KR20130051294A

KR20130051294A - 유산균을 포함하는 위염 억제／개선용 발효홍삼

Info

Publication number: KR20130051294A
Application number: KR1020110116558A
Authority: KR
Inventors: 백남수; 함기백; 김성수
Original assignee: 주식회사 메디오젠
Priority date: 2011-11-09
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2013-05-20
Also published as: KR101367250B1

Abstract

본 발명에서는 유산균을 포함하는 위염 억제/개선용 발효홍삼에 관한 것으로 보다 상세하게는 Lactobacillus plantarum MG208(KCTC 12036BP), Lactobacillus rhamnosus MG316(KCTC 12037BP) 및 Lactobacillus acidophilus MG501(KCTC 12035BP)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유산균을 포함하는 위염 억제/개선용 발효홍삼에 관한 것이며, 상기 발효홍삼은 20~30brix의 홍삼추출물을 (i) 85~100℃에서 25분~35분 살균처리 후 pH를 5.0~5.5로 유지하는 전처리 단계; (ii) Lactobacillus plantarum MG208(KCTC 12036BP)을 접종 후 15~17시간 발효하는 제1단계; (iii) Lactobacillus rhamnosus MG316(KCTC 12037BP)을 접종 후 15~17시간 발효하는 제2단계; (iv) Lactobacillus acidophilus MG501(KCTC 12035BP)을 접종 후 15~17시간 발효하는 제3단계를 통해 발효된 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명인 유산균을 포함하는 위염 억제/개선용 발효홍삼에는 헬리코박터 파이로리균에 의해 일어나는 위염을 억제한다는 유리한 효과가 있다는 것이 인정된다. 나아가 이를 이용한 제품은 자연식품으로 상시 섭취가 가능하고, 항생제와 같이 부작용을 염려할 필요가 없다는 점, 저비용으로 헬리코박터 파이로리균에 의해서 발생되는 제반 질환을 사전에 예방 및 치료할 수 있다는 점에서 식품산업적으로 매우 유용할 것으로 사료된다.

Description

유산균을 포함하는 위염 억제／개선용 발효홍삼{fermented red ginseng containing lactic acid bacteria for suppresssing／improving gastritis due to Helicobacter pylori}

본 발명은 발효홍삼에 관한 기술이다. 보다 상세하게는 Lactobacillus plantarum MG208(KCTC 12036BP), Lactobacillus rhamnosus MG316(KCTC 12037BP) 및 Lactobacillus acidophilus MG501(KCTC 12035BP)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유산균을 포함하는 위염 억제/개선용 발효홍삼에 관한 기술로서, 상기 위염 억제는 헬리코박터 파이로리균에 의해 유도되는 염증에 대해 다양한 억제기작을 발휘하는 것에 의함을 특징으로 할 수 있다.

헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)균은 1982년 호주의 marshall과 warren에 의하여 인체의 위점막에서 처음 분리된 이래 만성위염 및 소화성 궤양의 주요 원인균임이 밝혀졌으며, 1994년에는 세계보건기구 산하 국제 암연구기관에서 발암인자의 하나로 규명되었다. 이 균은 몇 개의 편모를 가진 그람음성 간균으로 위 점막층의 표층이나 점액내에 증식하며 가장 특징적인 미생물학적 성상은 강력한 운동성과 유레아제(urease)효소 활성을 가진 것이다. 강력한 운동성은 위의 점액내에서도 자유롭게 이동하면서 살아가기 위한 것으로 주된 역할을 하는 것은 편모이다. 또한 유레아제 활성은 위 점막 내에 낮은 농도로 존재하는 요소를 효과적으로 분해할 수 있으며 이에 따라 생산되는 암모니아가 세균의 주위환경을 중화시킴으로써 위산에 의한 공격에 대처하기 위한 것으로 추측되고 있다. 이러한 특징을 가진 헬리코박터 파이로리균은 만성위염, 위, 십이지장 궤양, 위암의 원인균으로 우리 나라 성인 인구 중 약 60~70%가 감염되어 있는 것으로 조사되고 있으며 만성 위염 환자의 경우 90% 이상의 감염률을 나타내고 있다.

헬리코박터 파이로리균은 특성에 대해 보다 구체적으로 검토하면 운동성이 있는 나선형 그람음성 간균으로 위점막의 점액질층에서 서식하며, 유레아제라는 효소를 가지고 있어 요소(urea)를 분해함으로써 생성되는 암모니아로 위의 강산성인 환경을 중화시켜 생존하고 있다. 헬리코박터 파이로리균은 만성위염과 위궤양과 관련이 있으며, 특히 위궤양의 70%, 위염의 90%, 십이지궤양의 90%가 직접적인 발병 원인이며 게스트릭 에더노머(gastric adenoma) 및 게스릭 무코사 어소시에이티드 림포머(gasric mucosa associated lymphoma)와 밀접한 관련이 있는 것으로 밝혀져 항헬리코박터 파이로리균에 대한 관심이 꾸준히 대두되고 있다.

