KR20130062046A - 한라송이풀 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한라송이풀(Pedicularis verticillata Linne var.hallaisanensis(Hurusawa)) 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 한라송이풀 추출물을 함유함으로써 미백 효과, 피부 노화 방지 효과 및 피부 보습력 개선 효과를 제공할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

한라송이풀 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물{Skin external composition containing Pedicularis verticillata Linne var.hallaisanensis extract}

본 발명은 한라송이풀(Pedicularis verticillata Linne var.hallaisanensis(Hurusawa)) 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 한라송이풀 추출물을 함유함으로써 미백 효과, 피부 노화 방지 효과 및 피부 보습력 개선 효과를 제공할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

인간의 피부는 나이가 들어감에 따라 여러 가지 내적, 외적 요인에 의해 변화를 겪는다. 즉, 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되며, 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양 광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하고 환경 오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가하며, 탄력이 감소될 뿐 아니라 피부 혈색도 칙칙해지고, 피부 트러블이 자주 발생하며, 기미와 주근깨 및 검버섯 또한 증가하는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다.

노화가 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산 및 당단백질의 함유량 및 배열이 변하거나 감소하는 증상들이 나타나게 되고, 자유 라디칼 및 활성 유해 산소에 의한 산화적 스트레스를 받게 된다. 또한 노화가 진행되거나 자외선에 의해서, 피부를 구성하는 대부분의 세포에서는, 염증을 일으킨다고 알려져 있는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 생성하는 효소인 사이클로옥시제나제-2(Cox-2, cyclooxygenase)의 생합성이 증가하고, 이들 염증성 인자에 의해 피부조직을 분해하는 효소인 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP, Mztrix metalloproteinase)의 생합성이 증가하며, iNOS(inducible nitric oxide synthase)에 의한 NO(nitric oxide) 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 즉 자연적으로 진행되는 내인성 노화에 따른 세포 활성의 감소 및 미세염증에 의해 기질물질의 생합성이 감소되고, 여러 가지 유해 환경에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선에 의한 활성 산호 종의 증가와 같은 외적 요인에 의해 분해 및 변성이 가속화되어 피부 기질이 파괴되고 얇아지면서 피부 노화의 제반 증상들이 나타나게 된다. 따라서, 이러한 노화의 현상들을 방지하고, 개선시킬 수 있는 활성성분에 대하여 많은 연구가 행하지고 있는 것이 현실이다.

사람의 피부색을 결정하는 데는 여러 가지 요인들이 관여하는데, 그 중에서도 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드와 빌리루빈 등 인체 내외의 색소 함유 유무 등의 요인들이 중요하다.

이중 특히 가장 중요한 요인은 인체 내의 멜라노사이트에서 타이로시나제 등의 여러 가지 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소이다. 이 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비, 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인 등이 영향을 미친다.

신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선을 차단하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 등 피부 내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 담당한다.

이와 같이 피부 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는 안정한 물질이다. 그러나 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미, 주근깨 및 점 등과 같은 과색소 침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다.

오늘날 동양권의 여성들은 백옥같이 하얗고 깨끗한 피부를 선호하며 이를 미의 중요한 기준으로 삼고 있기 때문에 과색소 침착에 대한 치료 및 미용상 문제를 해결하고자 하는 요구가 늘어나게 되었다.

이와 같은 요구에 부응하여 종전부터 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체, 또는 타이로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합하여 사용하여 왔으나, 이들의 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합 시 나타나는 제형 및 안정성의 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

