KR20130055580A

KR20130055580A - 기도의 염증 및 이상성 점액섬모 전달의 치료법으로서의 에어로졸화 댑손

Info

Publication number: KR20130055580A
Application number: KR1020127026909A
Authority: KR
Inventors: 브루스 케이. 루빈; 소이치로 가노; 츠요시 다나베
Original assignee: 버지니아 커먼웰스 유니버시티
Priority date: 2010-03-15
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2013-05-28
Also published as: US20150040894A1; CA2793170A1; KR101924162B1; BR112012023877A2; CA2793170C; WO2011115778A2; AU2011227613A1; WO2011115778A9; EP2547335A4; JP5908884B2; AU2011227613B2; JP2013522295A; US20180243213A1; US20130005822A1; EP2547335A2

Abstract

기도 염증, 특히 만성 호중구 중심의 염증을 치료하기 위해 에어로졸화된 댑손 (또는 별법으로, 댑손의 수성 포뮬레이션)이 사용된다. 본 발명 방법에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질병에는 만성폐쇄성 폐질환(COPDs), 천식, 낭성섬유증 등을 들 수 있다.

Description

기도의 염증 및 이상성 점액섬모 전달의 치료법으로서의 에어로졸화 댑손{AEROSOLIZED DAPSONE AS A THERAPY FOR INFLAMMATION OF THE AIRWAY AND ABNORMAL MUCOCILIARY TRANSPORT}

본 발명은 일반적으로 기도 염증 및 기도 염증에 의해 특징지어지는 증상의 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생체내 투여시 포유동물의 기도 염증을 감소시키는, 에어로졸화 댑손(또는 댑손의 수성 포뮬레이션)을 제공한다.

기도 염증과 관련된 질환, 특히 천식, 낭성섬유증, 폐기종 및 만성폐쇄폐질환과 같은 만성 염증성 질환은 심신을 약화시키며 치료하기가 복잡하고 비용도 많이 든다. 호중구가 두드러지는 감염에 의해 일반적으로 특징지어지는 이들 질환을 치료하는데 이용되는 현행 치료법의 예로는 면역계의 과활성화를 억제하기 위하여 스테로이드를 사용한다던지, 마크롤리드 항생제를 투여하는 것을 들 수 있다. 그러나, 이들 치료법은 두가지 모두 결점이 있다. 스테로이드는 일반적으로 면역계를 억제하므로, 이들을 사용할 경우 환자의 감염 위험성 (예컨대, 기회 감염)이 높아진다. 마크롤리드 항생제를 사용하면 마크롤리드-내성 박테리아의 출현 위험성이 급등한다. 따라서, 보다 개선된 기도 감염 치료법이 시급하다.

합성 술폰인 댑손(댑손:디아미노-디페닐 술폰)은 나병, 사람폐포자충(Pneumocystis jiroveci: 이전에는 P. carinii라 칭하였음) 폐렴 및 말라리아와 같은 다양한 질병을 치료하는데 성공적으로 사용되고 있다. 댑손은 또한 소염제로도 인식되어 있으며 예컨대 포진피부염과 같은 호중구 중심의 염증(neutrophil-dominated inflammations)이라는 특징을 갖는 피부 질환을 전신 또는 국소적으로 치료하는데 모두 사용되어왔다 (Zhu 외, 2001).

Berlow 등 (1990)은 경구 투여형 댑손을 사용하여 스테로이드-의존성 천식을 치료하는 것에 관하여 설명한 바 있다. 스테로이드-의존성 천식 증세를 나타내는 환자의 경우 스테로이드 투약을 중단하면 병증이 재발할 뿐만 아니라, 스테로이드를 특히 장기간 사용할 경우 그에 따른 부작용의 위험도 따른다. 이 연구 결과 10명의 환자 중 9명이 댑손을 투여받는 동안 스테로이드 투여를 실질적으로 중단하거나 또는 투여량을 감소할 수 있었다. 그러나, 경구 (즉, 전신 경로) 투여로 인해 10명의 환자들 중 9명에게서 심각한 빈혈이 일어났다.

Chougule 등 (2008)은 댑손의 스프레이 건조형 리포좀 건조분말 흡입기 포뮬레이션을 개발에 관하여 연구 조사하면서, 이 포뮬레이션으로 P. carinii 감염의 치료 가능성에 대하여 언급하였다. 이 연구의 목적은 스프레이 건조된 포뮬레이션의 시험관내 침적(deposition)을 평가하기 위한 것이었다. 그 결과 연구자들은 맞춤식 확산 셀을 이용하여 평가했을 때 셀로판막을 통해 장기간 (최대 16시간) 방출되는 것으로 나타난 댑손의 스프레이 건조형 포뮬레이션을 개발할 수 있었다. 시판되는 앤더슨 캐스케이드 임팩터 장치를 이용하여 에어로졸 성능 역시도 평가되었다. 연구자에 의하면, 그 결과는 "유망"한 것으로 나타났다. 그러나, 이들 결과들은 극히 예비적인 것이며; 어떠한 생체내 검사도 수행되지 않았고, 염증에 대한 어떠한 효과도 입증되거나 시사되지 않았다.

따라서, 이제까지의 종래기술은 에어로졸화 댑손 포뮬레이션을 이용한 호중구 중심의 기도 염증을 치료하는 방법을 제공하지 못하였다.

본 발명은 댑손의 에어로졸화 (또는 수성) 포뮬레이션을 이용하여 기도의 염증, 특히 호중구 중심의 염증을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 이러한 방식으로 포유동물에게 댑손으르 투여할 경우, 병에 걸린 개체의 기도에서 호중구 중심의 염증과 연관된 증상이 해소 (예컨대 감소, 약화 또는 저감)되었음을 최초로 입증하였다. 또한 본 발명에 의하여 댑손의 작용 모드, 즉 댑손이 면역억제제로서라기 보다는 면역조절제로서 기능한다는 것을 최초로 입증되었다. 따라서, 염증 치료를 위하여 예컨대 스테로이드 대신 댑손을 투여할 경우 치료를 받는 환자에 있어서 감염 위험성이 증가할 확률이 줄어든다. 뿐만 아니라, 이 화합물은 미생물에 선택적인 압력을 가하지 않기 때문에, 댑손을 사용한다고 해서, 항생제 내성인 박테리아 균주가 생기는 것도 아니다. 본 발명에서 입증되는 바와 같이, 경구 및 에어로졸 댑손 두가지 모두 LPS-유발형 상피내 호중구 축적을 감소시켰으나, 에어로졸 댑손으로 치료한 경우에만 점액섬모 전달(mucociliary transport)이 정상상태로 (그리고 경구 투여시 필요한 것도 더 적은 양으로) 회복되었다. 또한, 댑손의 전달로 표적화된 이러한 접근 방법은 댑손의 경구, 전신 전달 (예컨대 빈혈)에 의해 야기되는 원치않는 부작용의 위험성도 더 낮다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 댑손의 기도용 포뮬레이션을 투여함으로써 기도의 염증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 댑손은 IL-8과 IL-13을 억제함으로써 면역조절 (면역억제가 아니라) 효과를 발휘하는 것으로 믿어지지만 특정 이론에 구애되는 것은 아니다. IL-8은 시스테인-X-시스테인(CXC) 케모카인 패밀리에 속하는 멤버로서, 가장 강력한 호중구 화학유인물질 중 하나로 작용한다. 따라서, IL-8 활성이 약화되면 염증 부위에 대한 호중구의 소집(recruitment)이 감소 또는 저하되어, 그 부위에서의 호중구-중심의 염증이 감소 또는 저하된다. IL-13은 천식에 있어서 술잔세포 증식을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이 과정의 억제는 기도 염증 증상을 제어하는데 도움이 되는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 방법은 감염 억제를 위해 스테로이드를 사용하는 것에 비해 유리한데, 이는 스테로이드는 면역억제제임으로 해서, 이들을 사용할 경우 염증은 감소될 수 있으나, 이들의 사용이 면역억제를 결과시킴으로 해서, 감염(예컨대 기회 감염) 위험성이 증대될 수 있기 때문이다. 마찬가지로, 댑손의 사용은 마크롤리드 항생제를 사용하는 것에 비해 유리한데, 이는 댑손 사용은 마크롤리드-내성 박테리아의 출현에 기여하지 않기 때문이다. 이에 더해, 상기 입증된 바와 같이, 경구 및 에어로졸 댑손은 두가지 모두 LPS-유도된 상피내 호중구 축적을 감소시키지만, 에어로졸 댑손을 이용한 치료의 경우에서만이 점액섬모 전달을 정상상태로 복귀시켰다 (점액섬모 소거, 호흡기 상피 상에 존재하는 섬모에 의해 수행되는 기관의 자기-청소 메카니즘은 기도 표면의 건강 상태를 알리는 표시자이다). 따라서, 에어로졸화 댑손이 이러한 중요한 기능을 복구시키는데 있어서 경구 투여된 댑손보다 우수하다는 발견은 매우 중요한 의미를 가진다.

또 다른 구체예에서, 댑손은 예컨대 후술하는 댑손을 함유하는 생리적으로 허용가능한 수성 담체에 혼입되어 투여된다.

본 발명의 방법을 실시하면 에어로졸화 댑손 제제로 치료된 대상자의 기도에서 염증 증상이 감소한다. 이러한 투여에 의하여 IL-8이 억제되고 점액섬모 전달 및 청소 기능이 복구된다. 감소 (저하, 약화, 해소 등)는 완전할 수 있으나 (즉, 증상이 전적으로 사라질 수 있음), 항상 그러한 것은 아니다. 당업자들은 증상이 예컨대 환자로 하여금 정상적이거나 정상에 가까운 활동을 재개할 수 있을 정도만이라도 증상이 약화되거나 부분적으로 호전되면 환자에 있어서 큰 도움이 되리라는 것을 쉽게 이해할 것이다. 당업자들은 폐활량, 기도 폐쇄 정도, 혈액의 산소화 농도를 측정하거나, 증상의 존재/부재 및/또는 빈도를 관찰하고 (예컨대 쌕쌕거림, 재채기 등), 여러가지 조영 기술과 기타 기술을 함으로써, 이러한 치료 효과를 평가 및 판단하는데 익숙할 것이다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 염증 증상을 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 심지어 100% 감소시킨다.