현재 항헬리코박터 파이로리균에 대한 요법으로 일반적으로 항생제가 사용되고 있다. 그러나 항생제 남용으로 인한 주요 부작용은 쇼크, 내성균의 조성, 균교대 현상, 유전자에 대한 영향, 혈액장애, 간 장애, 위장관 출혈, 청각장애 등이 있다. 새로운 항생제 주사 중에는 술과 함께 복용했을 때 심각한 장애를 일으키는 것도 있다. 항생제의 위험성 중에서 내성균의 조성, 균교대 현상, 유전자에 미치는 영향 등은 항생제에만 있는 심각한 부작용이다. 또한 항생제는 신장병 발생의 주요 원인이 될 수 있다. 이태리의 베로나 대학 소아과학부 Fanos교수의 연구보고에 의하면 항생제의 투여 또는 항생제와 다른 약의 혼합 투여 시 신장(kidney)에 주는 위험에 대해 경고한 바 있다. 특히 저체중 신생아에게 흔히 투여되는 항생제가 신장을 악화시킬 수 있다고 보고했다(Fanos & Cataldi, 1999). 즉 완전한 제균이 힘들고 10~20%의 환자는 제대로 제균이 되지 않아 재감염이 일어나며 또다시 항생제를 처리하므로서 이의 남용에 따른 심각한 부작용과 항생제내성 균주의 증가로 국민건강에 악영향을 끼치는 악순환이 계속되는 실정이다.

따라서 부작용이 없으면서 식품과 같이 자연스럽게 섭취하여 헬리코박터 파이로리균을 예방하고, 나아가 치료효과를 발휘 할 수 있는 제품의 개발이 필요한 실정이다.

이하 본 발명과 관련된 특허문헌에 대해서 기재한다. 특허문헌으로서 KR 10-2007-0103435이 존재한다. 이 발명은 본 발명은 사포닌의 전환 방법, 발효 인삼 또는 홍삼의 제조방법 및 진세노사이드 Rg3 또는 Rh2의 인리치먼트 방법에 관한 것으로서, (a) 유산균을 인삼 또는 홍삼에 접종하는 단계; (b) 상기 유산균을 배양하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 배양 결과물을 열처리하는 단계로 구성되며, 이 발명에 따르면 비교적 간단한 공정으로 인삼 또는 홍삼 고유의 진세노사이드를 전환하여, Rg3 및/또는 Rh2가 인리치먼트된 인삼 또는 홍삼액을 얻을 수 있다고 기재하고 있다. 본 발명과 비교하여 인접한 기술이나, 본 발명의 경우는 기탁된 특정 유산균을 사용했다는 점, 3회의 발효 후 당해 유산균을 첨가한다는 점에서 기술상 차별성이 인정된다고 할 것이다.

본 발명은 위염 억제 또는 개선에 임상적 효과가 있는 발효홍삼을 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 상세하게는 Lactobacillus plantarum MG208(KCTC 12036BP), Lactobacillus rhamnosus MG316(KCTC 12037BP) 및 Lactobacillus acidophilus MG501(KCTC 12035BP)으로 3회 발효된 홍삼에 Lactobacillus plantarum MG208(KCTC 12036BP), Lactobacillus rhamnosus MG316(KCTC 12037BP) 및 Lactobacillus acidophilus MG501(KCTC 12035BP)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유산균을 추가적으로 혼합하는 발효홍삼을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명에서는 유산균을 포함하는 위염 억제/개선용 발효홍삼을 제공한다. 보다 상세하게는 Lactobacillus plantarum MG208(KCTC 12036BP), Lactobacillus rhamnosus MG316(KCTC 12037BP) 및 Lactobacillus acidophilus MG501(KCTC 12035BP)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유산균을 포함하는 위염 억제/개선용 발효홍삼을 제공한다.

상기 발효홍삼은 20~30brix의 홍삼추출물을 (i) 85~100℃에서 25분~35분 살균처리 후 pH를 5.0~5.5로 유지하는 전처리 단계(pH sensor는 InPro3030/120 이용); (ii) Lactobacillus plantarum MG208(KCTC 12036BP)을 접종 후 15~17시간 발효하는 제1단계; (iii) Lactobacillus rhamnosus MG316(KCTC 12037BP)을 접종 후 15~17시간 발효하는 제2단계; (iv) Lactobacillus acidophilus MG501(KCTC 12035BP)을 접종 후 15~17시간 발효하는 제3단계를 통해 발효된 것임을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 상기 제1단계 내지 제3단계의 발효온도는 20~40℃이다.

상기 제3단계 이후 75~85℃에서 25분~35분 살균처리 후 동결건조한 후, Lactobacillus plantarum MG208(KCTC 12036BP), Lactobacillus rhamnosus MG316(KCTC 12037BP) 및 Lactobacillus acidophilus MG501(KCTC 12035BP)을 첨가 한 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 위염 억제는 헬리코박터 파이로리균에 의해 유도되는 염증에 대해 다양한 억제기작을 발휘하는 것에 의함을 특징으로 할 수 있다.

본 발명인 유산균을 포함하는 위염 억제/개선용 발효홍삼에는 헬리코박터 파이로리균에 의해 일어나는 위염을 억제한다는 유리한 효과가 인정된다. 나아가 이를 이용한 제품은 자연식품으로 상시 섭취가 가능하고, 항생제와 같이 부작용을 염려할 필요가 없다는 점, 저비용으로 헬리코박터 파이로리균에 의해서 발생되는 제반 질환을 사전에 예방 및 치료할 수 있다는 점에서 식품 산업적으로 매우 유용할 것으로 사료된다.

