KR20130077308A

KR20130077308A - 유기용매를 사용하지 않는 생분해성 폴리락트산 유도체 미립구 제조방법

Info

Publication number: KR20130077308A
Application number: KR1020110145945A
Authority: KR
Inventors: 조중웅; 이상준; 김경해; 서민효
Original assignee: 주식회사 삼양바이오팜
Priority date: 2011-12-29
Filing date: 2011-12-29
Publication date: 2013-07-09
Also published as: KR101541822B1

Abstract

유기용매를 사용하지 않는 생분해성 폴리락트산 고분자와 다가 금속을 포함하는 단백질 및 펩타이드 함유 고분자 미립구 제조방법이 개시된다. 상기 제조방법에 의해 제조한 미립구는 표면이 다공성이 없는 일정한 크기의 구형 고분자 미립구로서 상기 제조방법을 통해 초기방출의 억제 및 주사의 편이성 증대가 가능하다.

Description

유기용매를 사용하지 않는 생분해성 폴리락트산 유도체 미립구 제조방법{Method for the preparation of microspheres of biodegradable polylactic acid derivative with no use of organic solvents}

본 발명은 수용성 폴리락트산 고분자 유도체의 미립구를 제조하는 방법에 관한 것으로, 유기용매 대신 물을 용매로 사용하는 것을 특징으로 하며, 단백질 및/또는 펩타이드 등의 수용성 약물을 변성 없이 미립구 내부에 봉입 가능하다는 이점을 갖는다.

생명공학 분야의 비약적인 발전으로 단백질 및 펩타이드의 기능과 역할이 밝혀지고 있으며, 이들의 대량생산이 가능하게 됨으로써, 여러 약물들이 상용화 되었으며 신약개발을 위한 노력이 계속되고 있다.

단백질 및 펩타이드는 경구로 투여할 경우에 장벽의 통과가 어렵고 소화관 내에서 쉽게 변성되거나 효소에 의해 분해되기 때문에 생체 이용률이 매우 낮아서 주사제의 형태로 개발되고 있는데, 잦은 투여로 인한 환자의 불편함을 해소하기 위하여, 1회 투여로 장기간 약효가 지속되는 서방형 제제를 개발하기 위한 다양한 방법들이 시도되고 있다. 이러한 시도들은 하기 문헌에 잘 정리되어 있다. (Khaled Al-Tahami et. al., "Smart Polymer Based Delivery Systems for Peptides and Proteins", Recent Patents on Drug Delivery & Formulation 2007, vol. 1, No. 1, pp. 65-71, 2007; Fei Wu et. al., "Polymer-Based Sustained-Release Dosage Forms for Protein Drugs, Challenges, and Recent Advances", AAPS PharmSciTech, vol. 9, No. 4, pp. 1218-1229, 2008)

상용화된 서방형 단백질 제제로서 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 단백질을 접합(conjugation)한 PEGylation 기술을 Interferon (PEGasys

, PEGintron

), GCSF (Neulasta

), Asparaginase (Oncaspar

), Adenosine deaminase (Adagen

) 등에 적용한 제품들이 있는데, 이들은 분자량 5,000 내지 50,000의 PEG와 단백질의 접합체로서, 단백질 자체가 아닌 새로운 물질이기 때문에 다른 단백질에 응용하기 위해서는 생물학적 안전성 및 유효성의 검증이 필수적으로 요구되고, 생산에 있어서 고가의 비용이 소요되는 단점이 지적되고 있다.

생분해성 고분자인 폴리락트산 또는 폴리락트산-글리콜릭산 고분자를 이용하여 현재까지 개발된 서방형 제제는, Leuprolide acetate (Lupron

Depot), Octreotide (Sandostatin

), Goserelin acetate (Zoladex

), Triptorelin Pamoate (Trelatar

Depot) 등의 펩타이드 약물에 대하여 효과적인 전달체로서 상용화되었지만, 단백질 약물로서는 유일하게 US FDA의 승인을 취득한 인간 성장호르몬의 서방형 제형(Nutropin

Depot)이 매일 투여하는 제형에 비해 효과가 미흡하여 2004년 시장에서 완전히 철수하였다. 이와 같이, 폴리락트산 또는 폴리락트산-글리콜릭산 고분자 미립자를 이용한 제형은, 여전히 초기 과다 방출 및 미흡한 지속 방출 효과 등 서방형 제제로서의 해결해야 할 과제를 안고 있다. 또한, 제조 공정 중의 약물의 변성 및 과다한 약물 손실로 인한 제조 원가의 상승 등 경제적인 요인도 문제점으로 지적되고 있다.

현재까지 고분자 미립구(microsphere)나 마이크로파티클(microparticle)을 이용하여 서방형제제를 제조하는 방법은 유기용매인 메틸렌클로라이드나 클로로포름 등을 이용하여 고분자를 녹이는 방법을 이용하였다. 유기용매를 이용하는 제조방법은 화학물질인 경우에는 특별한 문제가 발생하지 않지만, 수용성이고 특정한 상태에서 안정한 상태를 유지하는 단백질 이나 펩타이드를 이용할 경우 이들 약물의 안정성에 매우 심각한 영향을 미친다.

