KR20130051632A - 내건성 및 내염성 ＮｔＴＣ 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 건조 및 염 스트레스 저항성을 갖는 NtTC 단백질, 이를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 및 염/건조 저항성 단백질의 세포내 수준을 조절하여 식물의 염 및 건조 저항성을 조절하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 내염성 및 내건성을 갖는 유용 식물체를 간편하고 체계적으로 육종할 수 있으며, 이로 인한 생산성향상 및 안전한 농산물공급이 가능할 것으로 기대된다.

Description

내건성 및 내염성 ＮｔＴＣ 유전자 및 이의 용도{Salt and drought stress tolerant gene, NtTC and use thereof}

본 발명은 내염성 또는 내한발성 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 특정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 세포 내 수준을 조절하여 식물의 내염성 또는 내한발성을 증진시키는 방법, 상기 방법에 따라 제조된 식물 및 이의 종자에 관한 것이다.

농업은 타 산업에서는 볼 수 없는 특유의 위험과 불안정성이 있다. 농업은 재해에 따르는 손실이 클 뿐만 아니라 농산물가격 변동이 크며, 생산자재의 구입가격에 비해 농산물가격은 상대적으로 저위에 있기 때문에 더욱 불확실하다. 농업은 자연적 위험으로 한발이나 홍수, 서리, 우박 등에 의해 다른 어느 산업보다 피해를 입기 쉽다. 이는 농업생산의 장과 생산물의 이동이 불가능한 토지에 밀접하게 연결되어 있어서 제약을 받기 때문이며, 또한 생산의 대상이 동식물이기 때문에 생명현상의 제약에 따라 자연적인 조건에 지배되는 측면이 크기 때문이다.

한발(가뭄, 건조)은 강수부족으로 수량손실을 야기하거나 일정한 강수기간이 없어 관개수에 의존하여 작물을 재배하는 것으로 한발은 재배기간 중 어느 때라도 발생할 수 있고 지역에 따라서는 연중 발생하기도 한다. 생육초기에는 이앙시점이나 파종이 지연되고 중기에 발생한 한발이 지속되면 개화시기의 지연으로 수량에 치명적인 영향을 미친다. 우리나라는 연 강수량이 1,250 mm 정도로 풍부하지만 7-8월에 편중되어 있어 봄, 가을에는 반 건조성 기후의 성격을 띠고 있다. 따라서 봄, 가을은 상습적으로 한발이 일어나고 때에 따라서는 7-8월에도 강우가 부족하여 한해(旱害)를 입기도 한다.

작물의 염해는 염류토양과 나트륨성 토양에 작물을 재배할 때에 나타나며, 해수의 유입, 토양수분의 증발에 따른 염류의 농축, 한발로 하천수가 감소되어 해수가 역류된 염분함량이 높은 관개수의 관개, 조풍 또는 파랑에 의한 바닷물의 비말 등의 영향으로도 나타난다. 한국은 3면이 바다로 둘러져 있어 대부분은 해안으로 구성이 되어 염해지(鹽海地)가 많다. 염해지란 염수의 침입이나 토양수분의 증발로 염분의 농도가 짙어짐으로써 식물이 생육에 장애를 받는 땅으로 일부 지역은 염전으로 활용되었으며, 1960년대 이후 상당부분이 간척지로 변모하였다. 그 중 많은 면적은 숙답(熟沓)되어 벼의 수확량을 올리고 있지만, 비교적 근래에 간척사업이 끝난 신개답지의 경우 염의 피해를 받는 일이 많다.

식물형질전환 기술의 발달에 의해 유연관계가 먼 외래유전자의 발현이 가능해짐에 따라 불량환경에 견디는 유전자를 감수성 식물에 도입함으로써 내재해성 작물개발이 가능하게 되었다. 따라서 냉해와 한발 및 염해에 견디는 유전자의 분리 및 개발은 이러한 작물 개발에 필수 불가결한 요건이다.

특히, 염해와 한발은 작물의 삼투압에 의한 수분부족을 야기하여 식물은 형태적, 대사적 변화를 일으키며 이에 대한 자세한 기작은 아직 완전히 밝혀져 있지 않다. 이러한 물의 부족은 식물의 형태적 변화뿐 아니라 기공 폐쇄, 광합성율과 광호흡율의 감소, 소분자들의 증가 및 식물호르몬의 변화 그리고 유전자 발현의 변화 등도 야기한다.