도 1은 각 그룹별 마우스 체중 변화량에 관한 것이다.
도 2a 및 2b는 각 그룹별 대표 stomach 사진 및 discolorated area에 관한 것이다.
도 3a 및 3b는 H & E staining에 관한 것이다.
도 4a 및 4b는 Total pathologic score에 관한 것이다.
도 5는 IL-1βlevel 측정결과에 관한 것이다.
도 6는 IL-6 level 측정결과에 관한 것이다.
도 7는 IL-10 level 측정결과에 관한 것이다.
도 8는 TNF-a level 측정결과에 관한 것이다.
도 9는 MCP-1 level 측정결과에 관한 것이다.
도 10는 대표적 염증인자인 COX-2 expression 결과에 관한 것이다.
도 11는 BrdU staining 결과에 관한 것이다.
도 12는 TUNEL staining 결과에 관한 것이다.
도 13은 본 발명의 개략도이다.

헬리코박터 파이로리균에 대한 요법으로 일반적으로 사용되고 있는 항생제는 남용이 될 경우 부작용으로 쇼크, 내성균의 조성, 균교대 현상, 유전자에 대한 영향, 혈액장애, 간 장애, 위장관 출혈, 청각장애 등이 초래될 수 있다. 나아가 항생제의 위험성 중에서 내성균의 조성, 균교대 현상, 유전자에 미치는 영향 등은 항생제에만 있는 심각한 부작용이고, 신장병 발생의 주요 원인이 될 수 있다. 또한 헬리코박터 파이로리균에 대항하기 위해 항생제를 사용하더라도 완전한 제균이 힘들고 10~20%의 환자는 제대로 제균이 되지 않아 재감염이 일어나기 쉽다. 따라서 부작용이 없으면서 식품과 같이 자연스럽게 섭취하여 헬리코박터 파이로리균을 예방하고, 나아가 치료효과를 발휘 할 수 있는 제품이 개발이 필요하다고 할 것이다.

한편 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 오가피 나무과(Araliaceae)의 인삼속(Panax)에 속하는 다년생 음지성 숙근초로서 한반도를 중심으로 극동지역에 분포하고 있다. 인삼은 크게 인삼의 원형을 유지하는 1차 가공방법에 따라 수삼(생인삼), 백삼, 홍삼으로 구분한다. 우리가 흔히 인삼으로 칭하는 것은 수삼(수분 약 75%)을 건조한 백삼(수분 약 12%)을 말하여, 홍삼은 4~6년근 수삼을 엄격히 선별하여 껍질을 벗기지 않은 상태에서 증기로 쪄서 건조시킨 담황갈색 또는 담적갈색 인삼을 말한다. 인삼은 여러가지 효능들이 이미 많이 보고되었으며 그 중 대표적인 예를 들면 다음과 같다. 우선 면역증강활성을 들 수 있는데, 인삼의 ginsenoside Rg1은 생쥐의 혈중 조력T세포(helper T cell)의 수를 증가시키고 비장의 NK세포의 활성을 증가시켰으며, 백혈병 치료제인 cyclophosphamide처리에 의해서 손상된 면역반응을 회복시켰다. 또한 삼칠근 다당체는 항보체 활성과 IFN-r 생산 유도능을 보이며 면역을 증강시켰다. 그리고 홍삼 추출물은 장상피세포에서 H. pylori로 유도된 MAPK signaling의 저해와 NF-kB DNA binding activity의 억제, IL-8과 COX-2의 발현 억제, LOX 활성의 저해 등 항염증 활성을 나타냈고 백삼 폴리페놀 성분은 nitric oxide(NO)의 생산 저해, 인삼 사포닌은 TPA로 유도된 COX-2의 발현 저해 등을 나타내었다. 이 밖에도 발효 홍삼을 흰쥐에 경구 투여하였을 때 허혈성 재관류 뇌손상을 예방할 수 있었으며 흰쥐의 호염기구 임파종 세포주인 RBL-2H3세포에서는 발효홍삼의 주성분인 compound K가 탈과립 반응을 억제함으로써 항알레르기 활성을 나타냄이 보고된 바 있다. 그러나 임상적으로, 홍삼을 복용했을 때 홍삼의 사포닌 성분들은 체내에서 직접 흡수되는 것이 아니라, Bifidobacterium sp., Lactobacillus sp., Saccharomyces sp. 등의 인체 장내 미생물들에 의해 G-Rh2, compound K 등의 대사물로 전환된 후 흡수됨으로서 인체에서는 이러한 성분들이 더 높은 약리활성을 나타내게 된다. 따라서 홍삼의 다양하고 우수한 약리활성 작용에도 불구하고 개인별 장내 미생물의 분포 및 활성화의 차이로 인하여 실제로 홍삼의 약효에 차이에 나타낼 수 있다. 이를 극복하기 위하여 인삼을 장내환경과 같은 혐기상태에서 장내 미생물을 이용하여 발효하는 과정을 거쳐 최종 대사산물의 성분으로 변환 혹은 증가시키는 발효홍삼 제조에 관한 연구 및 개발이 이루어지고 있다.