한편 수용성의 저분자량 폴리락트산 유도체와 단백질이나 펩타이드를 수용액내에 함께 녹여서 고분자와 약물을 혼합하고 금속이온을 가하여 복합체를 형성하여 건조하면 체내 투여시 서방형 방출을 보이는 고분자 입자를 제조할 수 있다고 알려져 있다 (PCT/KR2010/009421). 하지만 유기용매를 사용하여 제조한 고분자 미립자에 비하여 수용액으로 제조한 고분자 미립자는 입자의 표면이 거칠고 균일하지 못하며 입자 내부에 많은 다공성을 갖고 있어서 비교적 짧은 약물의 방출을 보이고 초기 과다방출이란 문제점을 가지고 있다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고자 고안된 것으로, 본 발명의 일례는 유기용매를 사용하지 않고 표면이 매끄럽고 균일하며, 입자 내부에 다공도가 낮아 초기 과다 방출 문제가 없고, 약물의 지속 방출성이 우수하며, 독성이 없는 생본해성 고분자 미립구의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

다른 예는 이와 같이 제조된 고분자 미립구를 제공한다.

이에 유기용매를 사용하지 않고 수용액 내에서 제조된 고분자 미립자를 구형의 고분자 미립구로 변화시킬 수 있는 방법을 연구하던 중 본 발명을 완성하였다.

우선, 본 발명의 일례는 유기용매를 사용하지 않는 것을 특징으로 하는 생분해성 고분자 미립구의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 제조 방법은

a) 수용성 저분자량 폴리락트산 유도체 수용액에 약물을 혼합하여 약물 함유 고분자 수용액을 제조하는 단계;

b) 상기 약물 함유 고분자 수용액을 다가 금속염, 예컨대, Ca² ⁺, Mg² ⁺, Zn² ⁺, Fe²⁺ 등의 2가 금속염의 수용액에 첨가하여 약물 함유 고분자를 침전시키는 단계;

c) 상기 침전된 약물 함유 고분자를 건조시킨 후 분쇄하여 1 내지 150um 크기의 미세입자를 제조하는 단계;

d) 상기 미세입자를 폴리비닐알코올 수용액, 예컨대, 0.1 내지 5%(w/v) 폴리비닐알코올 수용액에 현탁 시킨 후 교반하는 단계 (상기 교반은 30℃ 이상 80℃ 미만 온도에서 1 내지 10분간 50 내지 2000rpm의 속도로 수행될 수 있음); 및

e) 상기 얻어진 혼합물을 예컨대 20℃ 이하로 냉각시켜 생성된 미립구를 분리하고 필요한 경우 건조하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제조 방법은 유기용매를 사용하지 않으며, 표면이 매끄럽고 균일하며, 입자 내부에 다공도가 낮아 초기 과다 방출 문제가 없고, 약물의 지속 방출성이 우수하며, 독성이 없는, 약물 전달용 생분해성 고분자 미립구를 제조하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 예에서, 상기 제조 방법에 의하여 제조되고,

i) 약물, 예컨대, 단백질 또는 폴리펩타이드;

ii) 수용성 저분자량 폴리락트산 유도체; 및

iii) 다가 금속, 예컨대, 2가 금속

을 포함하며,

평균 직경이 1 내지 150um이고,

크기가 균일하며, 표면이 매끄럽고, 구형인 것을 특징으로 하는,

약물 전달용 고분자 미립구 및 상기 고분자 미립구를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다:

상기 고분자 미립구에 함유된 약물은 단백질 및 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 고분자 미립구 내의 단백질 및/또는 폴리펩타이드의 함량은 크게 제한이 없으나, 방출 특성을 고려하여, 건조 중량 기준으로 0.01 내지 50 중량%일 수 있다. 일실시예에서, 상기 단백질 또는 폴리펩타이드는 성장 호르몬, 에리스로포이에틴, 단일클론 항체, 과립세포 콜로니 자극인자, 대식세포 콜로니 자극인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극인자, 스롬보포이에틴, 인슐린 유사 성장인자, 상피 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 전이 성장인자, 인터페론, 인터루킨, 종양 괴사 인자, 스트렙토키나제, 유로키니제, 스타필로키나제, 디엔에이즈, 글루코세레브로시다제, 알파 갈락토시다제, 엑세나타이드, 옥트레오타이드, 인슐린, 글루카곤, 황체형성호르몬 분비호르몬, 고세렐린(Goserelin), 루프로렐린(Leuprorelin), 여포자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 퍼티렐린(Fertirelin), 칼시토닌(Calcitonin), 코르티코트로핀 방출 인자(Corticotropin Releasing Factor), 두뇌 나트리유레틱 펩티드 (Brain Natriuretic Peptide), 티모펜틴(Thymopentin), 코르티코트로핀(Corticotropin), 엘카토닌(Elcatonin), 베타 아밀로이드(Beta Amyloid), 트립토렐린(Triptorelin), 부세렐린(Buserelin), 티모신(Thymosin), 소마토스타틴(Somatostatin), 아라렐린(Alarelin), 안지오텐신(Angiotensin), 아르기프레신(Argipressin), 아토시반(Atosiban), 비발리루딘(Bivalirudin), 세트로렐릭스(Cetrorelix), 데스로렐린(Deslorelin), 데스모프레신(Desmopressin), 엘카토닌(Elcatonin), 엔푸비르티드(Enfuvirtide), 엡티피바티드(Eptifibatide), GLP-1, 고난도렐린(Gonandorelin), 리스프레신(Lyspressin), 나파렐린(Nafarelin), 네시리티드(Nesiritide), 옥시토신(Oxytocin), 프람린티드(Pramlintide), 세크레틴(Secretin), 터이파라티드(Teriparatide), 터리프레신(Terlipressin), 테트라코삭티드(Tetracosactide), 바프레오티드(Vapreotide) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.