본 발명의 방법은 환자 또는 대상자의 호흡기에 생리적으로 상용가능한(compatible) 댑손의 에어로졸 조성물 (또는 또 다른 구체예에서는 댑손을 수성 캐리어 중에 담지시킴)을 투여하는 것을 포함하여 이루어진다. "호흡기(respiratory system)"라는 용어는 폐속으로 또는 폐 밖으로 공기(대개는 산소가 풍부한 공기)를 전달하고 폐로부터 나오는 폐기물, CO₂가 풍부한 공기를 담지하는데 참여하는 모든 오리피스 및 통로 뿐만 아니라 폐 자체도 의미하는 것이다. 예를 들어, 여기에는 코와 비강, 입, 후두, 기관, 기관지 및 세기관지, 이들의 브랜치, 및 폐포 소기도 (예컨대, 섬유근벽이 있는 비연골성 연결 기도인 막세기관지; 및 슴유근벽이 부분적으로 폐포화된 기도인 호흡기 세기관지)가 포함된다. 에어로졸화 댑손을 투여할 수 있는 2가지 천연 오리피스는 코와 입이며, 이들의 단독 또는 양쪽 모두에 의한 투여 경로가 본 발명에 포괄된다. 그러나, 에어로졸은 외과수술(예컨대 기관절개술)을 통해 열려진 개구부에, 심지어 예컨대 삽관에 의해 폐로 직접 투여될 수 있다.

이와 같이, 전달은 비제한적인 예로서 구강 흡입기(건조 분말 흡입기, 계량형 흡입기 등), 페이스 마스크, 비내 또는 기관내 튜브, 분무기 등을 비롯하여 널리 알려진 에어로졸 투여 장치를 이용함으로써 투여될 수 있다. 선택되는 장치의 유형은 예컨대 에어로졸이 환자에 의해 자가 투여되는지 또는 예컨대 급성 발작 또는 위기 상황인지, 의료진에 의해 전달되는지에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 만성 질환 치료의 경우, 사용되는 장치는 환자의 자가 투여에 적합한 것이 될 것이다. 이러한 투여는 기술 분야에 알려진 몇가지 종류나 스타일의 에어로졸 전달 장치를 사용하여 행해질 수 있다. 이들 장치의 비제한적인 예로는 약물이 추진제 (예컨대 134a 또는 227과 같은 플루오로카본, 가압 공기, 알칸 등)를 함유하는 가압된 카니스터의 용액 중에 가장 흔히 보관되는 (그러나 현탁액일 수도 있음)계량형 흡입기(MDI: metered-dose inhalers, 예컨대 "파퍼(puffers)"); 투여분량의 약물을 분말 에어로졸로서 방출시키는 건조분말 흡입기 (DPI: dry powder inhalers); 투여분량의 약물을 수성 포뮬레이션으로부터 만들어진 에어로졸로서 공급하는 분무기를 들 수 있다. 장치는 에컨대 일회 또는 다회 투여일 수 있으며, 일회용 또는 재사용가능한/재충전가능한 것일 수 있으며, 다양한 재료 및 다양한 모양으로 만들어질 수 있고 여러가지 메카니즘 (예컨대 호흡정지형, 호흡작동형, 등)에 의해 작동할 수 있다.

몇가지 구체예에서, 본 발명에 사용되는 흡입 장치들은 호흡작동형(breath actuated), 즉, 에어로졸화 포뮬레이션의 전달이 환자가 실제로 흡입하는 기간 동안에만 일어나는 유형이다. 본 발명을 실시하는데 적합한 이러한 호흡작동형 흡입 장치의 대표적인 예는 캘리포니아 써니베일에 소재하는 Aerogen, Inc.사로부터 구입가능한 Arodose^TM 흡입기이다. 이 흡입기는 압전식 오실레이터에 의해 구동되는 다공성막을 이용하여 에어로졸을 발생시킨다. 사용가능하나 기타의 흡입기 또는 분무기 장치로는 통상적인 에어-제트 분무기, 예컨대 PARI LC PLUS^TM 제트 분무기 (PARI GmbH, Stamberg, Germany); 및 기타 기술 분야에 알려진 것들을 들 수 있다. 다음의 미국특허, 즉: 7,740,463; 7,683,029; 7,497,214; 7,223,381; 7,163,014; 7,040,314; 6,932,962; 6,743,413, 및 6,575,162에는 에어로졸 전달을 위한 다양한 시스템, 장치 및 조성물이 설명되어 있으며 상기 문헌들은 그 전체가 본 발명에 참조 병합된다.

본 발명에서 "에어로졸"이라 함은 가스상 매질 중의 고체 또는 액체 입자의 현탁액을 의미한다. 여기서, 이 용어는 예컨대 "미스트", "분무된 포뮬레이션" 등을 모두 포괄한다. 본 발명에 따라 투여되는 포뮬레이션은 이를 필요로 하는 환자에게 에어로절화 전달하기에 적합한 것이다. 따라서, 포뮬레이션은 생리적으로 사용가능한 것들이다. 적어도 포뮬레이션은 댑손 플러스 생리적/생물학적으로 상용가능하거나 적합한 담체를 함유한다. 포뮬레이션 중의 댑손의 양은 다양할 수 있으나, 일반적으로 약 1 내지 99% (wt/vol)이다.

환자의 폐에 전달되기에 적합한 포뮬레이션은 일반적으로 전달시 가스상 매질 중에 현탁된 댑손을 포함하는 고체 입자 또는 전달시 가스상 매질 중에 현탁된 댑손을 포함하는 액적을 함유한다. 댑손의 시판 공급원은 당업자에게 잘 알려져 있다. 당업자들에게는 또한 활성성분인 댑손에 더해 1종 이상의 부가적인 성분들을 함유할 수 있는 이러한 포뮬레이션의 생산 및 제조업제에 대해서도 잘 알려져 있다. 액상 담체가 사용될 경우, 이것은 생리적으로 상용가능한 pH (예컨대 약 6.5 내지 8.0, 대개는 약 7.3-7.4)로 완충된 멸균 식염수 또는 식염수일 수 있다. 부가적인 첨가 성분의 비제한적인 예로는: 안정화제, 보존제, 다양한 제약용 유기 및 무기 부형제, 예컨대 폴리머, 저분자량 올리고머, 천연물질, 습윤제 및 계면활성제, 특히 비이온 및 이온 계면활성제를 들 수 있다. 부가적인 첨가 성분(표면 변형제일 수 있다)의 대표적인 예로는 세틸 피리디늄 클로라이드, 젤라틴, 카제인, 레시틴(포스파티드), 덱스트란, 글리세롤, 아카시아검, 콜레스테롤, 트라가칸트, 스테아르산, 벤잘코늄 클로라이드, 칼슘 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 세토스테아릴 알코올, 세토마크로골 유화용 왁스, 소르비탄 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (예컨대 세토마크로골 1000과 같은 마크로골 에테르), 폴리옥시에틸렌 카스터 오일 유도체, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르9예컨대 시판되는 Tweens, 예컨대 폴리소르베이트 20, 시판명 Tween

20 및 Tween 80

(ICI Specialty Chemicals)); 폴리에틸렌 글리콜(예컨대 Carbowaxs 3350

및 1450

및 Carbopol 934

(Union Carbide)), 도데실 트리메틸 암모늄 브로마이드, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 콜로이드형 이산화규소, 포스페이트, 소듐 도데실설페이트, 카르복시메틸셀룰로스 칼슘, 히드록시프로필 셀룰로스 (HPC, HPC-SL, 및 HPC-L), 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC), 카르복시메틸셀룰로스 소듐, 메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스 프탈레이트, 비정질 셀롤로스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 트리에탄올아민, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 4-(l,l,3,3-테트라메틸부틸)-페놀 폴리머와 에틸렌 옥사이드 및 포름알데히드 (틸록사폴, 수페리온 및 트리톤이라고도 알려져 있음), 폴록사머 (예컨대 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드와의 블록 코폴리머인 Pluronics F68

및 F108

); 폴록사민(예컨대, Tetronic 908

, 에틸렌디아민에 프로필렌 옥사이드와 에틸렌 옥사이드를 순차 첨가하여 유도된 4관능성 블록 코폴리머인 Poloxamine 908

이라고도 알려져 있음 (BASF Wyandotte Corporation, Parsippany, N.J.)); 하전된 인지질, 예컨대 디미리스토일 포스파티딜 글리세롤, 디옥틸설포숙시네이트(DOSS); 테트로닉1508

(T-1508) (BASF Wyandotte Corporation), 소듐 설포숙신산의 디알킬에스테르(예컨대, 소듐 설포숙신산의 디옥틸 에스테르인 Aerosol OT

(American Cyanamid)); 소듐 라우릴 설페이트인 Duponol P

(DuPont); 알킬 아릴 폴리에테르 설포네이트인 Tritons X-200

(Rohm 및 Haas); 수크로스 스테아레이트와 수크로스 디스테아레이트와의 혼합물인 Crodestas F-110 (Croda Inc.); Olin-10G

또는 Surfactant 10-G

이라고도 알려져 있는 p-이소노닐페녹시폴리-(글리시돌) (Olin Chemicals, Stamford, Conn.); Crodestas SL-40

(Croda, Inc.); 및 C_l8H₃₇CH₂(CON(CH₃)-CH₂(CHOH)₄(CH₂OH)₂　(Eastman Kodak Co.)인 SA90HCO; 데카노일-N-메틸 글루카미드; n-데실 β-D-글루코피라노사이드; n-데실 β-D-말토피라노사이드; n-도데실 β-D-글루코피라노사이드; n-도데실 β-D-말토사이드; 헵타노일-N-메틸글루카미드; n-헵틸-P-D-글루코피라노사이드; n-헵틸 β-D-티오글루코사이드; n-헥실 β-D-글루코피라노사이드; 노나노일-N-메틸 글루카미드; n-노일 β-D-글루코피라노사이드; 옥타노일-N-메틸글루카미드; n-옥틸 β-D-글루코피라노사이드; 옥틸 β-D-티오글루코피라노사이드; 등을 들 수 있다. 틸록사폴이 폐 또는 비내 전달에 특히 바람직한 표면 변형제이며 분무형 요법에서는 더욱 그러하다. 이들 화합물 대부분은 공지의 제약용 부형제들이며 본 발명에 참조된 미국약사협회(the American Pharmaceutical Association)와 영국 약사회(The Pharmaceutical Society of Great Britain)에 의해 공동발간된 Handbook of Pharmaceutical Excipients (The Pharmaceutical Press, 1986)에 상술되어 있다. 이들은 시판되고/시판되거나 공지 기술에 의해 제조될 수 있다.