한편 우리의 장내에 존재하는 장내 세균은 유익균과 유해균으로 나눌 수 있으며 이들의 종류는 약 2000여 종으로 균수는 100조 정도에 이른다. 이들은 증식을 계속하면서도 서로 다른 균의 증식을 항상 견제하고 있기 때문에 장내 환경의 급격한 변화가 없는 한 대체로 일정한 비율을 유지하며 장내에 동시에 살고 있다. 유해균과 유익균은 서로 경쟁적인 관계이다. 따라서 어느 쪽이 우월 하느냐에 따라 장이 건강한지 아니면 자주 문제가 발생하는 지가 결정되게 된다. 장내 세균의 균형이 파괴되어 유해균이 많아지거나 또는 유익균이 너무 적어지면 장의 기능이 떨어지고, 만성적 설사, 복부 통증, 팽만감, 냄새, 영양결핍, 패혈증, 쇼크 등 여러 증상들이 나타난다. 유해균은 주로 단백질을 분해시켜 인체에 해로운 암모니아나 유화수소, 아민, 페놀, 인돌 등의 악취가 나거나 독성이 강한 물질을 생성한다. 이들 유해물질은 장점막을 지나 혈액 속으로 스며들어 전신에 퍼질 수 있으며, 이로 인해 면역계에도 심각한 문제를 유발할 수 있다. 또한 장내 염증성 질환이나 설사를 일으키기도 한다.

장내 유익균으로 알려진 유산균은 장내 유해균과 부패균의 증식을 억제하여 각종 장질환의 원인물질인 암모니아, 인돌, 황화수소 등 장내 부패산물의 생성을 막고 장내에 작용하는 항생물질을 생성하여 장내 세균총을 정상적으로 만들어 준다. 또한 생체의 면역기전(대식세포, 임파구) 활성화와 혈액 내 항체의 생성을 촉진하여 면역성을 좋게 할 뿐만 아니라 장내 활성 산소와 발암물질을 생성하는 유해균의 생육을 억제하거나 사멸을 유도하여 항염작용을 하는 것으로 보고되고 있으며 비타민 K, 수용성 비타민 B군(B₁, B₂, B₆, B₁₂) 등을 합성하여 장의 영양 상태를 좋게 만든다. 특히 Lactobacillus sp.에 속하는 유산균 배양액을 사람이나 실험용 동물에게 음용시켰을때 항균 활성을 나타내며 스트레스성 변비나 설사를 개선시키고 콜레스테롤 합성을 억제시키며 알레르기 개선이나 피부미용에도 효과적이다. 특히 헬리코박터 파일로리를 억제하는 효과가 있슴이 다수 발표되었고 현재 국내에서도 헬리코박터 파이로리균를 억제하는 유산균을 발효유 및 다양한 건강기능식품으로 개발되거나 판매되고 있다.

따라서 본 발명 내용은 홍삼 추출물을 항염증 효과가 있는 유산균으로 발효 시킨 제품을 개발하여, 상시 섭취함으로써 항생제와 같이 부작용을 염려할 필요가 없고, 저비용으로 헬리코박터 파이로리균을 억제하여 이 균에 의해서 발생되는 제반 질환을 사전에 예방 및 치료하는데 그 목적이 있다.

이하 본 발명에 대해 실시예 및 실험예를 참조하여 구체적으로 설명한다.

1. 실시예

하기 표 1과 같은 시험군과 대조군의 형태로 실시예를 구성하였다. 이어서 기재할 실험예에서는 본 발명의 우수한 효과를 공신력 있는 기관에서 검증한 자료에 대해 개시한다. 보다 구체적으로는 이하 개시할 실험결과는 '국가지정 소화기질환 의료제품 유효성 평가 서비스센터'인 NCEED (http://www.nceed.kr/web/) 에서 수행한 결과이다(시험번호 : BGGM - G10016).

시험군	시험동물	시험물질	투여용량 (g/kg)	H. pylori 투여량 (300 μl)	동물 수
G1	Mongolian gerbil	Vehicle	-	-	8
G2		H. pylori	-	3X10⁸ CFU/gerbil	20
G3		H. pylori + 혼합유산균^*	12g/60kg	3X10⁸ CFU/gerbil	8
G4		H. pylori + 홍삼추출분말	12g/60kg	3X10⁸ CFU/gerbil	8
G5		H. pylori + 발효홍삼분말	12g/60kg	3X10⁸ CFU/gerbil	8
G6		H. pylori + 발효홍삼+혼합유산균	12g/60kg	3X10⁸ CFU/gerbil	8

* 혼합유산균 : Lactobacillus plantarum MG208(KCTC 12036BP) + Lactobacillus rhamnosus MG316(KCTC 12037BP) + Lactobacillus acidophilus MG501(KCTC 12035BP) >10⁸cfu/g

2. 실험방법

(1) 사망 및 임상증상 관찰

모든 동물에 대하여 투여 및 시험 종료시간까지 사망 또는 빈사발생여부 및 임상증상을 관찰하였다.

(2) 체중측정

입수 시, 순화기간 중 주 1회, 시험기간 중 주 1회 개체 별 체중을 측정하였다. 특히 시험기간 중 체중측정은 매 측정 시 오차를 최소화하기 위하여 동일한 요일과 동일한 시간대(오후 4시 전후)에 동일한 저울을 사용하여 측정하였다.