또한 본 발명의 실시에 적합한 약물로 단백질과 펩타이드가 언급되었으나, 이에 국한 되지 않고 다양한 약물을 적용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 파클리탁셀, 시롤리무스 등의 난용성 약물, 항균제, 소염진통제, 중추신경계 약물 등 다양한 저분자 약물을 사용하는 것도 가능하다.

본 발명은 약물 봉입에 사용되는 고분자를 용해시키기 위하여 통상적으로 사용되는 유기용매를 사용하지 않고 고분자 미립구를 제조하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해, 물에 용해되는 수용성 고분자를 준비하는 것이 주요 특징이다.

수용성 고분자를 준비하기 위하여, 생체적합성이 높아서 많이 사용되는 폴리락트산을 이용하였다. 폴리락트산은 저분자량의 고분자이지만 물에 녹지 않는 소수성 물질로서, 체내 투여시 일정기간동안 형태를 유지할 수 있지만, 소수성으로 인해 유기용매를 이용하지 않으면 용해시킬 수 없다. 이러한 폴리락트산 중 특정 분자량을 가지는 폴리락트산의 양쪽 말단을 나트륨 등의 금속으로 치환시키면 물과 접촉시 고분자 미셀을 형성하여 물에 잘 녹는 친수성 물질로 변하게 된다.

일례에서, 본 발명에서 사용되는 수용성 저분자량 폴리락트산 유도체는 수평균분자량이 7,000 달톤 이하인 하기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 화합물 이다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

X 및 X'은 각각 독립적으로 수소, 알킬, 또는 아릴이고,

Y 및 Z는 각각 독립적으로 알칼리 금속에서 선택되며,

m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이고, 5 < m + n < 100이고,

a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며,

R은 치환 또는 비치환된 -(CH2)k-, 탄소수가 2 내지 10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6 내지 20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 화학식 1에서, X 및 X'은 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬로 치환 또는 비치환된 탄소수 6내지 20, 특히 탄소수 6의 아릴이고, 보다 구체적으로는 수소, 메틸 또는 페닐이며, 보다 더 구체적으로는 메틸일 수 있다. 또한, 상기 Y 및 Z는 각각 독립적으로 알칼리 금속에서 선택되며, 서로 동일하거나 상이할 수 있고, 예컨대, 독립적으로 나트륨, 칼륨, 또는 리튬일 수 있다. 상기 수용성 저분자량 폴리락트산 유도체는 물에 녹였을 때 고분자 마이셀을 형성하며 빠른 시간내로 용해된다. 이러한 특성을 보이는 나트륨치환 폴리락트산은 그 분자량의 한계를 나타나는데 약 7000이하인 경우에만 이와 같은 용해성을 띨 수 있다. 나트륨으로 치환된 폴리락트산은 물에 매우 잘 녹는 고분자로 물에 녹였을 경우 마이셀 구조를 갖는 푸른 색깔을 띠는 투명한 액체가 된다.

상기 수용성 저분자량 폴리락트산 유도체는 수평균 분자량이 7,000달톤 이하, 구체적으로 500 내지 7,000달톤, 보다 구체적으로 700 내지 5,000달톤, 더욱 구체적으로 1,000 내지 4,000달톤인 것일 수 있다. 나트륨 치환 폴리락트산의 수평균 분자량이 7,000달톤을 초과하면 폴리락트산 유도체 화합물이 물에 용해되지 않아 약물 전달체로 이용하기 적합하지 않다. 또한 수평균 분자량이 500달톤 이하이면 분자량이 작아서 체내 분해가 너무 빨라 약물의 지속 방출을 기대하기 어려울 수 있다.

상기 수용성 저분자량 폴리락트산 유도체의 또 다른 특성은 나트륨 이외의 다가(multivalent), 예를 들어 2가 금속이온을 만나면 두 개 이상의 폴리락트산이 금속이온복합체를 형성하여 불용성침전물을 형성한다. 이러한 불용성 침전물은 건조 후 다시 물에 녹여도 여전히 불용성의 특징을 갖고 있지만, 체액조건(0.01M phosphate buffered saline, 37℃)에서는 서서히 금속이온복합체가 해리되어 용해된다. 이와 같은 특성을 이용하면 단백질이나 펩타이드와 같은 저분자량 약물을 금속이온 복합체에 봉입하고 서서히 방출시키는 서방형제제의 개발이 가능하다.

따라서 본 발명의 제조 방법은 상기 수용성 저분자량 폴리락트산 유도체와 저분자량 약물을 물에 용해시켜 약물-폴리락트산 수용액을 제조하는 단계 (단계 a)와, 상기 약물-폴리락트산 수용액에 다가 금속염, 예를 들어 2가 금속염을 포함하는 물질의 수용액을 첨가하여 침전시키는 단계(단계 b), 및 상기 침전물 (약물-폴리락트산-금속 복합체 침전물)을 1 내지 150um 크기로 분쇄하여 약물-폴리락트산-금속 복합체 함유 미세입자를 제조하는 단계(단계 c)를 포함한다.

