KR20130043155A - Ｔｌｒ7 및／또는 ｔｌｒ9 억제제를 사용하는 치료 방법 - Google Patents

Ｔｌｒ7 및／또는 ｔｌｒ9 억제제를 사용하는 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 TLR7 및/또는 TLR9의 억제제, 예를 들어, 면역 조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역 조절 화합물을 포함하는 면역 반응을 조절하는 조성물 및 방법과 관련된다. 본 출원은 또한 TLR7 및/또는 TLR9의 억제제를 포함하는 치료에 대한 질환의 반응성을 예측하고 및/또는 결정하는 조성물 및 방법과 관련된다.

Description

ＴＬＲ7 및／또는 ＴＬＲ9 억제제를 사용하는 치료 방법{METHODS OF TREATMENT USING TLR7 AND/OR TLR9 INHIBITORS}
관련된 출원에 대한 교차-참고
본 출원은 2010년 12월 14일 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/423,076, 2010년 11월 18일 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/415,289, 및 2010년 6월 16일 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/335,547의 이익을 주장하며, 이 전문은 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 출원은 TLR7 및/또는 TLR9의 억제제, 예를 들어, 면역조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역조절 화합물을 포함하는 면역 반응을 조절하는 조성물 및 방법과 관련된다. 본 출원은 또한 TLR7 및/또는 TLR9의 억제제를 포함하는 치료에 대한 질환의 반응성을 예측하고 및/또는 결정하는 조성물 및 방법과 관련된다.
면역력은 일반적으로 선천성 면역으로 또는 후천성 면역으로 분류될 수 있다. 선천성 면역 반응은 전형적으로 감염시 감염성 질환에 대한 초기 장벽을 제공하기 위하여 즉시 발생하는 반면, 후천성 면역은 항원 특이적 효과기 세포 및 종종 장기간 보호 면역의 발생과 함께 후에 발생한다. 선천성 면역 반응은 지속적인 보호 면역을 발생시키지 않지만 후에 후천성 면역 반응의 발생의 역할을 하는 것으로 나타난다.
톨-유사 수용체 (TLR)는 그것들이 다양한 다른 항원을 인식하고 면역/염증 반응, 예를 들어, 시토킨 생산, 및 수지상세포 및 대식세포 활성화를 개시하기 때문에 선천성 면역 반응에 필수적이다. 특히, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, 및 TLR9는 바이러스의 또는 박테리아의 리간드, 예를 들어, 당단백질, 단일 또는 이중-가닥 RNA 및 메틸화되지 않은 5'-CG-3' 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 인식한다. 면역자극 핵산 분자는 포유동물 TLR9 수용체와 상호작용 및 포유동물 TLR9 수용체를 통한 신호전달을 통해 면역 반응을 자극한다. Hemmi et al. (2002) Nat. Immunol. 3: 196-200 참조. 포유동물 DNA는 일반적으로 명백하게 CG 서열의 낮은 빈도 및 메틸화된 시토신을 갖는 대부분의 CG 서열로 인해 면역 자극 활성을 소유하지 않는다. 따라서 포유동물 면역계 세포는 TLR9 수용체를 통해 자체 DNA와 박테리아 DNA를 구별한다. 반면에, TLR7은 우리딘이 풍부한 단일 가닥 RNA를 인식함으로써 바이러스 감염을 감지하는 주요 수용체 중 하나이다.
자체 핵산에 의해 형질세포양 수지상세포 (plasmacytoid dendritic cell; PDC) 전두체 및 B 세포에서 TLR7 및 TLR9의 유발은 루푸스 (전신 홍반성 루푸스; SLE) 발병의 핵심이다. 이것은 환자의 혈액에서 IFN-조절된 유전자의 상향 조절 (IFN-군) 및 죽어가는 세포의 DNA 또는 RNA와 면역 복합체 (immune complex; IC)를 형성하는 B 세포의 항-DNA 및 항-RNP 항체에 의해 검출될 수 있는 PDC의 타입 I IFN의 생산으로 이어진다 (Barrat 및 Coffman, 2008; Marshak-Rothstein, 2006). PDC는 핵산을 함유하는 IC에 의해 유발되는 IFN-α의 주요 근원이다. 한 번 자체 DNA/염색질 또는 snRNP-함유 IC에 의해 활성화되면, PDC는 혈액으로부터 피부 및 신장을 포함하는, 염증 조직으로 이동한다.
IFN-α 및 PDC는 또한 IFN-α 군를 특징으로 하는 다른 자가 면역 질환의 발병에 기여하는 것으로 제안되었다. 실제로, 타입 I IFN-생산하는 PDC는 각각 진성 당뇨병, 피부근염 및 쇼그렌 증후군을 포함한다 (쇼그렌 증후군을 포함한다)에 걸린 사람의 췌장, 근육 및 침샘에 축적되며, 불규칙한 PDC 활성이 자가 면역 질환의 더 일반적인 특징이 될 수 있다고 강하게 제안한다 (Barrat 및 Coffman, 2008; Guiducci et al., 2009; Ueno et al., 2007).
SLE 환자들은 종종 세포 독성제, 항말라리아 화합물 및 글루코코르티코이드 (GC)를 포함하는, 강한 면역 억제 요법으로 치료된다. 글루코코르티코이드는 후천성 및 선천성 면역 기능 모두에 대하여 강한 항-염증 효과를 갖는다. 그것들은 B 및 T 세포 반응 및 단핵세포 및 호중구의 효과기 기능을 억제한다. 세포 수준에서, GC는 NF-kB 활성을 억제하는데, GC가 그것들의 항-염증 효과를 발휘하는 주요 메카니즘이라고 고려된다. 루푸스에서, 전형적인 격일 요법은 질환 대조군을 유지할 수 없기 때문에, GC는 전형적으로 매일 경구 투여된다. 40 mg/일 이상의 용량이 필요할 때, 환자는 정맥 내 메틸 프레드니솔론 (Solumedrol) 충격 요법을 받는다 (예를 들어, 3일 동안 매일 주어진 30 mg/kg/일 또는 1 g/kg/일의 용량). 이러한 치료는 일시적으로 질환 활성을 감소시킬 수 있지만, 종종 완화를 유발하지 않거나 말단 기관 손상을 방지하지 않는다. SLE의 치료가 많은 다른 자가 면역 질환보다 더 많은 GC 용량을 필요로 하는 이유는 명확하지 않다.
본 발명은 TLR9 및/또는 TLR7의 억제제 (예를 들어, 면역 조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역 조절 화합물) 및 이들의 사용 방법과 관련된다.
여기에 제공된 것은 개인에게 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법이며, 샘플에서 치료는 인터페론 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준에 기초한다. 또한 여기에 제공된 것은 (a) 샘플에서 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준을 갖는 개인을 선택하는 단계; 및 (b) 선택된 개인에게 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 질환을 치료하는 방법이다. 여기에 추가로 제공된 것은 병에 걸린 개인이 샘플에서 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준을 평가하는 단계를 포함하는, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제를 포함하는 치료에 반응할 가능성이 더 높은지 또는 더 낮은지 평가하는 방법이며, 샘플에서 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준은 개인이 치료에 반응할 가능성이 높거나 더 낮다는 것을 나타낸다. 또한 여기에 제공된 것은 (A) 샘플에서 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준을 평가하는 단계; 및 (B) 샘플에서 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준을 갖는 개인을 확인하는 단계를 포함하는, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 치료에 반응할 가능성이 더 높은지 또는 더 낮은지 확인하는 방법이다. 또한 여기에 제공된 것은 개인에게 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 개인의 질환을 치료하는 방법이며, 치료 반응 및 치료 반응의 결핍은 샘플에서 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준에 의해 나타난다. 또한 여기에 제공된 것은 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 질환 치료에 대한 개인의 반응성 또는 반응성의 결핍을 관찰하는 방법이며, 반응성은 샘플에서 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준에 의해 나타난다. 여기에 추가로 제공된 것은 샘플에서 개인이 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준에 기초하여 치료를 계속하는데 적합할 가능성이 높거나 질환 치료를 계속하는데 적합할 가능성이 낮은 것을 확인하는 방법이며, 치료는 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함한다.
여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, IFN 군는 타입 I IFN 군이다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, 샘플에서 IFN 군는 참고문헌의 IFN 군와 연관된다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, IFN 군는 참고문헌과 비교하여 BATF2, CMPK2, CXCL10, DDX60, EPSTI1, HERC5, HES4, IFI44, IFI44L, IFIT1, IFIT3, IFITM3, ISG15, LAMP3, LOC26010, LY6E, MX1, OAS1, OAS2, OAS3, OAS1, OTOF, RSAD2, RTP4, SERPING1, TRIM6, XAF1, c102h05 5, Agencourt-7914287 NIH-MCG_71, ISG20, IFI16, IRF7, 및 AIM2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생체 마커의 샘플에서 고저차 수준을 포함한다. 특정 구체예에서, IFN 군는 참고문헌과 비교하여 BATF2, CMPK2, DDX60, EPSTI1, HERC5, HES4, IFI44, IFI44L, IFIT1, IFIT3, IFITM3, ISG15, LAMP3, LOC26010, MX1, OAS1, OAS2, OAS3, OAS1, OTOF, RSAD2, RTP4, SERPING1, TRIM6, XAF1, c102h05 5, Agencourt-7914287 NIH-MCG_71, ISG20, IRF7, 및 AIM2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생체 마커의 샘플에서 고저차 수준을 포함한다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, 염증성 시토킨의 고저차 수준은 IL-1알파, IL-1베타, TNF-알파, IL-6, 및 IL-17, IFN-알파, IFN-오메가, IFN-람다1, IFN-람다2, 및 IP-10로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 염증성 시토킨 마커의 샘플에서 고저차 수준을 포함한다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, 샘플에서 고저차 수준은 참고 문헌과 비교하여 하나 이상의 마커의 높은 수준이고 높은 수준은 a) 개인이 치료에 반응할 가능성이 높거나 b) 개인이 치료에 선택되는 것을 나타낸다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, 샘플에서 고저차 수준은 참고 문헌과 비교하여 하나 이상의 마커의 낮은 수준이고 낮은 수준은 a) 개인이 치료에 반응할 가능성이 작거나 b) 개인이 치료에 선택되지 않는 것을 나타낸다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, 샘플에서 고저차 수준은 참고 문헌과 비교하여 하나 이상의 마커의 높은 수준이고 높은 수준은 a) 개인이 치료에 반응하지 않거나 b) 개인이 치료를 계속하는데 적합할 가능성이 작다는 것을 나타낸다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, 참고 문헌과 비교하여 하나 이상의 마커의 낮은 수준이고 낮은 수준은 a) 개인이 치료에 반응하거나 또는 b) 개인이 치료를 계속하는데 적합할 가능성이 크다는 것을 나타낸다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, 참고문헌은 질환에 걸린 두 번째 개인 또는 환자 집단의 IFN 군이다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, 참고문헌은 치료를 시작하는 시간에서 개인의 IFN 군이다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, 참고는 질환에 걸리지 않은 두 번째 개인 또는 환자 집단의 IFN 군이다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, 샘플은 말초 혈액 세포 또는 피부 조직을 함유하는 샘플이다.
여기에 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 것의 특정 구체예에서, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제는 식 5'-RγJGCNz-3' (SEQ ID NO: 147)의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드이며, 각각의 R은 뉴클레오티드이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, J는 U 또는 T이고, 각각의 N은 뉴클레오티드이고, z는 약 1 내지 약 100의 정수이다. 특정 구체예에서, γ는 0이고 z는 약 1 내지 약 50이다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제는 식 5'-RγJGCNz-3' (SEQ ID NO: 147)의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드이며, 각각의 R은 뉴클레오티드이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, J는 U 또는 T이고, 각각의 N은 뉴클레오티드이고, z는 약 1 내지 약 100의 정수이다. 특정 구체예에서, γ는 0이고 z는 약 1 내지 약 50이고, 이것은 식 5'-S1S2S3S4-3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, S1, S2, S3, 및 S4는 독립적으로 G, I, 또는 7-데아자-dG이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 식 5'-RγJGCKαS1S2S3S4Lβ-3' (SEQ ID NO: 148)이고, 각각의 R, K, 및 L은 뉴클레오티드이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, J는 U 또는 T이고, S1, S2, S3, 및 S4는 독립적으로 G 또는 G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍 (Hoogsteen base pairing)을 방지할 수 있는 분자는 약 1 내지 약 20의 정수이고, β는 약 1 내지 약 20의 정수이다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 식 5'-S1S2S3S4-3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, S1, S2, S3, 및 S4는 독립적으로 G, I, 또는 7-데아자-dG이다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 S1, S2, S3, 및 S4는 I이다. 특정 구체예에서, S1, S2, S3, 및 S4는 G이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 식 5'-GIGG-3'의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제는 식 5'-EζJGCFθTCCTGGAS1S2S3S4TT3φ-3' (SEQ ID NO: 152)이며, 각각의 E, F, 및 3은 뉴클레오티드, ζ, θ이고, φ는 약 0 내지 10의 정수이고, J는 U 또는 T이고, S1, S2, S3, 및 S4는 독립적으로 G, I, 또는 7-데아자-dG이다.
여기에 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 것의 특정 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형을 포함한다. 특정 구체예에서, 변형은 2'-당 변형이다. 특정 구체예에서, 2'-당 변형은 2'-0-메틸 당 변형이거나 2'-0-메톡시에틸 당 변형이다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 모두 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및 2'-당 변형 키메라 서열이다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및 2'-0-메틸 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및 2'-0-메티옥시에틸 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 변형된 포스페이트 결합을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 단지 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.
식 5'-S1S2S3S4-3'를 함유하는, 여기에 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 것의 특정 구체예에서, S1, S2, S3, 및 S4는 독립적으로 G, I, 또는 7-데아자-G이고, 뉴클레오티드는 모두 데옥시리보뉴클레오티드이다. 식 5'-S1S2S3S4-3'를 함유하는, 특정 구체예에서, S1, S2, S3, 및 S4는 독립적으로 G, I, 또는 7-데아자-G이고, 뉴클레오티드는 모두 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다. 예를 들어, TLR7 및/또는 TLR9 억제제가 식 RγJGCKα GIGG ββ-3' (SEQ ID NO: 146)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드인 방법 및 조성물에 대하여, 각각의 R, K, 및 L은 뉴클레오티드이고, J는 U 또는 T이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, α는 약 1 내지 약 20의 정수이고, β는 약 1 내지 약 20의 정수이고, 서열의 GIGG 부분에서 각각의 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다 (예를 들어, G는 2'-데옥시구아노신이고 I는 2'-데옥시이노신이다). 유사하게, 일부 구체예에서, GGGG, GIGG 또는 GZ'GG 모티프에서 각각의 뉴클레오티드에 있어서, I는 이노신이고 Z'은 7-데아자이고 G는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다 (예를 들어, G는 2'-데옥시구아노신이고, I는 2'-데옥시이노신이고 Z'은 7-데아자-2'-데옥시구아노신이다).
또한 여기에 제공된 것은 개인에게 개인의 면역 반응을 조절하는데 충분한 양으로 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는, 개인의 면역 반응을 조절하는 방법이며, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 64-78, SEQ ID NO: 123-135, 및 SEQ ID NO: 141-145로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나를 포함한다.
특정 구체예에서, 개인의 면역 반응의 조절은 질환을 치료하고 및/또는 방지한다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, 면역 반응은 억제된다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, TLR7 의존적인 면역 반응이 억제된다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, TLR9 의존적인 면역 반응이 억제된다. 방법 중 어느 것의 추가의 구체예에서, TLR7 및 TLR9 모두에 의존적인 면역 반응이 억제된다.
여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, 질환은 자가 면역 질환이다. 특정 구체예에서, 자가 면역 질환의 하나 이상의 증상이 개선된다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, 자가 면역 질환의 발생이 억제되거나 지연된다. 특정 구체예에서, 자가 면역 질환은 전신 홍반성 루푸스 (전신 홍반성 루푸스; SLE), 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 피부근염 (dermatomyositis), 및 쇼그렌 증후군으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 여기에 제공된 방법 중 어느 것의 특정 구체예에서, 질환은 염증과 관련된다. 특정 구체예에서, 염증은 무균 염증이다. 특정 구체예에서, 무균 염증은 간의 무균 염증이다.
본 발명은 SEQ ID NO: 64-78, 123-135, 및 141-145로 구성되는 (33개의 서열의) 그룹 중 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다. 본 발명은 또한 SEQ ID NO: 64-78, 123-135, 및 141-145로 구성되는 (33개의 서열의) 그룹 중 하나 이상으로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 모두 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 2'-당 변형을 포함한다. 이 구체예들의 서브세트에서, 2'-당 변형은 2'-0-메틸 당 변형 또는 2'-0-메톡시에틸 당 변형을 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 모두 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및 2'-당 변형 키메라 서열이다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및 2'-0-메틸 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및 2'-0-메티옥시에틸 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 변형된 포스페이트 결합을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 단지 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.
본 발명은 바람직하게 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트와 더 관련된다. 본 발명의 키트는 일반적으로 본 발명의 면역 조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역 조절 화합물을 포함하고 (일반적으로 적합한 용기에서), 개인의 면역 조절에서 면역 조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역 조절 화합물의 사용을 위한 설명서를 더 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 키트는 또 다른 치료제를 더 포함한다.
본 개시는 개인에게 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 개인의 자가 면역 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 건강한 대상체의 대조군 샘플의 염증 유전자 발현 패턴과 비교하여 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 치료의 시작시 개인으로부터의 샘플에 존재한다. 일부 구체예에서, TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 SEQ ID NO: 1-78, 80-108, 및 110-145로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO: 64-78, 123-135 및 141-145로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 식 RγJGCKα GIGG ββ-3' (SEQ ID NO: 146)의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드이며, 각각의 R, K, 및 L은 뉴클레오티드이고, J는 U 또는 T이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, α는 약 1 내지 약 20의 정수이고, β는 약 1 내지 약 20의 정수이다. 일부 구체예에서, 서열의 GIGG의 각각의 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다 (예를 들어, G는 2'-데옥시구아노신이고 I는 2'-데옥시이노신이다). 일부 구체예에서, TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 143 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 모두 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 2'-당 변형을 포함한다. 이 구체예들의 서브세트에서, 2'-당 변형은 2'-0-메틸 당 변형 또는 2'-0-메톡시에틸 당 변형을 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 모두 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및 2'-당 변형 키메라 서열이다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및 2'-0-메틸 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및 2'-0-메티옥시에틸 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 변형된 포스페이트 결합을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 단지 포스포로티오에이트 결합을 갖는다. 일부 구체예에서, 방법은 투여 단계 전에, 증가된 염증 유전자 발현 패턴을 갖는 개인을 선택하는 단계를 더 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제는 다음 결과 중 하나 이상을 달성하기 위한 유효량으로 투여된다: i) 개인의 치료 후 샘플에서 염증 유전자 발현 패턴의 감소; ii) 자가 면역 질환의 임상적 질환 활성 측정의 감소; iii) 자가 면역 질환의 혈청학적 질환 측정의 감소; 및 iv) 개인의 치료 후 말초 혈액 단핵 세포 샘플에서 형질세포양 수지상세포의 증가. 일부 구체예에서, 혈청학적 질환 측정은 보체 수준을 포함한다. 일부 구체예에서, 혈청학적 질환 측정은 항-dsDNA, 항-Sm (Smith 항원), 항-히스톤, 항-RNP, 항-Ro (SSA), 및 항-La (SSB)으로 구성된 그룹 중 하나 이상을 포함하는 항-핵 항원 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 제2 치료제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 제2 치료제는 코르티코스테로이드, 비스테로이드성 항염증제 (NSAID), IFN-알파 억제제, 및 항-말라리아로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 개인은 사람 환자이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 피부 홍반성 루푸스 (CLE)이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 SLE, 전신성 경화증 (systemic sclerosis), 다발성 근염 (polymyositis), 피부근염, 류마티스성 관절염 및 쇼그렌 증후군으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
또한 본 개시에 의해 제공되는 것은 개인에게 개인에 의해 글루코코르티코이드의 사용을 감소시키기 위한 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 개인에서 자가 면역 질환을 치료하는 방법이며, 건강한 대상체의 대조군 샘플과 비교하여 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 치료의 시작시 개인으로부터의 샘플에 존재한다. 본 개시는 개인으로부터의 샘플에서 염증 유전자 발현 패턴을 측정하는 단계를 포함하는, 자가 면역 질환을 갖는 개인이 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 치료에 반응할 가능성이 큰지 평가하는 방법을 더 제공하며, 건강한 대상체의 대조군 샘플과 비교하여 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 개인이 치료에 반응할 가능성이 크다는 것을 나타낸다. 추가적으로 본 개시는 개개의 치료 전 및 후의 샘플에서 염증 유전자 발현 패턴을 측정하는 단계를 포함하는, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 치료에 대한 자가 면역 질환을 갖는 개인의 반응성을 관찰하는 방법을 제공하며, 염증 유전자 발현 패턴은 치료 전 샘플에 비교하여 치료 후 샘플에서 감소되고, 개인은 치료에 반응성인 것으로 결정된다. 일부 구체예에서, TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 SEQ ID NO: 1-78, 80-108, 및 110-145로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO: 64-78, 123-135 및 141-145로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 식 RγJGCKαGIGGβ-3' (SEQ ID NO: 146)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이며, 각각의 R, K, 및 L는 뉴클레오티드이고, J는 U 또는 T이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, α는 약 1 내지 약 20의 정수이고, β는 약 1 내지 약 20의 정수이다. 일부 구체예에서, 서열의 GIGG의 각각의 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다 (예를 들어, G는 2'-데옥시구아노신이고 I는 2'-데옥시이노신이다). 일부 구체예에서, TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 143 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 모두 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 2'-당 변형을 포함한다. 이 구체예들의 서브세트에서, 2'-당 변형은 2'-0-메틸 당 변형 또는 2'-0-메톡시에틸 당 변형을 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 모두 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및 2'-당 변형 키메라 서열이다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및 2'-0-메틸 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및 2'-0-메티옥시에틸 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 변형된 포스페이트 결합을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 갖는다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 단지 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 구체예에서, 개인은 사람 환자이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 피부 홍반성 루푸스 (CLE)이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 SLE, 전신성 경화증, 다발성 근염, 피부근염, 류마티스성 관절염 및 쇼그렌 증후군으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
게다가, 본 개시는 증가된 염증 유전자 발현 패턴이, 대조군 샘플과 비교하여, BATF2, CMPK2, CXCL10, DDX60, EPSTI1, HERC5, HES4, IFI44, IFI44L, IFIT1, IFIT3, IFITM3, ISG15, LAMP3, LOC26010, LY6E, MX1, OAS1, OAS2, OAS3, OAS1, OTOF, RSAD2, RTP4, SERPING1, TRIM6, XAF1, c102h05 5, Agencourt-7914287 NIH-MCG_71, ISG20, IFI16, IRF7, 및 AIM2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생체 마커의 샘플에서 증가된 수준을 포함하는 인터페론 (IFN) 군를 포함하는 이전의 단락에 제공된 방법 중 어느 것의 구체예를 제공한다.
일부 구체예에서, 증가된 염증 유전자 발현 패턴은, 대조군 샘플과 비교하여, BATF2, CMPK2, DDX60, EPSTI1, HERC5, HES4, IFI44, IFI44L, IFIT1, IFIT3, IFITM3, ISG15, LAMP3, LOC26010, MX1, OAS1, OAS2, OAS3, OAS1, OTOF, RSAD2, RTP4, SERPING1, TRIM6, XAF1, c102h05 5, Agencourt-7914287 NIH-MCG_71, ISG20, IRF7, 및 AIM2로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생체 마커의 샘플에서 증가된 수준을 포함하는 인터페론 (IFN) 군를 포함한다. 일부 구체예에서, 증가된 염증 유전자 발현 패턴은, 대조군 샘플과 비교하여, IL-1알파, IL-1베타, TNF-알파, IL-6, IL-17, IFN-알파, IFN-오메가, IFN-람다1, IFN-람다2, 및 IP-10으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 시토킨의 샘플에서 증가된 수준을 포함한다. 일부 구체예에서, 증가된 염증 유전자 발현 패턴은, 대조군 샘플과 비교하여, FIT1 (테트라트리코펩티드 반복-1을 가진 인터페론-유발된 단백질), OAS1 (2'-5'-올리고아데닐화된 합성효소-유사), LY6E (림프구 항원 6 복합체, 위치 E), OAS2 (2'-5'-올리고아데닐화된 합성효소), OAS3 (2'-5'-올리고아데닐화된 합성효소), IFI44 (간염 C 미세관 응집체 단백질), MX1 (믹소바이러스 저항성 1), G1P3 (인터페론, 알파-유발성 단백질 또는 IFI-6-16), PRKR (단백질 키나제, 인터페론-α-유발성 이중-가닥 RNA-의존적), IFIT4 (인터페론-테트라트리코펩티드 반복 4를 가진 인터페론-유발된 단백질), PLSCR1 (인지질 스크램블라제 1), C10RF29 (IFI44와 유사한, 골아세포에서 발현되는 가상 단백질), HSXIAPAF1 (XIAP-연관 인자-1), G1P2 (인터페론, 알파-유발성 단백질 또는 IFI-15K), Hs. 17518 (Cig5 또는 바이페린), IRF7 (인터페론 조절 인자 7), CD69 (초기 T-세포 활성화 항원), LGALS3BP (렉틴, 갈락토시드-결합, 가용성, 3 결합 단백질), IL1RN (인터루킨-1 수용체 길항제), APOBEC3B (포볼린 1-유사), RGsi (G-단백질 신호전달 1의 조절기), AGRN (아그린), EREG (에피레굴린), THBS1 (트롬보스폰딘 1), ETsi (v-ets 적아세포증 (erythroblastosiss) 바이러스 E26 발암유전자 상동체 1), ADAM9 (A 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 도메인 9), SERPING1 (세린 또는 시스테인 프로테이나제 억제제 (CI 억제제)), 및 FCGRIA (IgG의 Fc 단편, 높은 친화성 Ia 수용체)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생체 마커의 샘플에서 증가된 수준을 포함한다. 일부 구체예에서, IFN 군는 SLE 군의 일부이다. 일부 구체예에서, SLE 군는, 대조군 샘플과 비교하여, GTPBP2, PCTAIRE2BP, DNAPTP96, GPR84, B4GALT5, FRAT2, 및 PAFAH1B로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생체 마커의 샘플의 증가된 수준을 포함한다. 일부 구체예에서, SLE 군는, 대조군 샘플과 비교하여, 미국 7, 608, 395의 표 1B (185 마커), 표 2B (1253 마커), 표 3B (18 마커), 및 표 4 (6 마커) 모두로 구성된 그룹으로부터 선택되는 (및 설명에서 재생산된 바와 같이) 하나 이상의 생체 마커의 샘플의 증가된 수준을 포함한다. 일부 구체예에서, 증가된 수준은 대조군 샘플보다 적어도 2. 0배, 적어도 2. 25배, 적어도 2. 5배 또는, 적어도 3배, 적어도 3. 5배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 이상의 발현 수준의 변화를 나타낸다. 다른 구체예에서, 감소된 수준은 대조군 샘플보다 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 더 낮은 수준에서 발현을 나타낸다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 생체 마커는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 25개의 생체 마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 건강한 대상체의 대조군 샘플은 적어도 10, 15, 20, 또는 25명의 건강한 사람 대상체의 PBMC를 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 피부 조직을 포함한다. 일부 구체예에서, 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 생체 마커의 유전자로부터 발현된 mRNA를 측정함으로써 결정된다. 다른 구체예에서, 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 생체 마커의 유전자로부터 발현된 단백질을 측정함으로써 결정된다. 일부 구체예에서, 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 나노스트링 분석, 효소-결합된 면역흡착 검정 (ELISA), 및 유동세포분석법으로 구성된 그룹으로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택된 기술에 의해 결정된다.
본 개시는 개인의 자가 면역 질환의 치료에 사용되는 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제를 포함하는 이전 단락의 방법에 사용되는 조성물을 추가로 제공하며, 건강한 대상체의 대조군 샘플과 비교하여 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 치료의 시작시 개인으로부터의 샘플에 존재하고, TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 146)을 포함하는 폴리뉴클레오티드이고, 각각의 R, K, 및 L는 뉴클레오티드이고, J는 U 또는 T이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, α는 약 1 내지 약 20의 정수이고, β는 약 1 내지 약 20의 정수이다. 일부 구체예에서, 서열의 GIGG의 각각의 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다 (예를 들어, G는 2'-데옥시구아노신이고 I는 2'-데옥시이노신이다).
본 개시는 또한 개인의 자가 면역 질환의 치료에 사용되는 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제를 포함하는 이전 단락의 방법에 사용되는 조성물을 제공하며, 건강한 대상체의 대조군 샘플과 비교하여 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 치료의 시작시 개인으로부터의 샘플에 존재하고, TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 식 5'-N 3 N 2 N 1 CGN1N2N3-Nm-3' (SEQ ID NO: 205)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이며, CG는 CpG, C*pG, C*pG*, 또는 CpG*인 올리고뉴클레오티드 모티프이고, C는 시토신이고, C*는 피리미딘 뉴클레오티드 유도체이고, G는 구아노신이고, G*는 퓨린 뉴클레오티드 유도체이고; N 1 은 뉴클레오티드 유도체 또는 올리고뉴클레오티드 모티프의 활성을 억제하는 비-뉴클레오티드 결합 변이이고, 각각의 발생시 N 2 -N 3 은 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유도체, 또는 올리고뉴클레오티드 모티프의 활성을 억제하는 비-뉴클레오티드 결합 변이이다. 각각의 발생시 N 1 -N 3 은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체이고, 각각의 발생시N m 및 Nm은 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유도체, 또는 비-뉴클레오티드 결합이다.
본 개시는 개인의 자가 면역 질환의 치료에 사용되는 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제를 포함하는 이전 단락의 방법에 사용되는 조성물을 추가로 제공하며, 건강한 대상체의 대조군 샘플과 비교하여 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 치료의 시작시 개인으로부터의 샘플에 존재하고, TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 식 XaCCN1N2N3YbN4GGGZc의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 206)을 포함하는 폴리뉴클레오티드이고, 각각의 C는 시티딘 또는 이들의 유도체이고, 적어도 하나의 C는 시티딘 유도체이다; 각각의 G는 구아노신 또는 이들의 데아자 유도체이다; Xa는 a 뉴클레오티드 길이인 어느 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, a는 0-12의 정수이고, 포함되고, 각각의 뉴클레오티드는 독립적으로 Xa 중에서 다른 것으로 선택된다; Y는 b 뉴클레오티드 길이인 어느 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, b는 0-21의 정수이고, 포함되고, 각각의 뉴클레오티드는 독립적으로 Yb 중에서 다른 것으로 선택된다; 및 각각의 뉴클레오티드는 독립적으로 Zc 중에서 다른 것으로 선택되고, N1, N2, N3, 및 N4는 각각 독립적으로 어느 뉴클레오티드일 수 있다.
도 1a-c는 단독으로 또는 테스트 된 IRP의 존재시 R848에 의한 TLR7 리간드 자극 후에 마우스 비장 세포의 IL-6 수준 (pg/ml)을 예측한다.
도 2a-d는 1O mpk 및 1OO mpk에서 (a, b) SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 109 (IRS)의 투여 후 및 90 mpk에서 (c, d) SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143 및 SEQ ID NO: 144의 투여 후 시간의 흐름에 따른 래트 체중 습득/손실을 나타낸다.
도 3a-b는 지시된 투여량에서 SEQ ID NO: 42 (a) 및 SEQ ID NO: 109 (b)의 투여 후 시간의 흐름에 따른 퍼센트 중량 습득 대 사전 투여량을 나타낸다. 도 3c는 100 mg/kg에서 SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143 및 SEQ ID NO: 144의 투여 후 시간의 흐름에 따른 퍼센트 중량 습득 대 사전 투여량을 나타낸다.
도 4a-d는 100 mg/kg에서 SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143 및 SEQ ID NO: 144의 투여 후 간, 심장, 신장 또는 비장의 기관 중량을 나타낸다.
도 5a-b는 (a) 단독으로 또는 테스트 된 IRP의 존재시 R848로 자극될 때 R848 단독과 비교하여 및 (b) 단독으로 또는 테스트 된 IRP의 존재시 CpG-ISS로 자극될 때 CpG-ISS 단독과 비교하여 생산된 IL-6의 퍼센트를 나타낸다.
도 6a-b는 각각 비장 세포 및 B-세포에서 R848과 비교하여 생산된 IL-6의 퍼센트 또는 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 R848로 자극될 때 생산된 IL-6의 수준 (pg/ml)을 나타낸다. 도 6c 및 d는 각각 비장 세포 및 B-세포에서 CpG-ISS와 비교하여 생산된 IL-6의 퍼센트 또는 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 CpG-ISS로 자극될 때 생산된 IL-6의 수준 (pg/ml)을 나타낸다.
도 7a는 단독으로 또는 테스트 된 IRP의 존재시 CpG-ISS로 자극될 때 CpG-ISS 단독과 비교하여 생산된 IL-6의 퍼센트를 나타낸다. 도 7b는 단독으로 또는 테스트 된 IRP의 존재시 R848로 자극될 때 R848 단독과 비교하여 생산된 IL-6의 퍼센트를 나타낸다. 도 7c 및 d는 단독으로 또는 테스트 된 IRP의 존재시 (c) 인플루엔자 바이러스 또는 (d) HSV로 자극될 때 바이러스 단독과 비교하여 생산된 IFN-α의 퍼센트를 나타낸다.
도 8a는 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 CpG-ISS로 자극될 때와 비교하여 생산된 IFN-α의 수준을 나타낸다. 도 8b-c는 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 (b) DNA-IC 또는 (c) RNP-IC로 자극될 때 DNA-IC 단독과 비교하여 생산된 IFN-α의 퍼센트를 나타낸다.
도 9a-b는 HSV로 자극될 때 PDC에서 테스트 된 IRP에 대한 IC50 값을 나타낸다. 도 9c 및 d는 인플루엔자 바이러스로 자극될 때 PDC에서 테스트 된 IRP에 대한 IC90 값을 나타낸다.
도 10a는 단독으로 다양한 농도의 SEQ ID NO: 73의 존재시 TLR9L HSV 또는 TLR71FLU로 자극된 사람 PDC의 투여량 반응 곡선을 나타낸다. 도 10b는 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시, 인플루엔자 바이러스로 자극될 때 바이러스 단독과 비교하여 생산된 IFN-α의 퍼센트를 나타낸다. 도 10c 및 d는 생산된 IL-6 (pg/ml)의 수준 및 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 CpG-ISS로 자극될 때 CpG-ISS 단독과 비교하여 생산된 IL-6의 퍼센트를 나타낸다.
도 11a-b는 간 및 신장에서 테스트 된 IRP의 조직 농도를 나타낸다. 도 11c 및 d는 테스트 된 투여량에서 간, 신장, 비장 및 심장에서 SEQ ID NO: 73 및 SEQ ID NO: 109의 조직 농도를 나타낸다.
도 12a-b는 테스트된 투여량에서 시간의 흐름에 따른 간, 신장, 비장 및 심장에 대한 SEQ ID NO: 73의 조직 농도를 나타낸다. 도 12c 및 d는 연구의 끝에 간, 신장 및 비장에서 SEQ ID NO: 73 및 109의 조직 농도를 나타낸다.
도 13a-d는 GC-처리된 SLE 환자의 PDC-유발된 IFN 군의 발현의 수준이 순환 혈액 PDC와 엄격하게 관련된다는 것을 나타낸다. (a) 정제된 PDC를 단독으로 또는 Flu와 함께 또는 정제된 항-RNP-IC를 단독으로 또는 GC (10-5M) 또는 IRS와 함께 비양하였고 3시간에 IFN-α 분비에 대하여 검정하였다. (b) 상위 패널: 매일 경구 프레드니손 5-10 mg (n=29) 또는 20-30 mg (n=6)에서 및 정맥 내 메틸프레드니솔론 펄스 (3연속 투여, n=6)에서, 치료되지 않은 SLE 환자 (n=30)의 인터페론 모듈 발현 수준 (IFN 모듈 내에 전사물의 평균). 중간 및 하위 패널: 5-10 mg 매일 경구 GC (n= 27), 매일 경구 GC 20-30 mg (n=16) 하에 및 정맥 내 펄스 다음날 (n=6), 치료되지 않은 SLE 환자 (n=13)의 혈액 PDC 및 단핵세포 수. (c) 정맥 내 펄스 전 및 후 제1일 및 제6일에 PDC의 대표적인 유동 세포 분석법. (d) 위: 정맥 내 펄스 전 및 펄스 후 제1일 (n=1) 및 제8일 (n=2)에서 건강한 대조군 (n=9), SLE 환자 (n=26)의 평균 인터페론 모듈 수준 발현의 정량 (나노스트링, 도 17 참조). 아래: IV 펄스 전 (D0, n=10) 및 펄스 후 제1일 (n=9) 및 제6일 (n=2)에서 CD 11 c 집단 환자의 PDC 빈도. 데이터는 평균 ± 표준 평균 오차로 플로팅되었다.
도 14a-g는 TLR-유발된 NF-kB 활성화에서 활성의 부족으로 인해 GC가 TLR7 & 9-활성화된 PDC의 생존력에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. (a-d) 정제된 PDC는 지시된 바와 같이 배양되었고 생존력은 24시간 후 평가되었다. (a) PDC를 지시된 바와 같이 단독으로 또는 GC와 함께 (10-5M 또는 10-6M) 배양하였다. 6-12의 독립적인 기증자의 평균은 ± SEM으로 나타났다. ** p<0.01 TLRL 단독 대 IRS와 함께 배양된 것. (b) PDC를 지시된 바와 같이 GC와 함께 (10-5M) 또는 단독으로 배양하였다. 5-8의 독립적인 기능자의 평균 ± SEM. (c-d) PDC를 CpG-C 단독으로 또는 p38 MAPK, PI3 키나제 또는 NF-kB 억제제와 함께 배양하였다. 6-8의 독립적인 기증자의 평균 ± SEM이 나타났다. (e-g) 정제된 PDC (e-f) 또는 단핵세포 (g)의 핵 추출물을 추출한 후 지시된 바와 같이 배양하였고 NF-kB의 전사 활성이 평가되었다. IKK-2를 0.5 μΜ로 사용하였다. 데이터는 적어도 4번의 독립적인 실험의 OD 값 (평균 ± SEM)으로 나타난다.