(3) 부검, 조직병리 및 H&E staining을 통한 병리학적 score 측정

시험물질 투여 후 16주가 경과되면 CO₂안락사하고 개체 별로 위장을 적출하여 그 일부를 10 % 중성완충포르말린용액 (10% buffered neutral formalin)에 고정하였다. 고정된 조직을 일정한 두께로 삭정한 다음, 일반적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀 포매하여 4~5의 조직절편을 제작한 후 일반적인 염색방법인 Hematoxylin & Eosin 염색(H&E stain)을 실시하여 염증의 조직병리학적 소견 (염증세포의 침윤, 상피세포의 구조파괴 등의 조직병리학적인 변화)을 blind test로 관찰하여 점수화하였다.

(4) Inflammatory 싸이토카인 측정

위장 시료 채취 후, 위장 조직의 일부를 액체 질소로 얼려서 homogenation한 다음, protein을 뽑아서 정량 후 inflammation을 유도한다고 알려진 싸이토카인들의 level을 ELISA kit을 이용하여 측정하였다.

(5) 염증성 유전자 발현 측정

위장 시료 채취 후, 위장 조직의 일부를 액체 질소로 얼려서 homogenation한 다음, protein을 뽑아서 정량 후 inflammation을 유도한다고 알려진 유전자들의 발현을 Western blot analysis 방법을 이용하여 측정하였다.

(6) BrdU staining

DNA 복제시 DNA를 합성한 세포에서만 염색이 되는 Bromodeoxyuridine (BrdU)를 실험 동물 안락사 2시간 전에 복강 투여한 후에 시험 종료 후 얻어진 위장 조직들을 BrdU로 염색하여 세포 증식 정도를 측정하여 염증 억제 정도를 측정하였다.

(7) Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) staining

DNA의 끝부분을 염색하는 방법으로 apoptosis의 대표적인 현상이 DNA fragmentation이고 fragment가 많이 형성되면 그만큼 DNA의 말단이 많아져 그 부위를 labeling하면 apoptosis가 진행중인 세포를 염색할 수 있다. Label된 dUTP를 기질로 이용하고 3' end에 nucleotide를 붙여주는 terminal transferase를 효소로 사용하여 처리하면 ulcer등이 생긴 부위의 조직의 DNA는 label된 dUTP가 첨가되어 이를 형광으로 검출하는 방법으로 H. pylori에 의한 손상을 측정하였다.

(8) 부검 및 시험동물의 처리

시험하는 동안 투여 및 기타요인으로 발생한 사망개체는 없었으며, 모든 동물은 시험 종료일에 stomach 시료 채취를 완료함과 동시에 안락사하였다.

(9) 통계처리

모든 시험결과는 평균과 표준편차로 나타내며, 각 군간의 비교는 통계프로그램 Sigmaplot을 사용하여 t-test 및 ANOVA test를 실시하였다.

3. 실험결과

(1) 사망 및 임상증상

모든 동물에서 특별한 임상 증상이 관찰되지 않았다.

(2) 체중 측정 결과 (도 1 참조)

실험을 시작할 때 각 그룹별 평균 체중은 대조군(G1): 70.75±3.0, 헬리코박터 단독 투여 그룹(G2): 70.90±3.8, 홍삼 발효시 사용된 혼합 유산균 투여 그룹(이후 혼합유산균)(G3): 71.44±3.7, 홍삼 투여 그룹(G4): 68.69±4.7, 발효홍삼 투여 그룹(G5): 70.50±6.2, 발효홍삼과 홍삼 발효시 사용된 유산균을 혼합하여 투여한 그룹(이후 발효홍삼+혼합유산균)(G6): 69.44±2.1이었고, H. pylori를 감염시키는 동안 하루 걸러 하루 절식을 하므로 1주일 후에 대조군: 69.31±6.7, 헬리코박터 단독 투여 그룹: 68.80±5.0, 혼합유산균 투여 그룹: 68.38±6.0, 홍삼 투여 그룹: 65.44±4.6, 발효홍삼 투여 그룹: 67.13±5.5, 발효홍삼+혼합유산균 투여한 그룹: 69.13±2.8로 체중이 약간 줄었으나 그 1주일 후에 대조군: 72.0±7.1, 헬리코박터 단독 투여 그룹: 70.65±4.7, 혼합유산균 투여 그룹: 70.81±6.6, 홍삼 투여 그룹: 65.88±4.0, 발효홍삼 투여 그룹: 69.5±5.7, 발효홍삼+혼합유산균: 71.56±2.5로 바로 회복하였다. 16주 후 각 그룹의 평균 체중은 대조군: 92.54±14.5, 헬리코박터 단독 투여 그룹: 100.56±11.7, 혼합유산균 투여 그룹: 94.13±9.5, 홍삼 투여 그룹: 96.61±8.6, 발효홍삼 투여 그룹: 90.25±13.2, 발효홍삼+혼합유산균 투여한 그룹: 96.65±9.5이었고 각 그룹별 체중 증가율은 대조군: 21.79, 헬리코박터 단독 투여 그룹:29.66, 혼합유산균 투여한 그룹: 22.69, 홍삼 투여 그룹: 27.93, 발효홍삼 투여 그룹: 19.75, 발효홍삼+혼합유산균 투여한 그룹: 27.21로 각 그룹별 큰 차이는 나타나지 않았다.