이에 더하여, 댑손 에어로졸은 예컨대, 소염 특성 (또는 기타 특성)이 있는 다른 화합물, 예컨대, 스테로이드, 항생제 (예컨대 마크롤리드), 충혈완화제, 항암제 등과 같은 기타 생물학적 활성 성분을 함유하거나 이들과 배합될 수 있다. 별법으로, 에어로졸 댑손 포뮬레이션은 동일한 포뮬레이션 중에 포함되지 않는다 해도 이러한 생물학적 활성 성분과 병용될 수도 있다.

환자에 의하여 (또는 환자를 돌보는 헬스케어 전문가) 유지되는 전달 스케쥴은 예컨대 치료되는 질병 또는 상태, 증상의 위중도; 환자의 연령, 성별 및 체중; 준수성 등을 획득 또는 극대화하기 위한 투여 스케쥴링의 편이성 등과 같은 몇가지 요소에 의해 변할 수 있다. 일반적으로, 투여는 1일 2-4회 (예컨대 매 12시간, 매 8시간 또는 매 4시간 마다) 이루어질 수 있으나, 경우에 따라서는 이보다 더 적은 빈도 (예컨대 하루 오직 1회) 또는 더 자주 (예컨대 매 2시간 마다) 투여할 수 있다. 각각의 투여 기간은 전달되는 양, 사용되는 장치의 유형 등에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 투여에 소요되는 시간은 약 5-30분, 예컨대 약 5, 10, 15, 20, 25 또는 30분이 걸린다. 그러나, 몇몇 급속 전달 장치를 이용할 경우 전달에 단지 수분(예컨대 1-4분)이 걸리는 경우도 있다. 또한, 몇몇 환자 (예컨대 급성 천식 발작을 경험하는 환자)의 경우, 그 환자가 입원되도록 이동될 때까지, 또는 환자가 의료진에 의해 안정화될 때까지 보다 긴 기간 동안 지속적으로 투여가 이루어질 수도 있다. 숙련된 의료전문가 (예컨대 의사, 호흡기 치료사 등)는 이러한 인자들을 숙지하고 있으며 따라서 치료 프로토콜을 기획 및 조정할 수 있다.

1회 투여시 전달되는 댑손의 투여량 역시도 여러가지 인자, 예컨대 치료하고자 하는 딜병이나 증상, 증상의 위중도; 환자의 연령, 성별 및 체중; 치료받는 환자의 관용성; 등에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 흡입에 의해 투여되는 양은 1회 투여 세션 당 약 0.5 to 약 5 mg/kg 체중, 예컨대 약 0.5 내지 약 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 또는 5.0 mg/kg 체중, 흔히 약 2 mg/kg 체중이다.

본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 질환에는 다양한 기도 염증, 특히, 호중구 중심의 염증을 들 수 있으며 이의 비제한적인 예로는 기관지 튜브가 좁아져서 공기의 폐 내외로의 이동을 곤란하게 하는 각종 폐쇄성 폐질환, 예컨대; 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD) 및 천식 (지속성 만성 천식, 위중함 천식 및 천식 "돌발성(flare-ups)" 또는 급성 발작, 특히 호중구성의 위중한 천식); 낭성섬유증, 기관지 확장증, 폐쇄세기관지염; 폐섬유증(예컨대 특발성 폐섬유증 폐기종; 급성 호흡곤란증후군; 기관지염; 만성 기관지염; 만성부비동염; 비부비동염 및 만성 비부비동염; 만성 기도감염; 독성 흡입손상 등을 들 수 있다. 염증을 촉발하는 비제한적인 원인으로는 담배연기 또는 간접 흡연에 대한 노출; 석탄광, 금광 및 면직물 산업 및 화학약품 예컨대 카드뮴, 이소시아네이트 및 용접시 나오는 흄 등, 작업장의 분진에 대한 직업 노출; 대기오염에 대한 노출 (예컨대 이산화황, 일산화탄소, 숫(soot), 분진 등의 소립자); 실내 공기오염, 예컨대 조리시 발생되는 연기 및 주방에서 나오는 연기; 유전적 감수성(예컨대 알파 1-안티트립신 결핍증; 및 자가면역반응 (예컨대 자가항에 및 자가반응 T 세포에 의해 매개되는 지속적인 염증); 알레르기성 면역반응 및/또는 예컨대 집먼지 진드기, 애완동물의 비듬, 꽃가루, 식품, 곤충에 쏘이거나 물리는 등; 및 기타의 원인을 들 수 있다.

본 발명의 방법은 기도 염증을 앓는 환자에게 댑손의 에어로졸화 포뮬레이션을 투여하는 것을 포함하여 이루어진다. 이러한 환자들은 일반적으로 포유동물, 대개 인간이지만, 반드시 이들로 한정되는 것은 아니다. 수의과용 용도 역시도 본 발명에 포괄된다.

본 발명의 방법은 일반적으로 기도 염증 또는 비정상적인 점액섬모 전달증 (MCT) (예컨대 기저 수준 또는 정상보다 느린 MCT), 특히 호중구가 모종의 역할을 하는 염증에 걸린 환자들을 동정하는 것을 포함한다. 이러한 질병의 비제한적인 예로는 낭성섬유증, 기관지 확장증, 폐쇄세기관지염, 폐기종, 만성 기관지염, 만성 비부비동염, 독성 흡입손상, 만성 폐쇄성폐질환, 특발성 폐섬유증, 천식 및 만성 기도 염증을 들 수 있다. 본 발명의 방법은 병에 걸린 환자의 기도에 기도 상피 세포, 특히 상피 섬모에 접촉하기 위하여, 댑손을 투여함으로써 실시된다. 본 발명의 방법에 의해 일반적으로 IL-8 과발현이 저하 또는 감소된다 (즉, 본 발명의 방법은 정상, 컨트롤 또는 기초 수준보다 높은 수준으로 IL-8 mRNA가 발현하는 것을 방지한다). 그 결과, 이러한 과발현에 기인하는 질병 증상이 ILp-8 과발현과 연관된 질병을 앓는 환자들에서 약화된다. 예컨대, 점액섬모 전달이 정상적으로 또는 정상에 가까운 수준으로 회복된다. 당업자들은 특정 인자, 예컨대 호흡 특성; 폐 및 기도의 영상 분석; 혈중 산소, C0₂, 등의 농도; 환자의 자가 보고현황; 생검; 가래 분석; 및 기타의 인자들을 관찰 및/또는 측정함으로써 이러한 환자들을 평가, 동정 및/또는 진단하는 방법과 검사법을 잘 알고 있다. 일단 환자가 에어로졸 댑손 치료법에 알맞는 후보로 동정되면, 보통 의료 전문가가 그 환자에 적합한 투여량 및/또는 투여 스케쥴을 처방하고 가능한 경우 흡입기의 사용 지침 또는 사용 시범을 알려준다. 이어서 의료 전문가는 에어로졸 투여 결과를 모니터링한다. 투여량 및/또는 투여 빈도는 그 질환의 임상적인 증상을 제어 또는 해소하기 위한 프로그레스에 대한 치료법에 대한 환자의 반응 또는 응답에 따라 조정될 수 있다. 치료 기간은 환자마다 상이할 수 있으며 또는 환자 개인에 있어서도 시간대를 달리할 수 있으며 장기간 또는 단기간이 소요될 수 있다. 흔히, 흔히 치료되는 증상의 만성적인 특성으로 인해, 에어로졸 댑손 치료법은 장기간 이어지며 에컨대 수주일 또는 수개우러 또는 수년 또는 심지어는 환자의 남은 일생동안 계속 이어질 수도 있다.

당업자들은 환자의 기도로 활성제를 전달하는 것이 반드시 에어로졸화 포뮬레이션을 이용하여서만 수행되는 것은 아님을 잘 이해할 것이다. 예컨대, 약물의 인스톨레이션 (예컨대 기관절개 튜브, 코 튜브 등과 같은 기존의 도관을 통해)은 예컨대 생리적으로 허용가능한 액상 담체 중의 댑손과 같이 수성 포뮬레이션을 사용할 것을 필요로 할 수 있다. 당업자들은 에어로졸의 전술한 제조법과 관련한 다양한 특성들을 공유하는 이러한 포뮬레이션의 제조방법을 숙지하고 있다 (예컨대 제제 중에 존재하는 활성제 및 부형제의 양; pH; 치료하고자 하는 질환; 환자의 동정, 진단 및 모니터링; 투여 스케쥴; 다른 제제와의 병용 투여; 등). 그러나, 이러한 제제는 "건조 분말"이 아니라 액체이다. 이러한 포뮬레이션의 투여 경로 및 투여방법의 비제한적인 예로는: 흡입; 수동 분배되는 코에 사용되기 위한 미스트 또는 스프레이 (예컨대 용기 또는 장치를 수동으로 쥐어짜거나 펌핑함으로써 전달됨); 점비(nasal drops) 또는 비세정(nasal irrigation) 등을 들 수 있다.