현재 인구 증가에 따라 식량증산은 계속 요구되고 있으나 농수 및 농지는 점점 줄어들고 있는 실정이다. 아울러, 작물은 고착생활을 하기 때문에 주위 환경이 변화하는 경우 생육기간 중 많은 스트레스를 받아 수확량에 큰 차이를 가져 오게 된다. 우리나라는 온대성 기후에 속하지만, 지구 기후변화로 예기치 못한 가뭄 및 고온 등 이상 기상 현상이 빈번히 발생하고 있으며 과거 10년간(1995-2004)의 한해, 풍수해, 냉해 등으로 인한 기상재해면적이 연평균 162.8천 ha로, 우리나라 총 경지면적 1,836천 ha의 8.87%에 해당된다. 이같이 자연재해에 의한 농업생산성 저하는 심각한 수준으로 이러한 불량환경에 잘 견디는 작물 개발이 식량증산에 절대적으로 요구되고 있다.

한편, 앞서 언급한 바와 같이, 자연환경에서 식물은 병해충, 고온이나 저온, 한발이나 과습, 과도한 염과 같은 생물적 또는 비생물학적 스트레스에 노출되는데, 스트레스에 노출되면 식물의 세포에서 생성된 활성산소가 잎에 축적되어 단백질, 지방 등과 같은 세포의 구성성분을 산화시켜 생리적 장애를 발생시키며, 심할 경우에는 세포의 사멸을 초래할 수 있다. 일반적으로 식물의 산화스트레스에 대한 방어기작에는 superoxide dismutase (SOD)나 peroxidase (POD)와 같은 효소나 ascorbate, tocopherol, GSH 등의 항산화물질이 관여하고 있다.

토코페롤(tocopherol)과 토코트리에놀(tocotrienol)은 일반적으로 vitamin E로 알려진 수용성 지질 항산화물질로 광합성 세균과 식물에서 합성된다. 토코페롤은 분자의 aromatic ring에 치환되는 메틸기의 위치와 수에 따라 α-, β-, γ- 및 δ-토코페롤의 4가지 isoform으로 분류된다. 토코페롤과 토코트리에놀 생합성의 첫 단계는 homogentisate phytyltransferase(HPT/ VTE2)와 homogentisate geranylgeranyl transferase 효소에 의해 이루어지며, homogentisic acid(HGA)에 phytyl diphosphate(PDP) 또는 geranylgeranyl diphosphate가 프레닐화(prenylation)되어 2-methy-6-phytyl-benzoquinol (2M6PBQ) 또는 2-metyl-6-geranyl geranyl benzoquinol(2M6GGBQ)이 생성된다. 2M6PBQ과 2M6GGBQ는 다음 단계에서 tocopherol cyclase(TC/VTE1)와 γ-tocopherol methyl transferase(γ-TMT/VTE4)의 활성과 기질 특이성에 따라 여러 isoform의 토코페롤과 토코트리에놀로 생합성된다. 식물체에서 토코페롤의 성분이나 함량은 종과 조직에 따라 다르다. 일반적으로 α-토코페롤은 잎에, 그리고 γ-토코페롤은 종자에 풍부하며, 대부분의 식물에서 β-와 δ-토코페롤의 함량은 많지 않다.

기내(in vitro) 실험에서 토코페롤의 redox-activated quinone ring이 활성산소에 영향을 주기 때문에 토코페롤은 산화적 분해로부터 세포막의 지질성분을 보호하는 중요인자로 알려져 있다. 특히 α-토코페롤은 기내 실험에서 모든 형태의 토코페롤 중 항산화활성이 가장 높으며, 기내의 리포좀(liposome)에서 지방산의 산화를 가장 많이 억제하는 항산화물질이다. 그러나 식물의 α-토코페롤과 스트레스의 관계는 명확하지 않다. 애기장대에서 γ-TMT 결핍 돌연변이 vte4-1은 생화학적 분석에서 여러 스트레스 환경에서 정상식물체에 비교하여 구별될 정도의 차이가 발견되지 않았다(Bergmuller et al., Plant Mol Biol 52:1181-1190, 2003). 반면에 dsRNAi 기술을 이용하여 γ-TMT 유전자의 전사 후 과정(post-transcription)을 차단한 담배에서는 정상담배에 비교하여 염에 대해 저항성이 약 20% 감소되고, sorbitol-매개로 인한 삼투압에 대한 저항성이 향상되었다는 보고가 있다(Abbasi et al., Plant Physiol 143:1720-1738, 2007). 항산화성 물질인 토코페롤과 식물의 환경 스트레스 내성과의 연관성과 식물종 및 isoform에 대한 기능 연구는 명확하지 않아 좀 더 많은 연구가 수행되어야 하며, 다른 항산화물질(GSH, ascorbate)과의 연관성은 풀어야 될 숙제이다.