도 15a-d는 생체 내에서 TLR9 활성화가 PDC를 GC 처리에 대하여 더 저항성으로 만들었다는 것을 나타낸다. (a, b) 18시간 후 129 마우스에 등급별 투여량의 덱사메타손 및 (a) 혈액 또는 (b) 비장으로부터 제조된 세포를 주사하였다. 혈액에서, 데이터를 (a) 혈액의 세포 수/ml 및 (b) 비장의 세포의 전체 숫자로 표현하였다. 그룹당 n=6 마우스. (c-d) 129 마우스를 치료하지 않거나 단독으로 또는 CpG-C ISS (50 μg/마우스)의 존재시 또는 CpG-C ISS 플러스 IRS (100 μg/마우스)와 함께 덱사메타손으로 치료한 채로 두었다; 혈액에서 세포 수/ml는 (c)에서 나타나고 비장에서 세포의 전체 숫자는 (d)에서 나타난다. 2개의 독립적인 실험의 누적 데이터; 그룹당 n=8 마우스가 나타난다. 플로팅된 데이터는 평균 ± 표준 평균 오차 ** p<0.01, *** p<0.001을 나타낸다.
도 16a-d는 PDC 형태 루푸스에 걸리기 쉬운 마우스가 자체 핵산에 의해 활성화된 TLR7 & 9로 인해 야생형 마우스와 비교된 바와 같이 GC-유발된 세포사에 대한 고유한 저항성을 갖고 있었다는 것을 나타낸다. (a-d) 정상 (폐쇄된 부호) 및 루푸스-걸리기 쉬운 (개방된 부호) 동물들을 치료하지 않거나 덱사메타손 (GC)으로 치료한 채로 두었다. 혈액 (a, 사전 출혈에 대하여 배로 변화) 및 비장 (b, 처리되지 않은 것에 대하여 배로 변화)를 18시간 후에 평가하였다. 적어도 3개의 독립적인 실험의 누적 데이터가 나타난다. *** p<0.001은 2개의 루푸스 균주 사이와 정상 균주의 차이를 나타낸다. (c) (NZBxNZW)F1 및 (D) TLR7.Tg.6 마우스를 치료하지 않거나 단독으로 또는 IRS 또는 GC 처리 전 10일 동안 3일 마다 주어진 대조군 (CTRL) ODN (100 μg/마우스 피하)의 존재시 GC로 치료한 채로 두었다. DEX 후 18시간에 생존력을 평가하였다. 2개의 독립적인 실험의 누적 데이터가 나타난다.
도 17은 GC-처리된 SLE 환자의 PDC-유발된 IFN 군의 일시적인 수준을 나타낸다. 정제된 사람 PDC를 단독으로 또는 Flu (2 MOI) 또는 SLE 환자로부터 분리되거나 단독으로 또는 GC (10-5M 또는 10-6M) 또는 IRS (0.5 μΜ)와 결합된 정제된 항-RNP IC의 존재시 배양하였다. 3시간 후, 세포를 IFN-α 분비에 대하여 검정하였고 MFI (평균 ± 표준 평균 오차)로 나타난 5의 기증자의 누적 데이터가 나타난다.
도 18a-e는 TLR-유발된 신호가 GC-유발된 세포사로부터 PDC를 보호하였다는 것을 나타낸다. IRS는 TLR7/9 자극된 사람 PDC에서 IFN-α 생산을 억제하였지만 세포사를 유발하지 않았고 외인성 IFN-α는 NF-kB 활성화의 부재시 PDC를 구하지 않았다. (a) 정제된 사람 PDC를 단독 (흰 막대) 또는 GC (10-5M)의 존재시 (검은 막대) CpG-C ISS (0.5 μΜ), IL-3 (5 ng/ml), TNF-α (20 ng/ml), IL-7 (10 ng/ml), FTL-3L (10 ng/ml)과 함께 배양하였다. 24시간 후 생존력을 평가하였다. 5번의 독립적인 실험에서 10 (왼쪽 패널) 및 13 (오른쪽 패널)의 독립적인 기증자의 평균 ± 표준 평균 에러가 나타난다 ** p<0.01, *** p<0.001. P 값은 CpG + GC 및 시토킨 + GC 그룹 사이이다. (b) 정제된 사람 PDC를 단독 또는 다양한 농도의 GC와 조합된 CpG-C ISS (0.5 μΜ), Flu (2 MOI)와 함께 배양하였다. 24시간 후 생존력 및 IFN-α의 생산을 평가하였다. 10의 독립적인 기증자의 평균이 나타난다. (c, d) 정제된 PDC를 단독 또는 IRS (1 μΜ)의 존재시 CpG-C ISS (0.5 μΜ), Flu (2 MOI) 또는 RNP-IC (0.5 mg/ml)와 함께 배양하였다. (c) 24시간 후 생존력을 평가하였다. (d) IFN-α를 ELISA로 측정하였다. 3번의 독립적인 실험의 누적 데이터를 나타낸다. n=10. (e) 정제된 PDC를 단독 또는 지시된 농도의 NF-kB 억제제 IKK-2의 존재시 가용성 IFN-α에 상관없이 CpG-C ISS (0.5 μΜ)와 함께 배양하였다. 24시간 후 생존력을 평가하였다. 10의 독립적인 기증자의 평균 ± 표준 평균 오차를 나타낸다.
도 19는 GC가 PDC의 TLR-유발된 p65 인산화에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 부정적으로 정제된 PDC를 PermBuffer III와 함께 투과된 세포를 얼음 위에서 즉시 30분 동안 고정한 후 90분 동안 치료하지 않은 채 두거나 단독 또는 GC (10-5M) 또는 NF-kB 억제제 IKK-2 (0.5 μΜ)의 존재시 (a) CpG-C ISS (0.5 μΜ), (b) Flu (2 MOI)와 함께 배양하였고 Alexa-647 항-사람 NF-kB p65 (pS529) (BD Bioscience)로 염색된 다음 유동 세포 분석법에 의해 분석하였다. 적어도 3번의 분리된 실험의 대표적인 막대그래프.
도 20은 생체 내에서 IRS가 CpG-C ISS-매개된 시토킨의 유도를 크게 감소시켰다는 것을 나타낸다. 129 마우스를 치료하지 않거나 CpG-C ISS (50 μg/마우스) 단독 또는 IRS (50 μg/마우스)로 치료한 채로 두었고 6시간 후 혈청을 수거하였다. IFN-α 및 IL-6를 ELISA로 평가하였다. 그룹당 n=6 마우스 ± 표준 평균 오차.
도 21은 루푸스에 걸리기 쉬운 마우스에서 PDC의 증가된 저항성은 TLR7 & 9 자극으로 인한 것이었다는 것을 나타낸다. (a) (NZBxNZW)F1 및 (b) TLR7.Tg.6 마우스를 치료하지 않거나 단독으로 또는 IRS와 함께 GC로 치료한 채로 두었다. IRS (100 μg/마우스 피하)를 GC 처리 전 10일 동안 3일 마다 투여하였다. GC의 주사 후 18시간에 다른 세포 서브세트의 생존력을 평가하였다. 데이터는 혈액에서 세포 수/ml을 나타낸다. 2번의 독립적인 실험의 누적 데이터 ± 표준 평균 오차 n= 8-12 마우스/그룹.
도 22a-d는 TLR 억제제로 루푸스에 걸리기 쉬운 마우스의 치료가 루푸스에 걸리기 쉬운 마우스에서 GC의 부재시 생체 내 생존력에 영향을 미치지 않았고 GC-c처리된 야생형 마우스에 대하여 어떤 효과도 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 루푸스 마우스의 GC-유발된 세포사에 대한 PDC의 저항성은 세포의 활성화를 필요로 한다. (a) (NZBxNZW)F1 또는 (b) TLR7.Tg.6을 치료하지 않거나 10일 동안 3일 마다 IRS로 (100 μg/마우스 피하) 치료한 채로 두었고 최종 IRS 투여 후 18시간에 비장에서 세포 수를 유동 세포 분석법으로 측정하였다. 데이터는 비장에서 전체 세포 숫자의 평균 ± 표준 평균 오차 그룹당 n=6 마우스를 나타낸다. 혈류에서 유사한 데이터를 얻었다 (미도시). (c) 도 16에 설명된 바와 같이 129 마우스를 치료하지 않거나 GC 0.5 mg 또는 GC 플러스 IRS (100 μg/마우스 피하)로 치료한 채로 두었다. GC의 주사 후 18시간에 PDC의 생존력을 평가하였다. 그룹당 n=6 마우스. (d) 도 16에서와 같이 129마리 또는 (NZBxNZW)F1 루푸스에 걸리기 쉬운 동물 (3주 또는 16주령)을 치료하지 않거나 GC로 치료한 채로 두었다. 여기에서, GC의 투여량을 마우스의 중량에 기초하여 조정하였고 3주령 마우스는 0.25 mg을 받았지만 성체 마우스는 0.5 mg을 받았다. 18시간 후 혈액 및 비장에서 PDC 세포 수를 평가하였다. 데이터는 각각의 마우스에 대한 치료되지 않은 마우스의 변화 배수로서 표현된다.
도 23a-c는 TLR 억제제로 루푸스에 걸리기 쉬운 마우스의 치료가 IFN-유발성 유전자의 수준을 감소시킨다는 것을 나타낸다. (a) 도 16에 설명된 바와 같이 (NZBxNZW)F1 마우스를 치료하였지만 마우스가 IRS를 받았을 때, 다른 투여량의 GC를 사용하였다 (여기에 마우스당 mg으로). (b) (NZBxNZW)F1 및 (C) TLR7.Tg.6 마우스를 치료하지 않거나 10일 동안 3일 마다 IRS (100 μg/마우스 s. c)로 치료한 채로 두었고 최종 IRS 주사 후 18시간에 비장을 수확하였다. RNA를 동물의 비장으로부터 제조하였고 타입 I IFN-조절 유전자의 수준을 정량 분석 (Taqman)으로 측정하였다. 그룹당 n=6-10 마우스에 대한 평균 ± 표준 평균 오차.
도 24a-f는 피부 상처가 백혈구 침윤 및 PDC에 의한 IFN-α의 생산 및 호중구에 의한 NET의 분비를 포함하는 활성화를 유발하였다는 것을 나타낸다. (a) 유동 세포 분석법에 의해 테이프-스트리핑을 통한 염증 후 24시간에 129 마우스의 피부에서 세포 침윤을 특징으로 한다. PDC는 CD11C+ PDCA1+120G8+로, cDC는 CD1 1c+PDCA1-120G8-로, 호중구는 LY6G+(1A8) F480-으로, 피부 대식세포는 F480+ LY6G 낮음으로, T 세포는 CD4+CD3+ 및 CD8+CD3+로 확인하였다. 적어도 10마리의 마우스의 대표적인 FACS 플롯이 나타난다. (b) 129 마우스를 테이프 스트리핑하였고 24시간 후 PDC 침윤 세포를 IFN-α에 대하여 유동 세포 분석법으로 평가하였다. 호중구 (LY6G+) 및 T 세포 (CD3+)를 음성 대조군으로 사용하였다. 3시간 동안 CpG-ISS로 자극된 배양된 골수 유래 PDC를 양성 대조군으로 사용하였다. 유사한 결과를 갖는 3번의 독립적인 실험의 대표 값이 나타난다. 테이프 스트리핑 후 24시간에 (c) 골수 (불활성화된 호중구의 근원으로서) 또는 (d) 마우스의 피부로부터 분리될 때 NET를 형성하는 호중구의 능력은 호중구를 검출하기 위해 Ly6G 및 DNA를 염색하기 위해 SyTox 염료를 사용하는 면역 염색법에 의해 결정되었다. LL-37-함유 DNA 또는 RNA NET 섬유의 존재는 특이적 염료를 사용하는 면역 염색법에 의해 검출되었다. 10마리의 마우스의 대표 값이 나타난다.
도 25a-b는 MyD88 신호 전달 경로가 타입 I IFN-조절 및 염증 유발 유전자 모두의 상향 조절에 필요했다는 것을 나타낸다. (a) MyD88-/-(줄무늬 막대 그래프) 및 나이가 맞춰진 야생형 C57/BL6 마우스 (검은 막대 그래프)를 치료하지 않은 채로 두거나 (나이브) 염증을 유발하기 위해 테이프 스트리핑하였다. 24시간 후, 피부 생체 조직 검사는 분리되었고 염증 유발 유전자의 수준을 Taqman으로 평가하였다. 적어도 2번의 독립적인 실험 그룹당 n=15-20의 누적 데이터가 나타난다 (평균 ± SEM). * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 나이브 (치료되지 않은) 그룹은 단지 C57/BL6 및 129 마우스에서만 나타난다. 적어도 2번의 독립적인 실험 n=15-20의 누적 데이터가 나타난다 (평균 ± SEM). * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001.
도 26a-b는 피부 염증의 유도를 위해 TLR7 및 TLR9의 자극이 필요하였지만 세포 침윤 후 피부 손상에 대한 것은 아니다는 것을 나타낸다. 129 마우스를 치료하지 않거나 (나이브, 하얀 막대 그래프), 테이프 스트리핑되거나 (테이프, 검은 막대 그래프) 이중 TLR7 및 TLR9 억제제 SEQ ID NO: 42 (IRS) (100 μg; 피하)로 치료 (피하) 후 즉시 테이프 스트리핑한 채로 두었다. a) 24시간 후 피부 침윤 세포를 분리하였고 도 24에서와 같이 PDC 및 호중구를 확인하였다. 막대 그래프는 2 x 2 cm 피부 생체 조직 (n=10)으로부터 얻은 전체 세포 숫자를 나타낸다. b) 유전자 발현 수준을 Taqman으로 평가하였다. 2번의 독립적인 실험 n=10-15 마우스의 누적 데이터가 나타난다 (평균 ± SEM). * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001.
도 27a-b는 PDC 및 호중구 모두의 활성화가 염증 유전자의 파열 후 테이프-스트리핑 손상에 대하여 결정적이었다는 것을 나타낸다. 129 마우스를 치료하지 않은 채로 두었거나 테이프 스트리핑된 PDC 및/또는 호중구가 특이적 항체를 사용하여 테이프 스트리핑 전에 고갈되었다. 마우스에 PDC의 고갈을 위하여 항 120G8 항체, 또는 호중구의 고갈을 위하여 항-GR1-LY6G 항체로 테이프 스트리핑 전 8시간에 제-2일 및 제0일에 복강 내 주어진 250 μg을 주사하였다. 혈류 및 피부 침윤에서 95% 이상의 세포 고갈을 달성하였다. 테이프 스트리핑 후 24에, 유전자 발현 수준을 (a) 피부 침윤 세포 및 (b) 피부 생체 조직에서 측정하였다. 나이브 그룹은 치료되지 않은 마우스에 대해서만 나타난다. 3번의 독립적인 실험 n=14 마우스의 누적 데이터가 나타난다 (평균 ± SEM). * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001.
도 28a-h는 루푸스에 걸리기 쉬운 (NZBxNZW)F1 마우스가 심각하고 만성인 피부 질환 유사한 사람 CLE에 걸린 후 테이프-스트리핑되는 것을 나타낸다. (a) 루푸스에 걸리기 쉬운 (NZBxNZW)F1 및 나이가 맞춰진 129 및 C57/BL6 마우스를 테이프 스트리핑 하였고 피부 생체 조직 검사를 24시간, 4일 및 20일 후 수거하였고 유전자 발현이 평가되었다 (IRF7, ISG15 및 IFIT를 타입 I IFN 조절 유전자로 분석하였고 TNF-α, IL1-A, IL1B를 염증 유전자로 분석하였다). 24시간에 유전자 발현의 수준을 100으로 설정하였고 테이프 스트리핑의 4일 및 20일 후에 얻은 수준과 비교하였다. 3번의 독립적인 실험의 누적 데이터가 나타난다 n=10 (평균 ± SEM). * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. (b) (NZBxNZW)F1, 129 및 C57/BL6 마우스에서 테이프 스트리핑 후 개방된 병변이 있는 영역의 정량. 적어도 2번의 독립적인 실험 n=15의 누적 데이터 (평균 ± SEM). (C-H) (c) 손대지 않은 (NZBxNZW)F1 마우스의 피부, 또는 (d) 129, (e) C57/BL6 또는 (F-H) 테이프 스트리핑 후 15-23일에 (NZBxNZW)F1 마우스의 피부의 대표적인 섹션. 크기 막대 200 μm.
도 29a-g는 루푸스에 걸리기 쉬운 마우스에서 PDC 및 TLR7 & 9 신호 전달이 피부 질환 형성에 필요했다는 것을 나타낸다. (a) (NZBxNZW)F1 마우스 (치료되지 않음), 매주 SEQ ID NO: 42 (IRS)의 주사로 치료되는 (NZBxNZW)F1 및 실험의 코스 중에 PDC가 고갈되는 (NZBxNZW)F1 마우스 (PDC 고갈됨)에서 테이프-스트리핑 후 15-23일에 개방된 가시적 피부 병변이 있는 영역의 정량. 적어도 2번의 독립적인 실험의 누적 데이터 n=12 (평균 ± SEM)가 나타난다. 손대지 않은 (NZBxNZW)F1 (나이브)의 피부 또는 (c) 치료되지 않거나 (d-e) IRS로 치료되거나 (f-g) PDC가 고갈된 채로 둔 (NZBxNZW)F1 마우스로부터 테이프 스트리핑 후 15-23일 후 분리된 피부의 대표적인 섹션. 크기 막대 200 μm.
도 30a-e는 SEQ ID NO: 42 (IRS)를 사용하여 만성 피부 염증으로 루푸스에 걸리기 쉬운 마우스의 치료적 처리가 CLE-유사 표현형을 크게 개선하였다. (a) 치료되지 않은 채로 둔 (NZBxNZW)F1 마우스 또는 치료적 설정 (도 36의 치료 계획)에서 제4일-제20일에 IRS로 치료된 (NZBxNZW)F1 마우스의 테이프 스트리핑 후 15-23일에 개방된 병변이 있는 영역의 정량.
2번의 독립적인 실험의 누적 데이터 n=12 (평균 ± SEM). (b, c) 치료되지 않거나 (d, e) 제4일부터 SEQ ID NO: 42 (IRS)로 치료된 (NZBxNZW)F1의 피부의 대표적인 섹션.
도 31a-b는 MyD88 신호 전달 경로가 손상된 피부를 침윤하는 백혈구에서 타입 I IFN-조절 및 염증 유발 유전자 모두의 상향 조절에 대해 필요했다는 것을 나타낸다. A) MyD88-/-(줄무늬 막대 그래프) 및 나이가 맞춰진 야생형 C57/BL6 마우스 (검은 막대 그래프)를 치료하지 않거나 (나이브) 염증을 유발하기 위하여 테이프 스트리핑한 채로 두었다. 24시간 후, 침윤하는 백혈구를 분리하였고 염증 유발 유전자의 수준을 Taqman으로 평가하였다. IFNAR-/-마우스 (줄무늬 막대 그래프) 및 나이가 맞춰진 야생형 129 마우스 (검은 막대 그래프)를 치료하지 않거나 (나이브) 염증을 유발하기 위하여 테이프 스트리핑한 채로 두었다. 24시간 후, 피부 생체 조직을 분리하였고 염증 유발 유전자의 수준을 Taqman으로 평가하였다. 적어도 2번의 독립적인 실험의 누적 데이터 그룹당 n= 15-20이 나타난다 (평균 ± SEM). * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 나이브 (치료되지 않음) 그룹은 C57/BL6 및 129 야생형 마우스에 대해서만 나타난다. 적어도 3번의 실험의 누적 데이터 n=15-20가 나타난다 (평균 ± SEM). * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001.
도 32는 TLR7 및 TLR9 자극이 피부 스트리핑 후 세포의 침윤이 필수적이지 않았다는 것을 나타낸다. 도 26에서와 같이 129 마우스를 치료하지 않거나 (나이브, 하얀 막대 그래프), 테이프 스트리핑하거나 (테이프, 검은 막대 그래프) 또는 이중 TLR7 및 TLR9 억제제 SEQ ID NO: 42 (IRS) (100 μg; 피하)로 치료 (피하) 후 즉시 테이프 스트리핑한 채로 두었다. 24시간 후 피부 침윤 세포를 분리하였고 도 24a에서와 같이 세포 집단을 확인하였다. 막대 그래프는 2 x 2 피부 생체 조직으로부터 얻은 전체 세포 숫자를 나타낸다 (n=10 마우스) (평균 ± SEM).
도 33은 TLR7 및 TLR9의 자극이 피부 염증의 유발에 필요했다는 것을 나타낸다. 129 야생형 마우스를 도 26에 설명된 바와 같이 치료하였다. 피부 생체 조직에서 유전자를 Taqman으로 측정하였다. 적어도 2번의 독립적인 실험의 누적 데이터 (n=10-15 마우스)가 나타난다 (평균 ± SEM). * p<0.05; *** p<0.001.
도 34a-d는 (NZBxNZW)F1의 마우스의 피부의 테이프 스트리핑이 SEQ ID NO: 42 (IRS)로 억제될 수 있는 강한 염증 반응을 유발하였다는 것을 나타낸다. 루푸스에 걸리기 쉬운 마우스에서 테이프 스트리핑을 통한 염증 다음에 피부 세포의 침윤의 특징. (NZBxNZW)F1을 낮추고 (a) 치료하지 않거나 (b, c) 테이프 스트리핑한 채로 두었다. (b, c) 24시간 후 피부 침윤 세포를 분리하였고 (d) 유전자 발현 수준을 Taqman으로 평가하였다. 세포를 도 24a에 설명된 바와 같이 특징지었다. (c) 막대 그래프는 2 x 2 cm 피부 생체 조직으로부터 얻은 전체 세포 숫자를 나타낸다 (n=8 마우스) (평균 ± SEM). (D) (NZBxNZW)F1 마우스를 치료하지 않고 (나이브, 하얀 막대 그래프), 테이프 스트리핑하거나 (테이프, 검은 막대 그래프) 또는 이중 TLR7 및 TLR9 억제제 SEQ ID NO: 42 (IRS)로 치료 후 즉시 테이프 스트리핑한 채로 두었다. 24시간 후 유전자 발현 수준을 Taqman으로 평가하였다. n=6 마우스는 (평균 ± SEM)로 나타난다. * p<0.05.
도 35a-f는 테이프 스트리핑 후 20일에 (NZBxNZW)F1에서 병변의 조직 병리학적 특징의 상세한 내용을 설명한다. 테이프 스트리핑 후 15-23일에 (NZBxNZW)F1의 피부의 대표적인 섹션. (a-c) 이상증식 및 섬유경화증과 함께 각막비후증 및 시판된 염증의 진피 침윤 (원본 확대 10Ox). (d) 지방 조직의 염증성 침윤 및 퇴화성 변형을 특징으로 하는 진피의 표피 접합의 대안 (원본 확대 10Ox). (e, f) 백혈구가 풍부한 호중구로 구성된 더 깊은 진피에서 침윤에 대한 상세한 설명 (핵 더스트는 e)에서 화살표로 나타나고 대식세포 (F에서 박스로 둘러싸인 영역)가 나타난다 (원본 확대 400x).
도 36은 TLR7 & 9 억제제 SEQ ID NO: 42 (IRS)를 가진 (NZBxNZW)F1 및 PDC-고갈 실험에서 치료 프로토콜에 대한 계획을 나타낸다. 실험의 전체 코스 중에 테이프 스트리핑의 날을 시작하거나 (도 29 a, d, e) 감소가 이미 확립되었을 때 손상 후 4일에 시작하는데 (도 30 a, d, e) SEQ ID NO: 42 (IRS)를 사용하였다. 둘 다의 경우에서 SEQ ID NO: 42 (IRS) (100 μg; 피하)를 일주일에 두 번 투여하였다. 또한 설명된 것은 도 29a, f, g에 설명된 PDC 고갈 실험의 타이밍이다. PDC 항-120G8에 대한 항체의 고갈 (250 μg; 복강 내)은 제-2일 및 제0일 테이프 스트리핑 전 8시간에 주어졌고 실험의 전체 기간 동안 일주일에 두 번 주어졌다. 치료되지 않은 그룹에서 병변의 진행에 의존하여 초기의 테이프 스트리핑 후 15-23일 사이에 실험을 멈추었다.
도 37은 TLR7 및 TLR9 신호 전달이 모두 피부 염증의 유도에 필요했다는 것을 나타낸다. (a) TLR7-/-(검은 막대 그래프) 및 나이가 맞춰진 야생형 C57/BL6 마우스 (회색 막대 그래프)를 치료하지 않거나 (나이브) 염증을 유발하기 위하여 테이프 스트리핑한 채로 두었다. 24시간 후, 피부 생체 조직을 분리하였고 염증 유발 유전자의 수준을 Taqman으로 평가하였다. n=10 마우스가 나타난다 (평균 ± SEM); * p<0.05. B) TLR9-/-를 테이프 스트리핑하거나 (검은 막대 그래프) 이중 TLR7 및 TLR9 억제제 IRS 954 (100 μg; 피하) (점선 막대 그래프)로 치료 후 즉시 테이프 스트리핑하였다. 나이가 맞춰진 야생형 C57/BL6 마우스를 치료하지 않거나 (나이브; 하얀 막대 그래프) 또는 테이프 스트리핑한 채로 두었다 (회색 막대 그래프). 24시간 후, 피부 생체 조직을 분리하였고 염증 유발 유전자의 수준을 Taqman으로 평가하였다. n=10 마우스가 나타난다 (평균 ± SEM); * p<0.05.
도 38a-b는 (a) 설명된 바와 같이 경구 GC 처리하거나 (n=18) 또는 하지 않은 (n=11) 29명의 SLE 환자의 전체 혈액으로부터 모듈 수준 분석을 나타낸다. 사용된 질환 활성 지수 (SLEDAI) 및 치료는 상기 나타난다. 축소된 모듈은 유전자의 발현하에 일치하지만 축소되지 않은 모듈은 대조군에 대하여 표준화된 유전자에 대한 관련된 과발현과 일치한다. (b) 나노스트링 카운터 시스템을 건강한 기증자 및 SLE 환자에서 종적인 혈액 유전자 발현 수준을 평가하기 위해 사용하였다. 12개의 IFN-유발성 유전자에 해당하는 프로브는 나노스트링 코드세트에 포함되었다 (표 1 참조). 유전자 발현 수준을 대조군 유전자 및 건강한 기증자에 대하여 표준화하였다. 8명의 SLE 환자의 종적인 샘플 (개인 컬럼)에 해당하는 히트맵 (로그 2 크기)이 나타난다. 환자 SLE 184, 190, 212, 252, 133 및 231에 해당하는 샘플을 2-3달 간격으로 얻었다. 이 환자들은 경구 GC를 받고 있었지만 정맥 내 메틸프레드니솔론 펄스는 아니었다. SLE 242를 IV 펄스 전 날, 2번의 독립적인 IV 펄스 후 8일 (0으로 표시됨), 및 경구 GC 중에 추가적으로 2번 더 분석하였다. SLE 249를 IV 펄스 전 날 및 다음날 분석하였고 (*로 표시됨), GC 중에 추가적으로 2번 더 분석하였다. IV 펄스 다음날에만 IFN-유발성 유전자의 발현 수준의 감소가 있었다. 축소 없음: 과발현. 축소: 저발현.
본 발명은 TLR7 및/또는 TLR9의 억제제, 예를 들어, 면역 조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역 조절 화합물, 및 이 억제제들을 사용하여 개인, 특히 사람에서 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 면역 조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역 조절 화합물은 면역 조절 서열 (IRS)을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역 조절 화합물은 변형되지 않은 IRS를 포함한다. 본 발명의 면역 조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역 조절 화합물은 특히 TLR7 및/또는 TLR9를 통한 신호 전달을 수반하는 이 반응들을 포함하는, 선천성 면역 반응을 억제한다. 본 발명의 면역 조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역 조절 화합물은 효과적으로 사람 세포의 IFN-α 및/또는 IL-6를 포함하는, 시토킨 생산을 억제할 수 있다. 여기에 설명된 면역 조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역 조절 화합물은 또한 효과적으로 면역 자극 핵산으로 자극된 세포의 증식 및/또는 성숙을 억제할 수 있다.
개인에게 여기에 설명된 면역 조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역 조절 화합물을 투여함으로써 개인의 자가 면역 장애 및 염증 장애, 예를 들어, 만성 염증 장애를 치료하고 방지하는 방법이 또한 여기에 제공된다. TLR7 및/또는 TLR9 억제제를 포함하는 치료에 대한 질환의 반응성을 예측하고 및/또는 결정하는 방법이 또한 여기에 제공된다. 일부 구체예에서, 면역 조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 면역 조절 화합물은 또 다른 치료제와 조합으로 투여된다. 일부 구체예에서, 다른 치료제는 코르티코스테로이드이다. 일부 구체예에서, 면역 조절 화합물 및/또는 면역 조절 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 면역 조절 화합물을 포함한다.
일반적인 기술
본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않으면, 분자 생물학 (재조합 기술을 포함하는), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 활용할 것이고, 이것들은 당업계의 기술 내에 있다. 이러한 기술들은 문헌, 예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et ah, 1989); Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques(Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); 및 Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, and N. A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993)에서 완벽히 설명된다.
정의
여기에 교체 가능하게 사용된 바와 같이, 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드"는 단일 가닥 DNA (ssDNA), 이중 가닥 DNA (dsDNA), 단일 가닥 RNA (ssRNA) 및 이중 가닥 RNA (dsRNA), 변형된 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오시드 또는 이들의 조합을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 선형 또는 원형의 모양일 수 있거나, 폴리뉴클레오티드는 선형 및 원형 세그먼트를 모두 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또 다른 결합, 예를 들어, 포스포오티오에이트 에스테르가 또한 폴리뉴클레오티드에 사용될 수도 있지만, 일반적으로, 포스포디에스테르 결합을 통해 결합된 뉴클레오시드의 폴리머이다. 뉴클레오시드는 당과 결합된 퓨린 (아데닌 (A) 또는 구아닌 (G) 또는 이들의 유도체) 또는 피리미딘 (티민 (T), 시토신 (C) 또는 우라실 (U), 또는 이들의 유도체) 염기로 구성된다. DNA의 4개의 뉴클레오시드 단위 (또는 염기)는 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 티미딘, 및 데옥시시티딘으로 불린다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 포스페이트 에스테르이다.
여기에 사용된 바와 같이 용어 "면역 자극 핵산" 또는 "면역 자극 폴리뉴클레오티드"는 시험관 내, 생체 내 및/또는 생체 외에서 측정된 바와 같이 측정 가능한 면역 반응에 영향을 미치고 및/또는 기여하는 핵산 분자 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드)를 나타낸다. 측정 가능한 면역 반응의 예는 항원-특이적 항체 생산, 시토킨의 분비, 림프구 집단, 예를 들어, NK 세포, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구, B 림프구, 등의 활성화 또는 확장을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 면역 자극 핵산 (ISNA) 서열은 선천성 면역 반응을 자극하는 것으로 알려져 있는데, 특히, 그 반응들은 세포에서 TLR9 신호 전달을 통해 발생한다. 업계에 알려진 바와 같이, 면역 자극 핵산 (ISNA) 분자는 미생물 근원, 예를 들어, 박테리아로부터 분리될 수 있고, 유전자 치료에 사용되는 핵산 벡터에 존재할 수 있거나 여기에 설명되고 업계에 알려진 기술 및 장비를 사용하여 합성될 수 있다. 일반적으로, 면역 자극 핵산 서열은 메틸화되고 있지 않은 디뉴클레오티드의 C를 가진, 적어도 하나의 CG 디뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 일부 경우에서 미생물 감염 및 투여된 DNA는 선천성 면역 반응의 자극을 야기한다.
여기에 사용된 바와 같이 용어 "면역 자극" 또는 "면역 반응을 자극"은 면역 반응에 참여하는 세포 타입의 자극 및 특이적 항원 물질에 대한 면역 반응의 향상을 포함한다. 면역 자극 핵산에 의해 자극되는 면역 반응은 일반적으로 "Th2-타입" 면역 반응과 대조적으로, "Th1-타입" 면역 반응이다. Th1-타입 면역 반응은 일반적으로 항원에 대한 "연기된-타입 과민증" 반응을 특징 및 활성화된 대식 세포 기능으로 하고 Th1-관련된 시토킨, 예를 들어, IFN-γ, IL-2, IL-12, 및 TNF-α의 증가된 수준에 의한 생화학적 수준에서 검출될 수 있다. Th2-타입 면역 반응은 일반적으로 높은 수준의 항체 생산, 특히 IgE 항체 생산 및 향상된 호산구의 수 및 활성화, 뿐만 아니라 Th2-관련된 시토킨, 예를 들어, IL-4, IL-5 및 IL-13의 발현과 관련된다.
여기에 사용된 바와 같이 용어 "선천성 면역 반응" 또는 선천성 면역력"은 세포 또는 개인이 병원체의 존재를 인식하고 반응하는 다양한 선천성 저항 메카니즘을 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이, "선천성 면역 반응"은 세포가 병원체 관련된 분자 패턴 또는 신호를 인식할 때 발생하는 세포 내 및 세포 사이의 이벤트 및 반응을 포함한다. 여기에 설명된 바와 같이, 선천성 면역 반응에서 활성인 세포의 수용체는 톨-유사 수용체 (TLR) 그룹을 포함하고 미생물 리간드는 다양한 TLR에 대하여 확인되었다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 조절 서열" 또는 "IRS"는 시험관 내, 생체 내, 및/또는 생체 외에서 측정된 바와 같은 측정 가능한 선천성 면역 반응을 억제하고 및/또는 억제하는 핵산 서열을 나타낸다. 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 조절 서열" 또는 "IRS"는 변형 (즉, 변형된 IRS)뿐만 아니라 변형을 포함하지 않는 핵산 (즉, 변형되지 않은 IRS)을 포함하는 핵산 서열 모두를 나타낸다. 변형된 IRS는 당, 염기 또는 백본의 변형을 포함할 수 있다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 자극 폴리뉴클레오티드" 또는 "IRP"는 시험관 내, 생체 내, 및/또는 생체 외에서 측정된 바와 같은 측정 가능한 선천성 면역 반응을 억제하고 및/또는 억제하는 적어도 하나의 IRS를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 자극 폴리뉴클레오티드" 또는 "IRP"는 변형된 및/또는 변형되지 않은 IRS를 포함할 수도 있다. 변형된 IRS는 당, 염기 또는 백본의 변형을 포함할 수 있다. TLR, 예를 들어, TLR-7 또는 9의 억제는 제한 없이 수용체 부위에서 억제, 예를 들어, 리간드-수용체 결합의 차단, 및 리간드-수용체 결합 후 다운스트림 신호 전달 경로의 억제를 포함한다. 측정 가능한 선천성 면역 반응의 예는 시토킨의 분비, 림프구 집단, 예를 들어, NK 세포, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구, B 림프구의 활성화 또는 확장, 세포 집단, 예를 들어, 형질세포양 수지상세포 등의 성숙을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 조절 화합물" 또는 "IRC"는 면역 조절 활성을 갖고 IRS를 포함하는 핵산 모이어티를 포함하는 분자, 뿐만 아니라 비-뉴클레오티드 스페이서를 나타낸다. IRC는 비-뉴클레오티드 스페이서, 및 하나 이상의 IRS를 포함하는 핵산 모이어티로 구성될 수도 있거나 적어도 하나의 IRS로 구성된다. IRC는 변형된 및/또는 변형되지 않은 IRS를 포함할 수도 있다. 변형된 IRS는 당, 염기 또는 백본의 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 용어 IRC는 비-뉴클레오티드 스페이서 모이어티와 공유 결합된 하나 이상의 핵산 모이어티를 포함하며, 이것들 중 적어도 하나는 IRS를 포함하는 화합물을 포함한다.
용어 "3'"은 일반적으로 같은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 또 다른 영역 또는 위치로부터 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 3' (다운스트림)의 영역 또는 위치를 나타낸다. 용어 "3' 끝"은 폴리뉴클레오티드의 3' 말단을 나타낸다.
용어 "5'"은 일반적으로 같은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 또 다른 영역 또는 위치로부터 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 5' (업스트림)의 영역 또는 위치를 나타낸다. 용어 "5' 끝"은 폴리뉴클레오티드의 5' 말단을 나타낸다.
용어 "콘쥬게이트"는 IRP 및/또는 IRC가 결합된 복합체를 나타낸다. 이러한 콘쥬게이트 결합은 공유 및/또는 비-공유 결합을 포함한다.
"보조제"는 면역원성 시약, 예를 들어, 항원에 추가될 때, 혼합물에 노출시 수령 숙주에서 비특이적으로 시약에 대한 면역 반응을 향상시키거나 강화하는 물질을 나타낸다.
용어 "펩티드"는 펩티드가 합텐인지 상관없이, 생물학적 반응, 예를 들어, 항원 생산 또는 시토킨 활성에 영향을 미치는데 충분한 길이 및 조성물인 폴리펩티드를 나타낸다. 전형적으로, 펩티드는 길이가 적어도 6개의 아미노산 잔기이다. 용어 "펩티드"는 변형된 아미노산 (자연적으로 또는 비-자연적으로 발생인지 상관없이)을 더 포함하고, 이러한 변형은 인산화, 글리코실화, 페길화, 지질화 및 메틸화를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"전달 분자" 또는 "전달 비히클"은 특정 부위에 IRP 및/또는 IRC의 전달을 가능하게 하고, 허용하고, 및/또는 향상시키고 및/또는 특정 타이밍과 관련된 화학적 모이어티이다.