도 1A-C. 배양 중 NHBE 세포로부터의 IL-8 분비에 미치는 댑손의 효과. 성장인자를 LPS 또는 댑손 노출 24시간 전에 배양배지로부터 회수하고, 상등액을 LPS 자극 24시간 후에 수확하였다. A: LPS 10 μg/ml는 IL-8을 유의적으로 증가시켰고 댑슨 0.3, 1 또는 10 μg/ml은 이 효과를 억제하였다: B 댑손 1 μg/ml은 24, 48 및 72시에서 기저 IL-8에 영향을 미치지 않았다. C: 댑손 1 μg/ml는 24시와 72시에 LPS-유도된 IL-8 분비를 대조군 수준으로까지 억제하였다. 값들은 평균 ± SE이다. n = 6. *P < 0.05, ***P < 0.001 대조군과 비교시 (Cont). HP < 0.05, ##P < 0.01 LPS 단독과 비교시.
도 2A-D. 공기-액체 계면 조건 하에서 배양된 NHBE 세포로부터 LPS-유도된 첨단측(apical)(A, C) 또는 기저측(basolateral) (B, D) IL-분비에 미치는 댑손과 덱사메타손(DEX)의 효과. NHBE 세포들을 댑손 1 μg/ml (A, B) 또는 DEX 0.1 μg/ml (C, D)의 존재 및 부재 하에 배지에서 인큐베이션시켜 첨단측(AP) 또는 기저측 (BL)으로부터 24시간 동안 LPS 10 μg/ml로 자극시켰다. A: AP-LPS는 첨단측 IL-8 분비를 유의적으로 증가시켰는데, 이는 댑손에 의해 억제된 효과였다. B: AP- 및 BL-LPS는 기저층 IL-8 분비를 유의적으로 증가시켰는데, 이는 댑손에 의해 억제된 효과였다. 값들은 평균치±SE, n = 6 (댑손의 경우)였다. ***P < 0.001 대조군과 비교시. #P < 0.05, ###P < 0.001 LPS 단독과 비교시. C: AP-LPS는 첨단측 IL-8 분비를 유의적으로 증가시켰다. DEX는 기저측 IL-8 수준 뿐 아니라 LPS-유도된 IL-8 분비도 억제하였다. D: AP- 및 BL-LPS는 기저측 IL-8 분비를 유의적으로 증가시켰는데, 이 효과는 DEX에 의해 억제되었다. DEX는 또한 기저측 IL-8 수준도 억제하였다. 값들은 평균치 ± SE, n = 4 였다. (DEX의 경우). *P < 0.05, **P < 0.001 대조군과 비교시. #P < 0.05 LPS 단독과 비교시.
도 3. LPS-유도된 IL-8 mRNA 발현에 미치는 댑손의 효과. 성장인자들을 LPS, 댑손 또는 덱사메타손 (DEX)에 노출시키기 24시간 전에 배양 배지로부터 회수하였다. NHBE 세포들을 LPS 10 μg/ml, 댑손 0.3-10 μg/ml, DEX 0.1 μg/ml 또는 이들의 조합으로 4 시간 동안 자극시켰다. 댑손 1 g/ml는 기저측 IL-8 mRNA 수준에는 영향을 미치지 않았으나, DEX는 이것을 감소시켰다. LPS 10 μg/ml는 IL-8 mRNA 발현을 5배 이상 증가시켰는데, 이 효과는 댑손 1 및 10 μg/ml 및 DEX 0.1 μg/ml에 의해 억제되었다. 데이터는 대조군과 비교한 폴드 변화로서 표현하였다. 값들은 평균치 ± SE, n = 4 였다. n = 4. *P < 0.05, ***P < 0.001 대조군과 비교시. #P < 0.05, MP < 0.01 LPS 단독과 비교시.
도 4. 24 시간에 걸친 LPS- 유도된 MAPK 활성화에 미치는 댑손의 효과. 성장인자들을 LPS 또는 댑손 노출 24시간 전에 배양 qowwl로부터 회수하였다. ERKl/2, p38 및 INK의 트레오닌 및 티로신 포스포릴화를 웨스턴 블로팅에 의해 측정하였다. 밴드 강도는 NIH Image J 소프트웨어를 이용하여 산출하였다. LPS 10 μg/ml은 포스포 (p)-ERKl/2 / ERKl/2 비율은 증가시켰으나, p-p38 / p38 비율은 증가시키지 않았다. p-JNK는 검출되지 않았다. 댑손 1 μg/ml는 1시에서 LPS-유도된 ERK1/2 포스포릴화를 억제하였으나 4시 및 24시에서는 억제하지 않았다. 3회 이상의 독립적인 실험으로부터 얻은 값들은 평균치 ± SE, n = 4 였다. *P < 0.05 대조군과 비교시 (각 시점에서 LPS -, 댑손 -). #P < 0.05 LPS 단독과 비교시.
도 5A 및 B. LPS-유도된 ERKl/2 포스포릴화(A) 및 IL-8 분비(B)에 미치는 PD98059 (MEK 억제제)의 효과. 성장 인자들을 LPS 노출 24 시간 전에 배양 배지로부터 회수하였다. PD98059, 20 μM을 LPS 자극 1시간 전에 첨가하였다. A: LPS는 4시에서 ERKl/2 포스포릴화를 투여량-의존 방식으로 증가시켰는데, 이 효과는 PD98059에 의해 억제되었다. 4회의 독립적인 실험으로부터 얻은 값들은 평균치 ± SE였다. *P < 0.05, **P < 0.01 대조군과 비교시 (Cont). #P < 0.05 LPS 단독과 비교시.
B: PD98059는 LPS-유도된 IL-8 분비를 억제하지 않았다. 값들은 평균치 ±SE, n = 6이었다. < 0.001 대조군과 비교시.
도 6A 및 B. 페렛의 기도에서 LPS-유도된 호중구 축적에 미치는 댑손의 치료 효과. 페렛에 5일 동안 1일 1회 30분동안 LPS (10 μg)-코팅된 기관내 튜브를 삽관하고 제4일부터 제8일까지 댑손을 경구 투여하거나 또는 분무 형태로 투여하였다. 제9일에 기관(tracheas)을 제거하고 조직학 분석을 수행하였다. 상피내 호중구의 촛 갯수를, 4개의 서로 다른 섹션으로부터의 표본 1개 당 무작위적인 8개소에서 150 μm에 대해 카운트하고 평균을 내었다. A: 댑손의 경구 투여는 상피내 호중구 수를 감소시켰으나, 유의적인 감소는 아니었다. 값들은 평균치 ± SE였다. B: 분무화된(Nebulized) 댑손은 호중구 축적을 유의적으로 억제하였다. 값들은 평균치 ± SE였다. n = 4 비히클의 경우 및 n = 5 댑손의 경우. *P < 0.05 비히클과 비교시 (LPS +, 댑손 -).
도 7A 및 B. 3 mm 세그먼트에 걸쳐 타이밍된 LPS-유도된 점액섬모 전달 (mucociliary transport:MCT)에 미치는 댑손의 치료 효과. A: 댑손의 경구 투여는 MCT를 증가시켰으나 유의적인 증가는 아니었다 (P = 0.09). 값들은 평균치 ± SE였다. B: 분무화된 댑손은 MCT (P = 0.007)를 정상 수준으로 유의적으로 증가시켰다. 값들은 평균치 ± SE였다. n = 5. **P < 0.01 비히클 (LPS +, 댑손 -)과 비교시.

실시예

실시예 1. 댑손은 LPS로 자극된 인간 기관지 상피세포로부터의 IL-8 분비를 억제하여 페렛에 있어서의 기도 염증을 해소한다.

서론

기도는 숙주의 내부 환경을 외부 세계로부터 격리시키는 상피 세포로 덧대어져 있다. 기도 상피는 외부 자극과 미생물에 대한 기계적 배리어 역할을 할 뿐 아니라 선천 및 후천적인 면역반응과 기도 염증에도 활발히 관여한다. 박테리아 침입에 대하여, 점액섬모 세정이 자극되어 염증 매개자와 시토카인이 방어기제로서 분비되지만 이들은 또한 기도에 손상을 입힐 수도 있다 상피-유도된 다발성(pleiotropic) 시토카인 중에서도, 시스테인-X-시스테인(CXC) 케모카인 패밀리의 멤버인 IL-8은 가장 강력한 호중구 화학유인제들 중 하나로서 작용한다. 호중구 중심의 염증(neutrophil-dominated inflammation)은 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 미만성 범세기관지염(DPB) 및 낭성섬유증(CF)에 특징적인 특성이다. IL-8은 기도 상피 세포에 의해 생성된다. 가래 및 기관지세척 (BAL: bronchoalveolar larvage) 플루이드 중에서의 IL-8의 증가는 DPB 및 CF의 위중도와 관련이 있고 심한 천식과 COPD를 앓는 대상자의 기관지 상피에서 IL-8의 유전자 발현이 증가된다.

전염증성 시토카인, 박테리아 플라겔린 및 지질당지질(LPS: lipopolysaccharide)은 정상적인 인간의 기관지 상피 (NHBE) 세포에 의한 IL-8 생성을 증가시킬 수 있다. 유기 분진 중에 존재하는 많은 물질들 중에서도 LPS는 염증 반응을 유도하는 주요한 유도자이다. LPS는 핵인자-κB (NK-κB) 경로, 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K) 및 미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK) 경로를 비롯하여, 세포내 신호 경로를 활성화시키는 톨유사 수용체 4 (TLR4)에 결합한다. 세가지 MAPK 경로가 IL-8 유전자 발현, 세포외-조절형 단백질 키나제 (ERK), c-Jun NH2-말단 단백질 키나제 (JNK), 및 p38 MAPK 캐스케이드에 기여한다. 이들 경로 및 기능적 결과 각각의 상대적인 활성화도는 특히 세포 종류 및 실험 시스템에 따라 달라진다.

마크롤리드 항생제는 DPB에 걸린 대상자로부터 얻은 BAL 중 호중구와 IL-8 농도 및 CF 중 가래의 IL-8 농도를 감소시킨다. 마크롤리드는 ERK 또는 NK-κB의 불활성화를 통해 배양체 중 기도 상피 세포로부터 IL-8의 방출을 억제할 수 있다.

본 발명자들은 댑손이 자극된 기도 세포에 의한 IL-8 분비를 억제하리라고 가정하였다. 따라서, 본 발명자들은 LPS에 의해 자극된 NHBE 세포로부터의 IL-8 분비에 미치는 댑손의 효과를 연구하여 이에 관련된 신호 경로를 더 조사하였다. 이어서 본 발명자들은 기도의 호중구 모집

LPS에 노출된(LPS에 의해 염증이 발생된) 페렛의 기도에 에어로졸을 경구 또는 에어로졸 투여한 경우 기도의 호중구 모집의 감소 및 점액섬모 청소의 보존에 관하여 평가하였다.