(3) Gross 관찰 결과 (도 2a 및 2b 참조)

16주 간의 시험을 종료하고 부검 후 얻어진 각 그룹의 stomach을 관찰한 결과, 헬리코박터 단독 투여 그룹에서 육안으로도 관찰될 정도의 염증 소견과 현저한 discoloration 현상이 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 즉 헬리코박터 그룹에서는 60%의 discoloration이 관찰되었으며 혼합 유산균 투여 그룹에서는 37.5%, 홍삼 투여 그룹에서는 25%, 발효홍삼 투여그룹에서는 12.5%의 discoloration이 각각 관찰되었으나 발효홍삼+혼합유산균 투여 그룹에서는 0%로 normal group과 유사한 소견을 보여주었다. 따라서 gross 관찰 결과, 모든 시험 물질이 헬리코박터 감염에 의한 위염에 대한 보호 효과를 보였지만 특히 발효홍삼+혼합유산균 투여 그룹에서 탁월한 보호 효과를 보임을 알 수 있었다.

(4) H&E staining을 통한 병리학적 score 측정 결과 (도 3a 및 3b 참조)

Hematoxylin & Eosin 염색(H&E stain) 후 blind test를 통하여 총 3가지의 염증의 조직병리학적 소견 (1. erosion/ulceration의 깊이와 넓이, 2. Inflammation, 3. discoloration, edema, hemorrhage를 관찰한 injury)을 관찰하여 점수화하였다. 3가지 병리학적 항목에 대한 각각의 결과는 도 3a 및 3b에 나타내었다. 3가지 항목에 대한 점수를 모두 합산한 총 병리학적 점수는 대조군: 0.25±0.5, 헬리코박터 단독 투여 그룹: 3.8±1.9, 혼합유산균 투여한 그룹: 3.5±2.0, 홍삼 투여 그룹: 3.25±2.4, 발효홍삼 투여 그룹:3.0±2.1, 발효홍삼+혼합유산균 투여한 그룹: 2.38±1.8이었다. Gross 관찰 결과와 마찬가지로 ulcer나 inflammation 점수와 total pathologic 점수에서 발효홍삼+혼합유산균 그룹에서 가장 좋은 보호 효과를 보임을 알 수 있었다.

(5) Inflammatory 싸이토카인 측정 결과 (도 4 내지 도 9 참조)

염증 반응을 유도하는 대표적인 싸이토카인인 IL-1β IL-6, IL-10, TNF-a 그리고 대표적인 케모카인 MCP-1 의 level을 측정해 본 결과, 헬리코박터균 감염으로 유도된 위염 그룹에서 염증성 싸이토카인들과 케모카인의 발현이 현저히 증가되어 있는 것을 관찰할 수 있었고, 시험물질의 처리에 의해서 그 발현 정도가 유의성 있게 감소한 것을 관찰하였다.

(6) 염증성 유전자 발현 측정 (도 10 참조)

헬리코박터균 감염으로 유도된 위염 그룹에서 대표적인 염증효소인 COX-2의 발현이 현저히 증가되어 있었고, 시험물질을 처리한 그룹에서 그 발현이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 시험물질 중 혼합유산균 투여 그룹과 홍삼 투여 그룹에서 그 저해 효과가 통계적으로 유의하게 나타나는 것을 관찰하였고, 특히 발효홍삼+혼합유산균 투여 그룹에서 그 저해 효과가 최대로 나타나는 것으로 보아 gross 관찰, 병리학적 관찰 결과와 모두 일치하는 것을 확인할 수 있었다.

(7) BrdU 측정 결과 (도 11 참조)

DNA 복제시 DNA를 합성한 세포에서만 염색이 되는 Bromodeoxyuridine (BrdU)를 실험 동물 안락사 2시간전에 복강 투여한 후, 시험 종료 후 얻어진 위장 조직들을 BrdU로 염색하여 세포 증식 정도를 측정하였다. 이 실험은 세포 증식 정도를 살펴보는 실험으로서 보통 세포 증식이 활발히 일어나는 암조직을 확인할 때 수행하는 실험이다. 이번 시험은 헬리코박터 감염 후 16주 동안 시험물질을 투여한 실험으로서 헬리코박터균에 의해 위에 염증은 수반되었으나, 아직 tumor가 생기지는 않은 상태라서 암세포에서 보이듯이 뚜렷한 BrdU 염색은 관찰되지 않았다. 따라서, 세포 증식을 확인하는 BrdU 염색이 아닌 세포 손상과 apoptosis를 확인할 수 있는 TUNEL staining assay를 추가 실험하였다.