피부 중에서 최외각에 위치한 표피(epidermis)의 가장 중요한 기능은, 외부로부터의 다양한 자극(화학물질, 대기오염물질, 건조한 환경, 자외선 등의 물리 및 화학적 자극인자)에 대한 방어와 피부를 통한 체내 수분의 과도한 발산을 막는 보호기능이며, 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층이 정상적으로 형성되어 있을 때만 그 기능을 유지할 수 있다. 표피 중에서도 가장 바깥에 존재하는 각질층(stratim corneum, horney layer)은 각질형성세포로부터 형성되며, 분화가 완결된 각질 세포와 그를 둘러싼 지질층으로 구성되어 있다(J. Invest. Dermatol. 1983; 80: 44~49). 각질세포는 표피 최하층에서 지속적으로 증식(proliferation)하는 기저세포(basal cell)가 단계적으로 형태 및 기능상의 변화를 거치며, 피부 표면까지 상승한 특징적은 세포이며, 일정 기간이 경과하면 오래된 각질세포는 피부에서 탈락되고 새로운 각질세포가 그 기능을 대신하게 되는데, 이러한 반복적인 일련의 변화 과정을 ‘표피 세포의 분화’ 또는 ‘각화(keratinization)’라고 부른다. 각화과정 중의 각질형성세포는 천연보습인자(natural moisturizing factor; NMF)와 세포간 지방질(세라마이드, 콜레스테롤, 지방산)을 생성하면서 각질층을 형성하여, 각질층이 견고함과 유연성을 가지게 하여 피부장벽(skin barrier)으로서의 기능을 보유하게 한다.

그러나, 이러한 각질층은 과도한 세안이나, 목용 등의 생활 습관적 요인, 건조한 대기, 오염물질 등의 환경적인 요인 및 아토피성 피부나 노인성 피부 같은 내인성 질환 등으로 인해 쉽게 그 기능이 손실될 수 있으며, 실제적으로 현대에 들어서 더욱 늘어난 여러 요인들로 인해 최근에는 건조피부증상 및 이로 인한 제반 장해를 호소하는 사람들이 점점 증가하고 있는 추세이다. 따라서, 적절한 피부수분을 유지하기 위하여 외부로부터 수분을 공급하거나, 체내로부터의 수분 손실을 방지하기 위한 연구가 많이 진행되어 왔으며, 실제로 수분보유능력이 있는 여러 종류의 보습제(moisturizer)가 개발되어 주로 화장품 영역에서 많이 사용되고 있다.

그러나, 생활환경 중에 인간에 대한 위해 요인이 점점 증가하고, 노령인구가 급격히 늘어나면서, 각질층의 생성-탈락속도(turnover rate)가 늦어지고, 각질형성세포의 지질합성능력이 저하되거나, 표피에서 정상적인 세포의 분열, 성숙 및 분화가 원활하지 않음으로써, 각질층의 보습인자와 지질의 양이 감소되어 정상적인 각질층의 기능을 유지하지 못하는 상태, 즉 피부장벽기능이 와해된 상태의 피부를 갖고 있는 인간들이 점점 증가하는 추세에 있다.

이러한 비정상적인 표피세포의 분열, 분화로 인해 피부는 피부건조증, 아토피 및 건선 등의 다양한 피부 질환을 유발하게 되며, 이러한 제 질환들은 자체로 수분 보유 기능만을 갖는 통상적인 보습제 만으로는 그 증상을 약간 완화시킬 수는 있으나, 근본적인 치유를 기대하기는 어려운 실정이다.

이에 본 발명자들은 천연물 추출물 중에서 한라송이풀 추출물이 미백, 항노화, 피부 주름 개선 및 보습 개선 효과를 제공할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 한라송이풀 추출물을 함유하여 미백, 항노화 등의 효과를 나타내고 보습력을 개선시킬 수 있는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 한라송이풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 한라송이풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백용, 항노화용 및 보습용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 한라송이풀 추출물을 함유함으로써 피부 미백 효과, 항노화 효과 및 피부 보습 개선 효과 등을 제공할 수 있다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 한라송이풀(Pedicularis verticillata Linne var . hallaisanensis(Hurusawa)) 추출물을 유효성분으로 함유한다.

한라송이풀(Pedicularis verticillata Linne var . hallaisanensis(Hurusawa))은 현삼과에 속하며 한라산에서 나는 다년초로서, 섬송이풀, 제주송이풀이라고도 한다. 크기는 높이 5~15cn이며, 원줄기의 능각에 부드러운 털이 많고, 밑에서 가지가 갈라진다.