재료 및 방법

시약

댑손(4,4'-디아미노디페닐 설폰), LPS (대장균 혈청형 0111: B4), 및 기나 모든 시약들을 달리 언급하지 않는 한 시그마-알드리치사 (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. PD-98059, 즉 MAPK ERK 키나제 (MEK, ERK1/2의 상류 키나제) 억제제를 Calbiochem (La Jolla, CA)으로부터 구득하였다. 포스포- 및 비(non)-포스포-특이적인 ERK1/2, 항-p38 MAPK, 항-SAPK/JNK, 및 포스포-특이적인 NF-κB p65 (Ser536) 및 항-토끼-IgG HRP 항체들은Cell Signaling Technology (Beverly, MA)로부터 구입하였다. DMSO를 댑손의 용매로서 사용하되, 최종 농도는 0.01% (v/v) 이하로 하였다. 시험관내 예비 실험결과 0.01% DMSO-배지는 72시간 까지는 세포 생존능 및 IL-8 분비에 유의적인 효과를 미치지 않은 것으로 나타났다 (데이터 표시하지 않음)

NHBE 세포 배양

NHBE 세포 (Lonza Walkersville, Walkersville, MD)를 3,500 세포/ cm²　in culture dishes in bronchial epithelial cell growth medium (BEGM) supplemented with the SingleQuot

키트 (Lonza)가 보강된 기관지 상피세포 성장배지 (BEGM) 중 배양 디쉬에서 항생제없이 37℃에서 5% CO₂　인큐베이터 중에서 3,500 세포/ cm²로 도말하였다. 본 발명자들은 내독소가 없는 배지 (< 0.005 내독소 유닛/ml) 및 2차 계대 세포들을 모든 실험에 사용하였다. 세포들을 6일간 컨플루언스 상태까지 성장시켰다. 이어서 항생제가 없는 배양체를 1형 래트-테일 콜라겐으로 코팅된 35 mm 디쉬 또는 6-웰에 옮기고 3,500 세포/ cm²로 접종하였다. 배지를 24시간 마다 갈아주었다. 세포 신호 및 IL-8 분비에 미치는 성장인지들의 영향을 회피하기 위하여, 세포들을 자극하기 24시간 전에 서플리먼트가 없는 기관지 상피 세포(BEBM) 중에서 배양하였다. 세포 성숙은 세포 신호 및 시토카인 분비에 영향을 미칠 수 있고 컨플언스시, 모든 세포들은 유사한 성장 단계에 있는 것이므로, 본 발명자들은 세포의 상대적인 수를 정규화하기 보다는 세포 컨플루언스시에 세포 반응을 평가하였다.

NHBE 세포 분화의 경우, 세포들을 타입 1 래트-테일 콜라겐으로 코팅된 6.5-mm 직경, 0.4-μm 두께 (Costar Transwell Clear, Cambridge, MA, USA)의 폴리카보네이트 삽입물 상에 2.0 x 10⁵ 세포/cm²로 플레이팅하고, DMEM/F12 medium containing ITS-A (1.0%; Invitrogen Co., Carlsbad, CA), 상피성장인자(EGF) (재조합 인간 EGF, 0.5 ng/ml; Invitrogen Co.), 트리요오도티로닌(10 ng ml; MP Biomedicals, Solon, OH), 히드로코르티손 (0.5 μg/ml; MP Biomedicals), 올-트랜스 레틴산 (1.0×10-7 M; Sigma-Aldrich), 소의 혈청 알부민 (2.0 μg/ml; Sigma-Aldrich) 및 소의 뇌하수체 추출물 (30 μg/ml; Invitrogen Co.)을 함유하는 무혈청 DMEM/F12 배지를 이용하여 배양하였다. 컨플루언스에 도달한 후, 첨단(apical), ㅂ. After 배지를 제거하고, 세포들을 공기-액체-계면(ALI) 법에 의해 배양하였다. 배양 배지들을 48 시간마다 갈아주고, 세포를 5% CO₂ 중 37℃에서 10-14일간 유지하였다.

세포독성 분석

살아있는 세포의 수를 측정하기 위하여, Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan)를 이용하여 포르마잔 염료 생성을 측정하였다. CCK-8 분석 용액을 이용하여 처리된 세포들을 2시간 동안 인큐베이션시키고 450 nm에서 흡수도를 측정하여 이를 마이크로플레이트 리더로 판독하였다. 데이터는 댑손에 노출되지 않은 대조군 세포의 %로서 표현하였다.

IL -8 분비의 측정

배양 상등액을 수집하여 200　 x g에서 5분간 원심분리한 다음, 분석시까지 -20℃에서 보관하였다. 제조업자의 지침에 따라 IL-8을 ELISA (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA)에 의해 측정하였다. 각 샘플 중의 농도를 표준 곡선으로부터의 내삽법에 의하여 구하고, 샘플 희석시 결과를 평균값으로서 산출하였다.

면역블로팅

자극 후, 도말된 세포들을 차가운 PBS로 세척한 다음 변형된 방사능면역침전 완충액 (1% Nonidet P-40, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.5, 5 mM 소듐 파이로포스페이트, 1 mM NaV04, 5 mM NaF, 1 μg/ml 아프로티닌, 1 μg/ml 류펩틴 및 0.1 mM PMSF) 중 얼음에서 15분간 용해(lysed)시킨 다음 디쉬로부터 스크래핑하였다. DNA를 27-게이지 바늘을 통해 용해불을 통과시킴으로써 전단시키고 불용성 물질들을 4℃에서 15분간 20,000g에서 원심분리하여 제거하였다. 얻어진 상등액의 단백질 농도를 DC 단백질 분석 (Bio-Rad, Hercules, CA)에 의해 정량하였다. 단백질 추출물의 동량을 12% SDS-PAGE 미니 겔 상에 로딩하고 니트로셀룰로스 막(Bio-Rad)에 전달하였다. 5% 탈지건조유를 함유하는 블로킹 완충액(150 mM NaCl, 20 mM Tris, 및 0.1% Tween 20, pH 7.6)을 이용하여 막을 4℃에서 블로킹시켰다. 이어서, 막을 헹구고 1차 항체: 포스포 (p)-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) (희석배수 1:2000), p-p38 MAPK (Thrl80/TyiT82) (희석배수 1 : 1000), p-S APK/JNK (Thr 183/Tyr 185) (희석 1 : 1000), 또는 p-NF-κB p65 토끼 폴리클로날 IgG (희석배수 1 :1000) (Cell Signaling Technology)와 함께 실온에서 2시간 인큐베이션시켰다. 이어서 막들을 항-토끼 IgG HRP 2차 항체 (희석배수: 1 :2000)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, LumiGLO 화학발광 기질 퍼옥사이드(Cell Signaling Technology)를 이용하여 블롯 막을 전개시켰다.

막들을 스트리핑 완충액 (100 mM 2-머캅토에탄올, 2% SDS, 및 62.5 mM Tris/HCl pH 6.7)을 이용하여 30℃에서 30분간 스트리핑시켰다. 블롯들을 항-p44/42 MAPK, 항-p38 MAPK, 또는 항-SAPK/JNK 항체 (각 경우 희석배수 1 : 1000), 이어서 항-토끼-lgG HRP 2차 항체 (희석배수 1 :2000)을 이용하여 재프로브시켰다. NF-κB p65에대한 로딩시 작은 차이를 보정하기 위해, 블롯들을 스트리핑하고 항-인간 β-액틴 항체 (희석배수 1 :5000), 이어서 항-마우스 IgG HRP 2차 항체(희석배수 1 :5000)를 이용하여 재프로브시켰다.

웨스턴 블롯 이미지들을 스캔하고 NIH Image J 소프트웨어 (18)을 이용하여 분석하였다.

실시간 정량적 폴리머라제 연쇄 반응

IL-8 mRNA 발현의 상대적인 정량을 위하여, 글리세랄데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH)의 발현을 내부 대조군으로 삼았다. 각 샘플 당 역가 사이클(threshold cycle: Ct) 값을 구하기 위하여 EvaGreen을 DNA 인터컬레이터 염료로 사용하여 증폭된 DNA 정량화를 모니터링하고, 실시간 정량 PCR 곡선을 CFX ManagerTM 소프트웨어 (Bio-Rad)로 분석하였다. 정량화는 표준 곡선에 기초하였다. 적절한 IL-8 및 GADPH 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하였다.

동물 연구

마샬 농장(Rose, NY)로부터 20마리의 다 자란 수컷 페렛 (체중, 1.3 내지 2.0 kg)을 구득하였다. 페렛들을 40 mg/kg 케타민과 5 mg/kg 자일라진으로 마취시키고, 300 μl 수용성 K-Y 젤리 (Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ) (Abanses et al., 2009) 중에 혼합된 10 mg의 LPS로 코팅된 3.0 언커프형(uncufffed) 기관지내 튜브 (ETT)를 삽관함으로써 1일 1회 30분씩 5일 동안 내독소(endotoxin)에 노출시켰다. 대조군으로서, LPS 없이 K-Y 젤리를 2마리의 페렛에 대해 사용하였다.

경구 투여를 위하여, 댑손을 5% (v/v) 에탄올/5% (v/v) 디메틸설폭사이드 (DMSO)/0.5% (w/v) 메틸-셀룰로스 용액 중에 최종 농도가 3 mg/ml가 되도록 제조하였다. 분무 형태로 투여하기 위하여, 댑손을 0.67% (v/v) DMSO/식염수에 0.5 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 무작위적으로 18 마리의 LPS-처리된 페렛에게 제4일 (LPS 3일 후)부터 시작하여 5일 동안 계속해서 댑손을 투여하였다. 경구 투여를 위해, 2 mg/kg 댑손 (n = 4) 또는 비히클 단독 (n = 4)을 경비위관을 통해 매일 투입하였다. 이것은 피부 질환이 있는 환자들을 치료하는데 사용되는 경구 투여량에 상당하는 것이다. 에어로졸 흡입을 위해, 페렛에게 ETT를 얕게, 즉 후두 1cm 하에 얕게 삽관하였다. 페렛들에게 분무형 0.5 mg/ml 댑손 (n = 5) 또는 0.67% DMSO/식염수 (비히클) (n = 5)로 하루 1회 15분씩 제트 분무기(PariMaster; PARI Respiratory Equipment Inc., Richmond, VA)를 투여하였다. 페렛 (체중 1.5 kg)은 0.3-0.4 ml 총 폐 라이닝 플루이드 부피를 가졌다. 따라서, 보고된 분무 효율을 감안할 때 이 시스템에서 폐에 전달된 투여량은 0.1 내지 1.0 μg이다.

