%であることを特徴とするバリンの連続分離方法。
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