본 발명에서 사용되는 한라송이풀 추출물은 한라송이풀에서 침출, 전출하여 얻은 침출액 뿐만 아니라, 침출액을 다시 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물 또는 상기 농축물을 다시 건조시켜 제조한 침체, 전제, 정기, 유동엑기스 및 한라송이풀 중에 함유되어 주 효과를 발휘하는 화학 물질은 물론 식물 그 자체를 모두 포함한다. 또한 본 발명에서는 줄기, 뿌리, 잎, 꽃 등 한라송이풀의 모든 부분으로부터의 추출물을 사용할 수 있으며, 어느 특정 부분의 추출물로 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 한라송이풀 추출물의 제조방법으로는 공지의 방법을 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 본 발명의 한라송이풀을 세절하고 건조한 후 물 또는 유기용매를 넣고, 환류 추출하여 침적시킨 후 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 한라송이풀 추출물을 얻을 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들 유기용매와 물의 혼합용매에서 선택될 수 있으며, 원료의 안전성을 고려할 때 바람직하게는 100% 물, 70% 에탄올 또는 부틸렌 글리콜(Butylene Glycol)을 사용한다. 이때, 추출 온도는 물의 경우 18~80℃가 바람직하고, 70% 에탄올과 부틸렌 글리콜의 경우는 18~40℃가 바람직하며, 추출 시간은 6~168시간이 바람직하다. 상기 추출 온도 및 추출 시간을 벗어나면 추출 효율이 떨어지거나 성분의 변화가 생길 수 있다. 상기에서 용매를 이용하여 추출물을 얻은 이후 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 상온에서 냉침, 가열 및 여과하여 액상물을 얻을 수 있으며, 또는 추가로 용매를 증발, 분무 건조 또는 동결 건조할 수 있다.

본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 상기 한라송이풀 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.001~50중량%로 함유할 수 있다. 상기 한라송이풀 추출물의 함량이 0.001중량% 미만이면 상기 추출물에 의한 효능, 효과가 미약하고, 50중량%를 초과하면 피부 안전성 또는 제형상의 문제가 있기 때문이다.

본 발명의 조성물은 미백용 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 티로시나제 활성을 저해하고 멜라닌의 생성을 억제함으로써 우수한 미백 효과를 제공할 수 있다.

본 발명의 조성물은 항노화용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 피부 탄력을 증진시키고 주름을 개선시키는 효과가 뛰어나다.

본 발명의 조성물은 보습용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 피부 장벽 기능을 강화시키고 피부 각질형성세포의 분화를 유도시킬 수 있다. 따라서 표피 분화의 불완전함으로 생기는 피부건조증, 아토피 피부염, 접촉성 피부염 또는 건선 등을 예방 또는 개선하는 피부 외용제 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

또한 본 발명에 의한 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

또한, 본 발명의 조성물은 피부 미백 효과, 피부 노화 개선 효과 및 피부 보습 개선 효과 등을 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.

이하, 시험예 및 제형예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 시험예 및 제형예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 한라송이풀 추출물의 제조

세절하여 음건한 한라송이풀을 추출용매로서 70% 에탄올을 사용하여 24시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 45℃ 이하에서 감압농축 및 동결 건조하였다.

[시험예 1] 엘라스타아제 활성 억제 효능 측정

한라송이풀 추출물의 엘라스타아제 활성 저해능을 포스포라미돈과 비교하여 측정하였다. 사용된 엘라스타아제와 기질은 미국 시그마알드리치 사로부터 상업적으로 구매하였고(Cat.No. E0127), 한라송이풀 추출물은 상기 실시예 1의 것을 사용하였다.

하기의 시험방법으로 엘라스타아제 활성 저해작용을 시험하였다.

96웰 플레이트에서 10mg/L Tris-HCL 완충액(pH 8.0)으로 조제한 것에 상기 실시예 1의 한라송이풀 추출물 10ppm이 되도록 20㎍/mL 엘라스타아제·타입 III 용액 50μL를 혼합하였다. 포스포라미돈 10ug/ml을 양성 대조군으로 사용하였으며 음성 대조군인 비처리군은 증류수를 사용하였다. 그 후, 상기 완충액으로 조제한 0.4514㎎/mL N-SUCCINYL-ALA-ALA-ALA-p-NITROANILIDE 100μL를 첨가하고, 25℃에서 15분 반응시켰다. 반응종료 후, 파장 415㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 동일한 방법으로 공시험을 행하여 보정하였다.