제 9일에 댑슨-처리된 동물과 비히클 대조군 동물들을 희생시켜 기관을 제거하였다. 각각의 기관 세그먼트를 10% 포르말린에 고정하여 파라핀에 담그고 광현미경(CKX41 ; Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 그리고 디지털 카메라 시스템 (AxioCam ICc 1; Carl Zeiss, Thornwood, NY)에 의한 포토그래피에 의해 면역학적 분석을 실시하였다. 조직들을 4 μm 두께로 절단하고, 슬라이드를 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 염증 세포의 축적량 및 염증의 전체적인 위중도를 측정하기 위해, 복강내 호중구의 총 수를 4가지 서로 다른 부위로부터의 표본 당 8군데의 무작위적인 개소에서 150 μm에 대하여 계수하여 이를 평균 내었다.

본 발명자들은 또한 기관의 점액섬모 전달 (MCT) 속도를 측정하기 위하여 절개된 기관 세그먼트를 이용하였다. 섬모들은 예컨대 외래 입자들 및 미생물들로 로딩된 점액을 입쪽으로 전달하여, 여기서 이것이 삼켜지거나 재채기에 의해 배출된다. 염증 상태 하에서는, 섬모 세포가 그들의 전달 기능을 유보하여 박테리아의 저미널(germinal) 콜로니화, 추가적인 자극 및 염증이 용이해진다.

기관 세그먼트를 상대 습도가 95 내지 100%로 유지되고 온도는 22℃ 내지 24℃로 유지된 챔버에서 링거 용액으로 포화된 거즈 조각에 위치시켰다. 그래디큘 (격자선) 대안렌즈가 구비된 현미경 하에 기관 세그먼트를 포커싱하고 기관 상피 상에 위치한 플라스틱의 매우 미세한 쉐이빙의 선도 가장자리의 전달 시간을 기록하여 MCT를 측정하였다. 입자를 3 mm 전달하는데 걸린 시간을 이용하여 MCT (분 당 밀리미터)를 계산하였다. 이 측정을 각각의 기관 세그먼트에 대해 5회 반복하였다. 이 연구는 Animal Care and Use Committee of Virginia Commonwealth University에 의해 승인된 것이다.

통계학

결과를 평균치 ± SE 또는 SD로서 적절히 표현한다. 데이터의 통계 분석을Stat View 5 통계학 패키지(SAS Institute, Cary, NC)를 이용하여 수행하였다.

언페어드 Student's t 테스트를 이용하여 2개의 그룹들을 비교하였다. Fisher's PLSD-테스트를 이용한 일방적인 변동 분석에 의해 다중 비교를 실시하고, p 값이 0.05 미만인 경우를 유의적인 것으로 고려하였다.

결과

NHBE 세포 생존능에 미치는 댑손의 효과

배양된 NHBE 세포의 총 갯수가 댑손 처리에 의해 영향을 받지 않음을 확인하기 위하여, 세포의 생존능을 CCK-8(Dojindo)을 이용하여 평가하였다. 96-웰 플레이트 (3,000 세포/웰) 상에 접종된 NHBE 세포들을 37℃에서 72 시간 (~ 70 컨플루언스) 배양하였다. 24시간 또는 72 시간 동안 댑손을 0.3, 1 또는 10 μg/ml의 농도로 첨가하였다. 그 결과 댑손으로 처리된 세포들의 경우, 살아있는 세포들의 총 갯수는 72 시간 동안 처리되지 않은 대조군의 그것과 유사하였다 (나타내지 않음).

LPS -유도된 IL -8 분비에 미치는 댑손의 효과

NHBE 세포로부터의 IL-8 분비에 미치는 댑손의 효과를 평가하기 위하여, 댑손 존재 및 부재 하에 (댑손 존재시 댑손은 LPS와 동시에 첨가함) LPS로 자극한지 24시간 후에 세포 상등액을 수확하였다. 본 발명자들은 세포의 상적인 수로 정규화되기 보다는 세포 컨플루언스 시에 세포 반응을 평가하는 것을 선택하였는데, 이는 세포 성숙은 세포 신호 및 시토카인 분비에 잠재적인 영향을 미칠 수 있어서, 컨플루언스시, 모든 세포들이 동일한 성장 단계에 도달하기 때문이다. 10 μg/ml 농도의 LPS는 NHBE 세포로부터의 IL-8 분비를 유의적으로 증가시켰으나 (P < 0.001), 0.3, 1 또는 10 μg/ ml 농도의 댑손은 이러한 효과를 유보하였다 (P < 0.01 각각의 경우) (도 1A).

댑손 1 μg/ml는 48 및 72시간 동안 기저 IL-8 분비에 영향을 미치지 못했다 (도 1B). 댑손 1 μg/ml의 존재 하에서, LPS-유도된 IL-8 분비는 최대 72시간 동안 유의적으로 그리고 지속적으로 감소하였다 (도 1C).

ALI - 컨디션된 NHBE 세포에 있어서의 댑손의 효과

댑손의 IL-8 억제 효과가 분화된 세포에서도 관찰되는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 14일에 걸쳐 ALI 조건 하에서 NHBE 세포를 배양하였다. ALI에서의 세포의 경우, 샘플들을 필터 상에서 성장된 세포의 첨단 챔버 (apical chamber) 및 기저 챔버 (basolateral chamber)의 두가지 모두로부터 수집하였다. 첨단 챔버로부터 샘플을 수집하기 위해, 첨단부에 150 μl의 Hanks 밸런스 염 용액 (Hank's balanced salt solution: HBSS; Lonza Walkersville, Inc.)을 첨가하였다. Apical IL-8 농도를 기저 배지 부피 600 μl와 동등하게 되도록 4배 희석한 값으로서 표시하였다.

NHBE 세포를 24시간 동안 첨단측 (AP-LPS) 또는 기저측 (BL-LPS)으로부터 LPS 로 자극하고, 이들 두개의 챔버 모두에 있어서의 IL-8 분비량을 측정하였다. 댑손은 기저측 배지에만 첨가하였다. 도 2A에 도시된 바와 같이, 첨단측 IL-8 수준은 AP-LPS에 의해 유의적으로 증가되었고(P < 0.001), 댑손은 이 과정을 억제하였다 (P < 0.05). 마찬가지로, 기저측 IL-8은 AP- 또는 BL-LPS (각각 P < 0.001)(2B)에 의해 유의적으로 증가되었고, 댑손은 첨단측 및 기저측 반응 두가지 모두를 억제하였다 (AP-LPS의 경우 P < 0.001, BL-LPS의 경우 P < 0.01).

코르티코스테로이드와 비교하기 위해, 본 발ㄹ명자들은 LPS-유도된 IL-8 분비에 미치는 덱사메타손(DEX)의 효과를 시험하였다. DEX는 첨단측 및 기저측 모두에 있어서 IL-8 수준을 억제하였다 (각각의 경우 P < 0.05) (도 2C, 2D). DEX는 또한 IL-8의 AP-LPS- 또는 BL-LPS-유도된 증가 (각각의 경우 P < 0.05)를 유의적으로 억제하였다.

LPS -유도된 IL -8 mRNA 발현에 미치는 댑손의 효과.

IL-8 mRNA에 대한 댑손의 작용을 시험하기 위해, RNA를 LPS, 댑손, DEX 또는 이들의 조합으로 자극한지 4 시간 후, 실시간 정량 PCR을 위해 제조하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 1 μg/ml 댑손은 기저 IL-8 mRNA 수준에 영향을 미치지 않았으나, 0.1 μg/ml DEX은 이것을 ~ 40%까지 감소시켰다 (P < 0.05). 10 μg/ml LPS는 IL-8 mRNA 수준을 대조군보다 5배 이상 증가시켰다 (P < 0.001). 1 및 10 μg/ml의 댑손은 LPS-유도된 IL-8 mRNA 과발현을 유의적으로 억제하였다 (각 경우 P < 0.05). 0.1 μg/ml의 DEX 역시도 이것을 억제하였다 (P < 0.01).

MAPKs 의 LPS -유도된 포스포릴화에 미치는 댑손의 효과

MAPK 시그널링은 IL-8의 합성 경로에 있어서 중요하다. 본 발명자들은 NHBE 세포에 있어서 ERKl/2, p38, 및 JNK의 LPS-유도된 포스포릴화에 미치는 댑손의 효과를 평가하였다. 10 μg/ml의 LPS는 1, 4 및 24시에 있어서 ERK1/2를 유의적으로 포스포릴화시킨 반면 (각 경우 P < 0.05), p38 및 INK는 그렇지 않았다 (도 4). 1 μG/ml의 댑손은 제1시에서 LPS-유도된 ERKl/2을 억제하였으나 (P < 0.05), 이 효과는 제4시 이후에는 사라졌다. 이어서 본 발명자들은 선택적인 세포-투과성 MEK 억제제인 PD98059 (2'-아미노-3'-메톡시플라본)의 효과를 평가하였다. 도 5A에 도시된 바와 같이, LPS ERKl/2 포스포릴화 및 IL-8 분비를 투여량 의존적으로 증가시켰고 20 μM에서의 PD98059는 10 μg/ml LPS-유도된 ERK1/2 포스포릴화를 억제하였다. 그러나, 이 농도의 PD98059는 IL-8 분비를 억제하지 않았다 (도 5B).

NF -κB p65 의 LPS -유도된 포스포릴화에 미치는 댑손의 효과.

LPS는 TLR4를 자극하여 NF-κB 경로를 통해 IL-8을 유도하므로, 본 발명자들은 NHBE 세포에 있어서의 NF-κB p 65 포스포릴화에 대한 댑손의 효과를 검사하였다. 성장인자들을 LPS 또는 댑손 노출 24시간 전에 배양 배지로부터 회수하였다. NF-κB p65의 쓰레오닌 포스포릴화를 웨스턴 블로팅에 의해 측정하였다. 밴드 강도를 NIH Image J 소프트웨어를 이용하여 산출하였다.