상기 약물-폴리락트산 수용액을 제조하는 단계에서, 수용액 내의 나트륨으로 치환된 폴리락트산 유도체의 농도는 10 mg/ml 내지 500 mg/ml이고, 약물의 농도는 0.01 mg/ml 내지 10 mg/ml이고, 나트륨으로 치환된 폴리락트산 유도체와 약물의 비율은 중량 기준으로 10:1 내지 1000:1 (폴리락트산 유도체 중량:약물 중량)이고, 최종 미립구 내의 약물 함량이 건조 중량 기준으로 0.01 내지 50 중량%이 되도록 하는 것이 좋다

상기 다가 금속은, 예컨대 칼슘(Ca² ⁺), 마그네슘(Mg² ⁺), 아연 (Zn² ⁺), 철 (Fe²⁺) 등의 2가 금속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있고, 다가 금속염은 상기 다가 금속의 염화물, 탄산염, 산화물, 황산염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 상기 다가 금속염, 예컨대 2가 금속염의 수용액은 농도가 0.1 내지 100 mg/ml, 1 내지 100 mg/ml, 보다 구체적으로 10 내지 50mg/ml인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예컨대, 나트륨으로 치환된 폴리락트산과 펩타이드 등의 저분자량 약물(구체예에서 엑세나타이드를 사용함)를 증류수에 용해시켜 혼합한 후 이 용액을 2가 금속 이온을 함유하는 수용액(예컨대, 염화아연, 산화아연, 탄산아연, 아세테이트아연, 황산아연, 염화칼슘, 염화마그네슘 등)에 침전시킨다. 엑세나타이드를 함유하는 고분자(나트륨으로 치환된 폴리락트산) 용액은 2가 이온 용액을 만나면 액적의 표면에서 급격히 폴리락트산의 나트륨과 2가 금속이온이 치환되면서 여러 개의 폴리락트산이 연결되어 외부 고분자막이 형성되면서 표면을 불용성으로 바꾼다. 이렇게 형성된 외부 고분자막은 약물이 액적 밖으로 방출되는 것을 막게 되고, 시간이 경과하면서 금속이온이 액적 내부로 확산되면서 전체 액적이 불용성 덩어리로 전환된다. 불용성으로 전환된 고분자 액적은 표면에서 가라앉고 이 상태에서는 약물은 완전하게 고분자 복합체덩어리 안에 봉입되게 된다. 2가 금속 이온은 고분자 사슬을 선형으로 연결하여 불용성 폴리락트산을 형성하며, 이 중 2가 금속 이온(예컨대, 아연이온)은 d-오비탈의 역할로 3차원의 네트워크구조를 형성할 것으로 생각된다.

이렇게 얻어진 고분자 덩어리를 건조한 후 분쇄하면 약물을 함유하는 불용성 폴리락트산 입자를 얻을 수 있다. 하지만 이렇게 얻어진 고분자 입자는 모양이나 크기가 불균일하여 일정한 패턴의 방출이 어렵고 초기의 과다 방출을 막기 어렵다. 또한 불균일한 모양으로 인하여 고분자 입자 제형의 주사에 있어서 나타나는 주사바늘의 굵기에 제한 받는 등의 한계가 있다.

본 발명의 구체예에서는 단계 c)에서 입자 크기가 1 내지 150 um, 구체적으로 50 내지 150um가 되도록 분쇄할 수 있다.

본 발명은 이러한 문제점을 보완하기 위하여, 상기 단계 a) 내지 c)를 통하여 제조된 분쇄된 약물-폴리락트산-금속 복합체 함유 미세입자를 0.1 내지 5%(w/v) 폴리비닐알코올 수용액에 현탁시켜 30℃ 이상 80℃ 미만 온도에서 1 내지 10분간 50 내지 2000rpm의 속도로 교반하는 단계 (단계 d)와 그 후 즉시 20℃ 이하로 냉각시키는 단계(단계 e)를 수행함으로써, 유기용매를 사용하지 않고 입자표면에 구멍이 거의 없고 일정한 크기의 구형모양 미립구를 제조할 수 있으며(실험예 1 및 도 1 내지 4 참조), 이를 통하여 종래의 문제점들을 해소한 서방형 제제를 제조할 수 있다.

상기 폴리비닐알코올 수용액에 현탁시키는 단계 d)에 있어서, 폴리비닐알코올은 수평균 분자량 10,000 내지 100,000 달톤, 구체적으로 40,000내지 70,000 달톤의 것일 수 있으며, 0.1% 내지 5%(w/v), 구체적으로 0.5내지 3%(w/v), 보다 구체적으로 1내지 2%(w/v) 농도의 수용액 상태로 사용될 수 있다.

또한, 단계 d)의 온도 범위는 30℃이상 80℃미만, 구체적으로 55 내지 75℃, 보다 구체적으로 60 내지 70℃로 하고, 시간은 1 내지 10분, 구체적으로 3 내지 7분, 보다 구체적으로 4 내지 6분 동안으로 할 수 있고, 교반 속도는 50 내지 2000rpm, 구체적으로 100 내지 1000 rpm 으로 할 수 있다. 상기 온도, 시간 및 교반속도를 상기 범위로 하는 경우, 표면이 매끄럽고 크기가 일정한 구형의 미립구가 고수율로 얻어지며 약물 함량도 높다 (표 1 참조). 교반 속도가 상기 범위보다 빠르면 얻어지는 미립구의 구형 형태가 깨져 버리고 약물이 고분자 내에서 빠져 나오게 되며, 반면, 상기 범위보다 느리면 매끈한 형태의 미립구가 얻어지지 않으므로, 교반 속도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 또한, 온도가 상기 범위보다 낮으면 미립구가 구형으로 얻어지지 않고, 상기 범위보다 높으면 고분자가 녹아 서로 늘어붙게 되어 바람직하지 못하므로, 온도는 상기 범위로 하는 것이 좋다.