본 발명의 목적은 염 및 건조 저항성을 부여하는 새로운 유전자를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 염 및 건조 저항성이 향상된 형질전환체를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 염 및 건조 저항성을 부여하는 새로운 유전자를 식물체에 도입하여 식물체에 염 및 건조 저항성을 부여하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 염 및 건조 저항성을 부여하는 새로운 유전자를 이용하여 염 및 건조 저항성을 조절하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 염 및 건조 저항성 NtTC 폴리펩티드를 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 NtTC 폴리펩티드를 암호화하는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 NtTC 유전자를 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 NtTC 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 염 및 건조 저항성이 향상된 형질전환 식물체 세포를 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 NtTC 유전자를 식물체에 도입하여 식물체에 염 및 건조 저항성을 부여하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 NtTC 폴리펩티드의 세포 내 수준(level)을 조절하여 식물체의 염 및 건조 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 염 및 건조 저항성 NtTC 폴리펩티드에 관한 것이다.

상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에는 이의 기능적 동등물이 포함된다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 동해에 대한 저항성을 증진시키는 활성을 의미한다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 야생형에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 NtTC의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 NtTC의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와　같은　다른 단백질과　융합으로 만들어진　융합단백질　등이 이에 포함된다. 또한, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 단편(fragment)으로서 야생형의 NtTC와 실질적으로 대등한 생리활성을 갖는 폴리펩타이드는 야생형 NtTC의 기능적 동등물의 또 다른 바람직한 그룹을 형성한다. 상기 "단편"은 단백질의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위 내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 메카니즘을 가진 것을 말하며 야생형에 존재하는 것이거나, 프로테이즈를 사용하여 절단한 것이거나 화학적으로 절단된 것이 모두 포함된다.

또한, 다른 양태로 본 발명은 NtTC 단백질을 암호화하는 염 및 건조 저항성 NtTC 유전자를 제공한다.

본 발명에 따른 NtTC 단백질을 암호화하는 염기 서열은 gDNA, cDNA 및 RNA를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 염기 서열은 야생형 단백질과 그의 기능적 동등물을 암호화하는 염기 서열 및 이들 서열과 고긴축 조건 (high stringent condition) 하에서 혼성화하는 서열들을 모두 포함한다. 고긴축 조건은 공지된 문헌(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 바와 같다. 바람직하게, 본 발명에 따른 NtTC 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 및 이의 서열 변이체가 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 서열 변이체는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열이 포함될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "상동성"이란 야생형(야생형) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

또한, 다른 양태로 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서의 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. 본 발명에서의 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서의 용어, "발현 벡터"는 목적한 암호화 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 적합한 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 재조합 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 상기 선택 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예컨대, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서의 용어, "프로모터"는 정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 작동 가능하게 연결된다(operably linked)는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol.Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseo세포주) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacteriumtumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 염 및 건조 저항성이 향상된 형질전환 식물체 세포에 관한 것이다.

본 발명에서 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)를 이용할 수 있다.

또한 형질전환에 사용될 수 있는 균으로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 형질전환체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다.

상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 담배, 배추, 고추, 감자, 유채, 상추 등의 식물일 수 있으며, 보다 바람직하게 본 발명의 유전자로 형질전환 시 높은 내염성과 내건성을 보이는 식물은 벼이다.