(8) Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) staining

세포사멸의 대표적인 현상인 DNA fragmentation을 응용하여, DNA의 말단 부위를 염색하여 apoptosis 즉 세포 사멸과 세포 손상의 정도를 확인할 수 있는 TUNEL assay를 수행하였다. 예상한 바와 같이, 헬리코박터 감염 그룹에서는 ulcer가 일어난 부위에서 현저하게 염색이 되었으며, 시험 물질이 처리된 그룹에서는 그 염색이 감소하는 것으로 보아 헬리코박터 감염에 의한 염증과 조직 손상이 시험 물질의 투여에 의해 감소한다는 것을 알 수 있었다. 각 그룹당 3 개의 다른 개체의 조직을 염색하여 통계처리 하였을 때, 혼합유산균 투여 그룹과 홍삼 투여 그룹에서는 유의한 감소 효과를 보이지 않았고, 발효홍삼 투여 그룹과 발효홍삼+혼합유산균 투여 그룹에서 유의한 감소 효과를 보였다. 특히, 다른 결과들과 마찬가지로 발효홍삼+혼합유산균 투여 그룹에서 헬리코박터 감염에 의한 염증과 조직손상에 대해서 가장 좋은 저해 효과를 나타내었다.

4. 결론

Helicobacter pylori (H. pylori)는 표재성 위염과 위축성 위염 및 장상피 화생(장상피 화생이라 함은 주로 위축성 위염에서 생기며 위 점막의 분비선이 없어지고, 위 점막에 작은 돌기같은 것이 무수히 생기며, 붉은 점막이 회백색으로 바뀌는 현상으로 위암의 전단계를 말한다)에 이르는 일련의 과정에 가장 중요한 병인으로 작용한다. H. pylori 양성인 위 및 십이지장 궤양의 치료에서 H. pylori를 제균할 경우 소화성 궤양의 재발이 현저하게 줄어든다는 사실이 알려지면서 소화성 궤양의 치료 방침이 변한 것은 주지의 사실이다. 따라서 위장 내에 기생하는 H. pylori를 박멸하기 위해 여러 항생제와 PPI 약물을 혼합한 약물 치료가 시도되고 있다. 그러나 약물 내성으로 인하여 약물에 의한 H. pylori의 박멸은 제한적이다. 따라서 최근에는 항생제를 근간으로 하는 약물 치료 이외에 H. pylori를 억제할 수 있는 물질들에 대하여 관심이 높아지고 있는데 H. pylori 균에 대한 특이면역항체를 함유하는 난황 추출물, 마늘, 요구르트 등이 연구되고 있고 그 중 일부는 이미 상품화되어 사용되고 있다. 따라서 본 연구는 메디오젠에서 제시한 유산균과 발효 홍삼 분말의 H. pylori 유도 위염에 대한 유효성을 평가하여 소화기질환 타깃의 제품화에 '근거 중심' 의 유효성 평가를 시행하는 것으로 Mongolian gerbil에 H. pylori를 감염시켜 염증상태를 유발시킨 후 발효홍삼에 대한 염증억제 효과를 평가하기 위하여 실시하였다.

시험 종료시, 특별한 임상 증상은 관찰되지 않았으며 실험을 시작할 때 각 그룹별 평균 체중은 약 70g 정도였고 16주 후 각 그룹의 평균 체중은 약 90 ~ 100g 정도였으며 각 그룹별 체중 증가율은 20 ~ 30g 정도로 각 그룹별 큰 차이는 나타나지 않았다. 부검 후 얻어진 각 그룹의 stomach을 관찰한 결과 헬리코박터 감염 그룹에서 육안으로도 관찰될 정도의 염증 소견과 현저한 discoloration 현상이 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 즉 헬리코박터 그룹에서는 60%의 discoloration이 나타났으나 모든 시험물질이 처리된 그룹에서는 유의적으로 감소하는 현상이 나타났으며, 특히 발효홍삼+혼합유산균 투여 그룹에서는 discoloration 현상이 완전히 사라는 현상을 관찰하였다. 따라서 육안 소견상 모든 시험 물질이 헬리코박터 감염에 의한 위염에 대한 보호 효과를 보였지만, 특히 발효홍삼+혼합유산균 투여 그룹에서 탁월한 보호 효과를 보임을 알 수 있었다. 이를 병리학적으로 살펴보았을 때에도 H. pylori에 의한 ulcer, inflammation, injury 항목에서 모든 시험물질 처리군에서 유의한 감소 효과를 보였으며, 특히 각 병리학적 점수를 합산한 총 병리학적 점수를 보면 발효홍삼+혼합유산균 투여 그룹의 점수가 2.38±1.8로 가장 좋은 효과를 보였다. 뿐만 아니라 시험 물질 처리시 유의하게 H. pylori 유도 염증성 증상들을 회복시킴을 관찰하였다. 즉, H. pylori로 유도된 염증성 사이토카인들과 염증성 케모카인, 그리고 대표적 염증성 효소인 COX-2의 발현에 대한 유의한 억제 효과를 보였다. 여러 시험물질들 중 특히 염증성 증상을 억제하는 데 있어서도 발효홍삼+혼합 유산균이 가장 좋은 효과를 보임을 관찰할 수 있었다. 활발하게 증식하는 세포를 확인하기 위하여 수행한 BrdU staining의 결과는 각 그룹별로 큰 차이를 나타내지 않았지만, 이는 Mongolian gerbil에 대한 H. pylori의 16주 감염으로는 염증 현상은 유발하지만, 암화 현상을 나타내지는 않는다는 것을 의미한다. 따라서 세포 증식을 확인하는 BrdU 염색이 아닌 세포 손상과 apoptosis를 확인할 수 있는 TUNEL staining assay를 추가 실험하였다. 예상한 바와 같이, 헬리코박터 감염 그룹에서는 ulcer가 일어난 부위에서 현저하게 염색이 되었으며, 시험 물질이 처리된 그룹에서는 그 염색이 감소하는 것으로 보아 헬리코박터 감염에 의한 염증과 조직 손상이 시험 물질의 투여에 의해 감소한다는 것을 알 수 있었다. 유산균과 홍삼 투여 그룹에서는 유의한 감소 효과를 보이지 않았고, 발효홍삼 처리 그룹과 발효홍삼+혼합유산균 투여 그룹에서 유의한 감소 효과를 보였다. 특히, 다른 결과들과 마찬가지로 발효홍삼+혼합유산균 투여 그룹에서 헬리코박터 감염에 의한 염증과 조직손상에 대해서 가장 좋은 저해 효과를 나타내었다.