"개인"은 포유동물, 더 바람직하게 사람이다. 포유동물은 사람, 영장류, 가축, 스포츠 동물, 설치류 및 애완동물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
물질의 "유효량" 또는 "충분한 양"은 임상적 결과를 포함하는, 이로운 또는 원하는 결과에 영향을 미치는데 충분한 양이고, 이와 같이, "유효량"은 그것이 적용되는 맥락에 의존한다. TLR9 의존적인 면역 반응을 억제하는 조성물의 투여의 맥락에서, 유효량은 TLR9를 통한 자극에 대한 세포의 반응을 억제하거나 감소시키는데 충분한 양이다. TLR7 의존적인 면역 반응을 억제하는 조성물의 투여의 맥락에서, 유효량은 TLR7을 통한 자극에 대한 세포의 반응을 억제하거나 감소시키는데 충분한 양이다. 유효량은 일 회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
여기에 설명된 바와 같이 용어 "동시-투여"는 면역 반응을 조절하는 시간에 충분히 가깝게 적어도 2개의 다른 물질의 투여를 나타낸다. 바람직하게, 동시-투여는 적어도 2개의 다른 물질의 동시 투여를 나타낸다.
반응 또는 파라미터의 "억제" 또는 "억제"는 원하는 조건 또는 파라미터를 제외하고 그외의 같은 조건과 비교할 때, 또는 대안으로, 또 다른 조건과 비교하여 반응 또는 파라미터의 감소를 포함한다. 예를 들어, 면역 자극 핵산을 억제하는 IRP를 포함하는 조성물 유발된 시토킨 생산은, 예를 들어, 면역 자극 핵산 단독에 의해 유발된 시토킨 생산과 비교하여 시토킨 생산을 감소시킨다. 또 다른 예로, 선천성 면역 반응과 관련된 시토킨 생산을 억제하는 IRP를 포함하는 조성물은, 예를 들어, 선천성 면역 반응에 의해 생산된 시토킨의 정도 및/또는 수준과 비교하여 시토킨 생산의 정도 및/또는 수준을 감소시킨다. TLR 반응, 예를 들어, TLR7 또는 9 반응의 억제는 예를 들어, 효과적인 리간드-수용체 결합을 방지하거나 차단함으로써, 수용체 부위에서 억제, 및 예를 들어, 효과적인 리간드-수용체 결합 후 다운스트림 신호 전달 경로의 억제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
반응 또는 파라미터의 "자극"은 그 반응 또는 파라미터의 유도 및/또는 향상을 포함한다. 예를 들어, 면역 반응, 예를 들어, 선천성 면역 반응 또는 Th1 반응의 "자극"은 반응의 증가를 의미하며, 반응의 유도 및/또는 향상으로부터 일어날 수 있다. 유사하게, 시토킨 또는 세포 타입 (예를 들어, CTL)의 "자극"은 시토킨 또는 세포 타입, 예를 들어, IL-6 및/또는 TNF-α의 양 또는 수준의 증가를 의미한다.
여기에 사용된 바와 같이, 및 업계에 잘 이해된 바와 같이, "치료"는 임상적 결과를 포함하는 이로운 또는 원하는 결과를 얻는 접근이다. 본 발명의 목적을 위해, 이로운 또는 원하는 임상적 결과는 검출 가능 여부에 상관없이, 하나 이상의 증상의 경감 또는 개선, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환의 확산 방지, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 완화 (부분적이거나 전체적으로)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우 예측되는 생존에 비교하여 연장된 생존을 의미할 수 있다.
질환 또는 장애의 "완화"는 장애를 치료하지 않은 것과 비교하여, 장애 또는 질환 상태의 정도 및/또는 원하지 않는 임상적 징후가 줄어들고 및/또는 진행의 시간 경로가 둔화하거나 길어진다. 특히 자가 면역 질환 맥락에서, 당업자에 잘 이해된 바와 같이, 완화는 원하지 않는 면역 반응의 조절 또는 감소시 발생할 수도 있다. 게다가, 완화는 일 회 투여량의 투여에 의해 반드시 발생하지 않지만, 종종 투여량의 연이은 투여시 발생한다. 따라서, 반응 또는 장애를 완화하는데 충분한 양은 다회수 투여로 투여될 수도 있다.
여기에 사용된 바와 같이 용어 "생체 마커"는 전사 (mRNA) 또는 번역 (단백질)의 수준에서 원하는 유전자의 차등의 발현을 나타낸다.
여기에 사용된 바와 같이 용어 "IFN 군"는 하나 이상의 인터페론-유발성 생체 마커의 존재를 나타낸다. 일부 구체예에서, 인터페론-유발성 생체 마커는, 본질적으로 타입 I 인터페론에 의해 조절되지 않는 하나 이상의 생체 마커의 발현과 비교하여, 타입 I 인터페론-상향조절된 유전자를 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이, "IFN 군"는 증가된 염증 유전자 발현 패턴의 일부이다.
여기에 사용된 바와 같이 용어 "증가된 염증 유전자 발현 패턴"은 염증 반응: IFN 군의 생체 마커; 및 추가의 생체 마커 (예를 들어, 직접적으로 인터페론-유발성이 아닌)의 일부로서 상향조절되는 둘 이상의 생체 마커의 존재를 나타낸다. 따라서, 용어 "증가된 염증 유전자 발현 패턴"은 IFN 군, 뿐만 아니라 염증 유발 매개자, 예를 들어, 케모킨, 및 케모킨-유발성 생체 마커를 포함한다 (Crow and Kirou, Arthritis Res Ther, 2008 10: 126, 및 Fu et al., Arthritis Res Ther, 2008, 10: R112). 예를 들어, 비-인터페론-유발성 생체 마커는 호중구, 과립구, 대식세포, 및 혈장 세포로 구성된 그룹으로부터 선택된 활성화된 림프구로부터의 군를 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이 용어 "증가된 염증 유전자 발현 패턴"은 "자가 면역 질환 군", 예를 들어, 지금까지 잘 설명된 "SLE 군"의 일부이다. "SLE 군"라고 불리지만, 복수의 생체 마커는 다른 전신 자가 면역 질환, 예를 들어, 전신성 경화증, 다발성 근염, 피부근염, 류마티스성 관절염 및 쇼그렌 증후군의 플레어에 대하여 일반적이다. 이와 같이, 본 개시의 조성물 및 방법은 다양한 전신 자가 면역 질환의 맥락에서 사용을 발견한다.
"관련된다" 또는 "관련되는"은, 어떤 방법으로든, 첫 번째 분석 또는 프로토콜의 수행 및/또는 결과와 두 번째 분석 또는 프로토콜의 수행 및/또는 결과를 비교하는 것을 의미한다. 예를 들어 두 번째 분석 또는 프로토콜이 수행되어야 하는지 결정하기 위하여 첫 번째 분석 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수도 있다. 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 구체예에 관하여, 특이적 치료 요법이 수행되어야 하는지 결정하기 위하여 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수도 있다.
"예측하는" 또는 "예측"은 치료 요법에 대하여 유리하게 또는 불리하게 반응할 것 같은 가능성을 나타내기 위하여 여기에 사용된다.
여기에 사용된 바와 같이, "치료를 시작하는 시점에" 또는 "베이스라인"은 치료에 대한 첫 번째 노출 기간 또는 이전을 나타낸다.
여기에 사용된 바와 같이, "의존적인"은 여기에 설명된 바와 같이 개인의 특징의 평가, 결정, 및 측정 (및 바람직하게 치료를 받는데 적합한 개인의 선택)을 포함한다.
여기에 사용된 바와 같이 "평가를 돕는" 방법은 임상적 결정을 하는 것을 지원하는 방법을 나타내고 평가에 관하여 결정적이거나 아닐 수도 있다.
여기에 사용된 바와 같이 "반응할 가능성" 또는 "반응성"은, 검출 가능 여부에 상관없이, 하나 이상의 증상의 경감 또는 개선, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환의 확산 방지, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 완화 (부분적이거나 전체적으로)로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는 임상적인 또는 비-임상적으로 어느 종류의 향상 또는 양성 반응도 나타낼 수 있다.
여기에 설명된 바와 같이 마커가 치료 방법의 선택, 평가, 측정, 또는 결정을 위한 "기준으로서 사용"될 때, 생체 마커는 치료 전 및/또는 중에 측정되고, 얻은 값은 임상의에 의해 다음 중 어느 것의 평가에 사용된다: (a) 초기에 치료를 받는 것에 대한 개인의 가능성 또는 가능한 적합성; (b) 초기에 치료를 받는 것에 대한 개인의 가능성 또는 가능한 부적합성; (c) 치료에 대한 반응성; (d) 계속해서 치료를 받는 것에 대한 개인의 가능성 또는 가능한 적합성; (e) 계속해서 치료를 받는 것에 대한 개인의 가능성 또는 가능한 부적합성; (f) 투약 조절; 또는 (g) 임상적 이익의 가능성 예측. 당업자에 잘 이해된 바와 같이, 임상적 설정에서 개인의 건강-관련된 생활의 질의 평가는 이 파라미터가 여기에 설명된 치료의 투여의 개시, 지속, 조절 및/또는 중단에 대한 기준으로서 사용되었다는 명백한 표시이다.
여기에 사용된 바와 같이, "샘플"은, 예를 들어, 물리적, 생화학적, 화학적, 생리학적, 및/또는 유전적 특징에 기초하여, 특징지어지고 및/또는 확인되는 분자를 함유하는 조성물을 나타낸다.
여기에 설명된 본 발명의 양태 및 구체예는 양태 및 구체예로 "구성되고" 및/또는 "본질적으로 구성되는" 것을 포함한다는 것으로 이해된다.
여기에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 참고는 그 자체로 그 값 또는 파라미터와 관련된 차이를 포함한다 (및 설명한다). 예를 들어, "약 X"를 나타내는 설명은 "X의 X +/-1%"의 설명을 포함한다.
여기에 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 단수형 "하나의", "또는", 및 "그"는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 참고를 포함한다. 예를 들어, "하나의" IRP는 하나 이상의 IRP를 포함한다.
당업자에 명백한 바와 같이, 치료를 받는 것에 대하여 평가되고, 선택되고, 및/또는 되는 개인은 이러한 활성이 필요한 개인이다.
생체 마커
여기에 평가된 생체 마커는 표 I의 생체 마커를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, "IFN 군"는 참고와 비교하여, 증가된 수준의 표 I의 하나 이상의 생체 마커를 포함한다. 추가의 구체예에서, "IFN 군"는 참고와 비교하여 하나 이상의 생체 마커의 감소된 수준을 더 포함한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
* 여기에 사용된 바와 같이 용어 "생체 마커"는 우선권 가특허 출원에 사용된 바와 같이 용어 "유전적 마커"를 대체한다.
일부 구체예에서, "IFN 군"는 증가된 수준의 표 I의 하나 이상의 마커를 포함한다. 대안으로 또는 추가적으로, "IFN 군"는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 증가된 수준의 하나 이상의 생체 마커를 포함한다: IFIT 1 (인터페론-테트라트리코펩티드 반복-1을 가진 인터페론-유발된 단백질-1), OAS1 (2'-5'-올리고아데닐화된 합성효소-유사), LY6E (림프구 항원 6 복합체, 위치 E), OAS2 (2'-5'-올리고아데닐화된 합성효소), OAS3 (2'-5'-올리고아데닐화된 합성효소), IFI44 (간염 C 미세관 응집체 단백질), MX1 (믹소바이러스 저항성 1), G1P3 (인터페론, 알파-유발성 단백질 또는 IFI-6-16), PRKR (단백질 키나제, 인터페론-α-유발성 이중-가닥 RNA-의존적), IFIT4 (인터페론-테트라트리코펩티드 반복-1을 가진 인터페론-유발된 단백질 4), PLSCR1 (인지질 스크램블라제 1), C10RF29 (골아세포에서 발현되는 가상 단백질, IFI44와 유사), HSXIAPAF1 (XIAP-관련 인자-1), G1P2 (인터페론, 알파-유발성 단백질 또는 IFI-15K), Hs. 17518 (Cig5 또는 바이페린), IRF7 (인터페론 조절 인자 7), CD69 (초기 T-세포 활성화 항원), LGALS3BP (렉틴, 갈락토시드-결합, 가용성, 3 결합 단백질), IL1RN (인터루킨-1 수용체 길항제), APOBEC3B (포볼린 1-유사), RGS 1 (G-단백질 신호전달 1의 조절기), AGRN (아그린), EREG (에피레굴린), THBS1 (트롬보스폰딘 1), ETS 1 (v-ets 적아세포증 바이러스 E26 발암유전자 상동체 1), ADAM9 (A 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 도메인 9), SERPING1 (세린 또는 시스테인 프로테이나제 억제제 (CI 억제제)), 및 FCGR1A (IgG의 Fc 단편, 높은 친화도 Ia 수용체) (Crow and Wohlgemuth, Arthritis Res Ther, 5: 279-287, 2003의 표 2 참조).
일부 구체예에서, "IFN 군"는 "SLE 군"의 일부이다. 일부 구체예에서, "SLE 군"는 미국 7, 608, 395 및 상기 재생산된 바와 같은 표 1B (185 마커), 표 2B (1253 마커), 표 3B (18 마커), 및 표 4 (6 마커) 모두의 증가된 수준의 하나 이상의 생체 마커를 포함한다. 일부 구체예에서, "SLE 군"는 GTPBP2 (NM_019096), PCTAIRE2BP (), DNAPTP6 (AK002064. 1), GPR84 (AF237762), B4GALT5 (NM_004776. 1), FRAT2 (AB045118. 1), 및 PAFAH1B (L13386. 1)로 구성된 그룹 (7개의 생체 마커)으로부터 선택되는, 증가된 수준의 하나 이상의 생체 마커를 포함한다. GPR84, B4GALT5, FRAT2 및 PAGAH1B가 발현의 수준이 SLEDAI 지수와 관련되는 IFN-조절 유전자가 아닌 것으로 이전에 보고되었지만, GTPBP2, PCTAIRE2BP 및 DNAPTP6는 발현의 수준이 SLEDAI 지수와 관련되는 IFN-조절 유전자인 것으로 이전에 보고되었다 (미국 특허 번호 7,608,395의 표 4 참조). 추가적으로 또는 대안으로, "SLE 군"는 MARK3 (AI745639), USP15 (AF153604. 1), MCOLN2 (AV713773), BUP (NM 012071), CAPN2 (M23254. 1), TORI B (AF317129. 1), SQRDL (NM_021199), GLB 1 (NM_000404), PTTG 1 IP (NMJJ04339), RTN4 (AB015639. 1), RAB31 (NM_006868), ANXA1 (NM_000700), SERPINB 1 (NMJ 0666. 1), F5 (NM_000130), GPR27 (AI703476), 10C147991 (BF057717), TNFRSF6 (AA164751), 및 FAM11B (NM_024121)로 구성된 그룹 (18개의 생체 마커)으로부터 선택되는, 증가된 수준의 하나 이상의 생체 마커를 포함한다 (미국 특허 번호 7,608,395의 표 3B 참조). 추가적으로 또는 대안으로, "SLE 군"는 L14457. 1, AF234255. 1, AF151024. 1, BG482805, NM_016459, BG540628, AW408194, AW404894, NM_005532, BC001886. 1, L14456. 1, AL555107, M20812, AB037805. 1, AJ408433, NM_016448, BG251467, NM_001775, NM_001067. 1, NM_001034. 1, NM_006010, NM_004523, NM_017709, AF326731. 1, BG251467, NM_002105, AW087870, L14454. 1, NM_021603, S73498. 1, NM_014736, NM_004219, NM_003003. 1, NM_016359, AA292789, NM_014333. 1, NM_001827, AY029179. 1, NM_012485, BF110588, BG492359, BC000323. 1, AA742244, NM_030920, BF001806, BG165011, U16996. 1, NM_006979, AA181060, 5 NM_016185, NM_014875, AF151075. 1, BCOOl 144. 1, NM_002794, NM_007019, AK022820.1, NM_001071, NM_003558, NM_003920, AI921320, BG478677, NM_013351, BF589413, NM_007295, NM_000942, NM_022109. 1, J04162. 1, AK002195. 1, AI651594, AI813331, BF983948, AI678096, BC006344. 1, M31523. 1, AL536986, NM_000942, NM_003003. 1, NM_003523, NM_018227. 1, NM_016199, BE961916, NM_003542, BG393795, NM_022346, 1. 0 BC006405. 1, BC000755. 1, NM_000173, N25325, NM_024918, NM_002661, AI560720, NM_016123, NM_012177, BC001689. 1, BE311760, AI147740, BF540954, BC000941. 1, R75637, NMJD00791, BE561798, NM_004146, AW291664, NM_014260.1, AF151037. 1, NM_005156, U29343. 1, AI887866, NM_004499, NM_012459, AF286162. 1, NM_006423, BG481459, AB033007. 1, BE966146, BG179991, AI692267, NM_014390, ALl 19957, AB029031. 1, 15 NM_014342, NM_016400, AI347000, AF031469. 1, BG260658, AW295105, AK026118. 1, BC004118. 1, NM_001689, NM_014501, NM_002592, NM_014239, AW271713, AI991669, NM_005530, BE397715, AF094700.1, NM_006420.1, BF246115, BC000738. 1, NM_003595, NM_004381, NM_018339, AI439695, BC006088. 1, NM_030580, NM_018468, BF439618, NM_001866, NM_014393, NM_001536, NM_007241, BF977829, NM_014302, NM_004237, 0 AV702994, AF060511. 1, AB022435. 1, BCOOl 817. 1, BF348067, U82756. 1, BG497776, NM_014721. 1, AL036451, AK025697. 1, NM_014874, BE856541, NM_002490, NM_006567, AF061729. 1, BC004872. 1, BC005009. 1, AW237172, AK000878. 1, NM_013354, AA971514, AK023415. 1, AI052257, AL008582, AI557319, NM_022406, BF126155, AW173222, AB037782. 1, 및 BC002711. 1로 구성된 그룹 (185개의 생체 마커)으로부터 선택되는, 증가된 수준의 하나 이상의 생체 마커를 포함한다 (미국 특허 번호 7,608,395의 표 1B). 추가적으로 또는 대안으로, "SLE 군"는 M97935, M97935, M97935, NM_007315, N53555, AWl 89843, AI337069, NM_016323, NM_001549, AI075407, AI742057, NM_006417. 1, NM_006820, NMJ302462, NM_004030, NM_005101, AK002064. 1, NM_002463, AA633203, NM_006187, NM_002346, NM_016817, AV755522, AF063612. 1, BE669858, BE966604, AF307338. 1, NM_002534, NM_001548, AA142842, AI738416, AI825926, NM_017414, AI651594, BC001356. 1, AA781795, AA131041, NM_003733, BE049439, AA083478, AL121994, BF338947, NM_015907, NM_005532, NM_017912, AA577672, NM_017631, NM_016816, NM_022873, AI631846, NM_005567, AA741307, NM_017654, AI967971, NM_016410, NM_015961, NM_022168, NM_004688, NM_002759, NM_022750, AL035689, AF317129. 1, AK023743. 1, NM_000062, AI954660, BE645480, AI539443, BC002704. 1, NM_001111, AL121829, NM_004223, AW129593, NM_004335, NM_009587, AI859280, AW014593, BC002666. 1, NM_000593, NM_002053, H98105, NM_014398, NM_017523, BE888744, AF280094. 1, NM_004509, AA749101, NM_003641, AI962367, NM_001953, NM_005138, BG386566, BC003602. 1, M10943, NM_005952, NM_002450, AL031602, NM_005953. 1, BF217861, AF333388. 1, AW664179, NM_000389, BE971383, NM_006435, BC001463. 1, BC00l165. 1, NM_003827, AA056548, NM_001295, NM_017742, NM_012420, N47725, NM_016381, AW014557, AF312735. 1, AA768888, NM_021105, NM_006084, BC000080.1, NM_000527, AI925506, R13458, AA150460, NMJ314314, BF055474, AW084937, U88964, NM_002201, NM_003113, AW291023, AI954660, NM_030776, AF129536. 1, AU145711, AFl 14264. 1, AL161961. 1, AA708470, BE563152, L13386. 1, AV648669, NM_000161, BE676543, AI984040, AI478268, AA910306, NM_006442, AL121829, BC001362. 1, AA628398, AK023724. 1, NM_004510, AW139261, AL050374. 1, AF300717. 1, NM_001565, AB028976. 1, NM_003592, AF078844. 1, NM_005950, D87433, NM_001908, AF009644. 1, AF009635. 1, NM_005874, AW271350, AB023430.1, AI041543, NM_016332, NM_013416, NM_001785, NM_000631, NM_024829, AI279062, NM_002631, NM_005621, NM_002432, NM_012198, AI806395, NM_001995, NM_021122, NM_020980, NM_003264, NM_002029, M60721. 1, NM_030666. 1, NM_003255, NM_030769, NM_018840, NM_001780, AI188653, BC000715. 1, BC002342. 1, AW001847, BC000373. 1, BC004371. 1, BC001709. 1, BC004564. 1, BC001709. 1, AL038787, AK023348. 1, TMM_002087, BC000324. 1, NM_002003, NM_002115, NM_000714, NM_002826, AA923524, BE622952, NM_006729, AF035307. 1, NM_006868, BE789881, BE742268, NM_006755, AW206817, NM_012387, AU151342, AI963142, NM_001183, NM_000308, L13974. 1, AF134715. 1, AW151360, X14355. 1, L03419. 1, NM_006665, NM_001860, AW135013, NM_005461, NM_012252, AB035482. 1, NM_004848, NM_012228, NM_002000, NM_005534, AK022852. 1, AW071793, AW241742, BF575514, NM_004049, AL161952. 1, NM_015364, NM_002065, NM_001124, NM_005384, M55580.1, BE563442, AW083357, AW083357, AF257318. 1, AF263293. 1, NM_003059, BC000764. 1, BE466274, J04183. 1, BF941983, AK026776. 1, NM_020179, AK025608. 1, BFl 10421, AB046766. 1, AW276572, U81501. 1, M88107. 1, BC002323. 1, NM_003461, AL571424, NM_003120, NM_000099, NM_002957. 2, NM_021039, NM_005620, AL122066. 1, NM_003864, BF247098, NM_004504, Z22969. 1, NM_004244, U15555. 1, BC005123. 1, NM_004427, NM_004633, AF056979. 1, NMJ321626, 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AF100544. 1, L33930, AK000168. 1, AA761181, M58664. 1, BG327863, AW337833, NM_002424, M18728. 1, BC005008. 1, NM_001925, M63310.1, NM_005564. 1, M33326. 1, U19970.1, NM_002343, NM_001725, NM_001062, NM_000045, NM_003064, X16354. 1, NM_001700.1, NM_000250, NM_001911, NM_002935, M80927. 1, L35848. 1, AL390736, AL522667, NM_004776. 1, NM_000896, NM_004994, NM_005980, M76742. 1, NM_004084, NM_005143, J04152, AI867408, AI343467, BF433657, NM_002934, H16791, NMJH8099, AF087942. 1, NM_004130, M81635. 1, X69397. 1, NM_003039, AI537887, NM_020415, W72338, AK022144. 1, NM_002852, NM_001629, NM_020406, W84421, NM_003909, AW170571, AL138717, NM_021199, NM_004832, MM_005274, NM_002629, NMJ)05566, BC001906. 1, NM_013252, D12502. 1, BF445012, AF240697. 1, AF240698. 1, BC000181. 2, AF305083. 1, AI917716, AK023184. 1, NM_001924, NM_004776. 1, AL078599, NM_024430, NM_022367, BF689355, NM_002965, AI922599, AFl 17234. 1, AF085357. 1, AI925518, NM_001747, NM_014918, NM_002294, BC000145. 1, AF293026. 1, 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NM_006854, AK001363. 1, BG292367, NM_005703, NM_005334, NM_000194, NM_004581, BC000190.1, T79584, NM_002803, BC005978. 1, BC003191. 1, AI972475, NM_005034, AK001899. 1, AI348935, BE251303, AA643304, AI587307, NMJH2071, Y13786. 2, AB023420.1, AL136923. 1, N39536, AI807356, BC000903. 1, NMJ)02266, BC000149. 2, AY029179. 1, BF001806, AL138828, BG031677, NM_020188, BC004239. 1, AF130059. 1, N31731, AI656807, AK025504. 1, NM_000143, AK026260.1, AF343663. 1, NM_004900, NM_002286, AU152456, AV740426, NM_000655, NM_001627. 1, AI191920, AF128458. 1, NMJ)00100, BC001460.1, NM_006353, BC002877. 1, NM_000297, AF092132. 1, NM_004258, NM_005789, BC002654. 1, AI935115, H95344, ALl 10209. 1, BF732638, W22924, T50399, AA479016, AW514654, AI753638, NM_006865, AU145538, BE793250, 및 NM_014758로 구성된 그룹 (1253개의 생체 마커)으로부터 선택되는, 증가된 수준의 하나 이상의 생체 마커를 포함한다 (미국 특허 번호 7,608,395의 표 2B 참조). 상기 그룹 중 어느 것의 생체 마커는 또한 그것들의 Affymetrix 또는 동등한 다른 유전자 칩 장비를 포함한다. 추가적으로 또는 대안으로, "SLE 군"는 M87434 (71 kD 2'5' OIAS), AB000115 (GS3686), D28195 (Hep C p44), X57352 (1-8U), M33882 (MX1), M30818 (MX2), U66711 (RIGE/TSA1), AB006746 (인지질 스크램블라제), L12691 (DEFA3), X04371 (2'5' OIAS E18 이소형태), AL047596 (EST Hute 1), U53831 (IRF 7b), M97935 (ISGF-3), AL022318 (포볼린 1 유사), U72882 (IF p35), L13210 (MAC-2-BP), X99699 (XIAP 관련 인자 1), M13755 (ISG-15), X69910 (p63 막 통과 단백질), X54486 (CI 억제제), X55988 (호산구 유래 뉴로톡신), L09708 (보체 구성요소 2), AFO 16903 (아그린), X57522 (TAP1), AF026939 (Cig 49), AI126134 (칼그라눌린과 유사한 EST), AJ225089 (TRIP 14 OIAS), U37518 (TRAIL), M84562 (포르밀 펩티드 수용체-유사), AL036554 (DEFA1), Z38026 (FALL-39), AB025254 (드로소필라 투도르와 유사), 및 M24594 (IFI-56)로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 증가된 수준의 하나 이상의 생체 마커를 포함한다 (Bennett et al., J Exp Med, 197: 711-723, 2003의 표 I 참조). 추가적으로 또는 대안으로, "SLE 군"는 본원에 참고로 포함되는, 미국 특허 번호 7,118,865의 표 2 또는 표 4의 증가된 수준의 하나 이상의 마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 증가된 수준은 대조군에 대하여 관찰된 것보다 적어도 2-배 더 높은 발현을 포함한다.
추가의 구체예에서, "SLE 군"는 미국 7, 608, 395, 및 상기 재생산된 바와 같이, 표 1A (160 마커), 표 2A (1751 마커), 및 표 3A (27 마커) 모두의 감소된 수준의 하나 이상의 마커를 더 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, "SLE 군"는 BG481877, BF434321, J04132. 1, BC002637. 1, BE677453, N25621, NM_002967, BG403671, T90771, U38979, NM 031214, NM_003107. 1, NM_003107. 1, BF345728, NM_015537, AA722878, AW293531, AL523320, AF070526. 1, AL050035. 1, NM_014612, BE910323, AI694452, AV682940, AK000921. 1, AW043594, 및 NM 004758로 구성된 그룹 (27개의 생체 마커)으로부터 선택되는, 감소된 수준의 하나 이상의 생체 마커를 포함한다 (미국 특허 번호 7,608,395의 표 3A 참조). 추가적으로 또는 대안으로, "SLE 군"는 AW292752, AA005361, NM_020405, NM_014686, AW138833, D13720.1, AL050166, AW027359, AI652861, AF332595. 1, NM_030571, AA205660, AW003635, NM_021038, NM_006445, L41690, BC000580.1, NM_016337, AW157773, BE542684, AA528017, AW614056, NM_024941, NM_004762, AW873606, NM_004281, NM_003423, NM_006625, AI598222, N21364, U19179. 1, AL080183. 1, AK001039. 1, AL136841. 1, AV728658, BC000120.1, BC001407. 1, NM_020987, AW450901, NM_006226, BE218028, BC004556. 1, D89053. 1, AWl 18862, NM_014635, AW189430, NMJH4739, NM_002114, NM_001812, NM_007146. 1, AW802645, NM_014415, BGl 11168, AL356115, AL043571, AI984541, AK024819. 1, NM_014315, NM_014153, NM_024419, ALl 17643. 1, AF202092. 1, L78132. 1, AW591660, NM_004396, AA927480, AI702962, NM_003345. 1, NM_018150, AI985751, NM_006802, AK001406. 1, D86550.1, NM_006420.1, ' NM_024835, NM_016628, NM_017917, AF279899. 1, AF217190.1, NM_005565, BC004130.1, AF092128. 1, NM_022760.1, BE672700, ABOl 1154. 1, AI659005, NM_014454, AA555096, BFl 14870, NM_025238, AB007895, BC002737. 1, NM_014164, AW134798, AI955119, AI078279, AI738556, AL096828, AV700626, NM_004068, AL583509, AI741415, NM_005198, AL136827. 1, NM_012433, AW084068, AI417897, AU144387, NMJH7869, N71116, C14394, NM_001967, AB037811. 1, BF056303, AF130099. 1, NM_014947, AL034550, NM_003297, NM_018281, NM_002035, NMJH4676, AL096857. 1, BC004902. 1, NM_012175, D80010.1, NM_018976, N35250, NM_024654, BG231980, NM_017652, NM_005642, Y09216. 1, NM_007269, D87450.1, BF431965, NM_006766, BE549532, AI887898, W72060, NM_004592, AA167775, AF226044. 1, BG284386, NM_016534, BG389744, NM_030979, AI265967, NM_022781, AI540253, AL133646. 1, AA836114, NM_001012, AK026678. 1, AK026954. 1, L22453. 1, AL137450.1, AI554106, AI695595, NM_005776, 및 NM_016127로 구성된 그룹 (1751개의 생체 마커)으로부터 선택되는, 감소된 수준의 하나 이상의 생체 마커를 포함한다 (미국 특허 번호 7,608,395의 표 1A 참조). 추가적으로 또는 대안으로, "SLE 군"는 AI654857, AI245026, BC004393. 1, AK023981. 1, AL036350, BE865517, AA863228, AA156238, AL544688, NM_006817, NM_001469, BE905157, AA044705, AA525163, AFl 12216. 1, AL136719. 1, AF103800.1, BE962299, BC000967. 2, BF345728, BC000533. 1, NM_003145, NM_003819, BC006235. 1, W05463, AA554827, AI472320, AW085312, AA215381, AI369933, AL109722. 1, NM_014710, AW299250, BE966599, D80001. 1, AF047473. 1, AA130247, AA005361, AK025651. 1, AF288571. 1, NM_022898, NM_006720, NM_003202, AL559122, M15564. 1, AF043179. 1, AF036906. 1, NM_005356, NM_015953, NM_025228, AI084226, NM_004619, NM_002221, N25986, NM_020379, AI650848, NM_019000, AL576253, NMJ300210, NM_004682, NM_014832, AI346026, AB028973. 1, NM_004808, AW293531, BE042354, NM_002300, AB0l 1154. 1, D89678. 1, AFl 16707. 1, BE867771, AA456099, AL023584, AW292872, U82828, AW269834, NM_018443, AL161999. 1, NM_000884, NM_001838, NM_002341, AV700815, BG170478, NM_021211, NM_006107, BE674119, W73788, AL138444, NM_004512, NM_017952, U26455. 1, NM_000051, NM_002971, AA002140, BF739767, BC006436. 1, AW614072, AW157773, AA286867, AI913123, AI341165, AI582192, AI745170, AI831675, AK025546. 1, NM_002013, NM_003143, NM_015251, D87453. 1, AA424065, M31523. 1, AL137450.1, BE250348, BF247371, NM_013265, NM_016091, NM_006893, NM_005051, M80261. 1, AK025446. 1, NM_014886, AI985751, AW148801, AI888672, AL162068. 1, NM_002271. 1, H12084, AB018268. 1, AW237290, AA020010, AI912523, U07236. 1, AW779917, AU144305, BG253884, AA126419, BF064224, AA541762, AI275605, BC004355. 1, AI249173, AU157224, AW513477, AI016714, AA156797, W60810, 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NM_014674, NM_017745, NMJ)21O3O., NM__024072, AW237172, AI460037, NM_019034, AL390164. 1, NM_017660, AW628835, NMJH6026, AI693862, AW055161, BG341575, NM_015909, AB023216. 1, U79277. 1, AI222805, AI820796, AI888657, BG339050, BGl 12118, NM_005735, NM_007344, AW296162, AK001652. 1, BC005370.1, AF183569. 1, BFl 14745, AJOl 1307, AI439695, BF240782, AI659219, AB049654. 1, AF275813. 1, AV751709, AF080579, D49737. 1, NM_003001, AF129756, AI814587, NM_016017, BF224247, N92500, L29008. 1, AI798846, AW264102, AI762876, BF206389, NM_004843, AB014576. 1, NM_025198. 1, T75480, AI870866, AB041836. 1, N32831, AL354612. 1, AW449353, AI760812, AI986239, AW972855, NM_012097, AI638235, AI589978, AI096706, NM_006457, NM_018340, BC002642. 1, AF333336. 1, AW451502, NM_002162, AW274846, AA152232, NM_018845, NMJH6586, NM_006802, AB023215. 1, AU157017, AI868315, BF063821, AI826279, AK025464. 1, NM_018465, NM_004546, NM_006886, BC002772. 1, N34846, AI939400, AF217197. 1, NM_002823, AK023255. 1, AI203021, NM_004780, AL049980.1, M14016. 1, BE670798, BF589088, D21089. 1, AI348010, NM_018312, AI741415, AL567411, BE551193, AA664258, AK001039. 1, AB051548. 1, AF077048. 1, NM_005402. 1, M32577. 1, NM_004634, AF226990.2, BC001041. 1, M27487. 1, AA789329, AL157424. 1, BC000978. 2, AI917328, AW236209, BC003669. 1, AI432713, BF676980, AF151842. 1, BF972871, AI335267, AA523441, AI435036, BG028884, BG388615, NM_021603, NM_024579, AK022050.1, AI332476, 및 AI738987로 구성된 그룹 (1751개의 생체 마커)으로부터 선택되는, 감소된 수준의 하나 이상의 생체 마커를 포함한다 (미국 특허 번호 7,608,395의 표 2A 참조). 상기 그룹 중 어느 것의 생체 마커는 또한 그것들의 Affymetrix 또는 동등한 다른 유전자 칩 장비를 포함한다. 추가적으로 또는 대안으로, "SLE 군"는 본원에 참고로 포함되는, 미국 특허 번호 7,118,865의 표 3의 감소된 수준의 하나 이상의 마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 감소된 수준은 대조군에 대하여 관찰된 것보다 50% 더 낮은 발현을 포함한다.
유전자에 적용되는 바와 같이, "달리 발현되는"은 유전자로부터 전사되는 및/또는 mRNA 전사물로부터 단백질 생산으로 번역되는 mRNA의 다른 생산을 나타낸다. 다른 대상체의 유사한 세포 타입 사이의 유전자 발현의 차이가 비교될 수도 있거나, 같은 대상체에서 첫 번째 및 두 번째 시점에서 유전자 발현의 차이가 비교될 수 있다. 추가로, 대상체의 발현 프로파일은 저장된 참고 발현 프로파일과 비교될 수 있다. 달리 발현되는 유전자는 정상 또는 대조군 세포의 발현 수준과 비교하여 과발현되거나 (예를 들어, 증가된 생체 마커 발현) 또는 덜 발현될 수도 있다 (감소된 생체 마커 발현). 하지만, 일부 바람직한 구체예에서, 과발현되는 것은 대조군 세포, 조직 또는 다른 생물학적 샘플보다 적어도 2. 0배, 적어도 2. 25배, 적어도 2. 5배, 적어도 3배, 적어도 3. 5배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 이상의 발현된 수준의 변화를 나타내기 위하여 사용된다. 이와 같이, X보다 2배 더 큰 수준은 2X인 수준을 나타낸다. 추가의 바람직한 구체예에서, 덜 발현되는 것은 대조군 세포 또는 조직보다 적어도 50% 낮은, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 낮은 수준에서 발현을 나타낸다. 달리 발현되는 것은 또한 대조군 세포에서 침묵하는 경우 발현되거나 대조군 세포에서 발현되는 경우 발현되지 않는 세포 또는 조직의 뉴클레오티드 및/또는 단백질 서열을 나타낸다.
용어 "대상체", "개인" 및 "환자"는 자가 면역 질환, 예를 들어, SLE로 고통받을 수도 있는 사람을 나타내기 위하여 교체 가능하게 사용된다. 용어 "참고" 및 대조군은 비교 목적으로 사용되는 대안의 대상체 또는 샘플을 나타내기 위하여 사용된다. 생체 마커가 증가된 또는 감소된 수준으로 발현되는지 결정하기 위하여 참고에서 사용된 바와 같이 용어 "대조군"은 유전자가 분석되는 대조군 샘플은 자가 면역 질환을 갖지 않는 하나 이상의 사람의 것인 하나 이상의 음성 대조군을 나타낸다. 대상체 및 대조군 모두에서 같은 세포 타입 또는 타입들의 유전자 발현 수준을 결정하는 것이 바람직하다. 하나 이상의 대조군이 사용될 수도 있다. 하나 이상의 대조군이 사용되면, 대조군에서 발현되는 수준은 바람직하게 대조군에서 유전자의 발현의 평균 또는 중간 수준이다. 어느 수의 대조군도 사용될 수 있다. 한 예에서, 적어도 10, 20, 30, 40, 또는 적어도 50개의 대조군이 사용된다. 대조군에서 유전자 발현의 수준은 대상체에서 유전자 발현의 수준이 결정되는 같은 시간쯤에 결정될 수도 있다. e안으로, 대조군의 수준 발현은 다음 비교에 대하여 이전에 결정되고 저장될 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 대조군에서 발현 수준의 결정 이전에 대상체의 발현 수준이 결정되고 저장될 수도 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 생체 마커는, 예를 들어, 적어도 둘 이상의 생체 마커, 적어도 셋 이상의 생체 마커, 적어도 넷 이상의 생체 마커, 적어도 다섯 이상의 생체 마커, 적어도 열 이상의 생체 마커, 또는 적어도 열다섯 이상의 생체 마커를 포함한다.