다른 양태로, 본 발명은 상기 NtTC 유전자를 식물체에 도입하여 식물체에 염 및 건조 저항성을 부여하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 세포내 수준(level)을 조절하여 식물의 염 및 건조 저항성을 조절하는 방법, 보다 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 과발현시켜 식물의 염 및 건조 저항성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

상기 "세포 내 수준"이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 1의 NtTC 또는 이의 변이체를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 서열번호 1의 NtTC 또는 이의 변이체의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 단백질 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 서열번호 1의 NtTC 또는 이의 변이체를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 단백질 또는 단백질의 안정성을 증진하는 방법 또는 단백질 또는 단백질의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법의 보다 구체적인 예로 1군 인트론 타입, M1 RNA 타입, 망치머리(hammerhead) 형 또는 머리핀(hairpin) 형　또는　microRNA　형 등의 전사된 mRNA에 작용하는 RNA를 암호화하는 DNA서열로 형질전환하거나, 표적 유전자 서열과 동일 또는 유사한 서열을 가지는 DNA의 형질전환을 통한 동시억제(cosuppression)를 유도할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 서열번호 2의 단백질 또는 이에 대한 기능적 동등물의 세포내 수준을 조절하는 것은 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 증가 또는 감소시키는 방법은 각각 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 2의 단백질 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 그 발현을 증진시키거나, 프로모터에 상기 유전자에 대한 안티센스 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 그 발현을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 가지는 NtTC 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하여 형질전환킴으로써 NtTC의 세포 내 발현 수준을 증가시켰다.

그리고 NtTC의 과발현 형질전환체의 특성을 조사한 결과, NtTC의 과발현이 염 및 건조 스트레스에 대한 저항성을 가져 내염성 및 내건성을 크게 향상시킴을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 염 및/또는 건조 스트레스에 대한 저항성 유전자로 형질전환된 식물체는 내염성 및/또는 내건조성 품종으로 육성 가능하며, 이로부터 지구 온난화 등 갑작스런 기후 변화에도 생산성에 영향을 받지 않고 안정적인 농산물 공급이 가능하다.

도 1. 식물 형질전환용 NtTC 과발현 벡터의 모식도
도 2. PCR 방법을 이용한 형질전환 식물의 도입유전자 확인. 1-6 : NtTC 형질전환벼, 7-8 : 대조 식물체.
도 3. 형질전환 식물에서의 NtTC 유전자 발현 확인. 1-6 : NtTC 형질전환벼, 7-8 : 대조 식물체.
도 4. 형질전환 벼(잎)의 total GSH 활성 분석 결과
도 5. NtTC 형질전환 벼의 내염성 검정 결과
도 6. NtTC 형질전환 벼의 내건성 검정 결과 (A) 분얼기 이전, (B) 분얼기 이후

이하 본 발명의 이해를 돕기 위해 하기 실시예를 제시한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되는 것은 아니다.

<실시예 1> NtTC 유전자 분리 및 염기서열 결정

담배(Nicotiana tabacum cv. Xanthi)에서의 토코페롤 사이클라제 유전자(TC)의 분리를 위해, 기존에 보고된 감자(Solanum tuberosum)의 염기서열(accession no. AY536918)을 기초로 하고 기보고된 여러 종의 유전자염기서열을 분석하여 conserved region으로 분석된 염기서열 부분을 기초로 하여 하기 한 쌍의 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 제작하였다.

TC 1 : 5'-TTCTTTGAAGGTTGGTTCTTTAAGGTATCAATTCCAGAG-3'

TC 2 : 5'-TGCCAATGTGGCTCAAATACTGGAAAAGCAGCAGGCCA-3'

Total RNA를 추출하기 위하여 담배 잎을 채취하여 액체질소를 이용하여 식물조직을 완전히 분쇄한 후 RNeasy Mini kit(Qiagen)를 이용하여 추출하였다. 추출된 전체 RNA 1㎍을 Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen)를 이용하여 cDNA로 변환시킨 후 상기의 프라이머 쌍을 이용하여 cDNA를 94℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 1분을 1회 반응주기로 하여 32회 증폭하였다. 증폭된 cDNA 단편은 pGEM-T easy Vector (Promega)에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.

전체 NtTC 유전자를 분리하기 위해서 상기 cDNA 단편 염기서열분석 결과를 기초로 하기의 뉴클레오티드 프라이머를 제작하였다.