그 결과 10 μg/ml에서의 LPS는 제15분에서 NF-κB p65 포스포릴화를 유의적으로 증가시킨 것으로 나타났으며 (P < 0.01), 이 효과는 2 시간 동안 지속되었다 (P < 0.05). 1 μg/ml의 댑손은 LPS-유도된 NF-κB p65 포스포릴화를 대조군 수준까지 유의적으로 억제하였다 (제15분 및 제30분에서 P <0.01, 제1시간 및 제2시간에서 P < 0.05). 또한, 이 억제 효과는 튜여량 의존적이었다 (0.3 μg/ml 댑손의 경우 P = 0.16 및 1 및 10 μg/ml 댑손의 경우 P < 0.01).

페렛의 활동도 및 체중에 미치는 댑손 존재 및 부재하에서의 기관 LPS 의

효과

LPS로 5일간 자극된 페렛에게 5일간 댑손으로 처리하거나 비히클 단독으로 처리하였다 (비히클의 경우 n = 8, 댑손 그룹의 경우 n = 9, 각각의 시점에서 시험됨) 이들 두가지 그룹을 비교하자 9일에 걸친 페렛의 활동도나 식욕에는 댑손 부재 또는 존재 시 LPS의 측정가능한 효과가 없었으며 체중에 있어서도 아무런 변화가 없었다. (데이터 나타내지 않음).

LPS - 염증형 페렛 기관에 있어서의 상피내 호중구 축적

댑손의 생체내 효과를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 기관내 튜브 (ETT) 상에 코팅된 국소용 LPS를 이용하여 호중구를 모집하고 마취되어 자발적으로 호흡하는 페렛의 기관에 염증을 일으켰다 (Abanses et al, 2009). 수용성 젤리(다른 그룹에서 LPS 비히클로서 사용됨)만으로 코팅된 ETT가 삽관된 대조군 페렛은 상피 포중구가 거의 (3/150 μm 미만) 나타나지 않았다. 기도에 LPS-염증이 생기고 분무된 비히클로 처리된 페렛 한마리는 제6일에 죽었기 때문에 완전하지 않았으며, 이 동물은 추가 분석에서 배제하였다. LPS 노출은 페렛의 기관 상피에서 현저한 호중구 축적을 유도하였으며 댑손 처리는 상피내 호중구 수를 감소시켰다 (데이터 나타내지 않음). 경구 투여된 댑손은 호중구 수집을 억제하지 않았으며 (P = 0.3) (도 6A), 분무된 댑손은 호중구 축적을 현저히 억제하였다 (P < 0.05) (도 6B).

절개된 기관 세그먼트 상에서의 점액섬모 전달 ( MCT : Mucociliary

transport )

점액섬모 전달 (또는 "점액섬모 청소: mucociliary clearance", MCC)은 기도 표면의 건강과 온전함을 재는 전체적인 척도이다. MCT는 3 mm 세그먼트에 걸쳐 시간을 재었다. LPS는 MCT를 1-3 mm/분으로 극적으로 감소시켰다 (정상적인 경우는 약 7 mm/분). 경구용 댑손은 MCT를 증가시켰으나 그 증가는 유의적이지 않았다 (P = 0.09). 그러나, 에어로졸 댑손은 도 7A 및 B에 도시된 바와 같이 MCT를 거의 정상적인 속도로 보존하였다 (6 mm/분; LPS 대조군과 비교할 때 P = 0.007)

토론

본 발명자들은 댑손이 LPS로 자극된 NHBE 세포들로부터의 IL-8 분비를 억제함을 입증하였다. 댑손은 주로 호중구 침윤성인 특징이 있는 피부 질환을 치료하는데 사용된다. 댑손이 기회 감염의 위험성을 증가시킴이 없이 염증 부위에서의 호중구의 주화학성(chemotaxis) 및 기능을 훼손시킨다고 가정하였다. 이것은 면역억제가 아니라 면역조절에 상응한다.

댑손에 대한 임상적 반응은 호중구 수의 감소에 의해 특징지어지므로, 댑손은 유독한 반응성 산소종, 미엘로퍼옥시다제 및 엘라스타제의 국소 생산을 억제하지만, 이것은 주요 활성 모드로 여기지지는 않는다. 다른 연구자들은 댑손이 부착 분자 CD1 lb/CD18의 활성화를 시험관내 간섭함으로써 호중구 화학주성을 훼손함을 보여주었다. 그러나, 이것은 생체내에서 측정된 치료 수준보다 더 높은 댑손 농도를 필요로 한다. 본 연구에서 본 발명자들이 사용한 댑손의 농도 0.5-5 μg/ml는 치료적 혈청 수준에서 요구되는 범위이다 (Zhu 외 2001). 본 발명자들은 이보다 낮은 댑손 농도 0.3 μg/ml를 사용한 경우에도 LPS-유도된 IL-8 분비가 억제됨을 발견하였는데 이 효과는 살아있는 세포들의 숫자에 의해 측정된 바와 같이 세포 독성에 기인한 것이 아니었다 Schmidt 등 (2001)은 치료적 농도의 댑손이 배양된 정상적인 인간 상피 각질세포 (NHEK)로부터의 수포성 유천포창 IgG-매개형 IL-8 분비를 억제하고 댑손이 기저 IL-8 수준은 디프레스시키지 않음을 보고한 바 있다. 이러한 데이터는 NHBE 세포를 이용한 본 발명자들의 결과와 유사한 것이다.

기도 상피는 관능적으로 극성화되어 있으며, 상피 세포가 양방향 방식으로 시토카인을 분비한다는 증가거 있다. 분화 및 극성화된 기도 상피 모델에서의 댑손의 작용 모드를 보다 잘 이해하기 위하여, NHBE 세포를 ALI에서 배양하였다 (Kanol et al., 2001). 댑손의 존재 하에서, LPS 자극에 의해 유도된 IL-8 분비는 유의적으로 감소된 반면, 구성적인(constitutive0 IL-8 방출은 댑손에 의해 억제되지 않았다. 흥미롭게도, 첨단측이 자극된 경우 (기도 감염 동안 일어나는 바와 같이) NHBE 세포는 기저측 뿐만 아니라 첨단측으로 IL-8을 분비한 반면, 기저측이 자극되지 이들은 기저측으로만 분비하였다. 필터상에서 생육되어 첨단측에서 스타필로코커스 아우레우스에 의해 자극된 기도 상피 세포들은 첨단측 T 세포 화학주성을 일으킨 반면 기저층 상등액은 그렇지 않았다 (Escotte et al, 2006). 첨단측 배향된 화학유인성 구배의 존재는 호중구 및 임파구와 같은 면역 세포를 상피 표면으로 구동하는데 필요할 수 있다 (Chin et al, 2007). 이에 더해, 본 발명자들은 본 발명의 배양 세포 시스템에 대한, 강력한 합성 코르티코스테로이드인 덱사메타손(DEX)의 효과를 검사하였다. DEX는 NHBE 세포로부터의 IL-8 방출을 억제하는 것으로 보고되었는데, 본 발명자들은 DEX가 댑손보다IL-8 mRNA 발현을 더 잘 억제함을 ㅎ호확인하였다. 그러나, 댑손과 달리, DEX는 기저측 IL-8 수준뿐 아니라 LPS-유도된증가도 억제하였는데, 이는 댑손이 면역조절성인데 반하여 DEX는 면역억제성임을 시사하는 것이다.

댑손이 IL-8을 억제하는 세포내 신호 경로는 아직까지 잘 특징화되어 있지 않다. MAPKrk 기도 상피 세포에서 IL-8 유전자 발현을 제어하므로, 본 발명자들은 이들 경로에 미치는 댑손의 효과를 vyd가하였다. 본 발명자들은 LPS 투여량이 ERK1/2 포스포릴화를 투여량 의존적으로 증가시킴을 발견하였으나, NHBE 세포에서 JNK 및 p38은 그렇지 않았으며, 증가된 ERKl/2 수준은 적어도 24 시간 동안 지속되었음을 발견하였다. 본 발명자들은 앞서 ERK1/2의 지속적인 활성화가 자극되지 않은 NHBE 세포로부터의 기저 IL-8 분비에 필요함을 보여준 바 있으며, 특이적인 MEK 억제제인 PD98059가 IL-8을 억제하는 반면, JNK 또는 p38의 약리학적 억제제는 그러하지 않음을 입증한 바 있다. 그 밖에 PD98059가 제1시 및 제2시에서 ERK1/2의 LPS-유도된 포스포릴화를 억제한 것으로 나타났다. 현재 연구에서, PD98059의 억제 효과 심지어 제4시에서도 확인되었다. 그러나, PD98059는 LPS-유도된 IL-8 분비를 감소시키지 않았다. 1 μg/ml의 댑손은 제1시에서 p-ERKl/2를 억제하였으나 제4시 이후에는 그렇지 못했다. 이를 종합하면, ERK1/2의 억제 단독은 LPS-자극된 세포에서 IL-8을 억제할 것으로 여겨지지 않으며, 이에 따라 댑손에 의한 일시적인 ERKl/2-억제는 IL-8의 효과에 책임이 없다.

본 발명자들은 이어서 NF-κB 활성화에 대한 댑손의 효과를 시험하였다. NF-κB는 기도 상피 세포에서 염증성 매개자와 시토카인의 유전자 발현을 유도할 수 있으며, LPS는 TLR4를 통해 NF-κB를 활성화시킬 수 있다. 베이직 NF-κB 컴플렉스는 Rel 패밀리 단백질인, p50 및 p65 (RelA)의 2가지 멤버의 다이머이다. 이들 두가지 서브유닛 모두 DNA와 접촉하는데 오직 p65만이 C-말단 대역 내에 전사 장치와 직접 상호반응하는 트랜스활성화 도메인을 함유한다. NF-κB p65는 포스포릴화에 의해 활성화되며, 이는 그의 전사 활성을 증강시켜, 핵의 전위에 관련되어 있다. 본 발명자들은 10 μg/ml의 LPS가 NHBE 세포에서 자극된지 15분 내지 2시간 후에 유의적인 NF-κB p65 포스포릴화를 이끌어냈다는 것을 입증하였다. LPS에 대한 이와 유사한 키네틱스가 쥐의 내장 근섬유아세포에서도 나타났는데, 여기서는 NF-κB의 포스포릴화가 LPS 처리로부터 30분 이내에 검출되어 4시간에 걸쳐 서서히 감소되었다. 본 발명자들은 1 μg/ml 댑손이 LPS 유도된 NF-κB p65 포스포릴화를 2시간에 걸쳐 기저 수준까지 억제하였음을 발견하였는데, 이는 댑손이 NF-κB p65 포스포릴화를 차단함으로서 IL-8 분비의 유도를 억제할 수 있음을 시사하는 것이다. 또한 포스포-NF-κB p65에 미치는 투여량-의존적인 억제 효과 역시도 IL-8 mRNA 발현에 있어서의 실험 결과와 일치하였다. 따라서, 댑손의 작용은 적어도 부분적으로는 유전자 전사 수준에서 IL-8을 하향 조절하는 것에 기인하는 것이다. 그러나, 댑손 0.3 μg/mL는 NF-κB p65 활성화를 유의적으로 억제하지 않은 반면, 동 농도의 댑손은 IL-8 방출을 강력하게 억제하였다. LPS-유도된 IL-8 mRNA 발현을 억제하기 위해서는 1 μg/ml를 초과하는 댑손이 필요하였다. Schimidt 등 (28)은 댑손이 mRNA 농도에 영향을 미침이 없이 전사후 수준에서 NHEK로부터 IL-8 방출을 억제한다고 추론하였다.