엘라스타아제 활성 저해작용의 계산방법은 하기 수학식 1과 같으며, 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

A: 시험물질 무첨가, 효소 첨가에서의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도

B: 시험물질 무첨가, 효소 무첨가에서의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도

C: 시험물질 첨가, 효소 첨가에서의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도

D: 시험물질 첨가, 효소 무첨가에서의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도

화합물	억제정도(%)
비처리군	0
포스포라미돈	35
실시예 1	32

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 한라송이풀 추출물의 엘라스타아제 활성 억제 정도가 대조군인 비처리군에 비하여 유의적으로 억제되었으며, 엘라스타아제 활성 억제제로 알려져 있는 포스포라미돈과 비교하여서도 동등한 정도의 효과가 나타나 본 발명의 한라송이풀 추출물의 엘라스타아제 활성 억제 효과가 우수함을 확인할 수 있다.

[시험예 2] 콜라게나아제(MMP-1) 저해능

본 발명의 한라송이풀 추출물의 콜라게나아제(MMP-1, 기질 메탈로프로테아제-1) 생성 저해능을 레티노익산과 비교하여 측정하였다.

2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 70~80% 정도 자랄 때까지 CO₂ 5%, 37℃ 배양기(incubator)에서 배양하였다. 한라송이풀 추출물을 10㎍/ml 농도로 24시간 동안 처리한 다음, 세포배양액을 채취하였다. 또한 비교를 위하여 레티노익산을 동일 농도로 처리한 것을 사용하였다.

상업적으로 이용가능한 콜라게나아제 측정기구(미국 아머샴파마샤 사, Catalog #: RPN 2610)를 이용하여 채취한 세포배양액의 콜라게나아제 생성 정도를 측정하였다. 먼저 1차 콜라게나아제 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채취한 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96-공 평판(96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, sigma)을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 발색반응을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띠게 되며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다.

노란색을 띠는 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하고, 하기 수학식 2에 의해 콜라게나아제의 합성 정도를 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 이때 조성물을 처리하지 않은 군에서 채취한 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.

화합물	발현정도(%)
비처리군	100
레티노익산	75
실시예 1	76

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 한라송이풀 추출물의 콜라게나아제 발현 정도가 콜라게나아제 발현 저해제로 알려져 있는 레티노익산과 비교하여서도 콜라게나아제 발현 저해 효과가 비슷한 수준임을 알 수 있다.

이와 같은 결과를 통하여, 본 발명의 한라송이풀 추출물은 기질 메탈로 프로테아제(MMP-1)를 저해시키는 효과를 가짐을 확인할 수 있다.

[참고예 1] 제형예 1 및 비교제형예 1의 제조

하기 표 3의 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조하였다(단위: 중량%).

배합성분	제형예1	비교제형예1
정제수	To 100	To 100
한라송이풀	0.1	-
식물성 경화유	1.50	1.50
스테아린산	0.60	0.60
글리세롤 스테아레이트	1.00	1.00
스테아릴 알코올	2.00	2.00
폴리글리세릴-10 펜타스테아레이트 & 베헤닐 알코올 &소디움 스테아로일 락틸에이트	1.00	1.00
아라키딜 베헤닐 알코올 &아라키딜글루코사이드	1.00	1.00
세틸아릴 알코올 & 세테아릴글루코사이드	2.00	2.00
PEG-100 스테아레이트 & 글리세롤올레이트 & 프로필렌글리콜	1.50	1.50
카프릴릭/카르릭 트리 글리세라이드	11.00	11.00
사이클로메디콘	6.00	6.00
방부제, 향	적량	적량
트리에탄올 아민	0.1	0.1

[시험예 3] 피부 탄력 향상 효능 확인

사람에서의 피부 탄력 향상 효과를 확인하기 위하여 상기 제형예 1과 비교제형예 1의 제형으로 다음과 같이 평가하였다.

30~40대의 건강한 여성 20명을 각각 제형예 1과 비교제형예 1의 2개 군에 대해 10명씩 2조로 나누어 영양크림을 매일 1회씩 12주간 안면에 도포하게 한 후, 피부탄력측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다. 표 4의 결과값은 Cutometer SEM 575의 ΔR8(R8(왼쪽)-R8(오른쪽)) 값으로 기재하였는데, R8 값은 피부 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.