이상과 같은 연구 결과는 H. pylori 감염에 대한 단순한 균주의 제거라든지 감염에 의해 발생된 염증조절만으로는 H. pylori 감염에 따른 각종 질환, 위암, 위축성 위염 등의 예방이 힘든 상황에서 H. pylori 감염에 따른 위손상을 예방하기 위하여서는 홍삼이나 유산균과 같은 이미 식품으로 복용하는 만큼 안정성이 입증된 물질들을 지속적으로 섭취하는 것이 중요하다 하겠다. 또한 약물에 의한 제균은 안전성과 부작용 그리고 약물에 대한 저항성이 가장 큰 문제점이다. 따라서 홍삼이나 유산균과 같은 오랜 역사와 전통을 가지고 있으며 이미 생활에 보편화되어 있는 식품소재가 H. pylori에 대한 제균 또는 감염에 의한 항염증작용을 갖는 것은 큰 의의를 갖는다고 할 수 있다. H. pylori 감염 Mongolian gerbil 모델에서 시험 물질들의 stomach ulcer 및 inflammation에 대한 예방 및 치료 효능을 관찰한 바, 혼합유산균, 홍삼, 발효홍삼, 발효홍삼+혼합유산균 등 모든 시험군에서 H. pylori에 의한 염증 관련 사이토카인과 효소들의 억제효능에 따라 통계적으로 유의한 위염 궤양 예방 및 치료효능이 있음을 규명할 수 있었고, 특히 발효홍삼+혼합유산균 투여군에서 그 효과가 가장 좋음을 규명하였다.

이상 본 발명의 구체적 실시형태와 관련하여 본 발명을 설명하였으나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 설명된 실시형태를 변경 또는 변형할 수 있으며, 이러한 변경 또는 변형도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본 명세서에서 설명한 각 구성요소의 물질은 당업자가 공지된 다양한 물질로부터 용이하게 선택하여 대체할 수 있다. 또한 당업자는 본 명세서에서 설명된 구성요소 중 일부를 성능의 열화 없이 생략하거나 성능을 개선하기 위해 구성요소를 추가할 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자는 공정 환경이나 장비에 따라 본 명세서에서 설명한 방법 단계의 순서를 변경할 수도 있다. 따라서 본 발명의 범위는 설명된 실시형태가 아니라 특허청구범위 및 그 균등물에 의해 결정되어야 한다.

한국생명공학연구원

KCTC12035BP

20111018

한국생명공학연구원

KCTC12036BP

20111018

한국생명공학연구원

KCTC12037BP

20111018

Claims

Lactobacillus plantarum MG208(KCTC 12036BP), Lactobacillus rhamnosus MG316(KCTC 12037BP) 및 Lactobacillus acidophilus MG501(KCTC 12035BP)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유산균을 포함하는 위염 억제/개선용 발효홍삼.
제1항에 있어서, 상기 발효홍삼은 20~30brix의 홍삼추출물을 (i) 85~100℃에서 25분~35분 살균처리 후 pH를 5.0~5.5로 유지하는 전처리 단계; (ii) Lactobacillus plantarum MG208(KCTC 12036BP)을 접종 후 15~17시간 발효하는 제1단계; (iii) Lactobacillus rhamnosus MG316(KCTC 12037BP)을 접종 후 15~17시간 발효하는 제2단계; (iv) Lactobacillus acidophilus MG501(KCTC 12035BP)을 접종 후 15~17시간 발효하는 제3단계를 통해 발효된 것임을 특징으로 하는 유산균을 포함하는 위염 억제/개선용 발효홍삼.
제2항에 있어서, 상기 제3단계 이후 75~85℃에서 25분~35분 살균처리 후 동결건조한 후, Lactobacillus plantarum MG208(KCTC 12036BP), Lactobacillus rhamnosus MG316(KCTC 12037BP) 및 Lactobacillus acidophilus MG501(KCTC 12035BP)을 첨가 한 것을 특징으로 하는 유산균을 포함하는 위염 억제/개선용 발효홍삼.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위염 억제는 헬리코박터 파이로리균에 의해 유도되는 염증에 대한 억제기작을 발휘하는 것에 의함을 특징으로 하는 유산균을 포함하는 위염 억제/개선용 발효홍삼.