이러한 면역조절 효과는 에리쓰로마이신, 클라리쓰로마이신 및 아지쓰로마이신과 같은 마크롤리드의 면역조절 효과와 유사한 것이었다. 클라리쓰로마이신은 NHBE 세포들 중 ERK1/2 포스포릴화를 조절하며, 아지쓰로마이신은 CF 세포주에 있어서 NF-κB 활성을 억제함으로 해서; IL-8을 조절한다. 댑손 역시도 IL-8의 조절을 통하여 기도 감염을 변경시키는 것 같다.

국소 적용된 LPS를 이용하여 페렛에서 기관 염증을 유발시킨 후, 본 발명자들은 상피 통합도의 통합적인 척도로서 호중구 염증 및 MCT에 미치는 경구 또는 에어로졸 댑손의 5일간에 걸친 효과를 평가하였다. 경구 댑신은 상피내 호중구 축적을 감소시켰으나 통계적으로 유의적인 것은 아니었다. 호중구성 피부장애를 치료하기 위해 크림으로서 국소 사용시 댑손이 효과적임을 감안하여, 본 발명자들은 LPS-유도된 기관 염증을 억제하는데 있어서의 저투여량의 에어로졸 댑손의 잠재능을 평가하였다. 분무된 댑손은 LPS에 대한 노출에도 불구하고 기도내의 호중구 침윤을 유의적으로 억제하고 MCT를 보존 또는 복구하였다. 비록 기도에 대한 정밀한 투여량을 측정하기는 어렵지만, 총 투여량의 10%가 기관에 효과적으로 전달되었다 해도 (38), 댑손의 전달량은 오직 0.3 mg이었다. 이러한 투여량은 1.5 kg 체중의 페렛의 경우 경구로 전신 투여되는 전신 투여량의 약 10분의 1에 해당한다.

요약하면, 댑손은 자극되지 않은 (기저:basal) IL-8 분비에는 영향을 미치지 않았다. 첨단 LPS 자극은 첨단 및 기저 IL-8의 두가지 모두를 유도한 반면, 기저 LPS는 기저 IL-8만을 증가시켰다. 댑손은 ALI-컨디션된 세포로부터의 극성화된 IL-8 분비를 억제하였다. 댑손은 또한 LPS-유도된 IL-8 mRNA 수준도 감소시켰다. LPS는 세포외 신호 조절된 키나제 (ERK)1/2의 포스포릴화를 선도하였으나, p38 MAPK 또는 c-Jun N-말단 키나제는 그렇지 아니하였다. LPS는 또한 NF-κB p65 포스포릴화를 유도하였는데, 이 효과는 댑손에 의해 억제되었다. 경구 및 에어로졸 댑손의 두가지 모두 LPS-유도된 상피내 호중구 축적을 감소시켰으나, 에어로졸 댑손을 이용한 치료의 경우에만 점액섬모 전달이 정상 수준으로 복귀되었다.

이와 함께 이들 데이터는 댑손이 인간의 기도 세포 중에서 IL-8 및 염증화된 포유동물의 기관에서 호중구 모집을 억제하면서도 MCT를 보존함을 나타낸다. 에어로졸 댑손은 낭성섬유증, 만성 기관지염 또는 위중한 천식과 같은 만성 염증성 기도 질환을 치료하는 유망하나 치료법이 될 수 있다. 따라서, 댑손을 전신 투여, 특히 에어로졸로서 투여하는 것은 호중구성 기도 감염을 치료하는데 유용할 수 있다.

실시예 2. 댑손의 IL-13 억제 특성

술잔 세포는 물에서 용해되어 점액을 형성하는, 뮤신을 분비하는 것이 유일한 기능인 컬럼형 상피 세포이다. 술잔 세포의 증식은 천식에 의한 기관지 상피 세포에 의해 나타나는 병리학적 과민반응과 연관이 있고, IL-13은 천식의 생체내 및 시험관내 모델 두가지 모두에서의 술잔세포 증식의 매개에 있어서 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 술잔 세포 증식을 억제하는 댑손의 능력을 시험관내에서 검사하였다. 술잔 세포 증식의 시험관내 모델을, 공기-액체 계면(ALI: air-liquid interface) 조건 하에서 배양된 정상적인 인간 기관지 상피 (NHBE) 세포를 이용하여 수립하였다. 여러가지 세포 염색 및 현미경 분석을 이용하여 분석된 대조군 실험 결과 댑손(3 μg/ml)은 ALI-컨디션의 NHBE 세포의 성장에 이렇다할 측정가능한 효과를 미치지 않은 것으로 나타났다 (데이터 표시하지 않음). 그러나, IL-13을 이용하여 술잔 세포 증식이 유도된 경우, 댑손 (10 μg/ml)은 대조군 세포 배양체에 비해, 술잔 세포 증식의 양과 정도를 감소시켰다 (데이터 표시하지 않음). 따라서, 댑손은 IL-13 유도된 술잔 세포 증식을 억제함에 의해서도 염증을 해소하는데 이로운 역할을 하는 것이다.

REFERENCES

Abanses JC, Arima S, Rubin BK. Vicks VapoRub induces mucin secretion, decreases ciliary beat frequency, and increases tracheal mucus transport in the ferret trachea. Chest 2009;135: 143-148.

Berlow, BA, Liebhaber, MI, Zeb, D and Spiegel, TM. J Allergy Clin Immunol. 1991 Mar;87(3):710-715.

Chin AC, Parkos CA. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu Rev Pathol 2007 ;2: 111-143.

Chougule, M, Padhi, B and Misra, A. AAPS PharmSciTech, 9(1): 47-53.

Schmidt E, Reimer S, Kruse N, Brocker EB, Zillikens D. The IL-8 release from cultured human keratinocytes, mediated by antibodies to bullous pemphigoid autoantigen 180, is inhibited by dapsone. Clin Exp Immunol 2001 ; 124: 157-162.

Escotte S, Al Alam D, Le Naour R, Puchelle E, Guenounou M, Gangloff SC. T cell chemotaxis

and chemokine release after Staphylococcus aureus interaction with polarized airway epithelium. Am J Respir Cell Mol Biol 2006;34:348-354.

Kanoh S, Kondo M, Tamaoki J, Kobayashi H, Motoyoshi K, Nagai A. Differential regulations between adenosine triphosphate (ATP)- and uridine triphosphate-induced CI- secretion in bovine tracheal epithelium. Am J Respir Cell Mol Biol 2001 ;25:370-376.

Zhu YI, Stiller MJ. Dapsone and sulfones in dermatology: overview and update. J Am Acad Dermatol 2001 ;45 :420-434.

이제까지 바람직한 구체예를 들어 본 발명을 설명하였으나, 당업자라면 본 발명이 첨부된 특허청구범위와 정신의 범위 내에서 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 구체예로 한정되는 것은 아니며, 상세한 설명에 제공된 정신과 범위 내에서 가능한 모든 변형 및 등가물을 모두 포괄하는 것이다.

Claims

환자에 있어서 기도의 염증을 예방 또는 치료하기 위한 방법으로서, 이 방법은 상기 환자의 상기 기도에 댑손을 포함하는 포뮬레이션을 투여하는 단계를 포함하여 이루어지며, 여기서 상기 포뮬레이션은 에어로졸화된 포뮬레이션 또는 수성 포뮬레이션인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 포뮬레이션은 에어로졸화된 포뮬레이션이고 상기 투여 단계는 계량형 흡입기 및 건조 분말 흡입기로 이루어지는 군으로부터 선택된 장치를 사용하여 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 포뮬레이션은 수성 포뮬레이션이고 상기 투여 단계는 인스톨레이션에 의하여 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 환자는 낭성섬유증, 기관지 확장증, 폐쇄세기관지염, 폐기종, 만성 기관지염, 만성 비부비동염, 독성 흡입 손상, 만성 폐쇄성 폐질환, 특발성 폐 섬유증, 천식 및 만성 기도 염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 증상을 앓는 환자인 것인 방법.
환자에 있어서 기도의 비정상적인 점액섬모 전달을 예방 또는 치료하기 위한 방법으로서, 이 방법은 상기 환자의 상기 기도에 댑손을 포함하는 포뮬레이션을 투여하는 단계를 포함하여 이루어지며, 여기서 상기 포뮬레이션은 에어로졸화된 포뮬레이션 또는 수성 포뮬레이션인 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 포뮬레이션은 에어로졸화된 포뮬레이션이고 상기 투여 단계는 계량형 흡입기 및 건조 분말 흡입기로 이루어지는 군으로부터 선택된 장치를 사용하여 수행되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 포뮬레이션은 수성 포뮬레이션이고 상기 투여 단계는 인스톨레이션에 의하여 수행되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 환자는 낭성섬유증, 기관지 확장증, 폐쇄세기관지염, 폐기종, 만성 기관지염, 만성 비부비동염, 독성 흡입 손상, 만성 폐쇄성 폐질환, 특발성 폐 섬유증, 천식 및 만성 기도 염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 또는 증상을 앓는 환자인 것인 방법.