일부 구체예에서, 생체 마커의 발현은 NanoString nCounter 유전자 발현 시스템을 사용하여 결정된다 (Geiss et al., Nature Biotechnology, 26: 3U-325, 2008, 참고로 본원에 포함됨). 하지만, 대조군 또는 대조군 세포에서 관찰되는 발현의 평균 수준과 비교하여, 대상체의 샘플에서 생체 마커 발현이 증가되거나 감소되는지 결정하기 위해 어느 방법도 사용될 수 있다.
사용 방법
여기에 제공된 것은 개인에게 TLR7 및/또는 TLR9의 억제제 (예를 들어, IRP 및/또는 IRC)의 유효량을 투여하는 방법을 포함하는 개인의 면역 반응을 조절하는 방법이다. IRP 및/또는 IRC는 IRS를 포함한다. 예를 들어, IRS는 SEQ ID NO: 64-78, SEQ ID NO: 123-135, 및 SEQ ID NO: 141-145로 구성된 그룹 중 하나의 IRS이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서 IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 IRS이다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 IRS이다. 일부 구체예에서, 면역 반응은 억제된다 및/또는 억제된다. 일부 구체예에서, 억제된 면역 반응은 TLR7 신호 전달 경로 및/또는 TLR9 신호 전달 경로와 관련된다. IRP 중 어느 것의 일부 구체예에서, IRP는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 서열이다. IRP 중 어느 것의 일부 구체예에서, IRP는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및/또는 2'-0-Me 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 일부 구체예에서, IRP는 변형된 포스페이트 결합을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 구체예에서, IRP는 단지 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.
전형적인 방법 및 조성물이 Guiducci et al., Nature 465: 937-941, 2010 (17 June 2010)에 설명되고, Guiducci et al. J. Exp. Med. 207: 2931-2942, 2010 및 Nov. 29, 2010 [상기 인쇄]에 설명되고, 이 각각의 개시는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명에 의해 제공된 면역 조절의 방법은 면역 자극 핵산 분자, 예를 들어, 박테리아 DNA에 의해 자극되는 면역 자극을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 면역 반응을 억제하고 및/또는 억제하는 것들을 포함한다. 본 발명은 또한 자가 면역과 관련된 증상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 원하지 않는 면역 활성과 관련된 증상을 개선하는 방법을 포함한다. 여기에 설명된 방법에 따르는 면역 조절은 면역 반응의 원하지 않는 활성과 관련된 장애로부터 고통받는 이들을 포함하는 개인에서 수행될 수 있다. 일부 변이에서, 면역 반응은 선천성 면역 반응이다. 일부 변이에서, 면역 반응은 후천성 면역 반응이다. 일부 구체예에서, 세포는 면역 반응에 기여하는 세포의 반응을 억제하기 위한 유효량으로 폴리뉴클레오티드와 접촉된다.
여기에 제공된 것은 개인에게 TLR7 및/또는 TLR9의 억제제 (예를 들어, IRP 및/또는 IRC)의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 개인의 질환을 치료하거나 방지하는 방법이다. 게다가, 제공된 것은 질환에 걸린 개인에게 TLR7 및/또는 TLR9의 억제제 (예를 들어, IRP 및/또는 IRC)의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 질환과 관련된 증상을 개선하는 방법이다. TLR7 및/또는 TLR9의 억제제 (예를 들어, IRP 및/또는 IRC)의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 발전을 방지하거나 지연시키는 방법이 또한 여기에 제공된다. 일부 구체예에서, 질환은 자가 면역 질환이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 SLE, 류마티스성 관절염, 피부근염, 및 쇼그렌 증후군을 포함한다. 일부 구체예에서, SLE의 증상을 억제하는데 효과적인 면역 조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역 조절 화합물은 TLR7 등급 또는 TLR9 등급 또는 TLR7/9 등급의 면역 조절 서열을 포함한다. 일부 변이에서, 질환은 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 경계면 피부염이다. 일부 구체예에서, 경계면 피부염은 피부근염, 피부 루푸스, 건선 (건선), 편평태선 (편평태선), 등이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 무균 염증성 질환, 예를 들어, 약물 유발 간 염증 및/또는 췌장 염증이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 염증성 간 질환이다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 64-78, SEQ ID NO: 123-135, 및 SEQ ID NO: 141-145로 구성된 그룹 중 하나이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 IRS이다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 IRS이다. IRP 중 어느 것의 일부 구체예에서, IRP는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 서열이다. IRP 중 어느 것의 일부 구체예에서, IRP는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및/또는 2'-0-Me 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 일부 구체예에서, IRP는 변형된 포스페이트 결합을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 구체예에서, IRP는 단지 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.
특정 구체예에서, 개인은 원하지 않는 면역 활성과 관련된 장애, 예를 들어, 알레르기성 질환 또는 질환, 또는 알레르기 및 천식으로 고통받는다. 알레르기성 질환 또는 질환에 걸린 개인은 기존의 알레르기성 질환 또는 천식의 인식 가능한 증상을 가진 개인이다. 여기에 설명된 방법 중 어느 것에서 IRS-함유 폴리뉴클레오티드는 면역 반응을 조절하기 위해 충분한 양으로 투여될 수도 있다. 여기에 설명된 바와 같이, 면역 반응의 조절은 체액성 및/또는 세포성일 수도 있고, 업계의 및 여기에 설명된 바와 같이 표준 기술을 사용하여 측정된다. 일부 구체예에서, 여기에 제공된 것은 TLR7 및/또는 TLR9 의존적인 세포 자극을 억제하고, 감소시키고, 및/또는 억제하는 방법이다.
여기에 제공된 다른 구체예는 바이러스에 노출되었거나 이에 감염되었던 개인의 면역 조절 치료와 관련된다. 바이러스에 노출되었거나 이에 감염되었던 개인에게 IRP 또는 IRC의 투여는 바이러스 유발 시토킨 생산의 억제를 일으킨다.
여기에 제공된 것은 인터페론 (IFN) 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준에 기초하여 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 치료를 위해 치료하고, 반응성을 평가하고, 개인을 확인하고, 및/또는 개인을 선택하는 방법이다. 또한 여기에 제공된 것은 인터페론 (IFN) 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준에 기초하여 IRP 및/또는 IRC의 유효량을 포함하는 치료를 위해 치료하고, 반응성을 평가하고, 개인을 확인하고, 및/또는 개인을 선택하는 방법이다.
본 발명은 개인에게 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 개인 (예를 들어, 사람)의 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 치료는 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준에 기초한다. 예를 들어, 개인 (예를 들어, 사람)의 질환을 치료하는 방법은 개인에게 IRP 및/IRC의 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 치료는 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준에 기초한다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나의 IRS이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 질환은 자가 면역 질환이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 SLE, 류마티스성 관절염, 피부근염, 및 쇼그렌 증후군을 포함한다. 일부 변이에서, 질환은 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 경계면 피부염이다. 일부 구체예에서, 경계면 피부염은 피부근염, 피부 루푸스, 건선, 편평태선, 등이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 무균 염증성 질환, 예를 들어, 약물 유발 간 염증 및/또는 췌장 염증이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 염증성 간 질환이다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 IRS이다.
여기에 제공된 것은 또한 (a) IFN 군 및/또는 시토킨의 고저차 수준을 갖는 개인을 선택하는 단계; 및 (b) 개인에게 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 치료하는 방법이다. 예를 들어, 질환을 치료하는 방법은 (a) IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준을 갖는 개인을 선택하는 단계; 및 (b) 선택된 개인에게 IRP 및/또는 IRC의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나의 IRS이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 질환은 자가 면역 질환이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 SLE, 류마티스성 관절염, 피부근염, 및 쇼그렌 증후군을 포함한다. 일부 변이에서, 질환은 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 경계면 피부염이다. 일부 구체예에서, 경계면 피부염은 피부근염, 피부 루푸스, 건선, 편평태선, 등이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 무균 염증성 질환, 예를 들어, 약물 유발 간 염증 및/또는 췌장 염증이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 염증성 간 질환이다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 IRS이다.
치료에 반응성에 반응할 가능성이 더 높은지 또는 더 낮은지를 나타내는 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준을 평가하는 단계를 포함하는, 질환에 걸린 개인이 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 치료에 반응할 가능성이 더 높은지 더 낮은지 평가하는 방법이 또한 여기에 제공된다. 예를 들어, 치료에 반응성에 반응할 가능성이 더 높은지 또는 더 낮은지를 나타내는 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준을 평가하는 단계를 포함하는, 질환에 걸린 개인이 IRP 및/또는 IRC의 유효량을 포함하는 치료에 반응할 가능성이 더 높은지 더 낮은지 평가하는 방법이 또한 여기에 제공된다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나의 IRS이다. 일부 구체예에서, 질환은 자가 면역 질환이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 SLE, 류마티스성 관절염, 피부근염, 및 쇼그렌 증후군을 포함한다. 일부 변이에서, 질환은 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 경계면 피부염이다. 일부 구체예에서, 경계면 피부염은 피부근염, 피부 루푸스, 건선, 편평태선, 등이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 무균 염증성 질환, 예를 들어, 약물 유발 간 염증 및/또는 췌장 염증이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 염증성 간 질환이다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 IRS이다.
개인이 치료에 반응할 가능성이 더 높은지 또는 이에 적합한지를 나타내는 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준을 평가하는 단계를 포함하는, 질환에 걸린 개인이 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 치료에 반응할 가능성이 더 높은지 또는 이에 적합한지의 평가를 지원하는 방법이 또한 여기에 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 질환은 자가 면역 질환이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 SLE, 류마티스성 관절염, 피부근염, 및 쇼그렌 증후군을 포함한다. 일부 변이에서, 질환은 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 경계면 피부염이다. 일부 구체예에서, 경계면 피부염은 피부근염, 피부 루푸스, 건선, 편평태선, 등이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 무균 염증성 질환, 예를 들어, 약물 유발 간 염증 및/또는 췌장 염증이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 염증성 간 질환이다. 일부 구체예에서, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제는 여기에 설명된 바와 같이 IRP 및/또는 IRC이다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID N0: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나의 IRS이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 IRS이다.
추가로, (A) IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준을 평가하는 단계; 및 다른 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준을 갖는 개인을 확인하는 단계를 포함하는, 질환에 걸린 개인이 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 치료에 반응할 가능성이 더 높은지 또는 더 낮은지 확인하는 방법이 여기에 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 질환은 자가 면역 질환이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 SLE, 류마티스성 관절염, 피부근염, 및 쇼그렌 증후군을 포함한다. 일부 변이에서, 질환은 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 경계면 피부염이다. 일부 구체예에서, 경계면 피부염은 피부근염, 피부 루푸스, 건선, 편평태선, 등이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 무균 염증성 질환, 예를 들어, 약물 유발 간 염증 및/또는 췌장 염증이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 염증성 간 질환이다. 일부 구체예에서, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제는 여기에 설명된 바와 같이 IRP 및/또는 IRC이다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나의 IRS이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 IRS이다.
추가로, (A) IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준을 평가하는 단계; 및 (B) 다른 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준을 갖는 개인을 선택하는 단계를 포함하는, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 치료에 적합할 가능성이 더 높거나 더 낮은 질환에 걸린 개인을 선택하거나 선택하지 않는 방법이 여기에 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 질환은 자가 면역 질환이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 SLE, 류마티스성 관절염, 피부근염, 및 쇼그렌 증후군을 포함한다. 일부 변이에서, 질환은 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 경계면 피부염이다. 일부 구체예에서, 경계면 피부염은 피부근염, 피부 루푸스, 건선, 편평태선, 등이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 무균 염증성 질환, 예를 들어, 약물 유발 간 염증 및/또는 췌장 염증이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 염증성 간 질환이다. 일부 구체예에서, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제는 여기에 설명된 바와 같이 IRP 및/또는 IRC이다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나의 IRS이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 IRS이다.
IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준을 평가하는 단계를 포함하는, 질환에 걸린 개인이 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 치료에 적합할 가능성이 더 높은지 또는 더 낮은지 결정하는 방법이 여기에 제공된다. 일부 구체예에서, 방법은 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 질환은 자가 면역 질환이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 SLE, 류마티스성 관절염, 피부근염, 및 쇼그렌 증후군을 포함한다. 일부 변이에서, 질환은 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 경계면 피부염이다. 일부 구체예에서, 경계면 피부염은 피부근염, 피부 루푸스, 건선, 편평태선, 등이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 무균 염증성 질환, 예를 들어, 약물 유발 간 염증 및/또는 췌장 염증이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 염증성 간 질환이다. 일부 구체예에서, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제는 여기에 설명된 바와 같이 IRP 및/또는 IRC이다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나의 IRS이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 IRS이다.
본 발명은 개인에게 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 개인 (예를 들어, 사람)의 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 치료 반응 또는 치료 반응의 결핍은 샘플의 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준에 의해 나타난다. 일부 구체예에서, 질환은 자가 면역 질환이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 SLE, 류마티스성 관절염, 피부근염, 및 쇼그렌 증후군을 포함한다. 일부 변이에서, 질환은 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 경계면 피부염이다. 일부 구체예에서, 경계면 피부염은 피부근염, 피부 루푸스, 건선, 편평태선, 등이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 무균 염증성 질환, 예를 들어, 약물 유발 간 염증 및/또는 췌장 염증이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 염증성 간 질환이다. 일부 구체예에서, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제는 여기에 설명된 바와 같이 IRP 및/또는 IRC이다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나의 IRS이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 IRS이다.
본 발명은 또한 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 질환 치료에 대한 개인의 반응성 또는 반응성의 결핍을 평가하는 방법을 제공하며, 반응성 또는 반응성의 결핍은 샘플의 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준에 의해 나타난다. 일부 구체예에서, 방법은 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 질환은 자가 면역 질환이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 SLE, 류마티스성 관절염, 피부근염, 및 쇼그렌 증후군을 포함한다. 일부 변이에서, 질환은 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 경계면 피부염이다. 일부 구체예에서, 경계면 피부염은 피부근염, 피부 루푸스, 건선, 편평태선, 등이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 무균 염증성 질환, 예를 들어, 약물 유발 간 염증 및/또는 췌장 염증이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 염증성 간 질환이다. 일부 구체예에서, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제는 여기에 설명된 바와 같이 IRP 및/또는 IRC이다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나의 IRS이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 IRS이다.
본 발명은 또한 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 질환 치료에 대한 개인의 반응성 또는 반응성의 결핍을 관찰하는 방법을 제공하며, 반응성 또는 반응성의 결핍은 샘플의 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준에 의해 나타난다. 일부 구체예에서, 방법은 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 질환은 자가 면역 질환이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 SLE, 류마티스성 관절염, 피부근염, 및 쇼그렌 증후군을 포함한다. 일부 변이에서, 질환은 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 경계면 피부염이다. 일부 구체예에서, 경계면 피부염은 피부근염, 피부 루푸스, 건선, 편평태선, 등이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 무균 염증성 질환, 예를 들어, 약물 유발 간 염증 및/또는 췌장 염증이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 염증성 간 질환이다. 일부 구체예에서, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제는 여기에 설명된 바와 같이 IRP 및/또는 IRC이다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나의 IRS이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 IRS이다.
또한 여기에 제공된 것은 샘플의 IFN 군 및/또는 염증성 시토킨의 고저차 수준에 기초하여 계속해서 질환 치료를 받기 위해 적합할 가능성이 더 크거나 계속해서 치료를 받기 위해 적합할 가능성이 더 작은지로 개인을 확인하는 방법이며, 치료는 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함한다. 일부 구체예에서, 질환은 자가 면역 질환이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 SLE, 류마티스성 관절염, 피부근염, 및 쇼그렌 증후군을 포함한다. 일부 변이에서, 질환은 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 경계면 피부염이다. 일부 구체예에서, 경계면 피부염은 피부근염, 피부 루푸스, 건선, 편평태선, 등이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 무균 염증성 질환, 예를 들어, 약물 유발 간 염증 및/또는 췌장 염증이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 염증성 간 질환이다. 일부 구체예에서, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제는 여기에 설명된 바와 같이 IRP 및/또는 IRC이다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나의 IRS이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 또는 SEQ ID NO: 144의 IRS이다.
상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, 반응성일 가능성이 더 높은지 또는 치료에 적합할 가능성이 더 높은지는 샘플의 IFN 군와 참고 IFN 군의 연관성에 의해 나타난다. 일부 구체예에서, 반응성일 가능성이 더 낮은지 또는 적합할 가능성이 더 낮은지는 샘플의 IFN 군와 참고 IFN 군의 연관성의 결핍에 의해 나타난다.
상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, 반응성은 샘플의 IFN 군와 참고 IFN 군의 연관성에 의해 나타난다. 일부 구체예에서, 비반응성은 샘플의 IFN 군와 참고 IFN 군의 연관성의 결핍에 의해 나타난다. 일부 구체예에서, 반응성은 샘플의 IFN 군의 변화에 의해 나타난다. 일부 구체예에서, 반응성의 결핍은 샘플의 IFN 군의 불충분한 변화에 의해 나타난다.
상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, IFN 군는 참고와 비교하여 샘플에서 다른 IFN 군이다. 일부 구체예에서, IFN 군는 참고 IFN 군보다 더 높다. 일부 구체예에서, IFN 군는 참고 IFN 군보다 더 낮다. 일부 구체예에서, 참고 IFN 군는 Chaussabel et al. Immunity 29: 150-164 (2008), Bennett et al. J. Exp. Med. 197(6): 711-723 (2003), 또는 Baechler EC et al., PNAS 100(5): 2610-5 (2003)에 설명된 바와 같은 IFN 군이고, 이것은 전문이 참고로 포함된다. 일부 구체예에서, 다른 IFN 군는 참고와 비교하여 샘플에서 IFN 군의 하나 이상의 생체 마커의 고저차 수준을 포함한다. 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, IFN 군는 타입 I IFN 군이다.
IFN 군는 BATF2, CMPK2, CXCL10, DDX60, EPSTI1, HERC5, HES4, IFI44, IFI44L, IFITl, IFIT3, IFITM3, ISG15, LAMP3, LOC26010, LY6E, MX1, OAS1, OAS2, OAS3, OAS1, OTOF, RSAD2, RTP4, SERPING1, TRIM6, XAF1, c102h05 5, Agencourt-7914287 NIH-MCG_71, ISG20, IFI16, IRF7, 및 AIM2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생체 마커의 발현 수준의 평가를 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 고저차 수준은 참고와 비교하여 BATF2, CMPK2, DDX60, EPSTI1, HERC5, HES4, IFI44, IFI44L, IFITl, IFIT3, IFITM3, ISG15, LAMP3, LOC26010, MX1, OAS1, OAS2, OAS3, OAS1, OTOF, RSAD2, RTP4, SERPING1, TRIM6, XAF1, c102h05 5, Agencourt-7914287 NIH-MCG_71, ISG20, IRF7, 및 AIM2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생체 마커의 고저차 수준이다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 생체 마커의 발현 수준은 참고와 비교하여 고저차 수준이다. 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, IFN 군는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 15개의 생체 마커 중 약 어느 것의 발현 수준을 평가하는 것을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 생체 마커는, 예를 들어, 적어도 둘 이상의 생체 마커, 적어도 셋 이상의 생체 마커, 적어도 넷 이상의 생체 마커, 적어도 다섯 이상의 생체 마커, 적어도 열 이상의 생체 마커, 또는 적어도 열다섯 이상의 생체 마커를 포함한다.
상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, IFN 군는 BATF2, CMPK2, CXCL10, DDX60, EPSTI1, HERC5, HES4, IFI44, IFI44L, IFITl, IFIT3, IFITM3, ISG15, LAMP3, LOC26010, LY6E, MX1, OAS1, OAS2, OAS3, OAS1, OTOF, RSAD2, RTP4, SERPING1, TRIM6, XAF1, c102h05 5, Agencourt-7914287 NIH-MCG_71, ISG20, IFI16, IRF7, 및 AIM2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생체 마커의 고저차 수준을 포함한다. 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, 고저차 수준은 참고와 비교하여 BATF2, CMPK2, CXCL10, DDX60, EPSTI1, HERC5, HES4, IFI44, IFI44L, IFITl, IFIT3, IFITM3, ISG15, LAMP3, LOC26010, LY6E, MX1, OAS1, OAS2, OAS3, OAS1, OTOF, RSAD2, RTP4, SERPING1, TRIM6, XAF1, c102h05 5, Agencourt-7914287 NIH-MCG_71, ISG20, IFI16, IRF7, 및 AIM2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생체 마커의 높은 고저차 수준이다.
상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, 참고와 비교하여 높은 발현 수준은 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 치료에 반응할 가능성이 더 높거나 이에 적합할 가능성이 더 높다는 것을 나타낼 수도 있다. 예를 들어, 개인은 고저차 수준이 참고와 비교하여 BATF2, CMPK2, CXCL10, DDX60, EPSTI1, HERC5, HES4, IFI44, IFI44L, IFIT1, IFIT3, IFITM3, ISG15, LAMP3, LOC26010, LY6E, MX1, OAS1, OAS2, OAS3, OAS1, OTOF, RSAD2, RTP4, SERPING1, TRIM6, XAF1, c102h05 5, Agencourt-7914287 NIH-MCG_71, ISG20, IFI16, IRF7, 및 AIM2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생체 마커의 높은 수준인 경우 치료를 위해 선택될 수도 있다. 게다가, 개인은 고저차 수준이 참고와 비교하여 BATF2, CMPK2, CXCL10, DDX60, EPSTI1, HERC5, HES4, IFI44, IFI44L, IFIT1, IFIT3, IFITM3, ISG15, LAMP3, LOC26010, LY6E, MX1, OAS1, OAS2, OAS3, OAS1, OTOF, RSAD2, RTP4, SERPING1, TRIM6, XAF1, c102h05 5, Agencourt-7914287 NIH-MCG_71, ISG20, IFI16, IRF7, 및 AIM2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생체 마커의 높은 수준인 경우 치료를 계속하지 않기 위해 선택될 수도 있다.
일부 구체예에서, 참고와 비교하여 낮은 발현 수준은 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 치료에 반응할 가능성이 더 낮거나 이에 적합할 가능성이 더 낮다는 것을 나타낼 수도 있다.
일부 구체예에서, 염증성 시토킨의 고저차 수준은, 대조군 샘플과 비교하여, IL-1알파, IL-1베타, TNF-알파, IL-6, IL-17, IFN-알파, IFN-오메가, IFN-람다1, IFN-람다2, 및 IP-10으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 염증성 시토킨 마커의 샘플의 고저차 수준을 포함한다.
상기 설명된 방법 중 어느 것의 다른 수준은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 15개 또는 모든 마커의 약 어느 것의 고저차 수준일 수도 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 생체 마커는, 예를 들어, 적어도 둘 이상의 생체 마커, 적어도 셋 이상의 생체 마커, 적어도 넷 이상의 생체 마커, 적어도 다섯 이상의 생체 마커, 적어도 열 이상의 생체 마커, 또는 적어도 열다섯 이상의 생체 마커를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 생체 마커는 CXCL10, LY6E, 및/또는 IFI16를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 고저차 수준은 개인에서 및 참고와 비교하여 원하는 유전자의 발현 수준 (예를 들어, 주어진 환자 집단에 대한 중간 발현 수준 또는 두 번째 개인의 발현 수준)을 측정함으로써 결정된다. 예를 들어, 단일 개인을 위한 원하는 유전자의 발현 수준이 환자 집단의 중간 발현 수준 이상인 것으로 결정되면, 그 개인은 원하는 유전자의 높은 발현을 갖는 것으로 결정된다. 대안으로, 단일 개인을 위한 원하는 유전자의 발현 수준이 환자 집단의 중간 발현 수준 이하인 것으로 결정되면, 그 개인은 원하는 유전자의 낮은 발현을 갖는 것으로 결정된다. 일부 구체예에서, 개인은 질환을 갖고 환자 집단 또는 두 번째 개인은 질환을 갖지 않는다 (즉, 정상). 일부 구체예에서, 개인은 질환을 갖고 환자 집단 또는 두 번째 개인은 질환을 갖는다. 일부 구체예에서, 개인은 치료에 대하여 반응성인 두 번째 개인 및/또는 환자 집단과 비교된다. 일부 구체예에서, 개인은 치료에 대하여 반응성인 두 번째 개인 및/또는 환자 집단과 비교된다.
차등 세포의 맥락에 사용된 바와 같이, 차등 유전자 군, 핵산, 또는 단백질은 참고와 비교되는 차이를 나타낸다 (예를 들어, 참고와 비교되는 세포 또는 세포 타입의 차등 생산, 유전자의 차등 카피 수, 유전자로부터 전사된 mRNA의 차등 생산, 또는 mRNA에 의해 암호화된 단백질 생성물). 유전자의 차등 발현은 참고와 비교된 바와 같이, 과발현되거나 (높은 발현) 저발현될 수도 있다 (낮은 발현) (예를 들어, 정상 세포, 대조군 세포, 생물학적 샘플, 주어진 환자 집단 또는 내부 대조군 유전자를 가진 환자).
고저차 수준은 개인의 하나 이상의 샘플에서 하나 이상의 마커의 발현 수준을 평가함으로써 평가될 수도 있다. 샘플의 발현 프로파일은 참고 (예를 들어, 참고 샘플)의 발현 수준과 비교될 수도 있다. 일부 구체예에서, 샘플은 조직 샘플 또는 혈액 샘플 (백혈구)를 함유하는 샘플이다. 샘플의 발현 프로파일은 사전 한정된 유전자 세트에 대하여 참고 (예를 들어, 참고 샘플)의 수준의 발현과 비교될 수도 있다. 참조예, Chaussabel et al. Immunity 29: 150-164 (2008), Bennett et al. J. Exp. Med. 197(6): 711-723 (2003), 또는 Baechler EC et al., PNAS 100(5): 2610-5 (2003). 유전자 세트 농축 분석 (GSEA)은 유전자 발현 데이터를 유전자 세트-발현 프로파일 (군)로 전환하기 위해 사용될 수도 있다.
일부 구체예에서, 유전자 세트 농축 분석 (GSEA)은 i) 선택된 표현형과 그들의 연관성에 기초하여, 데이터 세트, 예를 들어, DNA 미크로어레이 분석의 유전자 발현 프로파일의 유전자의 순위를 매김으로써; ii) 유전자 세트의 모든 멤버를 확인함으로써; 및 iii) 관찰된 순위 사이의 차이 및 주어진 임의적인 분포로 예상되는 것들을 나타내는 표준화된 농축 점수 (NES)일 수 있는, 농축 점수 (ES)를 계산함으로써 수행된다. ES/NES를 계산한 후, 방법은 샘플 라벨을 임의로 추출하고 임의의 분포에 기초하여 유전자 세트에 대한 ES/NES를 계산한다. 이 과정은 임의로 추출된 ES 점수의 분포를 생성하기 위해 다양한 번 반복된다. 임의로 추출된 ES/NES 점수를 크게 능가하는 관찰된 ES/NES 점수는 유의하다고 고려되기 때문에, 주어진 유전자 세트는 특정 생물학적 표현형을 갖는 세포 사이에서 해지된다, 즉, 상향 또는 하향 조절되거나 별도로 발현된다는 것을 나타낸다. GSEA를 수행하기 위한 소프트웨어는 broad.mit.edu/gsea/msigdb/index.jsp에서 웹상에서 온라인으로 무료로 이용 가능하다.
많은 또 다른 생물 정보학적 접근법이 유전자 발현 프로파일 데이터를 사용하여 유전자 세트 발현 프로파일을 평가하기 위하여 개발되었다. 방법은 Segal, E. et al. Nat. Genet. 34: 66-176 (2003); Segal, E. et al. Nat. Genet. 36: 1090-1098 (2004); Barry, W. T. et al. Bioinformatics 21: 1943-1949 (2005); Tian, L. et al. Proc Nat'l Acad Sci USA 102: 13544-13549 (2005); Novak B A 및 Jain A N. Bioinformatics 22: 233-41 (2006); Maglietta R et al. Bioinformatics 23: 2063-72 (2007); Bussemaker H J, BMC Bioinformatics 8 Suppl 6: S6 (2007)에 설명된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구체예에서, 샘플에서 원하는 마커의 발현 수준 및/또는 고저차 수준은 참고의 발현 수준보다 약 1. 25X, 1. 5X, 1. 75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 또는 100X 더 높거나 더 낮은 것 중 어느 것보다 더 크다. 일부 구체예에서, 샘플의 발현 수준 및/또는 고저차 수준은 참고의 발현 수준보다 약 1. 25X 내지 100X, 1. 25X 내지 50X, 1. 5X 내지 100X, 1. 5X 내지 50X, 2X 내지 100X, 2X 내지 50X, 1. 25X 내지 10X, 1. 5X 내지 10X, 2X 내지 10X 더 높거나 낮은 것 중 어느 것이다. 일부 구체예에서, 대상체 (예를 들어, 치료를 위해 선택된 개인, 치료에 반응할 가능성이 큰 것으로 확인된 개인, 또는 치료에 반응성으로 확인된 개인)의 샘플에서 마커의 발현 수준은 정상 대상체의 참고 샘플의 발현 수준보다 적어도 1. 25X, 1. 5X, 1. 75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 또는 100X 더 높다.
또 다른 구체예에서, 샘플의 원하는 마커의 발현 수준은 참고의 발현 수준과 비교하여, 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%까지 감소되거나 증가될 수도 있다.
일부 구체예에서, 마커는 샘플 대 참고의 통계적으로 유의한 고저차 수준으로 발현되고, 저발현되거나 과발현된다. 일부 구체예에서, 통계적 유의성은 0.1 이하, 0.05 이하, 또는 0.01 이하의 p-값으로 결정된다. 일부 구체예에서, p-값은 약 0.01 내지 0.05 또는 0.01 내지 0.1 중 어느 것이다. 일부 구체예에서, p-값은 다양한 비교를 위해 보정된다. 일부 구체예에서, 다양한 비교는 본페로니 보정 (Bonferroni correction)을 사용하여 보정된다. 일부 구체예에서, p-값은 당업자에 잘 알려진 순열 접근을 사용하여 결정된다. 순열 테스트는 임의 추출 테스트, 재임의 추출 테스트, 정확 테스트, 잭나이프 (jackknife), 부트스트랩 (bootstrap) 및 다른 리샘플링 계획을 포함한다. 일부 구체예에서, 임계치 기준은 상관값을 포함한다. 일부 구체예에서, 상관값은 r이다. 일부 구체예에서, r은 약 0.95, 0.90, 0.85, 0.80, 0.75, 0.70, 0.65, 0.60, 0.55, 0.50, 0.45, 0.40, 0.35, 0.30 또는 0.25 중 어느 것보다 크거나 이와 같다.
발현 수준은 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준으로 측정될 수도 있다. 일부 구체예에서, 마커 유전자의 측정된 발현 수준은 표준화된다. 예를 들어, 다른 샘플들 중에서 변하지 않는 (또는 유의하게 변하지 않는) 발현 수준은 유전자에 대하여 표준화된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 하우스키핑 유전자 (활성이 세포의 기능을 유지하기 위하여 필수적인 단백질을 암호화하는 유전자)의 발현 수준이 표준화를 위해 사용된다. 이 유전자들은 전형적으로 모든 세포에서 유사하게 발현된다. 하우스키핑 유전자는 리보솜 단백질 L19 (NP_000972), UBC (유비퀴틴 C), 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 (GAPDH), Cypl, 알부민, 액틴 (예를 들어, β-액틴), 튜불린, 시클로필린, 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제 (HRPT), 리보솜 단백질 L32 (NP_001007075), 및 리보솜 단백질/유전자 28S (예를 들어, Q9Y399) 및 18S를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
고저차 발현 및/또는 발현 수준은 치료를 시작하는 시점에 또는 치료 중의 시점에 결정될 수도 있다. 일부 구체예에서, "치료를 시작하는 시점" 또는 "베이스라인"은 치료 전 약 6개월, 3개월, 2개월, 1개월, 또는 며칠 중 어느 것이다. 일부 구체예에서, "치료를 시작하는 시점"은 치료에 첫 번째 노출 직전이거나 이와 일치한다.
치료하고, 반응성을 평가하고, 개인을 확인하고, 및/또는 치료를 위해 개인을 선택하는 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, 질환은 자가 면역 질환이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 장막염 (serositis; 능막염 (pleuritis) 또는 심막염 (pericarditis)), 입 궤양 (oral ulcer; 입 또는 비인두 궤양을 포함), 관절염 (둘 이상의 말초 관절의 비부식성 관절염), 감광성, 혈액-혈액학적 장애, 저보체혈증 (hypocomplementemia), 신장병, 항핵 항체 테스트 양성, 면역학적 장애, 신경 장애 (발작 또는 정신병), 뺨의 발진 (malar rash), 또는 원반상 발진 (discoid rash)을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 피부, 근육 조직, 및/또는 결합 조직과 관련된다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 피부, 근육 조직, 및/또는 결합 조직 증상에 의해 개인에서 입증되지 않는다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 전신성이다.
자가 면역 질환은 제한 없이, 류마티스성 관절염 (RA), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 타입 I 진성 당뇨병, 타입 II 진성 당뇨병, 다발성 경화증 (MS), 폐경과 같은 면역-매개 불임, 전신성 경화증, 쇼그렌 질환, 백반 (vitiligo), 탈모증 (alopecia; 대머리), 다선성 부전 (polyglandular failure), 그레이브 병 (Grave's disease), 갑상선 기능 저하증 (hypothyroidism), 다발성 근염, 심상성 천포창 (pemphigus vulgaris), 낙엽성 천포창 (pemphigus foliaceus), 크론 병 및 궤양성 대장염을 포함하는 염증성 장질환, B형 간염 바이러스 (HBV) 및 C형 간염 바이러스 (HCV)와 관련된 것을 포함하는 자가 면역 간염, 뇌하수체 기능 저하증 (hypopituitarism), 이식편대숙주병 (graft-versus-host disease; GvHD), 심근염 (myocarditis), 애디슨 병 (Addison's disease), 자가 면역 피부 질환, 포도막염 (uveitis), 악성 빈혈 (pernicious anemia), 및 부갑상선 기능 저하증 (hypoparathyroidism)을 포함한다.
자가 면역 질환은 또한 제한 없이, 하시모토 갑상선염 (Hashimoto's thyroiditis), 타입 I 및 타입 II 자가 면역 다선성 증후군, 부종양성 천포창 (paraneoplastic pemphigus), 유사 천포창 (bullus pemphigoid), 포진성 피부염 (dermatitis herpetiformis), 선형 IgA 질환 (linear IgA disease), 후천성 표피 수포증 (epidermolysis bullosa acquisita), 결절홍반 (erythema nodosa), 천포창양 임신 (pemphigoid gestationis), 반흔성 유천포창 (cicatricial pemphigoid), 혼합 원발성 한랭글로불린혈증 (mixed essential cryoglobulinemia), 소아 만성 수포성 질환 (chronic bullous disease of childhood), 용혈성 빈혈 (hemolytic anemia), 혈소판 감소성 자반병 (thrombocytopenic purpura), 구드파스튜어 증후군 (Goodpasture's syndrome), 자가 면역 백혈구 감소증, 중증 근무력증 (myasthenia gravis), 이튼-램버트 근무력 증후군 (Eaton-Lambert myasthenic syndrome), 강직-인간 증후군 (stiff-man syndrome), 급성 파종성 뇌척수염 (acute disseminated encephalomyelitis), 길뱅-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증 (chronic inflammatory demyelinating 폴리radiculoneuropathy), 전도 차단을 동반한 다초점 운동 신경병증 (multifocal motor neuropathy with conduction block), 단세포군 감마병을 동반한 만성 신경병증 (chronic neuropathy with monoclonal gammopathy), 안구간대경련-근간대경련 증후군 (opsonoclonus-myoclonus syndrome), 소뇌 변성 (cerebellar degeneration), 뇌척수염 (encephalomyelitis), 망막병증 (retinopathy), 원발성 담즙성 경화증 (primary biliary sclerosis), 경화성 담관염 (sclerosing cholangitis), 글루텐-과민성 장질환 (gluten-sensitive enteropathy), 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis), 반응성 관절염 (reactive arthritides), 다발성 근염/피부근염, 혼합 결합 조직 질환 (mixed connective tissue disease), 베체트 증후군 (Bechet's syndrome), 건선, 결절성 다발성 동맥염 (폴리arteritis nodosa), 알레르기성 맥관염 (allergic anguitis) 및 육아종증 (granulomatosis; 처그-스트라우스 병 (Churg-Strauss disease)), 다발성 혈관염 중복 증후군 (폴리angiitis overlap syndrome), 과민성 혈관염 (hypersensitivity vasculitis), 베게너 육아종증 (Wegener's granulomatosis), 측두 동맥염 (temporal arteritis), 타카야수 동맥염 (Takayasu's arteritis), 가와사키 병 (Kawasaki's disease), 고립 중추신경계 혈관염 (isolated vasculitis of the central nervous system), 폐색성 혈전 혈관염 (thromboangiutis obliterans), 유육종증 (sarcoidosis), 사구체신염 (glomerulonephritis), 및 한랭병증 (cryopathy)을 포함한다. 이 질환들은 의료 업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th ed., Fauci A S et al., eds., New York: McGraw-Hill, 1998에 설명된다.