상기 현탁 단계 수행 후, 즉시 20℃ 이하, 예컨대, 0 내지 20℃로 냉각하는 단계를 수행한다. 폴리락트산 고분자는 40℃ 이상에서는 부드러워 지는데 그 모양을 유지하기 위해서는 20℃ 이하로 빠르게 냉각시키는 과정이 필요하다.

본 발명의 또 다른 예는 0.1 내지 5%(w/v), 구체적으로 0.5 내지 3 %(w/v), 보다 구체적으로 1 내지 2 %(w/v) 농도의 폴리비닐알코올 수용액의 표면이 매끄럽고 균일한 구형의 약물-폴리락트산-금속 함유 미립구 제조에 있어서의 용도를 제공한다. 보다 구체적으로, 0.1 내지 5%(w/v), 구체적으로 0.5 내지 3 %(w/v), 보다 구체적으로 1 내지 2 %(w/v) 농도의 폴리비닐알코올 수용액을 포함하는 표면이 매끄럽고 균일한 구형의 약물-폴리락트산-금속 함유 미립구 제조용 조성물이 제공된다. 상기 폴리비닐알코올은 수평균 분자량이 10,000 내지 100,000 달톤, 구체적으로 40,000내지 70,000 달톤인 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 약물 함유 고분자 미립구는

i) 약물, 예컨대, 단백질 또는 폴리펩타이드 등의 저분자량 약물;

ii) 수용성 저분자량 폴리락트산 유도체; 및

iii) 다가 금속, 예컨대, 2가 금속

을 포함하며,

평균 직경이 1 내지 150um이고,

크기가 균일하며, 표면이 매끄럽고, 구형인 것을 특징으로 한다.

상기 약물 함유 고분자 미립구는 약물 전달용 조성물로서 유용하다.

상기 약물, 저분자량 폴리락트산 유도체, 다가 금속, 2가 금속 등의 모든 한정사항은 앞서 설명한 바와 같다.

상기와 같은 방법을 이용하여 제조한 고분자 미립구는 표면이 매끈하고 크기와 모양이 균일한 구형의 수용성 미립구의 형태로 초기방출 억제 및 일정한 방출에도 효과적이고 이와 더불어 주사를 용이하게 미립자의 모양을 균일한 구형으로 바꿈으로써 더 가는 굵기의 바늘의 사용을 가능하게 하여 환자의 편이성을 증가시킬 수 있었다.

도 1은 비교예1에 따라 제조된 엑세나타이드-아연복합체 미립자의 입자형태를 측정한 SEM의 영상이다.
도 2는 실시예 4에 따라 제조된 엑세나타이드-고분자 미립구의 입자형태를 측정한 SEM의 영상이다. (1%(w/v) 폴리비닐알코올 수용액, 60℃, 5분 교반)
도 3은 실시예2에 따라 제조된 엑세나타이드-고분자 미립구중 70℃ 수용액 온도에서 제조한 입자형태를 측정한 SEM의 영상이다. (1%(w/v) 폴리비닐알코올 수용액, 70℃, 5분 교반)
도 4는 실시예2에 따라 제조된 엑세나타이드-고분자 미립구중 80℃ 수용액 온도에서 제조한 입자형태를 측정한 SEM의 영상이다. (1%(w/v) 폴리비닐알코올 수용액, 80℃, 5분 교반)

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 다양한 폴리비닐알코올 농도에서의 엑세나타이드 함유 미립구 제조

(1 단계)

D,L-락트산 500g (5.56 mole)과 숙신산(succinic acid) 18.9g (0.16 mole)을 1L 의 2구 둥근바닥 플라스크에 넣고, 자석막대로 교반하면서 질소 퍼징할 수 있도록 장치하였다. 가열용 유조(Oil bath)를 160℃로 가열하고, 질소를 2000mL/min의 흐름 속도로 반응물 내부로 퍼징하였다. 반응 중에 생성되는 물은 질소의 흐름을 따라 반응기 밖으로 배출되도록 하였다. 1시간 동안 물을 제거하고, 유조를 200℃로 가열하였다. 24시간 반응을 시킨 후 반응을 종결하였다. 그 결과, 정제되지 않은 상태의 양 말단이 카르복실산으로 된 D,L-폴리락트산 유도체 368g을 얻었다. 제조된 폴리락트산 유도체에 대한 NMR 스펙트럼을 도 5에 나타내었다. 하기 NMR 분석법으로 측정한 결과, 제조된 폴리락트산 유도체의 수평균 분자량은 2,315달톤이었다.

<1H-NMR 스캔의 피크면적으로부터 수평균 분자량의 계산>

[수학식 1]

수평균 분자량 (달톤) = {(A + B) / (C/N)} X 72.1

상기 수학식 1에서,

A는 D,L-폴리락트산 유도체의 메틸렌 양성자의 피크 면적이고,

B는 고분자 말단 D,L-락트산 유도체의 메틸렌 양성자의 피크 면적이며,

C는 디카르복실산의 메틸렌 양성자의 피크 면적이고,

N은 디카르복실산의 메틸렌 양성자의 갯수이다.

상기 얻어진 폴리락트산 유도체 100g에 아세토니트릴 150mL를 첨가하여 용해시켰다. 여기에 탄산수소나트륨 수용액(0.1g/mL) 150mL를 서서히 첨가하였다. 상온에서 2시간 동안 교반하여 고분자를 중화시켜 폴리락트산 유도체 나트륨염을 제조하였다.