TC-A : 5'-ATGTACTCTGTAGAGAATCCTGCATTTCCCAAG-3'

TC-B : 5'-TCCTGCTGTAGACTTCTGCTTTGAGTTAACGT-3'

담배에서 추출한 total RNA를 SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)을 이용하여 cDNA를 제조하고 약 400 bp 정도의 유전자가 중첩되도록 TC-A와 TC-B 프라이머를 사용하여 각각 3'과 5'-RACE PCR을 실시하였고 증폭된 산물을 분리하여 각각의 DNA 증폭산물을 pGEM-T easy Vector(Promega)에 클로닝하고 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석결과로 확인된 중첩 유전자 부분의 단일 SacI 제한효소 자리를 이용하여 두 개의 벡터에 삽입된 유전자를 절단하고 연결하여 완전한 담배의 TC 유전자가 클로닝 되도록 한 후 전체 염기서열의 유전자 분석을 실시하였다.

담배의 TC 유전자(NtTC)는 1,539bp로 513개의 아미노산으로 구성되어 있으며 타 작물에서 분리된 TC 유전자와 다중아미노산 서열 분석결과 N-말단부분의 아미노산 서열은 상동성이 비교적 높지 않았다.

<실시예 2> 식물 형질전환용 NtTC 과발현 벡터 제작 및 벼 형질전환

식물세포 내에서 NtTC를 과발현시켰을 때의 효과를 조사하기 위하여 제초제 저항성 유전자(Bar)를 가지는 pMJ101 유래의 식물 형질전환용 벡터의 attR1과 attR2 사이에 NtTC의 전체 ORF가 삽입되어 cytochrome C 프로모터에 의해 과발현되는 식물형질전환 벡터 pTCGB를 제조하였다(도 1).

형질전환된 벼의 생산은 pTCGB가 형질전환된 아그로박테리움(LBA4404)을 흑남 벼 캘로스와 공동 배양한 후 phospinotricin(PPT, 6㎍/L)이 포함된 배지에서 형질전환체를 선발하고 온실에서 생육하였다.

<실시예 3> NtTC 형질전환체의 도입 유전자 확인 및 유전자 발현 분석

PPT 첨가 배지에서 선발한 형질전환체의 PCR 검정 및 유전자 발현 확인을 위하여 식물체내 도입유전자인 NtTC와 Bar에 특이적 염기서열을 가진 프라이머 set을 하기와 같이 제작하였다.

TC-FC : 5'-AATTTGAGCACTTTTCCGTCTACCTTGAAGC-3'

TC-RC : 5'-GCAGTCAAAGCAACATCTCCAATCGC-3'

Bar-FC : 5'-CGGTCTGCACCATCGTCAACCACT- 3'

Bar-RC : 5'-ATGCCAGTTCCCGTGCTTGAAGCC-3'

형질전환체 벼 및 대조벼 잎을 채취하여 전체 핵 DNA를 CTAB 방법으로 추출한 후 SapphireAmp Fast PCR Master Mix(Takara)와 상기 제조된 프라이머 set을 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응조건은 95℃에서 5분간 예비변성 시킨 후 94℃ 1분, 63℃ 1분, 72℃ 1분의 주기로 30회 반응시킨 후 최종 72℃에서 10분간 신장반응 하였다. 최종 PCR 산물은 1% agarose gel 상에서 전기영동으로 분리한 후 ethidium bromide로 염색하여 확인하였다(도 2). 도입유전자의 PCR 분석 결과 모든 형질전환 식물체에서 904 bp의 NtTC 유전자 및 419 bp의 Bar 유전자의 증폭물이 관찰된 반면 대조 식물체에서는 증폭물이 관찰되지 않았다.

벼에 도입된 NtTC 유전자의 발현은 RT-PCR 방법으로 확인하였다. 형질전환체와 대조 식물의 total RNA는 액체질소를 이용하여 분쇄한 후 RNeasy Mini kit (Qiagen)를 이용하여 추출하였다. 추출된 전체 RNA 1㎍을 Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen)를 이용하여 cDNA로 변환시킨 후 하기의 NtTC 유전자 프라이머 set (TC-FC/TC-RC)과 벼 내재 발현유전자인 tubulin primer set (TubF/TubR)을 이용하여 cDNA를 94℃ 1분, 63℃ 1분, 72℃ 1분을 1회 반응주기로 하여 25회 증폭하였다. 최종 RT-PCR 반응산물은 1% agarose gel 상에서 전기영동으로 분리한 후 ethidium bromide로 염색하여 확인하였다(도 3). RT-PCR 분석 결과 도입된 NtTC 유전자는 형질전환 식물체에서 과발현 되었지만 대조 식물체에서는 나타나지 않았다.