전신 질환 SLE는 거의 모든 세포에 풍부한 항원에 대한 항체, 예를 들어, 항-크로마틴 항체, 항-스플라이세소솜 항체, 항-리보솜 항체 및 항-DNA 항체의 존재를 특징으로 한다. 결론적으로, SLE의 효과는 다양한 조직, 예를 들어, 피부 및 신장에서 볼 수 있다. 자동 반응성 T 세포는 또한 SLE의 역할을 한다. 예를 들어, 쥐 루푸스 모델의 연구는 비-DNA 뉴클레오솜 항원, 예를 들어, 히스톤은 항-DNA를 생산하는 B 세포를 유도할 수 있는 자동 반응성 T 세포를 자극한다. IFN-α의 증가된 혈청 수준은 SLE 환자에서 관찰되었고 열병 및 피부 발진을 포함하는 질환 활성 및 심각성 모두, 뿐만 아니라 질환 과정과 관련된 필수적인 마커 (예를 들어, 항-dsDNA 항체 적정)와 관련된다는 것을 나타내었다.
일부 경우에, 자동 항원에 대한 말초 내성은 손실되고 (또는 파괴되고) 자가 면역 반응이 일어난다. 예를 들어, EAE에 대한 동물 모델에서, 면역 수용체 TLR9 또는 TLR4를 통한 항원 표출 세포 (APC)의 활성화는 자체 내성을 파괴하고 EAE의 유발을 일으킨다는 것이 나타났다 (Waldner et al. (2004) J. Clin. Invest. 113: 990-997).
치료하고, 반응성을 평가하고, 개인을 확인하고, 및/또는 치료를 위해 개인을 선택하는 특정 구체예에서, 개인은 자가 면역 질환에 걸릴 위험에 있다. 자가 면역 질환에 걸릴 위험에 있는 개인은, 예를 들어, 자가 면역 질환에 대한 유전적 또는 다른 성향의 것들을 포함한다. 사람에서, 특정 자가 면역 질환에 대한 민감도는 특정 MHC 등급 II 대립 유전자와 가장 강하게 결합되는 일부를 가진 HLA 타입 및 특정 MHC 등급 I 대립 유전자를 가진 다른 것들과 관련된다. 예를 들어, 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis), 급성 전안방성 포도막염 (acute anterior uveitis), 및 소아 류마티스성 관절염은 HLA-B27와 관련되고, 구드파스튜어 증후군 및 MS는 HLA-DR2와 관련되고, 그레이브 병, 중증 근무력증 및 SLE은 HLA-DR3와 관련되고, 류마티스성 관절염 및 심상성 천포창은 HLA-DR4와 관련되고 하시모토 갑상선염은 HLA-DR5와 관련된다. 자가 면역 질환에 대한 다른 유전적 성향은 업계에 알려져 있고 개인은 업계에 잘 알려진 검정 및 방법에 의해 이러한 성향의 존재에 대하여 조사될 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 자가 면역에 걸릴 위험에 있는 개인이 확인될 수 있다.
치료하고, 반응성을 평가하고, 개인을 확인하고, 및/또는 치료를 위해 개인을 선택하는 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, TLR7 및/또는 TLR9 억제제 (예를 들어, IRP 또는 IRC)는 자가 면역 질환을 지연시키거나 방지하기 위해 유효량이 투여된다. 치료하고, 반응성을 평가하고, 개인을 확인하고, 및/또는 치료를 위해 개인을 선택하는 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, TLR7 및/또는 TLR9 억제제 (예를 들어, IRP 또는 IRC)는 SLE 및 류마티스성 관절염을 포함하는, 자가 면역 질환의 하나 이상의 증상을 억제하기 위해 유효량이 투여된다. 일부 구체예에서, 치료와 조합으로 사용된 TLR7 및/또는 TLR9 억제제 (예를 들어, IRP 또는 IRC)는 개인을 치료하기 위해 필요한 및/또는 투여되는 코르티코스테로이드의 양 (투여량)을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 코르티코스테로이드의 양 (투여량)은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50% 중 어느 것으로 감소된다.
치료하고, 반응성을 평가하고, 개인을 확인하고, 및/또는 치료를 위해 개인을 선택하는 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, 질환은 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 무균 염증성 질환이다. 참조예, Imaeda AB et al. J Clin Invest. 119(2): 305-14 (2009), 이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 만성 염증성 질환이다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 염증성 간 질환이다. 일부 구체예에서, 억제되고 및/또는 억제되는 염증 반응은 약물 유발 염증이다. 일부 구체예에서, 약물 유발 염증은 간의 약물 유발 염증이다. 일부 구체예에서, 억제되고 및/또는 억제되는 염증 반응은 감염-유발된 염증이다. 일부 구체예에서, 장애는 염증성 간 질환이거나 염증성 췌장 장애이다. 염증성 간 장애의 예는, 예를 들어, 리갈락토스혈증 (ligalactosemia), 알라질 증후군 (AlAGI lle's syndrome), 알파 1-항트립신 결핍, 신생아 간염 (neonatal hepatitis), 티로신혈증 (tyrosinemia), 출혈성 모세혈관 확장증 (hemorrhAGI c telangiectasia), 라이 증후군 (Reye's syndrome), 윌슨 병 (Wilson's disease), 지중해빈혈 (thalassemia), 담도 폐쇄증 (biliary atresia), A형 간염, B형 간염, 또는 C형 간염과 같은 만성 활성 간염, 간암, 간경변 (cirrhosis), 타입 I 당원병 (glycogen storage disease), 포르피린증 (porphyria), 혈색소침착증 (hemochromatosis), 원발성 경화성 담관염 (primary sclerosing cholangitis), 유유육종증, 담석 (gallstones), 지방간 질환, 알콜성 간염, 또는 알콜성 간경변을 포함한다. 염증성 췌장 장애의 예는, 예를 들어, 췌장염 또는 췌장암을 포함한다.
IRP의 투여는 염증 반응의 감소를 일으킬 수도 있는 시토킨과 관련된 하나 이상의 면역 반응의 수준을 감소시키는 면역 조정을 일으킨다. 설명된 장애와 관련된 원하지 않는 면역 반응을 가진 개인의 면역 조절은 장애의 하나 이상의 증상에서 감소 또는 향상을 일으킨다.
치료하고, 반응성을 평가하고, 개인을 확인하고, 및/또는 치료를 위해 개인을 선택하는 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, 질환은 만성 병원성 자극과 관련된다. 일부 구체예에서, 질환은 만성 병원성 감염 또는 질환이다. 일부 변이에서, 면역 조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역 조절 화합물의 투여는 개인의 말라리아 및 만성 바이러스성 감염과 관련된 것들을 포함하는 만성 병원성 자극을 억제한다.
치료하고, 반응성을 평가하고, 개인을 확인하고, 및/또는 치료를 위해 개인을 선택하는 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, 방법은 염증성 질환 또는 장애에 걸린 개인에게 여기에 설명된 면역 조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역 조절 화합물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 조절 폴리뉴클레오티드의 투여는 염증성 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 개선한다.
치료하고, 반응성을 평가하고, 질환의 발전을 방지하고 및/또는 지연시키는 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, 방법은 병용 요법을 포함한다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환에 걸린 개인에게 여기에 설명된 TLR7 및/또는 TLR9 억제제 (예를 들어, IRP 또는 IRC) 및 다른 치료제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법은 자가 면역 질환의 하나 이상의 증상을 개선하기 위하여 제공된다. 일부 변이에서, 다른 치료제는 코르티코스테로이드이다. 일부 변이에서, 조합의 투여는 SLE 및 류마티스성 관절염을 포함하는 자가 면역 질환의 하나 이상의 증상을 개선한다. 일부 변이에서, SLE의 증상을 억제하기 위해 효과적인 병용 요법으로 사용된 면역 조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역 조절 화합물은 TLR7 등급 또는 TLR9 등급 또는 TLR7/9 등급의 면역 조절 서열을 포함한다.
치료하고, 반응성을 평가하고, 질환의 발전을 방지하고 및/또는 지연시키는 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, 방법은 자가 면역 질환에 걸릴 위험에 있는 개인에게 TLR7 및/또는 TLR9 억제제 (예를 들어, IRP 또는 IRC) 및 또 다른 치료제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 변이에서, 다른 치료제는 코르티코스테로이드이다. 일부 변이에서, 조합의 투여는 SLE 및 류마티스성 관절염을 포함하는 자가 면역 질환의 하나 이상의 증상의 발전을 방지하거나 지연시킨다. 일부 구체예에서, 병용 요법으로 사용된 TLR7 및/또는 TLR9 억제제 (예를 들어, IRP 또는 IRC)는 개인을 치료하기 위해 필요한 및/또는 투여되는 코르티코스테로이드의 양 (투여량)을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 코르티코스테로이드의 양 (투여량)은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75% 또는 100%로 감소된다.
치료하고, 반응성을 평가하고, 질환의 발전을 방지하고 및/또는 지연시키는 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, TLR7의 억제제 및/또는 TLR9의 억제제는 IRP 및/또는 IRC이며, 이것은 IRS를 포함한다. 치료하고 반응성을 평가하는 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, 방법은 질환의 발전을 방지하거나 지연시키기 위해 제공되고, TLR7의 억제제 및/또는 TLR9의 억제제는 구조 5'-Nm-N3N2N1CGN1N2N3-Nm-3'을 갖는 면역 조절 올리고뉴클레오티드이고, CG는 CpG, C*pG, C*pG*, 또는 CpG*인 올리고뉴클레오티드 모티프이고, C는 시토신이고, C*는 피리미딘 뉴클레오티드 유도체이고, G는 구아노신이고, G*는 퓨린 뉴클레오티드 유도체이다; N1은 뉴클레오티드 유도체 또는 올리고뉴클레오티드 모티프의 활성을 억제하는 비-뉴클레오티드 결합 변이이고, 각각의 발생시 N2-N3는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유도체, 또는 올리고뉴클레오티드 모티프의 활성을 억제하는 비-뉴클레오티드 결합 변이이고, 각각의 발생시 N 1 -N 3 는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체이고, 각각의 발생시N m 및 Nm는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유도체, 또는 비-뉴클레오티드 결합이다. 일부 구체예에서, 3' 말단에서 또는 기능화된 당 또는 기능화된 핵염기에 의해 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드와 결합되는 비뉴클레오티드 결합자는 글리세롤 (1,2,3-프로판트리올), 1,2,4,부탄트리올, 2(히드록시메틸)-1,3-프로판디올, 2-(히드록시메틸)-1,4-부탄디올, 1,3,5-펜탄트리올, 1,1,1트리스(히드록시메틸)에탄, 1,1,1-트리스(히드록시메틸)니트로메탄, 1,1,1트리스(히드록시메틸)프로판, 1,2,6-헥산트리올, 3-메틸-1,3,5-펜탄트리올, 1,2,3-헵탄트리올, 2-아미노-2-(히드록시메틸)-1,3-프로판디올, N-[트리스(히드록시메틸)메틸]아크릴아미드, 씨스1,3,5-시클로헥산트리올, 씨스-1,3,5-트리(히드록시메틸)시클로헥산, 3,5디(히드록시메틸)페놀, 1,3,5-트리히드록실-벤젠, 3,5-디(히드록시메틸)벤젠, 1,3디(히드록시에톡시)-2-히드록실-프로판, 1,3-디(히드록시프로폭시)-2-히드록실-프로판, 2데옥시-D-리보스, 1,2,4-트리히드록실-벤젠, D-갈락토알, 1,6-안히드로-~-D-글루코스, 1,3,5트리스(2-히드록시에틸)-시아누르산, 갈산, 3,5,7-트리히드록시플라본, 4,6-니트로피로갈롤, 에틸렌 글리콜, 1,3-프로판디올, 1,2-프로판디올, 1,4-부탄디올, 1,3-부탄디올, 2,3부탄디올, 1,4-부탄디올, 1,5-펜탄디올, 2,4-펜탄디올, 1,6-헥산디올, 1,2-헥산디올, 1,5-헥산디올, 2,5-헥산디올, 1,7-헵탄디올, 1,8-옥탄디올, 1,2-옥탄디올, 1,9-노난디올, 1,12-도데칸디올, 트리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, 2-(I-아미노프로필)1,3-프로판디올, 또는 1,2-디데옥시리보스이다. 일부 구체예에서, 3' 말단에서 또는 기능화된 당 또는 기능화된 핵염기에 의해 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드와 결합되는 비뉴클레오티드 결합자는 글리세롤 (1,2,3-프로판트리올)이다.
일부 구체예에서, TLR7의 억제제 및/또는 TLR9의 억제제는 서열 TCTGACGTTCT (SEQ ID NO: 169), TCTGACG1TTCT (SEQ ID NO: 170), TCTGACG4TTCT (SEQ ID NO: 171), TCTCTGACGTT (SEQ ID NO: 172), TCTGUCGTTCT (SEQ ID NO: 173), TCTGUCG1TTCT (SEQ ID NO: 174), TCTGACG4TTCT (SEQ ID NO: 175), TCTGACG1TT (SEQ ID NO: 176), UGUCG1TTCT (SEQ ID NO: 177), 또는 UGACG1TTCT (SEQ ID NO: 178)를 가지며, 굵은 G, A 또는 U = 2'-OMe; G1 = 7-데아자-dG; 및 G4 = 아라G. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 그것들의 3' 말단에서 비뉴클레오티드 결합자와 결합되며, TLR7의 억제제 및/또는 TLR9의 억제제는 5'-(TCTGACGTTCT)2X2 (5'-SEQ ID NO: 169-3'-X2-3'-SEQ ID NO: 169-5'), 5'-(TCTGACG1TTCT)2X2 (5'-SEQ ID NO: 170-3'-X2-3'-SEQ ID NO: 170-5'), 5'-(TCTGACG4TTCT)2X2 (5'-SEQ ID NO: 171-3'-X2-3'-SEQ ID NO: 171-5'), 5'-(TCTCTGACGTT)2X2 (5'-SEQ ID NO: 172-3'-X2-3'-SEQ ID NO: 172-5'), 5'-(TCTGUCGTTCT)2X2 (5'-SEQ ID NO: 173-3'-X2-3'-SEQ ID NO: 173-5'), 5'-(TCTGUCG1TTCT)2X2 (5'-SEQ ID NO: 174-3'-X2-3'-SEQ ID NO: 174-5'), 5'-(TCTGACG4TTCT)2X2 (5'-SEQ ID NO: 175'-3'-X2-3'-SEQ ID NO: 175'-5'), 5'-(TCTGACG1TT)2X2 (5'-SEQ ID NO: 176-3'-X2-3'-SEQ ID NO: 176-5'), 5'-(UGUCG1TTCT)2X2 (5'-SEQ ID NO: 177-3'-X2-3'-SEQ ID NO: 177-5'), 또는 5'-(UGACG1TTCT)2X2 (5'-SEQ ID NO: 178-3'-X2-3'-SEQ ID NO: 178-5')이고, 굵은 G, A 또는 U = 2'-OMe; G1 = 7-데아자-dG; X2 = 글리세롤 결합자, 및 G4 = 아라G. 일부 구체예에서, TLR7의 억제제 및/또는 TLR9의 억제제는 미국 특허 출원 번호 2009/0060898에 개시된 면역 조절 올리고뉴클레오티드이며, 이것은 전문이 참고로 포함된다.
상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, TLR7의 억제제 및/또는 TLR9의 억제제는 SEQ ID NO: 161 (5'-CTATCTGACGTTCTCTGT-3'), SEQ ID NO: 162 (5'-CTATCTGUCGTTCTCTGT-3'), SEQ ID NO: 163 (5'-CTATCTGACRTTCTCTGT-3'), 또는 SEQ ID NO: 164 (5'-CTATCTGUCRTTCTCTGT-3')이다. 일부 구체예에서, 특히, TLR7의 억제제 및/또는 TLR9의 억제제는 SEQ ID NO: 165 (5'-CTATCTGACGTTCTCTGT-3'), SEQ ID NO: 166 (5'-CTATCTGUCGTTCTCTGT-3'), SEQ ID NO: 167 (5'-CTATCTGACRTTCTCTGT-3'), SEQ ID NO: 168 (5'-CT ATCTGUCRTTCTCTGT-3')이며, R은 2'-데옥시-7-데아자구아노신 결합자이고 굵은 G/A/U는 2'0-메틸-리보뉴클레오티드 변이이다.
상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, TLR7의 억제제 및/또는 TLR9의 억제제는 미국 특허 출원 US 2005-0239733에 설명된 바와 같으며, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다. 예를 들어, 억제제는 서열 XaCCN1N2N3YbN4GGGZc를 포함하는 분리된 면역 억제 핵산 분자를 포함하는 조성물일 수도 있으며, 각각의 C는 시티딘 또는 이들의 유도체이고, 적어도 하나의 C는 시티딘 유도체이다; 각각의 G는 구아노신 또는 이들의 데아자 유도체이다; Xa는 뉴클레오티드 길이의 어떤 뉴클레오티드 서열 a이며, a는 0-12 포함 정수이고, 각각의 뉴클레오티드는 Xa에서 어느 다른 것 중 독립적으로 선택된다; Yb는 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열 b이며, b는 0-21 포함 정수이고, 각각의 뉴클레오티드는 Yb에서 어느 다른 것 중 독립적으로 선택된다; Zc는 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열 c이며, c는 0-12 포함 정수이고 각각의 뉴클레오티드는 Zc에서 어느 다른 것 중 독립적으로 선택된다; 및 N1, N2, N3, 및 N4는 각각 독립적으로 어떤 뉴클레오티드일 수 있다. 추가적으로, 예를 들어, 억제제는 서열 XaCCN1N2N3YbN4GGGZc를 포함하는 분리된 면역 억제 핵산 분자를 포함하는 조성물일 수도 있으며, CC 모티프의 각각의 C는 시티딘 또는 이들의 유도체이다; 각각의 G는 구아노신 또는 이들의 데아자 유도체이다; Xa는 T이다; Yb는 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열 b이며, b는 0-21 포함 정수이고, 각각의 뉴클레오티드는 Yb에서 어느 다른 것 중 독립적으로 선택된다; Zc는 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열 c이며, c는 0-12 포함 정수이고 각각의 뉴클레오티드는 Zc에서 어느 다른 것 중 독립적으로 선택된다; 및 N1, N2, N3, 및 N4는 각각 독립적으로 어떤 뉴클레오티드일 수 있다; 및 N1N2는 TG이다.
상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, TLR7의 억제제 및/또는 TLR9의 억제제는 WO 2004/047734에 설명되고, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다. 예를 들어, 억제제는 서열 5'-퓨린-피리미딘-[X]-[Y]-피르미딘-피르미딘-3'을 포함하는 분리된 면역 억제 핵산 분자를 포함하는 조성물일 수도 있으며, X 및 Y는 X 및 Y가 시토신-구아닌일 수 없는 것을 제외하고 어느 자연적으로 발생되거나 합성 뉴클레오티드일 수도 있다. 추가적으로, 억제제는 CpG 모티프 내에 비시토신으로 치환되는 적어도 하나의 시토신을 갖는 분리된 면역 억제 핵산 분자를 포함하는 조성물일 수도 있으며, CpG 모티프는 서열 5'-퓨린-퓨린-CG-피르미딘-피르미딘-3'을 포함하는 식이고 비시토신으로 치환되는 시토신은 CpG 디뉴클레오티드 내에 있다.
상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, TLR7의 억제제 및/또는 TLR9의 억제제는 미국 특허 출원 US 2010-0130593에 설명되고, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다. 예를 들어, 억제제는 a) i) a. X 및 Y는 시토신-구아닌일 수 없고 b. 피리미딘 2가 티미딘일 때 X 및 Y는 시토신-시토신일 수 없고 c. 피리미딘 1이 시토신일 때 X 및 Y는 시토신-티미딘일 수 없는 것을 제외하고, X 및 Y가 어느 자연적으로 발생하거나 합성 뉴클레오티드일 수도 있는, 헥사머 서열 5'-퓨린-피리미딘1-XY-피리미딘2-피리미딘3-3'; ii) CC 디뉴클레오티드가 헥사머 서열의 1 내지 5개의 뉴클레오티드인, 헥사머 서열에 대한 CC 디뉴클레오티드 5'; 및 iii) 적어도 3개의 근접한 G를 포함하고 헥사머 서열의 2 내지 5개의 뉴클레오티드이고 면역 조정 서열은 CG 서열을 함유하지 않는 헥사머 서열의 폴리G 영역 3'을 포함하는 면역 조정 서열을 포함하는 면역 조정 핵산 및 b) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물일 수도 있다. 다른 구체예에서, 억제제는 5'-CCATGTGGTTATGGGT-3' (SEQ ID NO: 183)을 포함하는 뉴클레오티드 서열일 수도 있다.
여기에 입증된 바와 같이, 일부 IRP 및/또는 IRC는 TLR9 의존적인 세포 반응 및 TLR7 의존적인 세포 반응 모두를 억제한다. 일부 구체예에서, 개인에게 개인의 TLR9 의존적인 시토킨 생산 및 TLR7 의존적인 시토킨 생산을 억제하기 위해 충분한 양으로 면역 조절 폴리뉴클레오티드 또는 면역 조절 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 방법은 개인의 TLR9 의존적인 면역 반응 및 TLR7 의존적인 면역 반응을 억제하기 위해 제공되며, IRP 또는 IRC가 TLR7/9 등급의 IRS를 포함한다. 일부 구체예에서, TLR7 및/또는 TLR9 의존적인 면역 반응은 선천성 면역 반응이다. 일부 구체예에서, TLR7 및/또는 TLR9 의존적인 면역 반응은 후천성 면역 반응이다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 변형된 IRS를 포함한다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 변형되지 않은 IRS를 포함한다. 일부 구체예에서, IPR 및/또는 IRC는 변형된 및 변형되지 않은 IRS 모두를 포함한다.
치료하고, 반응성을 평가하고, 질환의 발전을 방지하고 및/또는 지연시키는 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, 여기에 설명된 조성물은 B 세포 또는 a 형질세포양 수지상세포의 반응을 억제한다. 일부 구체예에서, 여기에 설명된 조성물에 의해 억제된 면역 반응은 세포에 의한 시토킨, 예를 들어, IL-6 및/또는 IFN-α 생산의 억제, 세포 성숙의 억제 및/또는 세포 증식의 억제를 포함한다. 일부 구체예에서, 여기에 설명된 조성물은 TLR9 의존적인 세포 반응, TLR7 의존적인 세포 반응, 및/또는 TLR7/9 의존적인 세포 반응을 억제한다.
치료하고, 반응성을 평가하고, 질환의 발전을 방지하고 및/또는 지연시키는 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, IRS는 치료적으로 허용 가능한 안전성 프로파일을 갖고 예를 들어, 있으면, 허용 가능하게 낮은, 간, 신장, 췌장 또는 다른 기관의 독성을 포함하는 치료적으로 허용 가능한 조직학적 프로파일을 가질 수도 있다. IRS가 특정 기관, 예를 들어, 간, 신장 및 췌장에 대한 독성을 나타낼 수 있고 여기에 제공되는 특정 선택된 IRS가 예상되지 않고 이로운 향상된 안전성 프로파일을 제공할 수 있다는 것이 관찰되었다. 일부 구체예에서, 치료적으로 허용 가능한 안전성 프로파일은 독성, 조직학적 프로파일, 및/또는 괴사의 평가 (예를 들어, 간, 신장 및/또는 심장의 평가에서)를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 치료적으로 허용 가능한 독성을 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 여기에 제공된 실시예에서 도시된 바와 같이 또 다른 IRS와 비교하여 감소된 독성을 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 낮거나 감소된 독성을 갖는다 (예를 들어, 또 다른 IRS, 예를 들어, SEQ ID NO: 79 또는 SEQ ID NO: 109와 비교하여). 일부 구체예에서, IRS는 치료적으로 초기 중량과 비교하여 허용 가능한 중량의 감소를 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 중량의 5%, 7. 5%, 10%, 12. 5, 또는 15% 감소 중 어느 것보다 낮게 감소시킨다 (예를 들어, 실시예 3에 설명된 방법에 의해 결정된 바와 같이). 일부 구체예에서, IRS는 치료적으로 허용 가능한 조직학 프로파일을 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 더 좋은 (예를 들어, 낮은 점수) 조직학적 프로파일을 갖는다 (예를 들어, 또 다른 IRS, 예를 들어, NO: 79 또는 SEQ ID NO: 109와 비교하여). 일부 구체예에서, IRS는 예를 들어, 실시예 3에 설명된 방법에 의해 결정된 바와 같이, 간, 신장 및 심장의 평가에서 더 좋은 (및/또는 더 낮은 점수) 조직학적 프로파일을 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 치료적으로 허용 가능한 괴사 점수를 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 감소된 괴사 및/또는 더 좋은 (예를 들어, 더 낮은) 괴사 점수를 갖는다 (예를 들어, 또 다른 IRS, 예를 들어, SEQ ID NO: 79 또는 SEQ ID NO: 109와 비교하여). 일부 구체예에서, 평균 괴사 점수는 약 3 이하이다. 일부 구체예에서, 평균 괴사 점수는 약 2 이하이다. 일부 구체예에서, 평균 괴사 점수는 약 1 이하이다. 일부 구체예에서, 평균 괴사 점수는 약 0 이하이다. 일부 구체예에서, IRS는 예를 들어, 실시예 3에 설명된 방법에 의해 결정된 바와 같이, 감소된 신장 및/또는 간세포 괴사 및/또는 더 좋은 신장 및/또는 간세포 괴사 점수를 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나의 IRS이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
치료하고, 반응성을 평가하고, 질환의 발전을 방지하고 및/또는 지연시키는 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, IRS는 치료적으로 허용 가능한 pK를 갖는다. 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, IRS는 PK 프로파일 또는 실시예에 설명된 바와 같이 또 다른 IRS와 유사한 PK를 갖는다. 일부 구체예에서, 치료적으로 허용 가능한 안전성 프로파일은 마우스 또는 래트에서 결정된다. 일부 구체예에서, 치료적으로 허용 가능한 안전성 프로파일은 래트에서 결정된다.
치료하고, 반응성을 평가하고, 질환의 발전을 방지하고 및/또는 지연시키는 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, IRS는 치료적으로 허용 가능한 B-세포 활성화를 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 감소되거나 낮은 B-세포 관련된 독성을 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 감소되거나 낮은 B-세포 활성화를 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 양성 대조군 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 면역 자극 서열 (ISS)), 또 다른 IRS, 또는 음성 대조군 폴리뉴클레오티드와 비교하여 및 여기에 제공된 실시예에 도시된 바와 같이 감소되거나 낮은 B-세포 활성화를 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 대조군, 예를 들어, 음성 대조군 폴리뉴클레오티드보다 유의적으로 더 높은 수준으로 B-세포 활성화를 유발하지 않는다. 일부 구체예에서, IRS는 대조군 예를 들어, 양성 대조군 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, ISS)보다 유의적으로 더 낮은 수준으로 B-세포 활성화를 유발한다. 일부 구체예에서, IRS는 양성 대조군 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, ISS)와 비교하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 중 어느 것보다 낮은 수준으로 세포 배양 검정의 B-세포 활성화를 유발한다. 일부 구체예에서, IRS는 양성 대조군 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, ISS)와 비교하여 약 5%, 10%, 15%, 또는 20% 중 어느 것보다 낮은 수준으로 세포 배양 검정의 B-세포 활성화를 유발한다. 일부 구체예에서, IRS의 B-세포 활성화는 양성 대조군 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, ISS)에 대하여 표준화된다. 일부 구체예에서, 다양한 IRS의 표준화된 결과는 비교된다. 일부 구체예에서, IRS는 두 번째 IRS보다 유의하게 낮은 수준에 대하여 B-세포 활성화를 유발한다. 일부 구체예에서, IRS는 배지 단독보다 유의하게 더 높은 수준 또는 음성 대조군 폴리뉴클레오티드에 대하여 세포 배양 검정의 B-세포 활성화를 유발하지 않는다. 일부 구체예에서, IRS는 양성 대조군 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, ISS)보다 유의하게 더 낮은 수준에 대하여 세포 배양 검정의 B-세포 활성화를 유발한다. 일부 구체예에서, IRS는 예를 들어, 약 4000 nM 내지 약 15 nM의 범위에 걸쳐, 농도-의존적인 B-세포 활성화를 나타낸다. 일부 구체예에서, IRS는 예를 들어, 약 4000 nM 내지 약 15 nM의 범위에 걸쳐, 낮은 농도-의존적인 B-세포 활성화를 나타낸다. 일부 구체예에서, B-세포 활성화는 실시예 1 및/또는 도 1c에 설명된 바와 같이 결정된다.
활성화된 B 세포 및/또는 PDC를 특징으로 하는 자가 면역 또는 염증성 질환에 걸린 개인을 치료하기 위한 유효량으로 여기에 설명된 IRS를 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 제공되며, IRS는 B 세포 및/또는 PDC에 의해 같은 자가 면역 또는 염증성 질환에 걸린 치료되지 않은 개인의 B 세포 및/또는 PDC와 비교하여 적어도 15% 이하로 TLR9 및/또는 TLR 7-의존적인 시토킨, 예를 들어, IL-6의 생산을 낮춘다. 일부 구체예에서, 치료 방법은 활성화된 B 세포 및/또는 PDC를 특징으로 하는 자가 면역 또는 염증성 질환에 걸린 개인을 치료하기 위한 유효량으로 여기에 설명된 IRS를 투여하는 단계를 포함하며, IRS는 B 세포 및/또는 PDC에 의해 같은 자가 면역 또는 염증성 질환에 걸린 치료되지 않은 개인의 B 세포 및/또는 PDC와 비교하여 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이하로 TLR9 및/또는 TLR 7-의존적인 시토킨, 예를 들어, IL-6의 생산을 낮춘다.
여기에 설명된 IRS가 치료적으로 허용 가능한 절반의 최대 억제 농도 (IC50) 및/또는 IC90을 갖는 추가적인 치료 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, IRS는 여기에 제공된 실시예 (예를 들어, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143. 또는 SEQ ID NO: 144, 하지만 이에 제한되지 않음)에 도시된 바와 같이 또 다른 IRS (예를 들어, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 79, 또는 SEQ ID NO: 109)와 비교하여 감소된 IC50 및/또는 IC90을 갖는다. 일부 구체예에서, 여기에 제공된 실시예 (예를 들어, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143 또는 SEQ ID NO: 144, 하지만 이에 제한되지 않음)에 도시된 바와 같이 또 다른 IRS에 의해 필요한 투여량과 비교될 때 IRS이 TLR-7 및/또는 TLR-9-의존적인 시토킨 생산을 억제하기 위해 필요한 투여량은 더 낮다.
고저차 수준의 결정
고저차 수준은 샘플 (예를 들어, 개인으로부터의 샘플 또는 참고 샘플)에 기초하여 결정될 수도 있다. 일부 구체예에서, 샘플은 생물학적 샘플이다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 생물학적 유동체 샘플 또는 생물학적 조직 샘플이다. 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, 고저차 수준은 피부 조직, 혈액 샘플, 또는 다른 생물학적 샘플에서 결정된다. 일부 구체예에서, 혈액 샘플은, 예를 들어, 혈소판, 백혈구, 다형핵 세포, 대식세포, 및 적혈구를 포함한다. 일부 구체예에서, 고저차 수준은 피부 조직 생체 조직에서 결정된다.
이 방법을 수행하기 위하여, 예를 들어, 샘플은 조직 또는 유동체를 함유하는 개인으로부터의 샘플이다. 상기 설명된 방법에 사용된 샘플 핵산은 대상체의 어느 세포 타입 또는 조직으로부터 얻을 수도 있다. 예를 들어, 대상체의 체액 (예를 들어, 혈액)은 알려진 기술 (예를 들어, 정맥 천자)에 의해 얻을 수 있다. 대안으로, 테스트를 건조 샘플 (예를 들어, 머리카락 또는 피부)에서 수행할 수 있다. 샘플은 신선하거나 동결될 수도 있다. 일부 구체예에서, 샘플은 고정되고 파라핀 등에 파묻었다.
일부 구체예에서, 방법은 테스트하기 위한 유전 물질을 함유하는 샘플을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 제자리에서 고저차 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 따라서, 이 출원의 방법은 분석 전에 유전 물질의 분리가 필요한 것에 제한되지 않는다.
발현 수준을 확인하기 위한 이 방법들은 생체 마커의 발현 수준을 확인하기 위해 사용된 기술에 제한되지 않는다. 원하는 유전자의 핵산 (예를 들어, RNA 또는 DNA) 또는 단백질 수준을 측정할 수 있다. 유전자 발현을 측정하고 및/또는 다형성의 검출을 위해 서열을 결정하는 방법은 업계에 잘 알려져 있고 면역학적 검정, 뉴클레아제 보호 검정, 노던 블롯, 제자리 히브리드화, ELISA, 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR), 실시간 폴리머라제 연쇄 반응, 발현된 서열 태그 (EST) 서열화, cDNA 미크로어레이 히브리드화 또는 유전자 칩 분석, 감소 클로닝, 유전자 발현의 직렬 분석 (SAGE), 대량 병렬 군 서열화 (MPSS), 합성에 의한 서열화 (SBS), 압타머-기초 검정, 웨스턴 블롯, 효소 면역 검정 및 색을 활용하는 Luminex Platform을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 참조예, Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) 및 18 (PCR Analysis). 생체 조직 또는 절제로부터 얻은 개인의 조직의 조직 절편 (고정된 및/또는 동결된)에서 제자리 진단 과정을 또한 수행할 수 있다.
미크로어레이 기술은 단일 실험 내에 수천 개의 유전자의 mRNA 발현 프로파일을 평가하기 위해 핵산 히브리드화 기술 및 컴퓨터 사용 기술을 활용한다. 참조예, 2001년 10월 11일에 출원된 WO 01/75166; 미국 5, 700, 637, 미국 특허 5, 445, 934, 미국 특허 5, 807, 522, lockart, Nat. Biotech., 14: 1675-1680 (1996); Cheung, V. G. et al., Nat. Gen. 21(Suppl): 15-19 (1999). DNA 미크로어레이는 자유 또는 다른 물질 상에 직접적으로 합성되거나 이에 딱 맞는 유전자 단편을 함유하는 소형 어레이이다. 수천 개의 유전자는 보통 단일 어레이에 나타난다. 전형적인 미크로어레이 실험은 다음 단계를 수반한다: 1) 샘플로부터 분리된 RNA의 형광 표지된 표적의 제조, 2) 미크로어레이에 대하여 표지된 표적의 히브리드화, 3) 샘플의 세척, 염색, 및 스캔, 4) 스캔된 이미지의 분석 및 5) 유전자 발현 프로파일의 발생. 현재 2개의 주요 타입의 DNA 미크로어레이가 사용된다: 올리고뉴클레오티드 (보통 25 내지 70머) 어레이 및 cDNA로부터 제조된 PCR 생성물을 함유하는 유전자 발현 어레이. 어레이를 형성하는데 있어서, 올리고뉴클레오티드는 제조될 수 있고 표면에 딱 맞거나 표면상에 직접적으로 합성될 수 있다 (제자리). Affymetrix GeneChip? 시스템 (예를 들어, Affymetrix, Inc. 의 GeneChip? Human Genome U133 Plus 2. 0 어레이 (카탈로그 번호 900470))은 상업적으로 이용 가능하고 유전자 발현 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 증폭은 PCR과 같은 방법, 결찰 증폭 (또는 리가제 연쇄 반응, LCR) 및 증폭 방법을 포함한다. 이 방법들은 업계에 알려져 있고 널리 실행된다. 일반적으로, PCR 과정은 (i) DNA 샘플 (또는 라이브러리) 내에 특이적 유전자에 대한 프라이머의 서열-특이적 히브리드화, (ii) DNA 폴리머라제를 사용하여 다양한 라운드의 가열, 신장, 및 변성을 수반하는 이후 증폭, 및 (iii) 정확한 크기의 밴드에 대하여 PCR 생성물의 선별로 구성되는 유전자 증폭의 방법을 설명한다. 사용된 프라이머는 충분한 길이의 올리고뉴클레오티드이고 폴리머화의 개시를 제공하기 위해 적절한 서열이다, 즉, 각각의 프라이머는 증폭되는 게놈의 위치의 각각의 가닥에 대하여 상보적이기 위해 특이적으로 설계된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 생체 마커의 발현은 RT-PCR에 의해 검정될 수도 있다. 일부 구체예에서, RT-PCR은 정량 RT-PCR (qRT-PCR)일 수도 있다. 일부 구체예에서, RT-PCR은 실시간 RT-PCR이다. 일부 구체예에서, RT-PCR은 정량 실시간 RT-PCR이다. 일부 구체예에서, 실시간 RT-PCR은 TaqMan? 화학법 (Applied Biosystems)을 사용하여 수행될 수도 있다. 일부 구체예에서, 실시간 RT-PCR은 TaqMan? 화학법 (Applied Biosystems) 및 ABI Prism? 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems)을 사용하여 수행될 수도 있다. 참조예, Overbergh, L. et al., J. Biomol. Tech. 14(1): 33-43 (2003).
PCR을 행하기 위한 시약 및 하드웨어는 상업적으로 이용 가능하다. 특정 유전자 영역으로부터 서열을 증폭하기 위해 유용한 프라이머는 바람직하게도 표적 영역 또는 그것의 플랭킹 영역의 서열에 상보적이고, 이에 대해 특이적으로 히브리드화한다. 증폭에 의해 발생된 핵산 서열은 직접적으로 서열화될 수도 있다. 대안으로 증폭된 서열은 서열 분석 이전에 클로닝될 수도 있다. 효소로 증폭된 게놈의 세그먼트의 직접적인 클로닝 및 서열 분석 방법은 업계에 알려져 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 유전자 발현은 세포에서 개개의 유전자 생성물 (단백질), 또는 이들의 단백질 가수 분해 단편의 하나 이상의 에피토프에 특이적인 하나 이상의 항체의 사용에 의한 세포에서 발현된 단백질의 분석에 의해 결정된다. 세포는 여기에 설명된 바와 같이, 세포주, 체액, 이종 이식 및 생체 조직을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 근원으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 실행에서 사용에 적합한 검출 방법론은 샘플 또는 조직을 함유하는 세포의 면역 조직학, 세포를 함유하는 조직 또는 혈액 샘플의 항체 샌드위치 검정을 포함하는 효소 결합된 면역흡착 검정 (ELISA), 질량 분광학, 및 면역-PCR을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 단백질 함량을 분석하는 단계는, 예를 들어, 질량 분광학, 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 면역 조직학 또는 2-D 겔 전기영동에 의해 단백질체학적 패턴을 평가하는 단계를 포함한다. 참조예, Latterich M. et al. Eur J. Cancer. 44: 2737-41 (2008); Conrotto P. Exp Oncol. 30: 171-80 (2008). 다른 구체예에서, 역상 단백질 용해물 미크로어레이가 사용된다. Paweletz, C. P., et al., Oncogene 20: 1981-1989 (2001) 참조.