그 후, 염석출법(salting-out)을 통해 제조된 고분자를 정제하였다. 즉, 반응 결과 용액에 염화나트륨(NaCl) 15g을 교반하면서 첨가하여 용해시키고, 분별 깔대기에서 2시간 동안 층분리시켜 수용액층을 제거하였다. 얻어진 유기용매층 고분자 용액에, 다시 증류수 100mL와 염화나트륨 10g를 첨가하여 용해시키고, 분별깔대기를 이용하여 다시 층분리시키고, 수용액층을 제거하였다. 얻어진 고분자를 포함하는 유기용매층 용액을 50?에서 회전 분별증류하여 유기용매와 소량의 증류수를 완전히 제거하였다.

유기용매와 증류수가 제거된 고분자에 무수 아세톤 500mL를 첨가하여 고분자를 용해시키고, 용해되지 않는 침전물은 여과지를 이용하여 여과하여 제거하였다. 여과된 고분자 용액을 50?에서 2시간 동안 회전 분별증류하여 아세톤을 완전히 제거하였다. 아세톤이 제거된 고분자를 50? 진공오븐 내에서 3일 동안 진공 건조하였다.

그 결과 양 말단에 카르복시산 나트륨염을 가지는, 정제된 폴리락트산 유도체의 나트륨염 91g을 얻었다. 제조된 폴리락트산 유도체 염의 NMR 스펙트럼을 도 6에 나타내었다. 상기 NMR 분석법으로 측정한 결과 상기 제조된 폴리락트산 유도체의 나트륨염의 수평균 분자량은 2,178달톤이었다.

상기 제조된 나트륨으로 치환된 폴리락트산(폴리락트산 유도체의 나트륨염) 5g을 증류수 42ml에 녹여 고분자 수용액(고분자의 용해 비율: 증류수 기준 10%(w/v))을 준비하고, 엑세나타이드(Polypeptide Laboratories, Inc.) 100mg을 증류수 3ml에 녹여 엑세나타이드 수용액을 제조하였다.

상기 고분자 수용액과 엑세나타이드 수용액을 혼합하고 0.45um 필터를 이용하여 불순물을 제거하여 엑세나타이드 함유 고분자 수용액을 제조하였다. 물에 염화아연을 25mg/ml의 농도로 녹인 염화아연 수용액 500ml을 준비하여 엑세나타이드 함유 고분자 수용액의 금속(아연) 복합체를 형성하기 위한 침전 용매로 사용하였다. 상기 염화아연 수용액에 엑세나타이드 함유 고분자 수용액을 3ml/min 속도로 점적하면서 교반기를 이용하여 120rpm의 속도로 교반시킴으로써, 엑세나타이드 함유 고분자 금속 복합체를 생성시켰다. 모든 엑세나타이드 함유 고분자의 침전이 완료되면 약 5분간 교반하면서 엑세나타이드-고분자-금속 복합체가 완전히 형성될 수 있도록 하였다.

5분 경과 후, 염화아연 수용액을 제거하고, 증류수 500ml을 넣고 120rpm으로 1분간 교반하여 잔류하는 염화아연을 세척하는 과정을 두 번 반복 수행하였다. 세척이 완료된 엑세나타이드-고분자-금속 복합체를 진공펌프를 이용하여 실온에서 1일 동안 방치하여 건조하였다.

완전히 건조된 복합체를 분쇄기를 이용하여 분쇄한 후 투여시 흐름성을 개선하기 위해 일정한 크기로 선별하였다. 보다 구체적으로, 100~400 mesh의 체를 이용하여, 평균 입경이 50um 내지 150um 정도인 입자만을 선별하였다.

(2 단계)

상기 1 단계에서 제조된 엑세나타이드-고분자-금속 복합체 입자 200mg을 각각 0.1%(w/v), 1%(w/v), 5%(w/v), 또는 10%(w/v)의 폴리비닐알코올(수평균분자량: 66,000달톤) 수용액에 가하여 현탁시켰다. 이어서 자석교반기로 교반하면서 수용액 온도를 60℃로 가온하고, 이 온도에서 5분간 500 rpm의 속도로 교반하였다. 그 후, 실온(20 ℃ 이하)으로 식혀서 미립구를 침전시키고, 증류수로 세 번 씻어주고 감압 건조하여, 미립구를 제조하였다.

실시예 2: 다양한 폴리비닐알코올 수용액 온도에서의 엑세나타이드 함유 미립구 제조

실시예 1의 1 단계에서 제조한 고분자 입자 200mg을 1%(w/v) 폴리비닐알코올(수평균분자량: 66,000달톤) 수용액에 가하여 현탁시켰다. 이어서 자석교반기로 교반하면서 수용액 온도를 30℃, 60℃, 70℃, 80℃로 각각 가온하였다. 이 온도에서 5분간 500rpm의 속도로 교반한 후 실온(20℃ 이하)으로 식혀서 미립구를 침전시켰다. 증류수로 세 번 씻어주고 감압 건조하여, 미립구를 제조하였다.

실시예 3: 다양한 폴리비닐알코올 수용액 교반시간에서의 엑세나타이드 함유 미립구 제조

실시예 1의 1 단계에서 제조한 고분자 입자 200mg을 1%(w/v) 폴리비닐알코올(수평균분자량: 66,000달톤) 수용액에 가하여 현탁시켰다. 이어서 자석교반기로 교반하면서 수용액 온도를 60℃로 가온하였다. 이 온도에서 1분, 5분, 10분, 또는 20분간 500rpm의 속도로 교반한 후 실온(20℃ 이하)으로 식혀서 미립구를 침전시켰다. 증류수로 세 번 씻어주고 감압 건조하여 미립구를 제조하였다.