실험제품	피부탄력효과
제형예 1	0.17
비교제형예 1	0.10

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 한라송이풀 추출물이 함유된 제형예 1은 비교제형예 1을 도포한 군에 비하여 피부 탄력성이 더 증가되었다.

따라서, 본 발명의 한라송이풀 추출물을 함유하는 조성물은 피부 탄력 향상에 매우 효과적임을 확인할 수 있다.

[시험예 4] 피부 주름 개선 효능 확인

본 발명의 조성물에 의한 사람에서의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 상기 제형예 1과 비교제형예 1을 이용하였다.

상기 제형예 1과 비교제형예 1의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 40대의 건강한 여성 20명을 각각 제형예 1과 비교제형예 1의 2개 군에 대해 10명씩 2조로 나누어 영양크림을 매일 1회씩 12주간 안면에 도포하게 한 후, 실리콘을 이용하여 레플리카를 떠서 주름의 상태를 피부측정기(visiometer, SV600, Courage+Khazaka electronic GmbH, Germany)로 측정하여 화상분석하였다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다. 하기 표 5의 값은, 도포 12주 후의 각각의 변수(parameter)값에서 도포 전 변수값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다.

사용 8주 후 임상 결과	R1	R2	R3	R4	R5
제형예 1	-0.29	-0.17	-0.12	-0.11	-0.05
비교제형예 1	0.04	0.03	0.01	-0.01	0.00

R1 : 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값

R2 : 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균

R3 : 5개씩 나눈 R1값 중 최고 값

R4 : 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각 각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값

R5 : 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각 각의 주름 윤곽을 뺀 값의 차이 값

상기 표 5에서 나타낸 바와 같이, 제형예 1의 외용제 조성물은 피부 주름 개선 효과가 아주 우수함을 알 수 있었다.

[시험예 5] 피부 보습력 증가 효과 측정

한라송이풀 추출물이 피부 보습력 증가에 미치는 효과를 측정하기 위하여, 상기 제형예 1 및 비교제형예 1을 이용하였고, 하기와 같이 평가하였다.

건조 피부로 분류된 40~50대 성인 남녀 20명을 각각 제형예 1 및 비교제형예 1의 2개 군에 대해 10명씩 2조로 나누어 영양크림을 매일 2회씩 4주간 안면에 도포하게 하였다. 도포 개시 전과, 도포 후 1주, 2주, 4주 경과한 시점, 그리고 도포를 중지한 2주 경과(총 6주 경과) 후에 항온, 항습 조건(24℃, 상대습도 40%)에서 피부수분량측정기(Corneometer CM825, C+K Electronic Co., 독일)로 피부수분량을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다. 표 6의 결과는 시험개시 직전에 측정한 피부 수분량 측정기 값을 기준으로 하여 일정기간 처치한 후의 측정값의 증가분을 백분율로 표시한 것이다.

시험군	수분 증가율 (%)
	1주 경과	2주 경과	4주 경과	6주 경과
제형예 1	35	39	38	32
비교제형예 1	30	32	32	15

상기 표 6의 결과를 보면, 비교제형예 1을 도포한 경우에는 도포가 이루어진 4주까지는 약 30% 정도의 수분 증가율을 보이지만, 도포를 중지한 후에는 피부수분량이 감소하는 반면, 한라송이풀 추출물을 함유한 제형예 1을 도포한 경우에는 도포를 중지한 후에도 대부분 30% 이상의 피부수분 증가율을 보임을 확인할 수 있다. 이를 통해 한라송이풀 추출물을 함유한 본 발명의 조성물은 피부 보습력 효과가 우수함을 알 수 있다.

[시험예 6] 각질형성세포 분화 촉진 효과 측정

한라송이풀 추출물의 각질형성세포의 분화 촉진 효과를 알아보기 위해, 하기와 같이 각질형성세포의 분화시 생성되는 CE(Cornified Envelop)양을 흡광도를 이용하여 측정하였다.