본 발명의 조성물
면역 조절 폴리뉴클레오티드 (IRP) 및 면역 조절 화합물 (IRC)이 여기에 제공된다. 여기에 제공된 것은 또한 여기에 설명된 방법 중 어느 것에 사용되는 IRP 및 IRC이다. 여기에 설명된 각각의 IRP 및 IRC는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, 뿐만 아니라 단일 또는 이중 가닥 RNA일 수도 있다. IRS를 포함하는 IRP 또는 IRC는 선형일 수도 있고, 원형일 수도 있거나 원형 부분을 포함할 수도 있고 및/또는 헤어핀 루프를 포함할 수도 있다. 본 발명에 사용된 IRP 및 IRC는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 (단지 또는 원칙적인 당 구성요소로서 리보스를 함유하는) 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드 (원칙적인 당 구성요소로서 데옥시리보스를 함유하는)를 포함할 수 있다. IRP에 포함되는 이종 고리식 염기, 또는 핵산 염기는 자연적으로 발생한 원칙적인 퓨린 및 피리미딘 염기 (즉, 우라실, 티민, 시토신, 아데닌 및 구아닌)일 수 있다.
여기에 명백히 전달되기 때문에, 여기에 설명된 공식에 관하여, 어느 및 모든 파라미터는 독립적으로 선택된다. 예를 들어, x=0-2인 경우, y는 x (또는 공식에서 어느 다른 선택 가능한 파라미터)의 값에 상관없이 독립적으로 선택된다.
여기에 제공된 조성물 중 어느 것의 특정 구체예에서, 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형을 포함한다. 특정 구체예에서, 변형은 2'-당 변형이다. 특정 구체예에서, 2'-당 변형은 2'-0-메틸 당 변형 또는 2'-0-메톡시에틸 당 변형이다. 여기에 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 것의 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 모두로 구성된다. 여기에 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 것의 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및 2'-당 변형 키메라 서열이다. 여기에 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 것의 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및 2'-0-메틸 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 여기에 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 것의 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및 2'-0-메티옥시에틸 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 여기에 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 것의 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 변형된 포스페이트 결합을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 갖는다. 여기에 제공된 방법 또는 조성물 중 어느 것의 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 단지 포스포로티오에이트 결합을 갖는다.
S1, S2, S3, 및 S4가 독립적으로 G, I, 또는 7-데아자-G인 식 5'-S1S2S3S4-3'을 함유하는 여기에 제공된 조성물 중 어느 것의 특정 구체예에서, 뉴클레오티드는 모두 데옥시리보뉴클레오티드이다. 예를 들어, TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 식 RγJGCKαGIGGβ-3' (SEQ ID NO: 146)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이고, 각각의 R, K, 및 L는 뉴클레오티드이고, J는 U 또는 T이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, α는 약 1 내지 약 20의 정수이고, β는 약 1 내지 약 20의 정수인 방법 및 조성물에 대하여, 서열의 GIGG 부분에서 각각의 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다 (예를 들어, G는 2'-데옥시구아노신이고 I는 2'-데옥시이노신이다).
여기에 제공된 것은 여기에 설명된 방법 중 어느 것에 사용되는 IRS 및 IRC이다. 일부 구체예에서, IRS는 폴리뉴클레오티드 5' 말단 (즉, 5'-TGC)에 또는 근처에 적어도 하나의 TGC 트리뉴클레오티드 서열 및/또는 S1, S2, S3, 및 S4가 독립적으로 G 또는 G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자인 식 5'-S1S2S3S4-3'의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, TGC 트리뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오티드 중 어느 것이다. 일부 구체예에서, TGC 트리뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오티드 중 어느 것보다 작다. 일부 구체예에서, S1, S2, S3, 및 S4는 G이다. 일부 예에서, S1, S2, S3, 및 S4 모두는 G가 아니다. 따라서, IRP 또는 IRC는 5'-GGGG-3' 서열을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, S1, S2, S3, 및 S4는 G, I 또는 7-데아자 G이고 뉴클레오티드는 모두 데옥시리보뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 식 5'-GGGG-3'의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, IRP 또는 IRC는 포스포티오에이트 백본으로 만들었을 때 특히 효과적이다. 일부 구체예에서, IRP 또는 IRC는 CG를 포함하지 않는다 (메틸화되지 않은 CpG를 포함하지 않는다). 일부 구체예에서, IRP 또는 IRC는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 아니다.
여기에 제공된 것은 IRS이며, IRS는 식 5'-RγJGCNz-3' (SEQ ID NO: 147)의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리펩티드이고, 각각의 R은 뉴클레오티드이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, J는 U 또는 T이고, 각각의 N은 뉴클레오티드, 및 z는 약 1 내지 약 1000의 정수이다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 식 5'-RγJGCNz-3' (SEQ ID NO: 147) 의 뉴클레오티드 서열로 구성되며, 각각의 R은 뉴클레오티드이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, J는 U 또는 T이고, 각각의 N은 뉴클레오티드이고, z는 약 1 내지 약 100의 정수이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 5'-RγJGCNz-3' (SEQ ID NO: 147)은 또 다른 뉴클레오티드 서열 5'-JGC-3'을 더 포함하며, J는 U 또는 T이다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 서열 5'-TGCTGC-3'을 포함한다.
일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 5'-RγJGCNz-3' (SEQ ID NO: 147)은 S1, S2, S3, 및 S4가 독립적으로 G 또는 G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자인 식 5'-S1S2S3S4-3'의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 식 5'-RγJGCKαS1S2S3S4Lβ-3' (SEQ ID NO: 148)의 뉴클레오티드 서열로 구성되며, 각각의 R, K, 및 L는 뉴클레오티드이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, J는 U 또는 T이고, S1, S2, S3, 및 S4는 독립적으로 G 또는 G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자이고, α는 약 1 내지 약 20의 정수이고, β는 약 1 내지 약 20의 정수이다. 일부 구체예에서, G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자는 G-4분자의 테트라머/4중 구조의 형성을 붕괴시키거나 방지한다. 일부 구체예에서, G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자는 뉴클레오티드 또는 이들의 유도체이다. G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자의 예는 I, 7-데아자-dG, 7-데아자-2'-데옥시잔토신, 7-데아자-8-아자-2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시네불라린, 이소데옥시구아노신, 8-옥소-2'-데옥시구아노신을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 S1, S2, S3, 및 S4는 G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자이다. 일부 구체예에서, 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 S1, S2, S3, 및 S4는 I이다. 일부 구체예에서, 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 S1, S2, S3, 및 S4는 7-데아자-dG이다. 일부 구체예에서, 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 S1, S2, S3, 및 S4는 G이다. 일부 구체예에서, S1, S2, S3, 및 S4는 G이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 식 5'-GIGG-3'의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, S1, S2, S3, 및 S4는 변형되지 않고 및/또는 더 변형되지 않는다. 일부 구체예에서, IRS는 식 X1S1S2S3S4X2X3 (SEQ ID NO: 149)의 서열을 포함할 수도 있으며, X1, X2, 및 X3은 뉴클레오티드이고, X1=C 또는 A인 경우, X2X3은 AA가 아니다는 것이 제공된다. 일부 구체예에서, IRS는 식 SEQ ID NO: 149의 서열을 포함할 수도 있으며, X1은 C 또는 A이다. 일부 구체예에서, IRS는 식 X1S1S2S3S4X2X3 (SEQ ID NO: 150)의 서열을 포함할 수도 있으며, X1, X2, 및 X3은 뉴클레오티드이고, X1= C 또는 A인 경우, X2X3은 AA가 아니다는 것이 제공되고, X1은 C 또는 A이다.
일부 구체예에서, γ는 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 중 어느 것이다. 일부 구체예에서, γ는 0이다 (5'-JGC-3'은 폴리뉴클레오티드의 5' 말단의 뉴클레오티드 서열이다). 일부 구체예에서, γ는 약 0 내지 7, 0 내지 5, 또는 0 내지 3 중 어느 것이다.
일부 구체예에서, z는 약 1 내지 약 750, 약 1 내지 약 500, 약 1 내지 약 250, 약 1 내지 약 200, 약 1 내지 약 150, 약 1 내지 약 125, 약 1 내지 약 100, 약 1 내지 약 75, 약 1 내지 약 50, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5 중 어느 것의 정수이다. 일부 변이에서, z는 약 1 내지 약 100의 정수이다. 일부 구체예에서, z는 1 내지 100의 정수이다. 일부 구체예에서, z는 약 200, 약 175, 약 150, 약 125, 약 100, 약 75, 약 50, 약 40, 약 30, 약 25, 약 20, 약 15 또는 약 10 중 어느 것 이하의 정수이다. 일부 구체예에서, z는 100 이하의 정수이다. 일부 구체예에서, z는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 10, 약 15, 또는 약 20 중 어느 것 이상의 정수이다.
일부 구체예에서, α 및/또는 β는 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5 중 어느 것의 정수이다. 일부 구체예에서, α 및/또는 β는 약 18, 약 15 또는 약 10 중 어느 것 이하의 정수이다. 일부 구체예에서, z는 100 이하의 정수이다. 일부 구체예에서, α 및/또는 β는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 10, 약 15, 또는 약 20 중 어느 것 이상의 정수이다.
여기에 제공된 것은 또한 IRS이며, IRS는 식 5'-S1S2S3S4-3'의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이고, S1, S2, S3, 및 S4는 독립적으로 G 또는 G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 식 5'-KpS1S2S3S4Qr-3' (SEQ ID NO: 151)의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 각각의 K 및 Q는 뉴클레오티드이고, p 및 r은 약 0 내지 약 500의 정수이고, S1, S2, S3, 및 S4는 G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자이다. 일부 구체예에서, G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자는 G-4분자의 테트라머/4중 구조의 형성을 붕괴시키거나 방지한다. 일부 구체예에서, G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자는 뉴클레오티드 또는 이들의 유도체이다. 일부 구체예에서, 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 S1, S2, S3, 및 S4는 G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자이다. 일부 구체예에서, 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 S1, S2, S3, 및 S4는 I이다. 일부 구체예에서, 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 S1, S2, S3, 및 S4는 7-데아자-dG이다. 일부 구체예에서, 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 S1, S2, S3, 및 S4는 G이다. 일부 구체예에서, S1, S2, S3, 및 S4는 G이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 식 5'-GIGG-3'의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, S1, S2, S3, 및 S4는 변형되지 않고 및/또는 더 변형되지 않는다. 식 5'-S1S2S3S4-3'의 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열의 어느 곳에서도 발견될 수 있다. 일부 변이에서, 식 5'-S1S2S3S4-3'의 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열 내부에서 발견된다, 즉, 뉴클레오티드 서열의 5' 말단 또는 3' 말단에서는 아니다. 일부 구체예에서, TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 식 RγJGCKαGIGGβ-3' (SEQ ID NO: 146)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이며, 각각의 R, K, 및 L은 뉴클레오티드이고, J는 U 또는 T이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, α는 약 1 내지 약 20의 정수이고, β는 약 1 내지 약 20의 정수이다. 전형적인 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성된다.
일부 구체예에서, p 및/또는 r은 약 1 내지 약 750, 약 1 내지 약 500, 약 1 내지 약 250, 약 1 내지 약 200, 약 1 내지 약 150, 약 1 내지 약 125, 약 1 내지 약 100, 약 1 내지 약 75, 약 1 내지 약 50, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5 중 어느 것의 정수이다. 일부 변이에서, p 및/또는 r은 약 1 내지 약 50의 정수이다. 일부 구체예에서, r은 1 내지 50의 정수이다. 일부 구체예에서, p 및/또는 r은 약 200, 약 175, 약 150, 약 125, 약 100, 약 75, 약 50, 약 40, 약 30, 약 25, 약 20, 약 15 또는 약 10 중 어느 것 이하의 정수이다. 일부 구체예에서, r은 50 이하의 정수이다. 일부 구체예에서, r은 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 10, 약 15, 또는 약 20 중 어느 것 이하의 정수이다.
일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 트리뉴클레오티드 서열 5'-JGC-3'을 더 포함하고, J는 U 또는 T이다. 일부 구체예에서, 5'-JGC-3'은 IRS 및/또는 IRP의 5' 말단으로부터 약 0-10개의 뉴클레오티드이다. 5'-JGC-3'은 IRS 및/또는 IRP의 5' 말단으로부터 0-7, 0-5, 0-3, 또는 0-2의 뉴클레오티드 중 어느 것일 수도 있다. 일부 구체예에서, 5'-JGC-3'은 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에서 5'-TGC 또는 5'-UGC 뉴클레오티드 서열이다.
예를 들어, 여기에 제공된 것은 IRS이며, 식 5'-EζJGCFθTCCTGGAS1S2S3S4TT3φ-3' (SEQ ID NO: 152)의 서열로 구성되고, 각각의 E, F, 및 3은 뉴클레오티드, ζ, θ이고, φ는 약 0 내지 10의 정수이고, J는 U 또는 T이고, S1, S2, S3, 및 S4는 독립적으로 G 또는 G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자이다. 일부 구체예에서, ζ, θ, 및 φ는 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 중 어느 것이다. 일부 구체예에서, G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자는 G-4분자의 테트라머/4중 구조의 형성을 붕괴시키거나 방지한다. 일부 구체예에서, G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자는 뉴클레오티드 또는 이들의 유도체이다. 일부 구체예에서, 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 S1, S2, S3, 및 S4는 G-4분자 형성을 방지할 수 있는 및/또는 후그스틴 염기쌍을 방지할 수 있는 분자이다. 일부 구체예에서, 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 S1, S2, S3, 및 S4는 I이다. 일부 구체예에서, 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 S1, S2, S3, 및 S4는 7-데아자-dG이다. 일부 구체예에서, 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 S1, S2, S3, 및 S4는 G이다. 일부 구체예에서, S1, S2, S3, 및 S4는 G이다. 일부 구체예에서, S1, S2, S3, 및 S4는 변형되지 않고 및/또는 더 변형되지 않는다. 식 5'-S1S2S3S4-3'의 뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열의 어느 곳에서도 발견될 수 있다.
예를 들어, IRS는 다음 서열 중 하나로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다:
5'-TCCTAACGGGGAAGT-3' (SEQ ID NO: 1);
5'-TCCTAAGGGGGAAGT-3' (SEQ ID NO: 2);
5'-TCCTAACGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 3);
5'-TCCTAACGGGGCTGT-3' (SEQ ID NO: 4);
5'-TCCTCAAGGGGCTGT-3' (SEQ ID NO: 5);
5'-TCCTCAAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 6);
5'-TCCTCATGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 7);
5'-TCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 8);
5'-TCCTGGAGGGGCTGT-3' (SEQ ID NO: 9);
5'-TCCTGGAGGGGCCAT-3' (SEQ ID NO: 10);
5'-TCCTGGAGGGGTCAT-3' (SEQ ID NO: 11);
5'-TCCGGAAGGGGAAGT-3' (SEQ ID NO: 12);
5'-TCCGGAAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 13);
5'-TGACTGTAGGCGGGGAAGATGA-3' (SEQ ID NO: 14);
5'-GAGCAAGCTGGACCTTCCAT-3' (SEQ ID NO: 15);
5'-CCTCAAGCTTGAGZ'GG-3' (Z'=7-데아자-dG; SEQ ID NO: 16);
5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO: 17);
5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAG-3' (SEQ ID NO: 18);
5'-TGCTTGCAAGCTTGCA-3' (SEQ ID NO: 19);
5'-GCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO: 20);
5'-CTTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO: 21);
5'-TTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO: 22);
5'-TGCTTGCAAGCTAGCAAGCA-3' (SEQ ID NO: 23);
5'-TGCTTGCAAGCTTGCTAGCA-3' (SEQ ID NO: 24);
5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCA-3' (SEQ ID NO: 25);
5'-TGCTTAGCAGCTATGCAGCA-3' (SEQ ID NO: 26);
5'-TGCAAGCAAGCTAGCAAGCA-3' (SEQ ID NO: 27);.
5'-TGCAAGCTTGCAAGCTTGCAAGCTT-3' (SEQ ID NO: 28);
5'-TGCTGCAAGCTTGCAGATGAT-3' (SEQ ID NO: 29);
5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGC-3' (SEQ ID NO: 30);
5'-TGCAAGCTTGCAAGCTTGCAAT-3' (SEQ ID NO: 31);
5'-TGCTTGCAAGCTTG-3' (SEQ ID NO: 32);
5'-AGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO: 33);
5'-TACTTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO: 34);
5'-TGATTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO: 35);
5'-AAATTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO: 36);
5'-TGCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 37);
5'-AAATTGACAGCTTGACAGCA-3' (SEQ ID NO: 38);
5'-TGATTGACAGCTTGACAGCA-3' (SEQ ID NO: 39);
5'-TGATTGACAGATTGACAGCA-3' (SEQ ID NO: 40);
5'-TGATTGACAGATTGACAGAC-3' (SEQ ID NO: 41);
5'-TGCTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 42);
5'-TGCTTGTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 43);
5'-TGCTTGACATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 44);
5'-TGCTTGACAGCTTGACAGTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 45);
5'-TGCTTGACAGCTTGATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 46);
5'-TGCTTGACAGCTTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 47);
5'-TGCTTGACAGCTTGCTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 48);
5'-TGCTTGACAGCTTGCTTGTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 49);
5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 50);
5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID N0: 51);
5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGGT-3' (SEQ ID NO: 52);
5'-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGG-3' (SEQ ID NO: 53);
5'-TGCTTGCAAGCTTGCTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 54);
5'-TGCTTGCAAGCTTCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 55);
5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCATCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 56);
5'-TGC TGC TCC TGG AGG GGT TGT TTG T-3' (SEQ ID NO: 57);
5'-TGC TGC TCC TTG AGG GGT TGT TTG T-3' (SEQ ID NO: 58);
5'-TGC TGC TCC TTG AGG GGT TGT-3' (SEQ ID NO: 59);
5'-TGC TGC TCC TGG AGG GGT TGT-3' (SEQ ID NO: 60);
5'-TGC TGC TCC TTG AGZ' GGT TGT TTG T-3', 여기에서 Z5'=7-데아자-dG (SEQ ID N0: 61);
5'-TGC TGC TCC TTG AGI GGT TGT TTG T-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 62);
5'-TGC TCC TTG AGI GGT TGT TTG T-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID N0: 63);
5'-TGC TTG TCC TGG AGI GGT TGT AAG T-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID N0: 64);
5'-TGC TTG TCC TGG AGI GGT GTT GT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID N0: 65);
5'-TGC TGC TCC TGG AGI GGT TGT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID N0: 66);
5'-TGC TCC TGG AGG GGT TGT AAG T-3' (SEQ ID N0: 67);
5'-TGC TCC TGG AGG GGT TG TAA GTT TGT-3' (SEQ ID N0: 68);
5'-TGC TCC TTG AGG GGT TGT-3' (SEQ ID N0: 69);
5'-TGC TGC TCC TTG AGI GGT TGT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 70);
5'-TGC TCC TTG AGI GGT TGT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID N0: 71);
5'-TGC TGC TCC TTG AGI GGT GTT GT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID N0: 72);
5'-TGC TCC TGG AGI GGT TGT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID N0: 73);
5'-TGC TTG TCC TGG AGI GGT TGT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID N0: 74);
5'-TGC TGC TCC TTG AGI GGT TGT AAG T-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID N0: 75);
5'-TGC TGC TCC TGG AGG GGT TGT TTG T-3' (SEQ ID N0: 76);
5'-TGC TGC TCC TGG AGI GGT TGT AAG T-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID N0: 78); 및
5'-TGC TGC TCC TGG AGI GGT GTTG T-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 79).
본 발명은 적어도 하나의 변형된 IRS를 포함하는 IRP 및 IRC를 더 제공한다. 변형된 IRS는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변형은 변형된 염기, 변형된 당, 및/또는 변형된 포스페이트일 수도 있다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변형은 자연적으로 발생한 변형일 수도 있다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변형은 합성 변형일 수도 있다. 일부 구체예에서, 변형은 폴리뉴클레오티드의 조립 전 또는 후에 전달될 수도 있다. 일부 구체예에서, 변형된 뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. "변형된 뉴클레오티드" 또는 변형된 뉴클레오시드"는 여기에 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 "유사체"의 동의어로서 한정된다.
일부 구체예에서, IRS 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형을 포함한다 (예를 들어, 뉴클레오티드는 변형을 포함한다). 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형을 포함한다 (예를 들어, 서열 Nz는 변형을 포함한다). 일부 구체예에서, 적어도 하나의 변형은 다양한 또는 각각의 뉴클레오티드에 대하여 같은 변형이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드는 변형되고 변형은 2'-0-메틸 당 변형 (즉, 뉴클레오티드 N은 변형으로 구성되고 변형은 2'-0-메틸 당 변형이다). 일부 구체예에서, 적어도 하나의 변형은 뉴클레오티드의 하나 이상의 다른 타입의 변형을 포함한다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변형은 변형된 염기를 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 염기"는 "염기 유사체"의 동의어이다, 예를 들어, "변형된 시토신"은 "시토신 유사체"의 동의어이다. 염기 변형의 예는 IRP의 시토신의 C-5 및/또는 C-6에 전자-끌기 모이어티의 추가를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게도, 전자-끌기 모이어티는 할로겐, 예를 들어, 5'-브로모시토신, 5'-클로로시토신, 5'-플루오로시토신, 5'-이오도시토신이다. 일부 구체예에서, 염기 변형은 면역 조절 폴리뉴클레오티드의 우라실의 C-5 및/또는 C-6에 전자-끌기 모이어티의 추가를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게도 전자-끌기 모이어티는 할로겐이다. 이러한 변형된 우라실은 5'-브로모우라실, 5'-클로로우라실, 5'-플루오로우라실, 5'-이오도우라실을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 염기 변형은 6-티오-구아닌, 4-티오-티민, 및 4-티오-우라실을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 염기에 하나 이상의 티올기의 추가를 포함한다. 일부 구체예에서, 염기 변형은 N4-에틸시토신, 7-데아자구아닌, 및 5'-히드록시시토신을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 참조예, Kandimalla et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9: 807-813. 일부 구체예에서, IRS는 2'-데옥시유리딘 및/또는 2-아미노-2'-데옥시아데노신을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 변형된 염기는 메틸화 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 메틸화 변형은 5'-메틸-시토신 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 다양한 염기 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 염기 변형은 같다. 일부 구체예에서, 염기 변형은 다르다. 일부 구체예에서, IRS는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5개의 다른 염기 변형 중 어느 것을 포함한다. 변형된 IRS의 제조에서 염기 변형은 또한 어느 포스페이트 변형 및/또는 당 변형으로 만들어질 수도 있고 이와 결합될 수도 있다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변형은 변형된 포스페이트를 포함한다. 일부 구체예에서, 변형된 포스페이트는 포스포디에스테르 결합 변형이다. 예를 들어, 포스페이트 변형은 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포아미데이트, 포스포르아미데이트 (브리징 또는 비-브리징), 포스포트리에스테르 및 포스포로디티오에이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않고 어느 조합으로도 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 포스페이트는 5'-말단 인터뉴클레오티드 포스포디에스테르 결합 변형이다. 예를 들어, 5'-말단 인터뉴클레오티드 포스포디에스테르 결합 변형은 알킬 또는 아릴 포스포트리에스테르, 알킬 또는 아릴 포스포네이트, 히드로겐 포스포네이트, 포스포르아미데이트, 및/또는 포스포로셀레네이트 결합 변형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 5'-말단 인터뉴클레오티드 포스포디에스테르 결합 변형은 포스포르아미데이트 변형이다. 일부 구체예에서, 변형된 포스페이트는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (0)NR2 ('아미데이트'), P(0)R, P(R)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈")에 의해 대체되는 구체예를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 각각의 R 또는 R'은 독립적으로 H 또는 선택적으로 에테르 (-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 시클로알클릴, 시클로알케닐, 또는 아랄딜을 함유하는, 치환되거나 치환되지 않는 알킬 (1-20 C)이다.
일부 구체예에서, IRS는 적어도 하나의 포스포티오에이트 백본 결합을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, IRS의 폴리뉴클레오티드는 단지 포스포로티오에이트 백본을 포함한다. 일부 구체예에서, IRS의 폴리뉴클레오티드는 단지 포스포디에스테르 백본을 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 결합의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 포스페이트 백본에서 포스페이트 결합의 조합을 포함할 수도 있다.
IRS는 포스페이트-변형된 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, 이것의 일부는 폴리뉴클레오티드를 안정화할 수도 있다. 따라서, 일부 구체예는 안정화된 면역 조절 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 다양한 포스페이트 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 포스페이트 변형은 같다. 일부 구체예에서, 포스페이트 변형은 다르다. 일부 구체예에서, IRS는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5개의 다른 포스페이트 변형 중 어느 것을 포함한다. 변형된 IRS의 제조에서 포스페이트 변형은 또한 어느 포스페이트 변형 및/또는 당 변형으로 만들어질 수도 있고 이와 결합될 수도 있다.
일부 구체예에서, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변형은 변형된 당을 포함한다. 본 발명에 사용된 IRP는 하나 이상의 변형된 당 또는 당 유사체를 포함할 수도 있다. 따라서, 리보스 및 데옥시리보스에 더하여, 당 모이어티는 펜토스, 데옥시펜토스, 헥소스, 데옥시헥소스, 글루코스, 아라비노스, 질로스, 릭소스, 및 당-유사체-시클로펜틸기일 수 있다. 당은 피라노실 또는 퓨라노실 형태일 수 있다. IRS에서, 당 모이어티는 바람직하게 리보스, 데옥시리보스, 아라비노스 또는 2'-0-알킬리보스의 퓨라노시드이다. 일부 구체예에서, 당은 α 또는 β 아노머 배열에서 각각의 헤테로시클릭 염기에 부착될 수 있다. 일부 구체예에서, 당은 일반적으로 존재하는 히드록실기를 대체함으로써 변형된다. 당에 일반적으로 존재하는 히드록실기는, 예를 들어, 제한되지 않지만, 포스포네이트기 또는 포스페이트기에 의해 대체될 수도 있다. 5' 및 3' 말단 히드록실기는 추가적으로 인산화될 수 있거나 아민기 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캐핑기 모이어티로 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 당은 2'-알콕시-RNA 유사체, 2'-아미노-RNA 유사체, 2'-플루오로-DNA, 및 2'-알콕시-또는 아미노-RNA/DNA 키메라를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 2'-당 변형이다. 일부 구체예에서, 변형된 당은 2'-0-메틸-, 2'-0-알릴, 또는 2'-아지도-당 변형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 2'-변형된 당은 2'-0-메틸 당 변형이다. 일부 구체예에서, 2'-변형된 당은 2'-0-메톡시에틸 당 변형이다. 예를 들어, IRS의 당 변형은 2'-0-메틸-유리딘, 2'-0-메틸-티미딘, 2'-0-메틸-아데닌, 2'-0-메틸-구아닌, 또는 2'-0-메틸-시티딘을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 당-변형된 뉴클레오티드는 하나 이상의 당 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 이 당들 또는 당 유사체들 및 이러한 당들 또는 유사체들이 헤테로시클릭 염기 (핵산 염기) 그 자체에 부착되는 각각의 "뉴클레오시드"의 제조는 잘 알려져 있고, 어느 특이적 예와 관련될 수 있는 이러한 제조의 범위를 제외하고, 여기에 설명될 필요가 없다. 일부 구체예에서, IRS는 다양한 당 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 당 변형은 같다. 일부 구체예에서, 당 변형은 다르다. 일부 구체예에서, IRS는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5개의 다른 당 변형 중 어느 것도 포함한다. 변형된 IRS의 제조에서 당 변형은 또한 어느 염기 변형 및/또는 포스페이트 변형으로 만들어질 수도 있고 이와 결합될 수도 있다.
여기에 설명된 변형된 폴리뉴클레오티드 중 어느 것도 폴리뉴클레오티드 서열의 어느 곳의 변형도 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 말단 또는 근처의 뉴클레오티드의 변형이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 말단에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드 중 어느 것이 변형된다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 말단에서, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드 중 어느 것이 변형된다. 일부 구체예에서, 변형은 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단 또는 근처의 뉴클레오티드의 변형이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드 중 어느 것이 변형된다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단에서, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드 중 어느 것이 변형된다. 일부 구체예에서,
폴리뉴클레오티드 서열의 5' 말단 또는 근처의 뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단 또는 근처의 뉴클레오티드 모두가 변형된다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 말단에서 및 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드 중 어느 것이 변형된다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 말단에서 및 폴리뉴클레오티드 서열의 3' 말단에서, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드 중 어느 것이 변형된다.
일부 구체예에서, 식 5'-RγJGCNz-3' (SEQ ID NO: 147)의 뉴클레오티드 서열이 변형된다. 변형은 상기 어느 설명된 것, 예를 들어, 변형된 염기, 변형된 당, 변형된 포스페이트일 수도 있다. 일부 구체예에서, 변형은 2'-당 변형, 5'-말단 인터뉴클레오티드 포스포디에스테르 결합 변형, 및/또는 5'-메틸-시토신 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 포스페이트 또는 말단 변형일 수도 있다. 일부 구체예에서, 포스페이트 또는 말단 변형은 5'-말단 인터뉴클레오티드 포스포디에스테르 결합 변형일 수도 있다. 일부 구체예에서, 5'-말단 인터뉴클레오티드 포스포디에스테르 결합 변형은 알킬 또는 아릴 포스포트리에스테르, 알킬 또는 아릴 포스포네이트, 히드로겐 포스포네이트, 포스포르아미데이트, 및 포스포로셀레네이트 결합 변형으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 5'-말단 인터뉴클레오티드 포스포디에스테르 결합 변형은 포스포르아미데이트 변형이다. 일부 구체예에서, 변형은 당 변형일 수도 있다. 일부 구체예에서, 당 변형은 여기에 설명된 바와 같이 2'-당 변형이다. 일부 구체예에서, 2'-당 변형은 2'-0-메틸 당 변형 또는 2'-0-메톡시에틸 당 변형이다. 일부 구체예에서, 변형은 변형된 염기, 예를 들어, 5'-메틸-시토신 변형이다.
일부 구체예에서, 변형된 IRS는 (SEQ ID NO: 80) 5'-UGCUCCUGGAGGGGUUGU-3'이며, 모든 뉴클레오티드는 포스포르아미데이트 변형 (포스페이트 변형)으로 변형된다. 일부 구체예에서, 변형된 IRS는 (SEQ ID NO: 81) 5'-UGCUCCUGGAGGGGUUGU-3'이며, 모든 시토신은 5'-메틸 dC (M) 변형 (염기 변형)으로 변형된다.
일부 구체예에서, 변형된 IRS는 2'-0-Me 변형으로 변형된다. 일부 구체예에서, 2'-0-Me 변형으로 변형되는 변형된 IRS 다음 중 어느 것이다:
5'-UGC UCC UGG AGG GGU UGU-3' (SEQ ID NO: 82)
5'-UGC TCC TGG AGG GGT TGT-3' (SEQ ID NO: 83);
5'-TGC TCC TGG AGG GGU UGU-3' (SEQ ID NO: 84);
5'-UGC TCC TGG AGG GGU UGU-3' (SEQ ID NO: 85);
5'-TGC TCC TGG AGG GGT TGT-3' (SEQ ID NO: 86);
5'-UGC TTG TCC TGG AGG GGT TGT-3' (SEQ ID NO: 87);
5'-TGC TCC TGG AGG GGA AGT UUG U-3' (SEQ ID NO: 88);
5'-UGC TTG TCC TGG AGG GGU UGU-3' (SEQ ID NO: 89);
5'-UGC TTG TCC TGG AGG GGA AGT UUG U-3' (SEQ ID NO: 90);
5'-UGC TG TCC TGG AGG GGA AGT UUG U-3' (SEQ ID NO: 91);
5'-UGC G TCC TGG AGG GGA AGT UUG U-3' (SEQ ID NO: 92);
5'-UGC TTG TCC TGG AGG GG TG UUG U-3' (SEQ ID NO: 93);
5'-UGC TG TCC TGG AGG GG TG UUG U-3' (SEQ ID NO: 94);
5'-UGC G TCC TGG AGG GG TG UUG U-3' (SEQ ID NO: 95);
5'-UGC TTG TCC TGG AGG GGT UGU-3' (SEQ ID NO: 96);
5'-UGC TG TCC TGG AGG GGT UGU-3' (SEQ ID NO: 97);
5'-UGC G TCC TGG AGG GGT UGU-3' (SEQ ID NO: 98);
5'-UGC TTG TCC TGG AGG GGT TGT UUG U-3' (SEQ ID NO: 99);
5'-UGC TTG TCC TGG AGG GGT TGU UUG U-3' (SEQ ID NO: 100);
5'-UGC TGC TCC TGG AGG GGT TGT UUG U-3' (SEQ ID NO: 101);
5'-UGC TGC TCC TTG AGG GGT TGT UUG U-3' (SEQ ID NO: 102);
5'-UGC TGC TCC TTG AGG GGT GUU GU-3' (SEQ ID NO: 103);
5'-UGC TGC TCC TTG AGG GGT TGU UUG U-3' (SEQ ID NO: 104);
5'-UGC UGC UCC UUG AGA GGU UGU-3' (SEQ ID NO: 105);
5'-UGC TGC TCC TGG AGG GGT TGU UUG U-3' (SEQ ID NO: 106);
5'-UGC TGC TCC TTG AGG GGT TGT TTG T-3' (SEQ ID NO: 107); 또는
5'-UGC TGC TCC TGG AGG GGT TGT TTG T-3' (SEQ ID NO: 108);
5'-UGC TGC TCC TTG AGI GGT TGT TTG T-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 109);
5'-UGC TGC TCC TTG AGZ' GGT TGT TTG T-3', 여기에서 Z'=7-데아자-dG (SEQ ID NO: 110);
5'-UGC TGC TCC TTG AGI GGT TGT TTG-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 111);
5'-UGC TGC TCC TTG AGI GGT TGT TT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 112);
5'-UGC TGC TCC TTG AGI GGT TGT T-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 113);
5'-UGC TGC TCC TTG AGI GGT TGT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 114);
5'-UGC TGC TCC TTG AGI GGT T-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 115);
5'-UGC TGC TCC TTG AGI GGT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 116);
5'-UGC TGC TCC TTG AGI GG-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 117);
5'-UGC TGC TCC TTG AGI G-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: l 18);
5'-UGC TGC TCC TTG AGI-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 119);
5'-GC TGC TCC TTG AGI GGT TGT TTG T-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 120);
5'-C TGC TCC TTG AGI GGT TGT TTG T-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 121);
5'-UGC TGC TCC TTG AGI GGT TG-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 122);
5'-UGC TTG TCC TGG AGI GGT TGT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 123);
5'-UGC TTG TCC TGG AGI GGT GTT GT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 124);
5'-UGC TGC TCC TGG AGI GGT TGT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 125);
5'-UGC TGC TCC TTG AGI GGT TGT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 126);
5'-UGC TGC TCC TTG AGI GGT TGT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 127);
5'-UGC TGC TCC TTG AGI GGT GTT GT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 128);
5'-UGC TGC TCC TTG AGI GGT TG TAAGT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 129);
5'-UGC TGC TCC TGG AGI GGT TG TAA GT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 130);
5'-UGC TCC TGG AGG GGU UGU-3' (SEQ ID NO: 131);
5'-UGC TGC TCC TGG AGI GGT GTT GT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 132);
5'-U GC-ddd-TCC TGG AGI GGT TG T-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 및 d is di에틸di티오dicarbonate (SEQ ID NO: 133);
5'-UGC CAA TCC TGG AGI GGT TGT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 134);
5'-UGC CAA TCC TGG AGI GGT GTT GT-3', 여기에서 I=데옥시-이노신 (SEQ ID NO: 135); 여기에서 굵고 이탤릭체로 쓰인 뉴클레오티드는 2'-0-Me 당 변형으로 변형된다.