TC-FC : 5'-AATTTGAGCACTTTTCCGTCTACCTTGAAGC-3'

TC-RC : 5'-GCAGTCAAAGCAACATCTCCAATCGC-3'

TubF : 5'-TCAGATGCCCAGTGACAGGACTGTTG-3'

TubR : 5'-TGGTGATCTCGGCAACAGAGAGTTGC-3'

<실시예 4> 형질전환체의 토코페롤 함량 및 GSH 활성 분석

NtTC 유전자의 작용에 의해 항산화물질인 토코페롤 성분변화를 알아보고자 대조식물체와 형질전환 식물체의 잎 샘플을 채취하고 동결건조 후 분쇄하여 HPLC 성분분석 결과 NtTC 형질전환체의 gamma-토코페롤 농도는 대조구와 비교하여 31% 증가하였고 알파-토코페롤 농도는 53.7%가 증가하여 전체 토코페롤 농도는 52% 가량 유의성 있는 증가를 나타났다(표 1). 하기 표 1은 형질전환 벼(잎)의 토코페롤 함량 분석 결과이다.

ng / mg ( Dry W)	CON	TC
alpha-Tocopherol	230.74±38.04 (100%)	354.72±53.67* (153.7%)
beta-Tocopherol	0.78±0.17 (100%)	1.10±0.25 (141.0%)
gamma-Tocopherol	9.79±1.60 (100%)	12.88±2.12 (131.6%)
Total	241.31±39.81 (100%)	368.70±56.04* (152.8%)

식물에서 glutathione(GSH)는 환경스트레스와 외부 화합물질로부터 식물체를 방어하는 중요한 항산화물질로 알려져 있다. 대조식물체와 형질전환 식물체의 잎 샘플을 동결건조 후 분쇄하여 GSH 농도를 Bioxytech GSH-420(OxisResearch)을 사용하여 측정하였다. 형질전환체의 GSH 활성은 대조 식물체와 비교하여 27% 유의성 있는 증가를 나타냈다(도 4).

<실시예 5> NtTC 형질전환 벼의 내염성 검정

NtTC 형질전환 식물체의 내염성에서의 종자 발아력을 알아보고자 200 mM 농도로 NaCl이 첨가된 MS 배지에 대조식물체 종자와 형질전환 식물체 종자(T₂ 세대)를 치상하고 3주간 발아시켜 뿌리의 생육정도를 측정하였다. 검정결과 대조식물체와 비교하여 형질전환체의 뿌리 생육정도가 우수한 것으로 나타났다(도 5A). 또한 기본 MS 배지에서 9일 동안 배양한 유묘를 100mM NaCl이 첨가된 하이포넥스 용액으로 옮겨 13일간 배양한 후 식물내의 내염성 정도를 살펴보았다. 실험 결과 형질전환 식물체는 대조식물체에 비하여 100 mM NaCl 환경에서 높은 생존력을 나타내었다(도 5B).

<실시예 6> NtTC 형질전환 벼의 내건성 검정

형질전환 식물체의 내건성 검정은 분얼기 이전의 유묘와 분얼이 완전히 진행된 출수기 이전의 NtTC 형질전환 벼와 대조 식물체를 각각 온실에서 물을 주지 않고 처리한 후 물을 공급하는 방법으로 NtTC 형질전환 벼의 내건성을 알아보았다. 도 6A는 분얼기 이전의 식물체를 11일간 물을 공급하지 않다가 물을 공급한지 하루 후의 결과이다. 대조식물체에 비해 건조스트레스에 의한 성장저해 효과가 매우 낮은 것으로 나타났다. 도 6B는 분얼기 이후의 식물체에 12일간 물을 공급하지 않다가 물을 공급하고 4일 후의 결과이다. 대조 식물체에 비해 생존개체수가 확연히 높음을 알수 있다. 상기 결과는 NtTC의 발현으로 형질전환 벼의 내건성이 증진되었음을 증명한 것이다.