먼저, 신생아의 표피로부터 분리해 일차 배양한 사람의 각질형성세포를 배양용 플라스크에 넣어 바닥에 부착시킨 뒤 하기 표 7의 시험물질을 배양액에 5 ppm 농도로 처리한 후 세포가 바닥 면적의 70~80% 정도 자랄 때까지 5일간 배양하였다. 이때, 저칼슘(0.03mM) 처리군과 고칼슘(1.2mM) 처리군을 각각 음성 대조군, 양성 대조군으로 하였다. 그 다음 상기 배양한 세포를 수확하여 PBS(Phophate buffered saline)로 세척한 뒤 2% SDS(sodium dodecyl sulfate)와 20mM 농도의 DTT(Dithiothreitol)를 함유한 10mM 농도의 트리스-염산 완충액(Tris-HCl, pH 7.4) 1ml를 가하여 소니케이션(sonication), 보일링(boiling), 원심분리를 하고, 침전물을 다시 PBS 1ml에 현탁시켜 340nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이와 별도로 상기 소니케이션 후의 용액을 일부 취하여 단백질 함량을 측정하고, 세포 분화정도 평가시 기준으로 삼았다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

시험물질	각질형성세포에서의 분화능(%)
저칼슘(0.03mM) 용액 (음성 대조군)	100
고칼슘(1.2mM) 용액 (양성 대조군)	210
실시예 1	129

상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 한라송이풀 추출물을 처리한 경우 각질 형성 세포의 분화 촉진 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

[시험예 7] 피부 장벽기능 회복 효과 측정

한라송이풀 추출물이 피부 손상으로 인해 손상된 피부 장벽기능의 회복에 미치는 효과 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 성인 남녀 10명의 상박을 테이프 스트립핑(Tape Stripping) 방법을 이용하여 피부 장벽에 손상을 주고 각각 하기 표 8의 조성으로 제조한 제형예 2 및 비교제형예 2의 16개 군을 도포하면서 7일 동안 하루에 한번씩 경피수분손실량(TWEL)의 회복 정도를 Vapometer(Delfin, 핀란드)로 측정 비교하였다. 여기에서 비교제형예 2는 음성대조군으로서 비히클(vehicle)이다. 실험 결과는 하기 표 9에 나타내었다. 표 9의 결과는 장벽 손상 전과 장벽 손상 후의 처리전 차이를 100% 기준으로 하여 비교하였다.

배합성분	제형예 2	비교제형예 2
정제수	69	70
프로필렌글리콜	30	30
실시예 1	1

시험군	TWEL 변화 (%)
	처리전	1일	2일	3일	4일	5일	6일
제형예 2	100	117.5	83.2	51.9	30.8	25.3	12.9
비교제형예 2	100	121.4	112.7	98.3	70.5	62.3	43.5

상기 표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 한라송이풀 추출물을 처리할 경우 빠른 속도로 경피 수분 손실량이 정상으로 돌아오며 장벽 손상이 회복됨을 확인할 수 있다.

[시험예 8] 미백 효과

<티로시나제 저해 효과>

티로시나제 효소는 버섯류(Mushroom)로부터 추출된 것으로 시그마(SIGMA)사의 것을 사용하였다. 먼저 기질인 티로신을 증류수에 용해시켜 0.3mg/ml의 용액으로 만들고 그 용액을 1.0ml씩 시험관에 넣은 다음, 여기에 포타슘-포스페이트 완충용액(0.1mol 농도, pH 6.8) 1.0ml 및 증류수 0.7ml를 첨가하였다.

본 발명의 한라송이풀 추출물을 에탄올 용액에 적당농도로 혼합하여 준비한 시료액 0.2ml를 반응액에 넣은 다음 37℃ 항온조에서 10분 동안 반응시켰다. 이때 대조군은 각 시료액 대신 용매만을 0.2ml 넣은 것으로 준비하였고, 양성대조군으로는 아스코르브산을 사용하였다. 이 반응액에 2500유닛/ml의 티로시나제 용액 0.1ml씩을 넣고 다시 37℃ 항온조에서 10분 동안 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음물속에 넣어서 급냉시켜 반응을 중지시키고 광전분광분석계로 파장 475nm에서의 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다. 각각의 티로시나제 저해 효과는 하기 수학식 3으로 산출하였다.