TLR7 및/또는 TLR9를 억제하는데 효과적인 IRP의 다른 전형적인 예는, 예를 들어, PCT/US2005/030494 및 PCT/US2008/012220에서 발견되며, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
IRS의 어느 것의 일부 구체예에서, 변형된 IRS의 유리딘 (U) 뉴클레오시드는 티미딘 (T) 뉴클레오시드로 치환될 수도 있다. 일부 구체예에서, IRS의 모든 유리딘 (U) 뉴클레오시드는 티미딘 (T) 뉴클레오시드로 치환될 수도 있다. IRS의 어느 것의 일부 구체예에서, 변형된 IRS의 티미딘 (T) 뉴클레오시드는 유리딘 (U) 뉴클레오시드로 치환될 수도 있다. 일부 구체예에서, IRS의 모든 티미딘 (T) 뉴클레오시드는 유리딘 (U) 뉴클레오시드로 치환될 수도 있다. 일부 구체예에서, 변형된 IRS는 유리딘 (U) 뉴클레오시드 및 티미딘 (T) 뉴클레오시드 모두를 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 면역 조절 폴리뉴클레오티드는 (염기 또는 염기쌍으로) 약 다음 길이 중 어느 것보다 작다: 10000; 5000; 2500; 2000; 1500; 1250; 1000; 750; 500; 300; 250; 200; 175; 150; 125; 100; 75; 60; 50; 40; 30; 25; 20; 15; 14; 13; 12; 11; 10; 9; 8; 7; 6; 5; 4. 일부 구체예에서, 면역 조절 폴리뉴클레오티드는 (염기 또는 염기쌍으로) 약 다음 길이 중 어느 것보다 크다: 4; 5; 6, 7, 8, 9, 10 11; 12; 13; 14; 15; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 500; 750; 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 50000. 대안으로, 면역 조절 폴리뉴클레오티드는 10,000; 50,000; 2500; 2000; 1500; 1250; 1000; 750; 500; 300; 250; 200; 175; 150; 125; 100; 75; 60; 50; 40; 30; 25; 20; 15; 14; 13; 12; 11; 10 9; 8; 7; 6; 5; 4의 상한 및 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10 11; 12; 13; 14; 15; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 500; 750; 1000; 2000; 5000; 7500의 독립적으로 선택되는 하한을 갖는 크기의 범위 중 어느 것일 수 있으며, 하한은 상한보다 작다. 일부 구체예에서, IRP는 길이가 바람직하게도 약 200 이하 염기 또는 염기쌍이다.
여기에 입증된 바와 같이, IRS를 포함하는 특정 IRP 및 IRC는 TLR-7 의존적인 세포 반응 및/또는 TLR9 의존적인 세포 반응을 억제한다. 일부 구체예에서, 특정 IRP는 TLR4 의존적인 세포 반응을 억제하지 않는다. 일부 구체예에서, 여기에 설명된 바와 같이, 변형된 IRS를 포함하는 IRP 및/또는 IRC는 시험관 내, 생체 내, 및/또는 생체 외에서 측정된 바와 같이 측정 가능한 면역 반응을 억제하고 및/또는 억제한다. 일부 구체예에서, 면역 반응은 선천성 면역 반응이다. 일부 구체예에서, 면역 반응은 후천성 면역 반응이다.
여기에 설명된 바와 같이, 일부 IRS는 TLR9 의존적인 세포 반응을 억제하는데 특히 효과적이다. 이러한 IRS는 SEQ ID NO: 1-14, 16, 37, 42-79, 및 83-117, 및 120-145를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
여기에 설명된 바와 같이, 일부 IRS는 TLR7 의존적인 세포 반응을 억제하는데 특히 효과적이다. 이러한 IRS는 SEQ ID NO: 17-36, 37, 42-79, 82-145를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
여기에 설명된 바와 같이, 일부 IRS는 TLR7 의존적인 세포 반응을 억제하는데 특히 효과적이다. 이러한 IRS는 SEQ ID NO: 42-79 및 83-117, 및 120-145를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구체예에서, IRP 또는 IRC는 SEQ ID NO: 64-78, SEQ ID NO: 123-135, 및 SEQ ID NO: 141-145로 구성된 그룹으로부터 선택되는 IRS를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나의 IRS이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, IRP 또는 IRC는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹으로부터 선택되는 IRS를 포함한다.
IRS의 어느 것의 일부 구체예에서, IRS는 치료적으로 허용 가능한 안전성 프로파일을 갖고 예를 들어, 있으면, 허용 가능하게 낮은, 간, 신장, 췌장 또는 다른 기관의 독성을 포함하는 치료적으로 허용 가능한 조직학적 프로파일을 가질 수도 있다. IRS가 특정 기관, 예를 들어, 간, 신장 및 췌장에 대한 독성을 나타낼 수 있고 여기에 제공되는 특정 선택된 IRS가 예상되지 않고 이로운 향상된 안전성 프로파일을 제공할 수 있다는 것이 관찰되었다. 일부 구체예에서, 치료적으로 허용 가능한 안전성 프로파일은 독성, 조직학적 프로파일, 및/또는 괴사의 평가 (예를 들어, 간, 신장 및/또는 심장의 평가에서)를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 치료적으로 허용 가능한 독성을 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 여기에 제공된 실시예에서 도시된 바와 같이 또 다른 IRS와 비교하여 감소된 독성을 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 낮거나 감소된 독성을 갖는다 (예를 들어, 또 다른 IRS, 예를 들어, SEQ ID NO: 79 또는 SEQ ID NO: 109). 일부 구체예에서, IRS는 치료적으로 초기 중량과 비교하여 허용 가능한 중량의 감소를 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 중량의 5%, 7. 5%, 10%, 12. 5, 또는 15% 감소 중 어느 것보다 낮게 감소시킨다 (예를 들어, 실시예 3에 설명된 방법에 의해 결정된 바와 같이). 일부 구체예에서, IRS는 치료적으로 허용 가능한 조직학 프로파일을 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 더 좋은 (예를 들어, 낮은 점수) 조직학적 프로파일을 갖는다 (예를 들어, 또 다른 IRS, 예를 들어, NO: 79 또는 SEQ ID NO: 109와 비교하여). 일부 구체예에서, IRS는 예를 들어, 실시예 3에 설명된 방법에 의해 결정된 바와 같이, 간, 신장 및 심장의 평가에서 더 좋은 (및/또는 더 낮은 점수) 조직학적 프로파일을 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 치료적으로 허용 가능한 괴사 점수를 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 감소된 괴사 및/또는 더 좋은 (예를 들어, 더 낮은) 괴사 점수를 갖는다 (예를 들어, 또 다른 IRS, 예를 들어, SEQ ID NO: 79 또는 SEQ ID NO: 109와 비교하여). 일부 구체예에서, 평균 괴사 점수는 약 3 이하이다. 일부 구체예에서, 평균 괴사 점수는 약 2 이하이다. 일부 구체예에서, 평균 괴사 점수는 약 1 이하이다. 일부 구체예에서, 평균 괴사 점수는 약 0 이하이다. 일부 구체예에서, IRS는 예를 들어, 실시예 3에 설명된 방법에 의해 결정된 바와 같이, 감소된 신장 및/또는 간세포 괴사 및/또는 더 좋은 신장 및/또는 간세포 괴사 점수를 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹 중 하나의 IRS이거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, IRS는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
IRS의 어느 것의 일부 구체예에서, IRS는 치료적으로 허용 가능한 pK를 갖는다. 상기 방법 중 어느 것의 일부 구체예에서, IRS는 PK 프로파일 또는 실시예에 설명된 바와 같이 또 다른 IRS와 유사한 PK를 갖는다. 일부 구체예에서, 치료적으로 허용 가능한 안전성 프로파일은 마우스 또는 래트에서 결정된다. 일부 구체예에서, 치료적으로 허용 가능한 안전성 프로파일은 래트에서 결정된다.
IRS의 어느 것의 일부 구체예에서, IRS는 치료적으로 허용 가능한 B-세포 활성화를 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 감소되거나 낮은 B-세포 관련된 독성을 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 감소되거나 낮은 B-세포 활성화를 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 양성 대조군 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 면역 자극 서열 (ISS)), 또 다른 IRS, 또는 음성 대조군 폴리뉴클레오티드와 비교하여 및 여기에 제공된 실시예에 도시된 바와 같이 감소되거나 낮은 B-세포 활성화를 갖는다. 일부 구체예에서, IRS는 대조군, 예를 들어, 음성 대조군 폴리뉴클레오티드보다 유의적으로 더 높은 수준으로 B-세포 활성화를 유발하지 않는다. 일부 구체예에서, IRS는 대조군 예를 들어, 양성 대조군 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, ISS)보다 유의적으로 더 낮은 수준으로 B-세포 활성화를 유발한다. 일부 구체예에서, IRS는 양성 대조군 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, ISS)와 비교하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 중 어느 것보다 낮은 수준으로 세포 배양 검정의 B-세포 활성화를 유발한다. 일부 구체예에서, IRS는 양성 대조군 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, ISS)와 비교하여 약 5%, 10%, 15%, 또는 20% 중 어느 것보다 낮은 수준으로 세포 배양 검정의 B-세포 활성화를 유발한다. 일부 구체예에서, IRS의 B-세포 활성화는 양성 대조군 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, ISS)에 대하여 표준화된다. 일부 구체예에서, 다양한 IRS의 표준화된 결과는 비교된다. 일부 구체예에서, IRS는 두 번째 IRS보다 유의하게 낮은 수준에 대하여 B-세포 활성화를 유발한다. 일부 구체예에서, IRS는 배지 단독보다 유의하게 더 높은 수준 또는 음성 대조군 폴리뉴클레오티드에 대하여 세포 배양 검정의 B-세포 활성화를 유발하지 않는다. 일부 구체예에서, IRS는 양성 대조군 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, ISS)보다 유의하게 더 낮은 수준에 대하여 세포 배양 검정의 B-세포 활성화를 유발한다. 일부 구체예에서, IRS는 예를 들어, 약 4000 nM 내지 약 15 nM의 범위에 걸쳐, 농도-의존적인 B-세포 활성화를 나타낸다. 일부 구체예에서, IRS는 예를 들어, 약 4000 nM 내지 약 15 nM의 범위에 걸쳐, 낮은 농도-의존적인 B-세포 활성화를 나타낸다. 일부 구체예에서, B-세포 활성화는 실시예 1 및/또는 도 1c에 설명된 바와 같이 결정된다.
선천성 면역 반응의 면역 조절 핵산 및 다른 자극기는 업계에 설명되었고 그것들의 활성은 선천성 면역 반응, 예를 들어, 시토킨 분비, 항체 생산, NK 세포 활성화, B 세포 증식, T 세포 증식, 수지상세포 성숙의 다양한 양태를 나타내는 표준 검정을 사용하여 쉽게 측정될 수도 있다. 참조예, Krieg et al. (1995) Nature 374: 546-549; Yamamoto et al. (1992) J. Immunol. 148: 4072-4076; Klinman et al. (1997) J. Immunol. 158: 3635-3639; Pisetsky (1996) J. Immunol. 156: 421-423; Roman et al. (1997) Nature Med. 3: 849-854; Hemmi et al. (2000), Supra; Lee et al. (2003), Supra; WO 98/16247; WO 98/55495; WO 00/61151 및 미국 특허 번호 6,225,292. 따라서, 이 또는 다른 방법들은 면역 조절 서열, 폴리뉴클레오티드 및/또는 화합물을 확인하고, 테스트하고 및/또는 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, IRP 또는 IRC의 효과는 선천성 면역 반응이 자극되는 세포 또는 개인이 IRP 또는 IRC와 접촉될 때 결정될 수 있다.
면역 조절 화합물
여기에 제공된 것은 또한 IRC이며, 이것은 면역 조절 활성을 갖고 여기에 설명된 방법에 사용되는 IRS, 및 IRC를 포함하는 핵산 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, IRC는 변형된 IRS를 포함한다. 일부 구체예에서, IRC는 변형된 IRS를 포함한다. 일부 구체예에서, IRC는 변형된 및 변형되지 않은 IRS 모두를 포함한다. 여기에 제공된 IRC는 하나 이상의 핵산 모이어티 및 하나 이상의 비-핵산 스페이서 모이어티를 함유한다. 다양한 구조적 식으로 확인하는 화합물은 IRC로서 사용되는 것으로 고려되고, 상기, 식 I-VII에 설명된 코어 구조를 포함한다. 식 I-III는 "선형 IRC"에 대한 코어 서열을 나타낸다. 식 IV-VI는 "분지형 IRC"에 대한 코어 서열을 나타낸다. 식 VII는 "단일 스페이서 IRC"에 대한 코어 구조를 나타낸다.
여기에 제공된 각각의 식에서, "N"은 핵산 모이어티 (5'-3' 또는 3'-5' 방향으로 향하는)를 지정하고 "S"는 비-핵산 스페이서 모이어티를 지정한다. 대시 ("-")는 핵산 모이어티 및 비-핵산 스페이서 모이어티 사이의 고유 결합을 지정한다. 이중 대시 ("--")는 비-핵산 스페이서 모이어티 및 적어도 2개의 핵산 모이어티 사이의 공유 결합을 지정한다. 삼중 대시 ("---")는 비-핵산 스페이서 모이어티 및 다양한 (즉, 적어도 3개) 핵산 모이어티 사이의 공유 결합을 지정한다. 첨자는 다르게 위치한 핵산 또는 비-핵산 스페이서 모이어티를 지정하기 위해 사용된다. 하지만, 다른 핵산 모이어티를 구별하기 위한 첨자의 사용은 모이어티가 반드시 다른 구조 또는 서열을 갖는다는 것을 나타내는 것은 아니다. 유사하게, 다른 스페이서 모이어티를 구별하기 위한 첨자의 사용은 모이어티가 반드시 다른 구조를 갖는다는 것을 나타내는 것은 아니다. 예를 들어, 식 II에서, 상기와 같이, 핵산 모이어티를 지정하는 N1 및N2는 같거나 다른 서열을 가질 수 있고, 스페이서 모이어티를 지정하는 S1 및 S2는 같거나 다른 구조를 가질 수 있다. 게다가, 추가적인 화학적 모이어티 (예를 들어, 포스페이트, 모노뉴클레오티드, 추가적인 핵산 모이어티, 알킬, 아미노, 티오 또는 이황화기 또는 결합자, 및/또는 스페이서 모이어티)는 코어 구조의 말단에서 공유 결합될 수도 있다고 고려된다.
선형 IRC는 코어 구조의 비-핵산 스페이서 모이어티가 2개 이하의 핵산 모이어티와 공유 결합되는 구조를 갖는다. 전형적인 선형 IRC는 다음 식으로 확인한다:
N1-S1-N2 (I)
N1-S1-N2-S2-N3 (II).
N1-S1-N2-S2-[Nv-Sv]A (III)
A가 1 내지 약 100의 정수이고 [Nv-Sv]가 A를 나타내는 경우 핵산 모이어티의 추가적인 반복은 비-핵산 스페이서 모이어티에 결합되었다. 첨자 "v"는 N 및 S가 "[Nv-Sv]"의 각각의 반복에서 독립적으로 선택된다는 것을 나타낸다. "A"는 가끔 1 내지 약 10이고, 가끔 1 내지 3이고, 가끔 정확하게 1, 2, 3, 4 또는 5이다. 일부 구체예에서, A는 1, 2, 3, 4, 또는 5의 하한 및 독립적으로 선택된 10, 20, 50 또는 100의 상한에 의해 한정된 범위의 정수이다 (예를 들어, 3 내지 10).
전형적인 선형 IRC는 다음을 포함한다:
N1-HEG-N2-OH (Id. at)
N1-HEG-N1-P04 (Ib)
N1-HEG-N2-HEG (Ic)
HEG-N1-HEG-N1-HEG (Id)
N1-HEG-N2-HEG-N1 (Ie)
N1-HEG-N2-(HEG)4-N3 (If)
(N1)2-글리세롤-N1-HEG-N1 (Ig)
P04-Na-HEG-N2 (Ih)
N1-(HEG)15-T (Ii)
N1-HEG-T-HEG-T (Ik)
N1-HEG-N2-TEG-N3 (IIa)
HEG는 헥사-(에틸렌 글리콜)을 나타낸다. TEG는 테트라-(에틸렌 글리콜)을 나타낸다. N1 및 N2; 및 S1 및 S2는-[NV-SV]A를 함유하지 않은 예에서 독립적으로 선택된다. IRP의 어느 것의 일부 구체예에서, IRP는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 서열이다. IRP의 어느 것의 일부 구체예에서, IRP는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및/또는 2'-0-Me 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 일부 구체예에서, IRP는 변형된 포스페이트 결합을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 구체예에서, IRP는 단지 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.
바람직한 선형 IRC는 다음을 포함한다:
5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-HEG-TCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 136);
5'-TGCTTGCAAGCTAGCAAGCA-HEG-TCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 137);
5'-TGCTTGCAAGCTTGCTAGCA-HEG-TCCTGGAGGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 138);
5'-TGCTTGCAAGCTTGCTAGCA-HEG-TCCTGGAGZGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 139);
5'-TCCTGGAGGGGTTGT-HEG-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3' (SEQ ID NO: 140);
5'-TGC TCC TGG AGG GGT TGT-HEG-HEG-3' (SEQ ID NO: 141);
5'-UGC TTG TCC TGG AGI GGT TG-HEG-T-3' (SEQ ID NO: 142);
5'-TGC TCC TGG AGI GGT TG-HEG-T-3' (SEQ ID NO: 143);
5'-TGC TGC TCC TGG AGI GGT TG-HEG-T-3' (SEQ ID NO: 144);
5'-UGC HEG TCC TGG AGI GGT TGT-3' (SEQ ID NO: 145);
5'-UGC HEG TCC TGG AGI GGT GTT GT-3' (SEQ ID NO: 77);
굵고 이탤릭체로 쓰인 뉴클레오티드는 2'-0-Me 당 변형으로 변형된다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 변형은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 백본 변형을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 단지 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 변형은 2'-당 변형을 포함한다. 이 구체예들의 서브세트에서, 2'-당 변형은 2'-0-메틸 당 변형 또는 2'-0-메톡시에틸 당 변형을 포함한다.
분지형 IRC는 적어도 3개 (3)의 핵산 모이어티와 공유 결합되는 다원자가 스페이서 모이어티 (SP)를 포함한다. 전형적인 분지형 IRC는 다음 식에 따라 설명된다
[NV]A---SP (IV)
[SV-NV]A---SP (V)
(S1-N1)-SP--(NV-SV)A (VI)
SP는 수량 "A"가 독립적으로 선택된 핵산 모이어티 NV, SV-NV와 공유 결합된 다원자가 스페이서이다 (이것은 핵산 모이어티와 공유 결합된 스페이서 모이어티를 포함한다). "[SV-NV]" 또는 "[NV-SV]"의 말단 반복은 단지 NV를 포함할 수도 있다. 식 IV 및 V에 대하여, A는 적어도 3이다. 식 IV 및 V의 다양한 구체예에서, A가 약 3, 5, 10, 50, 또는 100의 하한 및 독립적으로 선택된 약 5, 7, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 또는 500의 상한에 의해 한정된 범위의 정수일 수도 있지만, A는 3 내지 100의 정수이거나 (포함), 대안으로 A가 500 이상일 수도 있다. 식 VI에 대하여, A는 적어도 2이고, 2, 5, 10, 또는 100의 하한 및 독립적으로 선택된 5, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 또는 500, 또는 500 이상의 상한에 의해 한정된 범위의 정수이다.
전형적인 분지형 IRC는 다음을 포함한다:
(N1)2-글리세롤-N1 (IVa)
(N2-HEG)2-글리세롤-N1 (IVb)
(N1-HEG-N2)2-글리세롤-N1 (IVc)
[(N1)2-글리세롤-N1]2-글리세롤-N1 (IVd)
(N1-HEG)2-글리세롤-HEG-N2 (IVe)
(N1-HEG)a-글리세롤-N1-TEG-N1 (VIa)
HEG는 헥사-(에틸렌 글리콜)을 나타낸다. TEG는 테트라-(에틸렌 글리콜)을 나타낸다. IRP의 어느 것의 일부 구체예에서, IRP는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 서열이다. IRP의 어느 것의 일부 구체예에서, IRP는 2' 데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및/또는 2'-0-Me 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 일부 구체예에서, IRP는 변형된 포스페이트 결합을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 구체예에서, IRP는 단지 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.
바람직한 분지형 IRC는 (5'-N1-3'-HEG)2-글리세롤-HEG-5'-N1-3' 및 (5'-N1-3'-HEG)2-글리세롤-HEG-5'-N1'를 포함한다. IRP의 어느 것의 일부 구체예에서, IRP는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 서열이다. IRP의 어느 것의 일부 구체예에서, IRP는 2' 데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및/또는 2'-0-Me 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 일부 구체예에서, IRP는 변형된 포스페이트 결합을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 구체예에서, IRP는 단지 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.
단일 스페이서 IREC는 단일 스페이서 모이어티에 공유 결합된 단일 핵산 모이어티가 있는 구조, 즉,
N1-S1 (VII)
을 포함한다.
예를 들어, 상기 설명된 바와 같이, 바람직한 다양한 S1은 전형적으로 에스테르 결합 (예를 들어, 포스포디에스테르 EH는 포스포로티오에이트 에스테르)에 의해 결합된, 더 작은 단위를 포함하는 멀티머의 구조를 갖는다. 참조예, 식 VIIa, 상기. 멀티머는 헤테로머 또는 호모머일 수도 있다. 한 변이에서, 스페이서는 에스테르 결합 (예를 들어, 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 에스테르)에 의해 결합된 모노머 단위의 헤테로머 (예를 들어, HEG, TEG, 글리세롤, 1'2'-디데옥시리보스, C2 알킬과 C12 알킬 결합자, 등)이다. 참조예, 식 VIIb, 상기.
전형적인 단일 스페이서 IRC는 다음을 포함한다:
N1-(HEG)15 (VIIa)
N1-HEG-프로필-HEG-프로필-HEG (VIIb)
HEG는 헥사-(에틸렌 글리콜)을 나타낸다. IRP의 어느 것의 일부 구체예에서, IRP는 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 서열이다. IRP의 어느 것의 일부 구체예에서, IRP는 2' 데옥시리보 폴리뉴클레오티드 및/또는 2'-0-Me 당 폴리뉴클레오티드 키메라 서열이다. 일부 구체예에서, IRP는 변형된 포스페이트 결합을 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 구체예에서, IRP는 단지 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.
특정 구체예에서, IRC의 말단 구조는 공유 결합되고 (예를 들어, 핵산 모이어티와 핵산 모이어티; 스페이서 모이어티와 스페이서 모이어티, 또는 핵산 모이어티와 스페이서 모이어티), 원형 구조를 발생시킨다.
여기에 제공된 면역 조절 조성물에 사용되는 IRC는 적어도 하나의 핵산 모이어티를 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 모이어티"는 뉴클레오티드 모노머 (즉, 모노뉴클레오티드) 또는 폴리머 (즉, 적어도 2개의 근접한 뉴클레오티드를 포함)를 나타낸다. 여기에 사용된 바와 같이, 뉴클레오티드는 (1) 포스페이트기와 에스테르 결합에 있는 당과 결합된 퓨린 또는 피리미딘 염기, 또는 (2) 예를 들어, 상기 설명된 바와 같이, 염기 및/또는 당 및/또는 포스페이트 에스테르가 유사체에 의해 대체되는 유사체를 포함한다. 하나 이상의 핵산 모이어티를 포함하는 IRC에서, 핵산 모이어티는 같거나 다를 수도 있다.
면역 조절 조성물에 포함되는 IRC에 사용되는 핵산 모이어티는 여기에 개시된 IRS 서열 중 어느 것도 포함할 수 있고 추가적으로 6개 이하의 염기쌍의 서열일 수도 있다. 다양한 핵산 모이어티를 포함하는 IRC에서 핵산 모이어티는 같거나 다른 길이일 수 있다고 고려된다. 일부 구체예에서, IRC가 하나 이상의 핵산 모이어티를 포함하는 경우, 단 하나의 모이어티는 IRS를 포함해야 한다. 일부 구체예에서, IRS는 변형된 IRS이다. 일부 구체예에서, IRS는 변형되지 않은 IRS이다.
다양한 핵산 모이어티를 포함하는 IRC에서, 핵산 모이어티는 같거나 다를 수 있다고 고려된다. 따라서, 다양한 구체예에서, 면역 조절 조성물에 포함되는 IRC는 (a) 같은 서열을 가진 핵산 모이어티, (b) 핵산 모이어티의 하나 이상의 반복, 또는 (c) 둘 이상의 다른 핵산 모이어티를 포함한다. 추가적으로, 단일 핵산 모이어티는 하나 이상의 IRS를 포함할 수도 있으며, 이것은 인접하거나, 중복되거나 핵산 모이어티 내에 추가적인 뉴클레오티드 염기에 의해 분리될 수도 있다.
여기에 설명된 바와 같이, 일부 IRP는 TLR9 의존적인 세포 반응을 억제하는데 특히 효과적이고 일부 IRP는 TLR7 의존적인 세포 반응을 억제하는데 특히 효과적이다. IRC가 하나 이상의 IRP를 포함할 수도 있지만, 다양한 활성을 가진 IRP는 특정 사용을 위한 특정 활성을 갖는 IRC를 생성하도록 결합될 수 있다.
일부 예에서, IRC에서 2개의 IRP의 결합은 IRP 중 하나 단독과 다른 IRC의 면역 조절 활성으로 이어진다.
IRC는 핵산 모이어티와 공유 결합되는 하나 이상의 비-핵산 스페이서 모이어티를 포함한다. 편의상, 비-핵산 스페이서 모이어티는 가끔 여기에 간단하게 "스페이서" 또는 "스페이서 모이어티"로 나타난다. 스페이서는 일반적으로 약 50 내지 약 50,000, 전형적으로 약 75 내지 약 5000, 가장 흔히 약 75 내지 약 600의 분자량인데, 다양한 구체예에서, 이것은 1, 2, 3 이상의 핵산 모이어티와 공유 결합된다. 다양한 시약은 핵산 모이어티를 결합시키는데 적합하다. 예를 들어, "비-핵산 결합자", "비-뉴클레오티드 결합자", 또는 "원자가 플랫폼 분자"로 과학 문헌에 나타나는 다양한 화합물은 IRC에서 스페이서로서 사용될 수도 있다. 특정 구체예에서, 스페이서는 다양한 공유 결합된 부단위를 포함하고 호모폴리머 또는 헤테로폴리머 구조를 가질 수도 있다. 핵산 모이어티 및 인접한 비-핵산 스페이서 모이어티 사이에 차이가 없다는 배제 없이, 모노뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는 비-핵산 스페이서의 정의에 포함되지 않는다는 것을 인정할 것이다.
특정 구체예에서, 스페이서는 하나 이상의 모염기 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다 (즉, 뉴클레오티드 염기가 결핍되지만, 당 및 포스페이트 부분을 가짐). 전형적인 무염기 뉴클레오티드는 1'2'-디데옥시리보스, 1'-데옥시리보스, 1'-데옥시아라비노스 및 이들의 폴리머를 포함한다.
다른 적합한 스페이서는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 폴리글리콜, 선택적으로 치환된 폴리아민, 선택적으로 치환된 폴리알콜, 선택적으로 치환된 폴리아미드, 선택적으로 치환된 폴리에테르, 선택적으로 치환된 폴리이민, 선택적으로 치환된 폴리포스포디에스테르 (예를 들어, 폴리(1-포스포-3-프로판올), 등을 포함한다. 선택적인 치환기는 알콜, 알콕시 (예를 들어, 메톡시, 에톡시, 및 프로폭시), 직선형 또는 분지형 사슬 알킬 (예를 들어, C1-C12 알킬), 아민, 아미노알킬 (예를 들어, 아미노 C1-C12 알킬), 포스포르아미디트, 포스페이트, 티오포스페이트, 히드라지드, 히드라진, 할로겐 (예를 들어, F, CI, Br, 또는 I), 아미드, 알킬아미드 (예를 들어, 아미드 C1-C12 알킬), 카르복실산, 카르복실 에스테르, 카르복실 무수물, 카르복실산 할리드, 술포닐 할리드, 이미데이트 에스테르, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 할로포르메이트, 카르보디이미드 부가물, 알데히드, 케톤, 술프히드릴, 할로아세틸, 알킬 할리드, 알킬 술포네이트, R1R2가 -C(=0)CH=CHC(=0) (말레이미드)인 NR1R2, 티오에테르, 시아노, 당 (예를 들어, 만노스, 갈락토스, 및 글루코스), α, β-불포화 카르보닐, 알킬 머큐리얼, α, β-불포화 술폰을 포함한다.
적합한 스페이서는 다환성 분자, 예를 들어, 페닐 또는 시클로헥실 고리를 함유하는 것들을 포함할 수도 있다. 스페이서는 폴리에테르, 예를 들어, 폴리포스포프로판디올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 이기능적 다환성 분자, 예를 들어, 이기능성 펜탈렌, 인딘, 타프탈렌, 아줄렌, 헵탈렌, 비페닐렌, 비대칭적인 인다센, 대칭-인다센, 아세나프틸렌, 플루오렌, 페날렌, 페나트렌, 안트라센, 플로란센, 아세페나트릴렌, 아세안드릴렌, 트리페닐렌, 피렌, 크리센, 나프타센, 티안트렌, 이소벤조푸란, 크로멘, 잔텐, 페녹사티인일 수도 있으며, 이것은 치환되거나 변형될 수도 있고, 또는 폴리에테르 및 다환성 분자의 결합일 수도 있다. 다환성 분자는 C1-C5 알킬, C6 알킬, 알케닐, 히드록시알킬, 할로겐 또는 할로알킬기로 치환되거나 많이 치환될 수도 있다. 질소-함유 헤테로 다환성 분자 (예를 들어, 인돌리진)은 전형적으로 적합한 스페이서가 아니다. 스페이서는 또한 폴리알콜, 예를 들어, 글리세롤 또는 펜타에리트리톨일 수도 있다. 한 변이에서, 스페이서는 1-포스포프로판)3-포스페이트 또는 1-포스포프로판)4-포스페이트 (또한 테트라포스포프로판디올 및 펜타포스포프로판디올이라고 불림)를 포함한다. 한 변이에서, 스페이서는 유도된 2,2'-에틸렌디옥시디에틸아민 (EDDA)을 포함한다.
IRC에 유용한 비-핵산 스페이서의 특이적 예는 Cload et al. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 6324; Richardson et al. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 5109; Ma et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21: 2585; Ma et al. (1993) Biochemistry 32: 1751; McCurdy et al. (1991) Nucleosides & Nucleotides 10: 287; Jaschke et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34: 301; Ono et al. (1991) Biochemistry 30: 9914; 및 국제 출원 번호 WO 89/02439에 의해 설명된 결합자를 포함한다.
다른 적합한 스페이서는 Salunkhe et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 8768; Nelson et al. (1996) Biochemistry 35: 5339-5344; Bartley et al. (1997) Biochemistry 36: 14502-511; Dagneaux et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 4506-12; Durand et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 6353-59; Reynolds et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 760-65; Hendry et J. (1994) Biochem. Biophys. Acta 1219: 405-12; Altmann et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 4827-35에 의해 설명된 결합자를 포함한다. 또 다른 적합한 스페이서는 유럽 특허 번호 EP0313219B1 및 미국 특허 번호 6,117,657에 설명된다.
전형적인 비-핵산 스페이서는 올리고-에틸렌 글리콜 (예를 들어, 트리에틸렌 글리콜, 테트라에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜 스페이서, 및 최대 약 10, 약 20, 약 40, 약 50, 약 100 또는 약 200개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 다른 폴리머), 알킬 스페이서 (예를 들어, 프로필, 부틸, 헥실, 및 다른 C2-C12 알킬 스페이서, 예를 들어, 보통 C2-C10 알킬, 가장 흔히 C2-C6 알킬), 무염기 뉴클레오티드 스페이서, 글리세롤에서 유래된 대칭적인 또는 비대칭적인 스페이서, 펜타에리트리톨 또는 1,3,5-트리히드록시시클로헥산 (예를 들어, 여기에 설명된 대칭적인 이배기 (doubler) 및 삼배기 (trebler) 스페이서 모이어티)를 포함한다. 스페이서는 또한 상기 언급된 화합물 (예를 들어, 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 이황화, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포트리에스테르, 포스포로디티오에이트, 메틸 포스포네이트 또는 다른 결합에 의해 결합)의 헤테로머 또는 호모머 올리고머 및 폴리머를 포함한다.
적합한 스페이서 모이어티는 IRC에 대한 전하 및/또는 소수성에 기여할 수 있고, IRC에 대한 선호하는 약물동력학적 성질 (예를 들어, 향상된 안정성, 혈액에서 더 긴 체류 시간)에 기여할 수 있고, 및/또는 특정 세포 또는 기관에 대한 IRC의 표적화를 일으킬 수 있다. 스페이서 모이어티는 원하는 약물동력학적 성질 및 원하는 투여의 방식 (예를 들어, 경구 투여)에 대한 적합성 IRC를 맞추기 위하여 선택되거나 변형될 수 있다. 편의상, 스페이서 (또는 스페이서 구성요소)는 가끔 IRC가 실제로 화합물 및 인접한 핵산 모이어티 또는 다른 스페이서 모이어티 구성요소를 포함한다는 이해와 함께, 스페이서 구성요소가 유래된 화합물의 화학명 (예를 들어, 헥사에틸렌 글리콜)으로 불린다는 것이 독자들에 의해 인정될 것이다.
하나 이상의 스페이서 모이어티를 포함하는 IRC에서, 스페이서는 같거나 다를 수도 있다. 따라서, 한 변이에서 IRC의 모든 비-핵산 스페이서 모이어티는 같은 구조를 갖는다. 한 변이에서, IRC는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 6개 이상의 다른 구조를 가진 비-핵산 스페이서 모이어티를 포함한다.
일부 고려된 구체예에서, IRC의 스페이서 모이어티는 특정 구조를 배제하도록 한정된다. 따라서, 일부 구체예에서, 스페이서는 무염기 뉴클레오티드 또는 무염기 뉴클레오티드의 폴리머 이외의 것이다. 일부 구체예에서, 스페이서는 올리고(에틸렌글리콜) (예를 들어, HEG, TEG 등) 또는 폴리(에틸렌글리콜) 이외의 것이다. 일부 구체예에서, 스페이서는 C3 알킬 스페이서 이외의 것이다. 일부 구체예에서, 스페이서는 폴리펩티드 이외의 것이다. 따라서, 일부 구체예에서, 면역원성 분자, 예를 들어, 단백질 또는 폴리펩티드는 스페이서 모이어티의 구성요소로서 적합하지 않다. 하지만, 상기 논의된 바와 같이, 특정 구체예에서, IRC는 "단백질성 IRC", 즉, 폴리펩티드를 포함하는 스페이서 모이어티를 포함한다는 것이 고려된다. 하지만, 일부 구체예에서, 스페이서 모이어티는 단백질성이 아니고 및/또는 항원이 아니다 (즉, IRC로부터 분리되면, 스페이서 모이어티는 항원이 아니다).
일반적으로, 적합한 스페이서 모이어티는 그것들이 IRC의 구성요소인, IRC를 수용액 (예를 들어, PBS, pH 7. 0)에 불용성으로 만들지 않는다. 따라서, 스페이서의 정의는 미세담체 또는 나노담체를 배제한다. 추가로, 낮은 가용성을 가진 스페이서 모이어티, 예를 들어, 도데실 스페이서 (디알콜 전구체 1,12-디히드록시도데칸으로 측정될 때 5 mg/ml 미만의 가용성)는 그것이 IRC의 친수성 및 활성을 감소시킬 수 있기 때문에 바람직하지 않다. 바람직하게도, 스페이서 모이어티는 디알콜 전구체로 측정될 때 5 mg/ml보다 큰 (예를 들어, >20 mg/ml, >50 mg/ml 또는 >100 mg/ml) 가용성을 갖는다.
IRC의 전하는 포스페이트, 티오포스페이트, 또는 핵산 모이어티의 다른 기뿐만 아니라 비-핵산 스페이서 모이어티의 기에 의해 기여될 수도 있다. 일부 구체예에서, 비-핵산 스페이서 모이어티는 순전하 (예를 들어, pH 7에서 측정될 때 양성 순전하 또는 음성 순전하)를 운반한다. 한 유용한 변이에서, IRC는 음성 순전하를 갖는다. 일부 구체예에서, IRC에서 스페이서 모이어티의 음전하는 전하를 증가시키기 위해 여기에 설명된 스페이서 부단위의 유도에 의해 증가시킨다. 예를 들어, 글리세롤은 2개의 핵산 모이어티와 공유 결합될 수 있고 남은 알콜은 활성화된 포스포르아미디트와 반응된 후, 각각 포스페이트 또는 티오포스페이트를 형성하기 위해 산화 또는 황화될 수 있다. 특정 구체예에서 IRC의 비-핵산 스페이서 모이어티에 의해 기여되는 음전하 (즉, 하나 이상의 스페이서가 있을 때 전하의 합계)는 IRC의 핵산 모이어티에 의해 기여되는 음전하보다 더 크다. 분자식에 기초하여 전하를 계산하거나, 실험적으로, 예를 들어, 모세혈관 전기 영동에 의해 결정할 수 있다 (Li, ed., 1992, Capillary electrophoresis, Principles, Practice and Application Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands, pp202-206).
하기 지시된 바와 같이, 적합한 스페이서는 일반적으로 비-뉴클레오티드 "결합자"로 불리는 화합물을 포함하는, 자체가 스페이서로서 유용한 더 작은 비-핵산 (예를 들어, 비-뉴클레오티드) 화합물, 예를 들어, 여기에 설명된 것들의 폴리머일 수도 있다. 이러한 폴리머 (즉, "복합 단위 스페이서")는 헤테로머 또는 호모머일 수도 있고, 종종 에스테르 결합 (예를 들어, 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 에스테르)에 의해 결합된 모노머 단위 (예를 들어, HEG, TEG, 글리세롤, 1'2'-디데옥시리보스, 등)을 포함한다. 따라서, 한 변이에서 스페이서는 비-뉴클레오티드 단위의 폴리머 (예를 들어, 헤테로폴리머) 구조 (예를 들어, 2 내지 약 100 단위, 대안으로 2 내지 약 50, 예를 들어, 2 내지 약 5, 대안으로 예를 들어, 약 5 내지 약 50, 예를 들어, 약 5 내지 약 20)를 포함한다.
도시를 위하여, IRS 및 복합 단위 스페이서를 함유하는 IRC는 다음을 포함한다:
5'-TCCTGGAGGGGTTGT-(C3)15-T (SEQ ID NO: 153)
5'-TCCTGGAGGGGTTGT-(글리세롤)15-T (SEQ ID NO: 154)
5'-TCCTGGAGGGGTTGT-(TEG)8-T (SEQ ID NO: 155)
5'-TCCTGGAGGGGTTGT-(HEG)4-T (SEQ ID NO: 156).