비교예 1: 엑세나타이드 -고분자-금속복합체 미립자의 제조

실시예 1에서 1단계만 수행하여 얻어진 엑세나타이드-고분자-금속 복합체 미립자를 이용하였다.

실시예 4: 엑세나타이드 -고분자-금속 복합체 미립구 제조

실시예 1에서 1단계만 수행하여 얻어진 엑세나타이드-고분자-금속 복합체 미립자 200mg 취하여 1%(w/v) 폴리비닐알코올 수용액에 가하여 현탁시켰다. 그 후, 자석교반기로 교반하면서 수용액의 온도를 60℃로 가온하였다. 이 온도에서 5분간 500rpm의 속도로 교반한 후 실온(20℃ 이하)으로 식혀서 미립구를 침전시켰다. 증류수로 세 번 씻어주고 감압 건조하였다.

실험예 : 고분자 미립자의 특성평가

실험예 1. 입자의 형태측정

미립자의 외관을 관찰하기 위하여 실시예 2에서 다양한 온도에서 각각 제조된 미립자 및 비교예 1과 실시예 4에서 제조된 미립자를 각각 약 50mg의 양으로 알루미늄 스터브에 고정시키고, 진공도 0.1torr 및 고전압 (5kV)하에서 15분간 백금으로 코팅한 후, SEM (제조사: JEOL, 모델명: JSM-6335F)을 사용하여 미립자 외관을 비교 관찰하였다.

상기 얻어진 결과를 도 1 내지 도 4에 나타내었다. 아래의 영상은 위쪽의 영상을 확대한 사진이다.

도 1과 도 2는 각각 비교예 1과 실시예 4에서 제작된 미립구의 입자 형태를 보여주는 사진이고, 도 3과 도 4는 실시예 2에서 제조된 미립구 중 70℃에서 교반하여 얻어진 미립구(도 3)와 80℃에서 교반하여 얻어진 미립구 (도 4)의 형태를 보여주는 사진이다.

도1은 구형으로 만들기 전의 미립자의 형태로 기존 주사제형에서 만들었던 제형으로, 모양이나 크기가 불규칙하여, 방출시 일정한 방출의 경향을 보여주지 못하기도 하고 초기 방출도 큰 편이며, 또한, 주사할 때도 불규칙한 모양과 크기 때문에 굵은 guage의 바늘을 써야 하는 단점이 있다. 이를 폴리비닐알코올을 이용하여 1%, 60℃, 5분이라는 조건에서 작업하면 구형의 표면이 매끈한 모양의 미립구가 되며 (도 2 참조), 이 조건에서 벗어날수록 모양이나 표면상태가 다소 떨어지는 것을 볼 수 있다.

실험예 2. 입자의 함량 변화 및 수득률 측정

실시예 1 내지 4에서 제조된 미립구에서, 초기 투입량과 비교하여 건조하여 얻은 50~150um 크기의 미립구의 수득률을 계산하였다.

또한 다음과 같은 방법으로 최종 미립구 내의 엑세나타이드의 함량 변화를 분석하였다. 미립구 5mg을 1.5ml의 마이크로 튜브에 넣고 여기에 0.3ml 아세토니트릴을 넣고 흔들어 완전히 녹였다. 완전히 녹은 용액에 0.25N NaOH 0.35ml을 넣고 흔들어 혼합하였다. 혼합 후 1분 이내, 0.25N HCl 0.35ml을 첨가한 후 약 10초간 흔들었다. 완전히 혼합된 용액을 원심분리기에서 1분간 10000rpm으로 회전시켜 불용성물질을 제거하였다. 이렇게 분리해낸 엑세나타이드를 HPLC로 분석하였다.

상기 최종 미립구 내의 엑세나타이드의 함량 분석 결과를 다음의 표 1에 기재하였다.

	폴리비닐알코올 농도	수용액 온도	교반시간	함량 (%)*	수득률 (%)
실시예 1	0.1%(w/v)	60℃	5분	97.2	68.5
	1%(w/v)	60℃	5분	98.5	94.2
	5%(w/v)	60℃	5분	97.7	88.3
	10%(w/v)	60℃	5분	97.3	51.1
실시예 2	1%(w/v)	30℃	5분	96.6	42.0
	1%(w/v)	60℃	5분	98.5	94.2
	1%(w/v)	70℃	5분	98.3	92.7
	1%(w/v)	80℃	5분	97.0	-**
실시예 3	1%(w/v)	60℃	1분	97.4	55.6
	1%(w/v)	60℃	5분	98.5	94.2
	1%(w/v)	60℃	10분	92.9	90.6
	1%(w/v)	60℃	20분	85.0	62.3

* 엑세나타이드 함량(중량%)

** 표면이 매끄럽고 규칙적이고 균일한 모양의 미립구가 얻어지지 않음

(실시예 4: 실시예 1, 2, 3에서 폴리비닐알코올 농도 1%(w/v), 수용액 온도 60℃, 교반시간 5분에서 수행하는 공정에 해당)

표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 폴리비닐알코올의 농도 약 1%(w/v), 수용액 온도 60 내지 70℃, 교반시간 약 5분의 조건에서 제조한 미립구가 가장 우수한 수득률과 엑세나타이드 함량을 보였다.