<110> Rural development administration <120> Salt and drought stress tolerant gene, NtTC and use thereof <130> P11-217 (2011-0202-10-A) <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1539 <212> DNA <213> NtTC (Tocopherol cyclase of Nicotiana tabacum) <400> 1 atggagaaca tatacgattt ttccaccatc tcttcaattt ctcagcctaa gaaaaatctt 60 ggattttctt ggactgtgac taattctgca acttcagtaa caaatgggaa aattctctct 120 ttgaccaagt tcaagaattt gagcactttt ccgtctacct tgaagctgca gtgtcaaaaa 180 tcaagacatg catgtgtagt gaacgcagtc gcaggagctg attcatctgt tgaaatgaca 240 aaacaggaaa atagggaggc tgtgaaaccg gtttactctt ctacaccttc taatcgtcct 300 cttcgaactc ctcatagcgg gtaccatttt gatggaagta gcagaaaatt ctttgaaggt 360 tggttcttta aggtatcaat tccagaatgc agacagagtt tttgctttat gtattctgta 420 gagaatcctg catttcccga gaaattgagc agctttgagg agttgcaata tggtcctcgg 480 tttactggtg tgggagctca aattcttggt ccagatgaca agtatatttg tcaatatact 540 caagagtctt caaacttctg gggaagtagg catgaactga tgcttgggaa caccttcatt 600 gcccaaaata gtgctaggcc tccaaataag gaagttcctc cgcaggagtt taatcgccgg 660 gttgtagagg gttttcaagt taccccactt tggcatcaag gaagtattcg cgatgatggg 720 aggacagatt atactgaaat tgtgaaaact gctagctggg agtatagcac gcaacccatt 780 tatggatggg gtgacgttaa ctcaaagcag aagtctacag caggatggcc tgctgctttt 840 cctgtatttg aaccacattg gcaaatatgc atggcagctg gactttcaac gggctggata 900 gagtgggatg gtcagcgata tgagtttcaa aatgctcctt cttactctga aaagaattgg 960 ggtggtgcct tcccaagaaa gtggttttgg gtgcaatgca gtgtctttga aggtgcgatt 1020 ggagatgttg ctttgactgc tggtggtgga ttaaggcagc ttcctggatt gagtcagaca 1080 tttgaaaatg ctgctttgat aggaattcac tatggaggta ttttctatga atttgttcca 1140 tggaatgcta gcattagttg ggaaattgct caatggggta aatggcatat atttggggag 1200 aatgagacac atacagtaga actggaagca acagcggaag atcctggtac cacattgcgc 1260 gctcccacag atgagatggg tctcgctcct gcatgtagag acacgtgttt cagtgatcta 1320 agactgcggt tgtgggaacg gaagagtaat ggaagtaaag gaaaggttat tttggatgtt 1380 acaagcaata tggcaggtct agaagttggg ggaggaccat ggttcaacac atggaaggga 1440 aaagcacaga tgccagaaat tgttactcga gctattaacg ttcctgtgga tttggatggc 1500 atattcggct tgactccatt tctcaaacct cctggcctg 1539 <210> 2 <211> 513 <212> PRT <213> NtTC (Tocopherol cyclase of Nicotiana tabacum) <400> 2 Met Glu Asn Ile Tyr Asp Phe Ser Thr Ile Ser Ser Ile Ser Gln Pro 1 5 10 15 Lys Lys Asn Leu Gly Phe Ser Trp Thr Val Thr Asn Ser Ala Thr Ser 20 25 30 Val Thr Asn Gly Lys Ile Leu Ser Leu Thr Lys Phe Lys Asn Leu Ser 35 40 45 Thr Phe Pro Ser Thr Leu Lys Leu Gln Cys Gln Lys Ser Arg His Ala 50 55 60 Cys Val Val Asn Ala Val Ala Gly Ala Asp Ser Ser Val Glu Met Thr 65 70 75 80 Lys Gln Glu Asn Arg Glu Ala Val Lys Pro Val Tyr Ser Ser Thr Pro 85 90 95 Ser Asn Arg Pro Leu Arg Thr Pro His Ser Gly Tyr His Phe Asp Gly 100 105 110 Ser Ser Arg Lys Phe Phe Glu Gly Trp Phe Phe Lys Val Ser Ile Pro 115 