시험물질	티로시나제 저해율(%)
대조군(무첨가)	0
아스코르브산	52
실시예 1	58

상기 표 10의 결과에서, 본 발명에서 사용되는 한라송이풀 추출물의 티로시나제 억제율이 공지된 티로시나제 저해제인 아스코르브산보다 높아 미백 효과가 우수함을 알 수 있었다.

<B16/F10 멜라노마 세포를 이용한 멜라닌 생성 억제 효과>

상기 실시예 1 및 비교물질인 코지산을 각각 0.001중량%로 함유한 시료를 시험물질로 하여 일정 농도로 B16/F10 멜라노마 세포(한국세포주은행)의 배양액에 첨가하여 3일간 배양한 후 배양액을 제거하고 PBS로 세척하고 1N NaOH로 세포를 녹여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 시험물질을 첨가하지 않은 세포를 대조군으로 하여 대조군에서의 멜라닌 함량과 비교하여 각 시험물질의 멜라닌 생성 저해 정도를 측정하였다. 수학식 4에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하여 그 결과를 표 11에 나타내었다.

시험물질	멜라닌생성 저해율(%)
대조군(무첨가)	0
코지산	53
제형예 1	43

상기 표 11의 결과에서, 본 발명에 의한 한라송이풀 추출물을 함유하는 제형예 1의 화장료 조성물의 멜라닌 생성 억제율이 공지된 멜라닌 생성 저해제인 코지산과 유사한 수준을 보여 미백 효과가 우수하다는 것을 알 수 있었다.

[참고예 2] 제형예 3 및 비교제형예 3의 제조

하기 표 12의 조성에 따라 통상적인 방법으로 로션을 제조하였다(단위: 중량%).

원료명	제형예 3	비교제형예 3
1.세테아릴알코올	1.0	1.0
2.친유형글리세릴스테아레이트	1.0	1.0
3.글리세릴스테아레이트SE	1.5	1.5
4.피토스쿠알란	3	3
5.하이드로지네이티드폴리데센	2	2
6.디메치콘	0.5	0.5
7.폴리소르베이트 60	1	1
8.소르비탄세스퀴올리에이트	0.4	0.4
9.메칠파라벤	0.1	0.1
10.프로필파라벤	0.05	0.05
11.정제수	To 100	To 100
12.부틸렌글리콜	5	5
13.폴리아크릴레이트-13* 폴리이소부텐* 폴리소르베이트 20	0.5	0.5
14.한라송이풀 추출물(실시예 1)	1	-

[시험예 9] 인체 피부에 대한 미백 효과 실험

건강한 12명의 남자를 대상으로 피검자의 상박 부위에 가로, 세로 각각 1.5㎝인 정사각형의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5 내지 2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하였다.

조사 후 시험물질로 상기 제형예 3 및 비교제형예 3을 바르고, 한 곳은 아무 것도 바르지 않는 대조군 부위를 마련하여 8주 동안 상태변화를 관찰하였다. 4주, 6주, 8주에 피부의 색깔을 색차계 CR2002(일본, 미놀타 사)로 측정하였다. 도포 시작시점과 완료시점에서의 피부색의 차이(△L*)를 하기 수학식 5에 따라 계산하고, 그 결과를 표 13에 나타내었다. 미백효과는 시료 도포 부위와 대조군 부위의 △L*의 비교로 판정하였다.

구분	피부색 밝기 정도(△L*)
측정 주	4주	6주	8주
제형예 3	0.3	0.8	1.5
비교제형예 3	0.2	0.6	1.2

상기 표 13에서 알 수 있듯이, 본 발명의 한라송이풀 추출물을 함유하는 제형예 3은 한라송이풀 추출물을 함유하지 않는 비교제형예 3보다 인체 피부에 대한 미백 효과가 월등히 높음을 확인할 수 있다.

Claims (7)

1. 한라송이풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 한라송이풀 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001~50중량%의 양으로 함유되는 피부 외용제 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 미백용인 피부 외용제 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항노화용인 피부 외용제 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 탄력 향상용인 피부 외용제 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 주름 개선용인 피부 외용제 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 보습용인 피부 외용제 조성물.