Claims

a) 수평균 분자량 7,000달톤 이하인 하기 화학식 1의 폴리락트산 유도체 수용액에 약물을 혼합하여 약물 함유 고분자 수용액을 제조하는 단계;
b) 상기 약물 함유 고분자 수용액을 다가 금속염의 수용액에 첨가하여 약물 함유 고분자를 침전시키는 단계;
c) 상기 침전된 약물 함유 고분자를 건조시킨 후 분쇄하여 1 내지 150um 크기의 미세입자를 제조하는 단계;
d) 상기 미세입자를 폴리비닐알코올 수용액에 현탁 시킨 후 교반하는 단계; 및
e) 상기 얻어진 혼합물을 냉각시켜 생성된 미립구를 분리하는 단계
를 포함하는
고분자 미립구 제조방법:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
X 및 X'은 각각 독립적으로 수소, 알킬, 또는 아릴이고,
Y 및 Z는 각각 독립적으로 알칼리 금속에서 선택되며,
m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이고, 5 < m + n < 100이고,
a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며,
R은 치환 또는 비치환된 -(CH2)k-, 탄소수가 2 내지 10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6 내지 20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
제1항에 있어서, 상기 단계 a)의 폴리락트산 유도체는 분자량이 1,000 내지 4,000 달톤인 것인, 고분자 미립구 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 b)의 다가 금속은 칼슘(Ca² ⁺), 마그네슘(Mg² ⁺), 아연 (Zn² ⁺), 및 철 (Fe² ⁺)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인, 고분자 미립구 제조 방법.
제3항에 있어서, 상기 단계 b)의 다가 금속염은 상기 다가 금속의 염화물, 탄산염, 산화물, 및 황산염로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인, 고분자 미립구 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 c)의 폴리비닐알코올 수용액은 농도가 0.1 내지 5%(w/v)인 것인, 고분자 미립구 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 c)는
30℃ 이상 80℃ 미만의 온도;
1 내지 10분 동안의 시간; 및
50 내지 2000rpm의 교반 속도
로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 조건 하에서 수행되는 것인, 고분자 미립구 제조 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약물은 단백질, 펩타이드, 난용성 약물, 항균제, 소염진통제, 및 중추신경계 약물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인,
고분자 미립구 제조 방법.
제7항에 있어서, 상기 약물은 성장 호르몬, 에리스로포이에틴, 단일클론 항체, 과립세포 콜로니 자극인자, 대식세포 콜로니 자극인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극인자, 스롬보포이에틴, 인슐린 유사 성장인자, 상피 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 전이 성장인자, 인터페론, 인터루킨, 종양 괴사 인자, 스트렙토키나제, 유로키니제, 스타필로키나제, 디엔에이즈, 글루코세레브로시다제, 알파 갈락토시다제, 엑세나타이드, 옥트레오타이드, 인슐린, 글루카곤, 황체형성호르몬 분비호르몬, 고세렐린(Goserelin), 루프로렐린(Leuprorelin), 여포자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 퍼티렐린(Fertirelin), 칼시토닌(Calcitonin), 코르티코트로핀 방출 인자(Corticotropin Releasing Factor), 두뇌 나트리유레틱 펩티드 (Brain Natriuretic Peptide), 티모펜틴(Thymopentin), 코르티코트로핀(Corticotropin), 엘카토닌(Elcatonin), 베타 아밀로이드(Beta Amyloid), 트립토렐린(Triptorelin), 부세렐린(Buserelin), 티모신(Thymosin), 소마토스타틴(Somatostatin), 아라렐린(Alarelin), 안지오텐신(Angiotensin), 아르기프레신(Argipressin), 아토시반(Atosiban), 비발리루딘(Bivalirudin), 세트로렐릭스(Cetrorelix), 데스로렐린(Deslorelin), 데스모프레신(Desmopressin), 엘카토닌(Elcatonin), 엔푸비르티드(Enfuvirtide), 엡티피바티드(Eptifibatide), GLP-1, 고난도렐린(Gonandorelin), 리스프레신(Lyspressin), 나파렐린(Nafarelin), 네시리티드(Nesiritide), 옥시토신(Oxytocin), 프람린티드(Pramlintide), 세크레틴(Secretin), 터이파라티드(Teriparatide), 터리프레신(Terlipressin), 테트라코삭티드(Tetracosactide), 바프레오티드(Vapreotide), 파클리탁셀, 및 시롤리무스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인,
고분자 미립구 제조 방법.
i) 약물;
ii) 수평균 분자량 7,000달톤 이하인 하기 화학식 1의 폴리락트산 유도체; 및
iii) 다가 금속
을 포함하며,
평균 직경이 1 내지 150um이고,
크기가 균일하며, 표면이 매끄럽고, 구형인 것을 특징으로 하는,
약물 함유 고분자 미립구:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
X 및 X'은 각각 독립적으로 수소, 알킬, 또는 아릴이고,
Y 및 Z는 각각 독립적으로 알칼리 금속에서 선택되며,
m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이고, 5 < m + n < 100이고,
a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며,
R은 치환 또는 비치환된 -(CH2)k-, 탄소수가 2 내지 10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6 내지 20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
제9항에 있어서, 상기 약물은 단백질, 펩타이드, 난용성 약물, 항균제, 소염진통제, 및 중추신경계 약물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인,
약물 함유 고분자 미립구.
제9항에 있어서. 상기 다가 금속은 칼슘(Ca² ⁺), 마그네슘(Mg² ⁺), 아연 (Zn² ⁺), 및 철 (Fe² ⁺)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인,
약물 함유 고분자 미립구.
0.1 내지 5%(w/v) 농도의 폴리비닐알코올 수용액을 포함하는 표면이 매끄럽고 균일한 구형의 약물-폴리락트산-금속 함유 미립구 제조용 조성물.