120 125 Glu Cys Arg Gln Ser Phe Cys Phe Met Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala 130 135 140 Phe Pro Glu Lys Leu Ser Ser Phe Glu Glu Leu Gln Tyr Gly Pro Arg 145 150 155 160 Phe Thr Gly Val Gly Ala Gln Ile Leu Gly Pro Asp Asp Lys Tyr Ile 165 170 175 Cys Gln Tyr Thr Gln Glu Ser Ser Asn Phe Trp Gly Ser Arg His Glu 180 185 190 Leu Met Leu Gly Asn Thr Phe Ile Ala Gln Asn Ser Ala Arg Pro Pro 195 200 205 Asn Lys Glu Val Pro Pro Gln Glu Phe Asn Arg Arg Val Val Glu Gly 210 215 220 Phe Gln Val Thr Pro Leu Trp His Gln Gly Ser Ile Arg Asp Asp Gly 225 230 235 240 Arg Thr Asp Tyr Thr Glu Ile Val Lys Thr Ala Ser Trp Glu Tyr Ser 245 250 255 Thr Gln Pro Ile Tyr Gly Trp Gly Asp Val Asn Ser Lys Gln Lys Ser 260 265 270 Thr Ala Gly Trp Pro Ala Ala Phe Pro Val Phe Glu Pro His Trp Gln 275 280 285 Ile Cys Met Ala Ala Gly Leu Ser Thr Gly Trp Ile Glu Trp Asp Gly 290 295 300 Gln Arg Tyr Glu Phe Gln Asn Ala Pro Ser Tyr Ser Glu Lys Asn Trp 305 310 315 320 Gly Gly Ala Phe Pro Arg Lys Trp Phe Trp Val Gln Cys Ser Val Phe 325 330 335 Glu Gly Ala Ile Gly Asp Val Ala Leu Thr Ala Gly Gly Gly Leu Arg 340 345 350 Gln Leu Pro Gly Leu Ser Gln Thr Phe Glu Asn Ala Ala Leu Ile Gly 355 360 365 Ile His Tyr Gly Gly Ile Phe Tyr Glu Phe Val Pro Trp Asn Ala Ser 370 375 380 Ile Ser Trp Glu Ile Ala Gln Trp Gly Lys Trp His Ile Phe Gly Glu 385 390 395 400 Asn Glu Thr His Thr Val Glu Leu Glu Ala Thr Ala Glu Asp Pro Gly 405 410 415 Thr Thr Leu Arg Ala Pro Thr Asp Glu Met Gly Leu Ala Pro Ala Cys 420 425 430 Arg Asp Thr Cys Phe Ser Asp Leu Arg Leu Arg Leu Trp Glu Arg Lys 435 440 445 Ser Asn Gly Ser Lys Gly Lys Val Ile Leu Asp Val Thr Ser Asn Met 450 455 460 Ala Gly Leu Glu Val Gly Gly Gly Pro Trp Phe Asn Thr Trp Lys Gly 465 470 475 480 Lys Ala Gln Met Pro Glu Ile Val Thr Arg Ala Ile Asn Val Pro Val 485 490 495 Asp Leu Asp Gly Ile Phe Gly Leu Thr Pro Phe Leu Lys Pro Pro Gly 500 505 510 Leu

Claims (9)

1. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 염 및 건조 저항성 NtTC 단백질.
2. 제 1 항의 단백질을 암호화하는 NtTC 유전자.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 NtTC 유전자.
4. 제 2 항 또는 제 3 항에 따른 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
5. 제 4 항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 염 및 건조 저항성이 향상된 형질전환 식물체 세포.
6. 제 2 항 또는 제 3 항에 따른 NtTC 유전자를 식물체에 도입하여 식물체에 염 및 건조 저항성을 부여하는 방법.
7. 제 1 항에 따른 NtTC 단백질의 세포 내 수준(level)을 조절하여 식물체의 염 및 건조 저항성을 조절하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서,
   상기 단백질을 과발현시켜 식물체의 염 및 건조 저항성을 향상시키는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 단백질을 과발현시키는 방법이 프로모터에 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 식물에 형질전환하거나, 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 식물체 세포에 도입하는 방법인 것을 특징으로 하는 방법.

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