(C3)15는 포스포로티오에이트 에스테르를 통해 결합된 15개의 프로필 결합자를 의미한다; (글리세롤)15는 포스포로티오에이트 에스테르를 통해 결합된 15개의 글리세롤 결합자를 의미한다; (TEG)8은 포스포로티오에이트 에스테르를 통해 결합된 8개의 트리에틸렌글리콜 결합자를 의미한다; 및 (HEG)4는 포스포로티오에이트 에스테르를 통해 결합된 4개의 헥사에틸렌글리콜 결합자를 의미한다. 특정 복합 단위 스페이서가 음성 순전하를 갖고, 음전하는 예를 들어, 에스테르-결합된 모노머 단위의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다는 것을 인정할 것이다.
특정 구체예에서, 스페이서 모이어티는 다원자가 비-핵산 스페이서 모이어티 (즉, "다원자가 스페이서")이다. 이 맥락에 사용된 바와 같이, 다원자가 스페이서를 함유하는 IRC는 셋 (3) 이상의 핵산 모이어티와 공유 결합된 스페이서를 함유한다. 다원자가 스페이서는 가끔 업계에서 "플랫폼 분자"로 불린다. 다원자가 스페이서는 폴리머 또는 비폴리머일 수 있다. 적합한 분자의 예는 글리세롤 또는 치환된 글리세롤 (예를 들어, 2-히드록시메틸 글리세롤, 레불리닐-글리세롤); 테트라아미노벤젠, 헵타아미노베타시클로덱스트린, 1,3,5-트리히드록시시클로헥산, 펜타에리트리톨 및 펜타에리트리톨의 유도체, 테트라아미노펜타에리트리톨, 1,4,8,11-테트라아자시클로 테트라데칸 (Cyclam), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 (Cyclen), 폴리에틸렌이민, 1,3-디아미노-2-프로판올 및 치환된 유도체, 프로필옥시메틸]에틸 화합물 (예를 들어, "삼배기"), 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 예를 들어, 소위 "Star PEG" 및 "bPEG" (참조예, G나노u et al. (1988) Makromol. Chem. 189: 2885; Rein et al. (1993) Acta Polymer 44: 225; 미국 특허 번호 5,171,264), 및 덴드리머를 포함한다.
덴드리머는 업계에 알려져 있고 일반적으로 분지형 구조를 얻기 위해 다기능성 모노머의 단계적 또는 반복적인 반응에 의해 제조되는 구형의 분자로 화학적으로 한정된다 (참조예, Tomalia et al. (1990) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29: 138-75). 다양한 덴드리머, 예를 들어, 아민-종결된 폴리아미도아민, 폴리에틸렌이민 및 폴리프로필렌이민 덴드리머가 알려져 있다. 전형적인 유용한 덴드리머는 소위 "폴리(아미도아민)("PAMAM") 덴드리머"를 포함하는, "덴스 스타" 폴리머 또는 "스타버스트" 폴리머, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,587,329; 5,338,532; 및 6,177,414에 설명된 것들을 포함한다. 사용에 적합한 또 다른 멀티머 스페이서 분자는 화학적으로 한정된, 비-폴리머 원자가 플랫폼 분자, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,552,391; 및 PCT 출원 공보 WO 00/75105, WO 96/40197, WO 97/46251, WO 95/07073, 및 WO 00/34231에 개시된 것들을 포함한다. 많은 다른 적합한 다원자가 스페이서가 사용될 수 있고 당업자에 알려질 것이다.
전형적으로 핵산 모이어티 및 플랫폼 분자에서 하나 이상의 가교제 및 작용기를 수반하는, 플랫폼 분자에 핵산 모이어티의 활용은 여러 방법으로 영향을 미칠 수 있다. 연결기를 표준 합성 화학 기술을 사용하여 플랫폼에 추가하였다. 연결기를 표준 합성 기술을 사용하여 핵산 모이어티에 추가하였다.
다양한 원자가를 갖는 다원자가 스페이서는 유용하고, 다양한 구체예에서, IRC의 다원자가 스페이서는 약 3 내지 약 400, 종종 3 내지 100, 가끔 3-50, 흔히 3-10개의 핵산 모이어티에 결합한다. 다양한 구체예에서, 다원자가 스페이서는 10개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 또는 500개 이상의 핵산 모이어티에 결합된다 (이것은 같거나 다를 수도 있다). IRC가 다원자가 스페이서를 포함하는 특정 구체예에서, 약간 다른 분자 구조를 가진 IRC의 집단이 여기에 제공된다는 것을 인정할 것이다. 예를 들어, 높은 원자가의 다원자가 스페이서로 덴드리머를 사용하여 IRC를 제조할 때, 분자의 약간의 불균질 혼합물이 생산된다, 즉, 각각의 덴드리머 분자와 결합된 다른 수 (결정 가능한 범위 내에 또는 주로 내에)의 핵산 모이어티를 포함한다.
핵산 모이어티에 결합을 허용하기 위해 유도된 다당류는 IRC의 스페이서로 사용될 수 있다. 적합한 다당류는 자연적으로 발생한 다당류 (예를 들어, 덱스트란) 및 합성 다당류 (예를 들어, 피콜)을 포함한다. 예를 들어, 아미노에틸카르복시메틸-피콜 (AECM-피콜)은 Inman (1975) J. Imm. 114: 704-709의 방법에 의해 제조될 수 있다. AECM-피콜은 헤테로 이기능성 가교제, 예를 들어, 6-말레이미도 카프로익 아실 N-히드록시숙신이미드 에스테르와 반응될 수 있고, 그 후 티올-유래된 핵산 모이어티와 결합될 수 있다 (Lee et al. (1980) Mol. Imm. 17: 749-56 참고). 다른 다당류는 유사하게 변형될 수도 있다.
통상적인 방법을 사용하여 IRC를 제조하는 것은 이 명세서 및 업계의 지식에 의해 안내된, 당업자의 능력 내에서 잘 될 것이다. 핵산 모이어티 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 및 변형된 올리고뉴클레오티드)를 만드는 기술이 알려져 있다. 핵산 모이어티는 효소적 방법 및 화학적 방법 및 효소적 및 화학적 접근법의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 포스포디에스테르 결합을 함유하는 DNA 또는 RNA는 이후에 적절한 뉴클레오시드 포스포르아미디트를 5'-말단에서 고체 지지대에 부착된 성장하는 올리고뉴클레오티드의 5'-히드록시기와 결합시킴으로써 화학적으로 합성된 후, 포스페이트 트리에스테르로 중간의 포스피트 트리에스테르의 산화가 일어날 수 있다. DNA 합성을 위해 유용한 고체 지지대는 Controlled Pore Glass (Applied Biosystems, Foster City, CA), 폴리스티렌 비드 매트릭스 (Primer Support, Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) 및 TentGel (Rapp Polymere GmbH, Tubingen, Germany)을 포함한다. 원하는 올리고뉴클레오티드 서열이 합성되면, 올리고뉴클레오티드는 지지대로부터 제거되고, 포스페이트 트리에스테르기는 포스페이트 디에스테르로 탈보호되고 뉴클레오시드 염기는 수성 암모니아 또는 다른 염기를 사용하여 탈보호된다.
예를 들어, 포스포디에스테르 결합을 함유하는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 (핵산 모이어티)는 일반적으로 다음 단계의 반복적인 반복에 의해 합성된다: a) 5'-고체 지지대-결합된 뉴클레오시드 또는 핵산의 5'-히드록실기로부터 보호기의 제거 단계, b) 활성화된 뉴클레오시드 포스포르아미디트와 5'-히드록실기가 결합하는 단계, c) 포스페이트 트리에스테르로 포스피트 트리에스테르의 산화 단계, 및 d) 반응되지 않은 5'-히드록실기의 캐핑. 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 DNA 또는 RNA는 산화 단계가 황화 단계로 대체되는 것을 제외하고, 상기 설명된 바와 같이 제조된다. 원하는 유클레오티드 서열이 합성되면, 올리고뉴클레오티드는 고체 지지대로부터 제거되고, 포스페이트 트리에스테르기는 포스페이트 디에스테르로 탈보호되고 뉴클레오시드 염기는 수성 암모니아 또는 다른 염기를 사용하여 탈보호된다. 참조예, Beaucage (1993) "Oligodeoxyribonucleotide Synthesis" in PROTOCOLS FOR OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGS, SYNTHESIS AND PROPERTIES (Agrawal, ed.) Humana Press, Totowa, NJ; Warner et al. (1984) DNA 3: 401; Tang et al. (2000) Org. Process Res. Dev. 4: 194-198; Wyrzykiewica et al. (1994) Bioorg. & Med. Chem. Lett. 4: 1519-1522; Radhakrishna et al. (1989) J. Org. Chem. 55: 4693-4699. 및 미국 특허 번호 4,458,066). 특이적 서열의 핵산 모이어티를 자동으로 합성하는 프로그램 작동 가능한 기계는 널리 이용 가능하다. 예는 Expedite 8909 자동화된 DNA 합성기 (Perseptive Biosystem, Framington MA); ABI 394 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA); 및 OligoPilot II (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 산-불안정한 5' 보호기 및 5'-포스포르아미디트를 함유하는 염기-보호 뉴클레오시드 (모노머)를 사용하여 3'에서 5' 방향으로 조립될 수 있다. 이러한 모노머의 예는 보호 뉴클레오시드의 예가 N6-벤조일아데노신, N4-벤조일시티딘, N2-이소부트리릴구아노신, 티미딘, 및 유리딘을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 경우, 5'-0-(4, 4'-디메톡시트리틸)-보호 뉴클레오시드-3'-0-(Ν, Ν-디이소프로필아미노) 2-시아노에틸 포스포르아미디트를 포함한다. 이 경우에서, 사용된 고체 지지대는 5'-결합된 보호 뉴클레오시드를 함유한다. 대안으로, 폴리뉴클레오티드는 산-불안정한 5'-보호기 및 5'-포스포르아미디트를 함유하는 염기-보호 뉴클레오시드를 사용하여 5'에서 3' 방향으로 조립될 수 있다. 이러한 모노머의 예는 보호 뉴클레오시드의 예가 N6-벤조일아데노신, N4-벤조일시티딘, N2-이소부트리릴구아노신, 티미딘, 및 유리딘을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 경우, 3'-0-(4, 4'-디메톡시트리틸)-보호 뉴클레오시드-5'-0-(N, N-디이소프로필아미노) 2-시아노에틸 포스포르아미디트를 포함한다 (Glen Research, Sterling, VA). 이 경우에서, 사용된 고체 지지대는 5'-결합된 보호 뉴클레오시드를 함유한다. 원형 핵산 성분은 분리되고, 재조합 방법을 통해 합성되거나, 화학적으로 합성될 수 있다. 화학적인 합성은 문헌에 설명된 어느 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 참조예, Gao et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 2025-2029 및 Wang et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 2326-2333.
비-핵산 스페이서 모이어티의 추가는 통상적인 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 특정 스페이서 모이어티의 추가 방법은 업계에 알려져 있고, 예를 들어, 상기 인용된 참고문헌에 설명된다. 참조예, Durand et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 6353-6359. 스페이서 모이어티 및 핵산 모이어티 사이의 공유 결합은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 이황화, 포스포르아미데이트, 포스포트리에스테르, 포스포로디티오에이트, 메틸 포스포네이트 및 다른 결합을 포함하는 여러 타입 중 어느 것일 수 있다. 핵산 모이어티의 합성에 사용되는 같은 포스포르아미디트-타입 화학법을 사용하여 스페이서 모이어티 및 핵산 모이어티를 결합시키는 것이 종종 편리할 것이다. 예를 들어, 여기에 설명된 IRC는 편의상 포스포르아미디트 화학법을 사용하는 자동화된 DNA 합성기 (예를 들어, Expedite 8909; Perseptive Biosystems, Framington, MA)를 사용하여 합성될 수 있다 (참조예, Beaucage, 1993, 상기; Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry , 상기). 하지만, 당업자는 자동화된 DNA 합성기에 의해 수행된 같은 (또는 동등한) 합성 단계가 또한, 원하면, 수동으로 수행될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 합성에서, 전형적으로, 하나의 스페이서의 말단 (또는 멀티머 스페이서에 대한 스페이서 부단위)은 4, 4'-디메티옥시트리틸기로 보호되지만, 다른 말단은 포스포르아미디트기를 함유한다.
필수적인 보호기 및 반응기를 가진 다양한 스페이서는 상업적으로 이용 가능하다, 예를 들어:
Figure pct00004
Figure pct00005
이것들 및 매우 다양한 다른 보호 스페이서 모이어티 전구체 (예를 들어, DMT 및 포스포르아미디트기 보호기를 포함)는 구입할 수 있거나 여기에 개시된 IRC를 제조하는데 사용되는 통상적인 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 기구는 제조사의 지시에 따라 원하는 순서에 뉴클레오티드 모노머 및 스페이서를 추가하도록 프로그램될 수 있다.
포스포르아미디트 화학법의 사용이 특정 IRC의 제조에 편리하지만, 여기에 설명된 IRC는 어느 특정 합성 또는 제조 방법에 의해 제조된 화합물에 제한되지 않는다고 인정될 것이다.
한 변이에서, 하나 이상의 타입의 핵산 모이어티와 결합된 다원자가 스페이서를 가진 IRC가 제조된다. 예를 들어, 2개의 말레이미드기를 함유한 플랫폼 (이것은 티올-함유 폴리뉴클레오티드와 반응할 수 있다), 및 두 개의 활성화된 에스테르기 (이것은 아미노-함유 핵산과 반응할 수 있다)가 설명되었다 (참조예, PCT 출원 공보 WO 95/07073). 이 2개의 활성화된 기는 독립적으로 서로와 반응될 수 있다. 이것은 4개의 핵산 모이어티 전체, 각각의 서열 중 2개를 함유하는 IRC를 일으킬 것이다.
2개의 다른 핵산 서열을 함유하는 다원자가 스페이서를 갖는 IRC는 또한 상기 설명된, 대칭적인 분지형 스페이서, 및 통상적인 포스포르아미디트 화학법을 사용하여 (예를 들어, 수동 또는 자동화된 방법을 사용하여) 제조될 수 있다. 대칭적인 분지형 스페이서는 하나의 포스포르아미디트기 및 같고 동시에 제거되는 2개의 보호기를 함유한다. 한 접근에서, 예를 들어, 첫 번째 핵산이 합성되고 대칭적인 분지형 스페이서와 결합되고, 보호기는 스페이서로부터 제거된다. 이후 2개의 추가적인 핵산 (같은 서열의)은 스페이서에서 합성된다 (각각의 단계에서 단일 핵산 모이어티의 합성에 사용된 시약의 양의 두 배를 사용하여).
3개의 다른 핵산 모이어티 (하기 핵산 I, II, 및 III로 나타남)를 다원자가 플랫폼 (예를 들어, 비대칭적인 분지형 스페이서)에 결합시키기 위해 유사한 방법이 사용될 수 있다. 이것은 자동화된 DNA 합성기를 사용하여 가장 편리하게 수행된다. 한 변이에서, 비대칭적인 분지형 스페이서는 하나의 포스포르아미디트기 및 독립적으로 제거될 수 있는 2개의 직각의 보호기를 함유한다. 첫 번째, 핵산 I은 합성되고, 이후 비대칭적인 분지형 스페이서는 핵산 I과 결합되고, 이후 핵산 II는 보호기 중 하나의 선택적 제거 후 추가된다. 핵산 II는 탈보호되고, 캐핑되고, 이후 스페이서의 다른 보호기가 제거된다. 최종적으로, 핵산 III이 합성된다.
일부 구체예에서, 핵산 모이어티가 합성되고, 반응성 연결기 (예를 들어, 아미노, 카르복실화, 티오, 이황화, 등)는 표준 합성 화학 기술을 사용하여 추가된다. 반응성 연결기 (결과로 얻은 스페이서의 일부를 형성하는 것으로 생각된다)는 스페이서 모이어티를 형성하기 위하여 추가적인 비-핵산 화합물과 결합된다. 연결기는 핵산 합성에 대한 표준 방법을 사용하여 핵산에 추가되며, 문헌에 설명되거나 상업적으로 이용 가능한 다양한 시약을 활용한다. 예는 보호 아미노기, 카르복실화기, 티올기, 또는 이황화기 및 포스포르아미디트기를 함유하는 시약을 포함한다. 이 화합물들이 활성화된 포스포르아미디트를 통해 핵산에 포함되고, 탈보호되는 경우, 그것들은 아미노, 카르복실화, 또는 티올 반응성을 갖는 핵산을 제공한다.
가변성 길이의 친수성 결합자는, 예를 들어, 핵산 모이어티 및 플랫폼 분자를 결합시키는데 유용하다. 다양한 적합한 결합자가 알려져 있다. 적합한 결합자는, 제한 없이, 에틸렌 글리콜의 선형 올리고머 또는 폴리머를 포함한다. 이러한 결합자는 식 R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O (CH2)mCO2R2를 가진 결합자를 포함하며, n = 0-200, m = 1 또는 2, R1 = H 또는 보호기, 예를 들어, 트리틸, R2 = H 또는 알킬 또는 아릴, 예를 들어, 4-니트로페닐 에스테르. 이 결합자는 티오에테르를 통해 티올 반응기, 예를 들어, 할로아세일, 말레이미드, 등을 함유하는 분자와 아미드 결합을 통해 아미노기를 함유하는 두 번째 분자를 결합시키는데 유용하다. 부착의 순서는 달라질 수 있다, 즉, 아미드 결합이 형성되기 전 또는 후 티오에테르 결합이 형성될 수 있다. 다른 유용한 결합자는 술포-SMCC (술포숙시니미딜 4-[N-말레이미도메틸]-시클로헥산-1-카르복실레이트) Pierce Chemical Co. 제품 22322; 술포-EMCS (N-[M-말레이미도카프로일옥실 술포숙시니미드 에스테르) Pierce Chemical Co. 제품 22307; 술포-GMBS (N-[K-말레이미도부티릴옥시] 술포숙시니미드 에스테르) Pierce Chemical Co. 제품 22324 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), 및 일반적인 식 말레이미도--R-C(O)NHS 에스테르의 유사한 화합물을 포함하며, R = 알킬, 시클릭 알킬, 에틸렌 글리콜의 폴리머, 등.
핵산 모이어티와 다원자가 스페이서의 공유 결합에 특히 유용한 방법은 상기 인용된 참고문헌에 설명된다.
특정 구체예에서, "단백질성 IRC"를 형성하기 위하여 폴리펩티드를 복수의 핵산 모이어티가, 직접적으로 또는 결합자를 통해, 공유 결합되는 다원자가 스페이서 모이어티로 사용하였다. 폴리펩티드는 담체 (예를 들어, 알부민)일 수 있다. 전형적으로, 단백질성 IRC는 (a) 길이가 2 내지 7, 더 종종 4 내지 7개의 뉴클레오티드, 대안으로 길이가 2 내지 6, 2 내지 5, 4 내지 6, 또는 4 내지 5개의 뉴클레오티드이고 및/또는 (b) 낮은 분리된 면역 조절 활성을 갖거나 분리된 면역 조절 활성을 갖지 않는 적어도 하나, 및 보통 여러 또는 많은 핵산 모이어티를 포함한다. 본 개시의 재검토에서 단백질성 IRC를 만드는 방법은 당업자에 명백할 것이다. 핵산은, 예를 들어, 핵산 모이어티의 3' 또는 5' 말단 (또는 핵산 모이어티의 내부 위치에서 적합하게 변형된 염기에서) 및 적합한 반응기 (예를 들어, N-히드록시숙시니미드 에스테르, 이것은 시토신 잔기의 N4 아미노기와 직접적으로 반응될 수 있다)를 가진 폴리펩티드 사이의 결합을 포함하는 업계에 알려진 방법에 의해 폴리펩티드 스페이서 모이어티와 공유 결합될 수 있다. 추가의 예로서, 폴리펩티드는 핵산 모이어티에 포함되는 아민, 티올, 또는 카르복실기를 통해 핵산 모이어티의 자유 5'-말단에 부착될 수 있다. 대안으로, 폴리펩티드는 여기에 설명된 바와 같이, 스페이서 모이어티와 결합될 수 있다. 게다가, 한 말단에 보호 아민, 티올, 또는 카르복실을 포함하는 연결기, 및 포스포르아미디트는 폴리뉴클레오티드의 히드록실기에 공유 결합될 수 있고, 탈보호 이후, IRC를 펩티드에 공유 부착시키기 위해 기능성이 사용될 수 있다.
IRP 및/또는 IRC 복합체 및 조성물
IRP 또는 IRC는 개인에게 직접적으로 투여될 수 있거나 그것들은 세포에 IRP 또는 IRC 전달 및/또는 세포에 의한 흡수를 향상시키기 위하여 조성물 또는 복합체로 투여될 수 있다. 조성물 또는 복합체는 또한 세포에 둘 이상의 다른 IRP 및/또는 IRC 종의 동시-전달을 향상시키기 위하여 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, IRC 및 IRP의 혼합물은 적어도 하나의 IRC 및 IRP 종을 전달하기 위하여 복합체를 를 형성할 수도 있다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 변형된 IRS를 포함한다. 일부 변이에서, IRP 및/또는 IRC는 변형되지 않은 IRS를 포함한다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 변형되고 변형되지 않은 IRS 모두를 포함한다. 이러한 전달 조성물의 예는 수중유 에멀젼, 미셀, 및 리포솜을 포함한다. 여기에 설명된 바와 같이, 전달 조성물 또는 복합체는 또한 결합자 분자, 플랫폼 분자, 나노입자 또는 미세 입자와 결합되는 IRP 및/또는 IRC를 포함한다. 이러한 결합자는 공유 및 비-공유 결합 모두를 포함한다. 달리 지시되지 않으면, 여기에 설명된 IRP와 함께 사용되는 복합체 및 조성물 제형은 또한 IRC와 함께 사용에 적절하다.
일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 결합자 분자와 결합된다. IRP 및/또는 IRC 부분은 공유 및/또는 비공유 상호작용을 포함하는 다양한 방법으로 콘쥬게이트의 결합자 부분과 결합될 수 있다.
부분들 사이의 결합자는 IRP 및/또는 IRC의 3' 또는 5' 말단에서, 또는 IRP 및/또는 IRC의 내부 위치에서 적합하게 변형된 염기에서 만들어질 수 있다. 결합자가 펩티드이고 적합한 반응기 (예를 들어, N-히드록시숙시니미드 에스테르)를 함유하면, 그것은 시토신 잔기의 N4 아미노기와 직접적으로 반응될 수 있다. IRP 및/또는 IRC의 시토신 잔기의 수 및 위치에 의존하여, 하나 이상의 잔기에서 특이적 결합이 이루어질 수 있다.
대안으로, 업계에 알려져 있는 변형된 올리고뉴클레오시드는 각각의 말단에, 또는 IRP 및/또는 IRC의 내부 위치에 포함될 수 있다. 이것들은, 차단이 해제될 때, 원하는 결합자상에 존재할 수 있거나 이에 부착될 수 있는 다양한 작용기와 반응성인 차단된 작용기를 함유할 수 있다.
결합자가 펩티드인 경우, 콘쥬게이트의 이 부분은 고체 지지대 화학법을 통해 IRP 및/또는 IRC의 3' 말단에 부착될 수 있다. 예를 들어, IRP 부분은 지지대에서 사전-합성된 펩티드 부분에 추가될 수 있다. Haralambidis et al. (1990a) Nucleic Acids Res. 18: 493-499; 및 Haralambidis et al . (1990b) Nucleic Acids Res. 18: 501-505. 대안으로, IRP는 3'-말단에서 확장되는 쪼개질 수 있는 결합자를 통해 고체 지지대에 결합되도록 합성될 수 있다. 지지대로부터 IRP의 화학적 분할에서, 말단 티올기는 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 남거나 (Zuckermann et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 5305-5321; 및 Corey et al . (1987) Science 238: 1401-1403) 또는 말단 아미노기는 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 남는다 (Nelson et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 1781-1794). 아미노-변형된 IRP 및/또는 IRC와 펩티드의 아미노기의 결합은 Benoit et al. (1987) Neuromethods 6: 43-72에 설명된 바와 같이 수행될 수 있다. 티올-변형된 IRP 및/또는 IRC와 펩티드의 카르복실기의 결합은 sinah et al. (1991) Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Press에 설명된 바와 같이 수행될 수 있다. 첨부된 말레이미드를 펩티드의 시스테인 잔기의 티올 측쇄로 운반하는 올리고뉴클레오티드의 결합은 또한 설명된다. Tung et al. (1991) Bioconjug. Chem. 2: 464-465.
콘쥬게이트의 펩티드 결합 부분은 합성 중에 올리고뉴클레오티드에 포함되는 아민, 티올, 또는 카르복실기를 통해 IRP 및/또는 IRC의 5'-말단에 부착될 수 있다. 바람직하게도, 올리고뉴클레오티드는 고체 지지대에 고정되지만, 한 말단에 보호 아민, 티올, 또는 카르복실, 및 다른 말단에 포스포르아미디트를 포함하는 연결기는 5'-히드록실에 공유 부착된다. Agrawal et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14: 6227-6245; Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13: 4485-4502; Kremsky et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 2891-2909; Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15: 3131-3139; Bischoff et al. (1987) Anal. Biochem. 164: 336-344; Blanks et al . (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10283-10299; 및 미국 특허 번호 4,849,513, 5,015,733, 5,118,800, 및 5,118,802. 탈보호 후에, 아민, 티올, 및 카르복실 기능성은 올리고뉴클레오티드를 펩티드에 공유 부착시키기 위하여 사용될 수 있다. Benoit et al. (1987); 및 Sinah et al. (1991).
IRP 및/또는 IRC 콘쥬게이트는 또한 비-공유 상호작용, 예를 들어, 이온 결합, 소수성 상호작용, 수소 결합 및/또는 반더발스 인력을 통해 형성될 수 있다.
비-공유 결합된 콘쥬게이트는 비-공유 상호작용, 예를 들어, 비오틴-스트렙타비딘 복합체를 포함할 수 있다. 비오티닐기가, 예를 들어, IRP 및/또는 IRC의 변형된 염기에 부착될 수 있다. Roget et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7643-7651. 펩티드 부분에 스트렙타비딘 모이어티의 통합은 스트렙타비딘 결합된 펩티드 및 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드의 비-공유 결합 복합체의 형성을 허용한다.
비-공유 결합은 또한 올리고뉴클레오티드와 상호작용할 수 있는 전하를 띈 잔기를 포함하는 결합자 부분의 사용을 통해 IRP 및/또는 IRC를 수반하는 이온 상호작용을 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, 비-공유 결합은 일반적으로 음전하를 띈 IRP 및/또는 IRC 및 펩티드 결합자의 양전하를 띈 아미노산 잔기, 예를 들어, 폴리리신, 폴리아르기닌 및 폴리히스티딘 잔기 사이에서 발생할 수 있다.
지질에 IRP 및/또는 IRC의 결합은 표준 방법을 사용하여 형성될 수 있다. 이 방법들은 올리고뉴클레오티드-인지질 콘쥬게이트 (Yanagawa et al. (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19: 189-192), 올리고뉴클레오티드-지방산 콘쥬게이트 (Grabarek et al. (1990) Anal. Biochem. 185: 131-135; 및 Staros et al. (1986) Anal. Biochem. 156: 220-222), 및 올리고뉴클레오티드-스테롤 콘쥬게이트의 합성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. Boujrad et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5728-5731.
올리고뉴클레오티드와 올리고당의 결합은 알려진 표준 방법을 사용하여 형성될 수 있다. 이 방법들은 올리고뉴클레오티드-올리고당 콘쥬게이트의 합성을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 올리고당은 면역글로불린의 모이어티이다. O'Shannessy et al. (1985) J. Applied Biochem. 7: 347-355.
원형 IRP 및/또는 IRC와 펩티드 결합자의 결합은 여러 방법으로 형성될 수 있다. 원형 IRP 및/또는 IRC가 재조합 또는 화학적 방법을 사용하여 합성되는 경우, 변형된 뉴클레오시드는 적합하다. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press에서 Ruth (1991). 표준 결합 기술은 원형 IRP 및/또는 IRC 및 펩티드를 결합시키기 위해 사용될 수 있다. Goodchild (1990) Bioconjug. Chem. 1: 165. 원형 IRP 및/또는 IRC가 분리되거나 재조합 또는 화학적 방법을 사용하여 합성되는 경우, 결합은 펩티드에 포함된 반응기 (예를 들어, 카르벤, 라디칼)를 화학적으로 활성화하거나, 광활성화함으로써 형성될 수 있다.
펩티드 및 다른 분자와 올리고뉴클레오티드의 추가적인 부착 방법은 미국 특허 번호 5,391,723; Kessler (1992) "Nonradioactive labeling methods for nucleic acids" in Kricka (ed.) Nonisotopic DNA Probe Techniques , Academic Press; 및 Geoghegan et al. (1992) Bioconjug. Chem. 3: 138-146에서 발견될 수 있다.
IRP 및/또는 IRC는 다른 방법으로 근위에 결합될 수 있다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 캡슐화에 의해 근위에 결합된다. 다른 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 플랫폼 분자에 의해 근위에 결합된다 "플랫폼 분자 (또한 "플랫폼"으로 불림)는 IRP 및/또는 IRC의 부착이 허용되는 부위를 함유하는 분자이다. 다른 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 표면, 바람직하게 담체 입자상에 흡착에 의해 근위에 결합된다.
일부 구체예에서, 여기에 설명된 방법은 IRP 및/또는 IRC와 관련된 캡슐화제를 활용한다. 바람직하게도, IRP 및/또는 IRC 및 캡슐화제를 포함하는 조성물은 보조 수중유 에멀젼, 미립자 및/또는 리포솜의 형태이다. 더 바람직하게, IRP 및/또는 IRC를 캡슐화하는 보조 수중유 에멀젼, 미립자 및/또는 리포솜은 크기가 약 0.04 μm 내지 약 100 μm, 바람직하게 다음 범위 중 하나의 형태이다: 약 0.1 μm 내지 약 20 μm; 약 0.15 μm 내지 약 10 μm; 약 0.05 μm 내지 약 1. 00 μm; 약 0.05 μm 내지 약 0.5 μm.
콜로이드 분산 시스템, 예를 들어, 미소구체, 비드, 고분자 복합체, 나노캡슐 및 지질-기초 시스템, 예를 들어, 수중유 에멀션, 미셀, 혼합된 미셀 및 리포솜은 IRP 및/또는 IRC-함유 조성물의 효과적인 캡슐화를 제공할 수 있다.
캡슐화 조성물은 널리 다양한 성분 중 어느 것도 더 포함한다. 이것들은 명반, 지질, 인지질, 지질 막 구조 (LMS), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 다른 폴리머, 예를 들어, 폴리펩티드, 글리코펩티드, 및 다당류를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
캡슐화 성분에 적합한 폴리펩티드는 업계에 알려져 있는 어느 것도 포함하고 지방산 결합 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 변형된 폴리펩티드는 글리코실화, 인산화, 미리스틸화, 황산화 및 히드록실화를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 다양한 변형 중 어느 것도 함유한다. 여기에 사용된 바와 같이, 적합한 폴리펩티드는 면역 조절 활성을 보존하기 위하여 IRP 및/또는 IRC-함유 조성물을 보호하는 것이다. 결합 단백질의 예는 알부민, 예를 들어, 소 혈청 알부민 (BSA) 및 완두콩 알부민을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 적합한 폴리머는 약학적 업계에 알려진 어느 것도 될 수 있고 자연적으로 발생한 폴리머, 예를 들어, 덱스트란, 히드록시에틸 전분, 및 다당류, 및 합성 폴리머를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 자연적으로 발생한 폴리머의 예는 단백질, 글리코펩티드, 다당류 및 지질을 포함한다. 추가저인 폴리머는 합성 폴리머일 수 있다. 사용에 적합한 합성 폴리머의 예는 폴리알킬 글리콜 (PAG), 예를 들어, PEG, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (POP), 예를 들어, 폴리옥시에틸화된 글리세롤 (POG), 폴리트리메틸렌 글리콜 (PTG) 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리히드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리비닐 알콜 (PVA), 폴리아크릴산, 폴리에틸옥사졸린, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 폴리아미노산, 폴리우레탄 및 폴리포스파젠을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 합성 폴리머는 또한 선형 또는 분지형, 치환되거나 치환되지 않은, 둘 이상의 다른 합성 모노머의 호모폴리머, 코폴리머, 또는 차단 코폴리머일 수 있다.
캡슐화 조성물에 사용되는 PEG는 화학 공급 업체로부터 구입하거나 당업자에 알려진 기술을 사용하여 합성된다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "LMS"는 층상 지질 입자를 의미하며, 극성 지질의 극성 머리 부분이 막 구조를 형성하는 계면의 수층을 향하도록 배열된다. LMS의 예는 리포솜, 미셀, 코크리트 (즉, 일반적으로 원통형 리포솜), 미크로에멀젼, 단층 베시클, 다중층 베시클, 등을 포함한다.
선택적인 콜로이드 분산 시스템은 리포솜이다. 여기에 사용된 바와 같이, "리포솜" 또는 "지질 베시클"은 적어도 하나의 및 가능하게는 하나 이상의 이중층 지질 막에 의해 결합된 작은 베시클이다. 리포솜은 인지질, 당 지질, 지질, 스테로이드, 예를 들어, 콜레스테롤, 관련된 분자, 또는 소니케이션, 압출, 또는 지질-세제 복합체로부터 세제의 제거를 포함하지만, 이제 제한되지 않는 업계에 알려진 어느 기술에 의한 이들의 조합으로부터 인공적으로 만들어진다. 리포솜은 또한 선택적으로 추가적인 성분, 예를 들어, 조직 표적 성분을 포함할 수 있다. "지질 막" 또는 "지질 이중층"은 지질로만 구성될 필요는 없지만, 콜레스테롤 및 다른 스테로이드, 지질-가용성 화학물질, 어느 길이의 단백질, 및 다른 양친매성 분자를 포함하지만, 제한되지 않는, 추가적으로 어느 적합한 다른 성분을 함유할 수 있고, 막의 일반적인 구조는 소수성 코어를 둘러싸는 2개의 친수성 표면의 시트인 것을 제공한다. 막 구조의 일반적인 논의에 대하여, The Encyclopedia of Molecular Biology by J. Kendrew (1994) 참고. 적합한 지질에 대하여, 참조예, Lasic (1993) "Liposomes: from Physics to Applications" Elsevier, Amsterdam.
리포솜을 함유하는 IRP 및/또는 IRC 조성물을 제조하는 과정은 업계에 알려져 있다. 지질 베시클을 업계에 알려진 어느 적합한 기술에 의해 제조할 수 있다. 방법은 미크로캡슐화, 미크로유동체화, LLC 방법, 에탄올 주입, 프레온 주입, "버블" 방법, 세제 투석, 수화, 소니케이션, 및 역상 증발을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. Watwe et al. (1995) Curr. Sci. 68: 715-724에서 재검토된다. 기술은 가장 바람직한 속성을 갖는 베시클을 제공하기 위하여 결합될 수도 있다.
LMS를 함유하는 조직 또는 세포의 표적 성분의 사용이 여기에 제공된다. 이러한 표적 성분은 온전한 동물, 기관, 또는 세포 배양에 투여될 때 다른 조직 또는 세포의 부위에 관하여 특정 조직 및 세포 부위에서 축적을 향상시키는 LMS의 성분이다. 표적 성분은 일반적으로 리포솜 밖으로부터 접근 가능하고, 그러므로 바람직하게 외부 표면에 결합되거나 외부 지질 이중층에 삽입된다. 표적 성분 중에서도 펩티드, 더 큰 펩티드의 영역, 세포 표면 분자 또는 마커에 특이적인 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편, 핵산, 탄수화물, 복합 탄수화물의 영역, 특별한 지질, 또는 작은 분자, 예를 들어, 약, 호르몬, 또는 합텐이며, 상기 언급된 분자 중 어느 것에 부착된다. 세포 타입 특이적 세포 표면 마커에 대한 특이성을 가진 항체는 업계에 알려져 있고 업계에 알려진 방법에 의해 쉽게 제조될 수 있다.
LMS는 치료적 처리를 받게 되는 어느 세포 타입, 예를 들어, 면역 반응을 조절하고 및/또는 이에 참여하는 세포 타입에 대하여 표적화될 수 있다. 이러한 표적 세포 및 기관은 APC, 예를 들어, 대식세포, 수지상세포 및 림프구, 림프성 구조, 예를 들어, 림프절 및 비장, 및 비림프성 구조, 특히 수지상세포가 발견되는 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
여기에 제공된 LMS 조성물은 추가적으로 계면활성제를 포함한다. 계면활성제는 양이온성, 음이온성, 양친매성, 또는 비이온성일 수 있다. 바람직한 등급의 계면활성제는 비이온성 계면활성제이다; 특히 바람직한 것은 수용성인 것이다.
플랫폼 분자에 결합에 의해 IRP 및/또는 IRC가 근위에 결합되는, 일부 구체예에서, 플랫폼은 단백질성 또는 비-단백질성 (즉, 유기적)일 수도 있다. 단백질성 플랫폼의 예는 알부민, 감마글로불린, 면역글로불린 (IgG) 및 오발부민을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. Borel et al. (1990) Immunol. Methods 126: 159-168; Dumas et al. (1995) Arch. Dematol. Res. 287: 123-128; Borel et al. (1995) Int. Arch. Allergy Immunol. 107: 264-267; Borel et al. (1996) Ann. N. Y. Acad. Sci. 778: 80-87. 플랫폼은 하나 이상의 IRP 및/또는 IRC에 결합을 수용하는 다원자가이다 (즉, 하나 이상의 결합 또는 결합, 부위를 함유한다). 따라서, 플랫폼은 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상의 결합 또는 결합 부위를 함유할 수도 있다. 폴리머 플랫폼의 다른 예는 덱스트란, 폴리아크릴아미드, 피콜, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐 알콜, 및 폴리 D-글루탐산/D-리신이다.
일부 구체예에서, 폴리머 플랫폼은 폴리머이다. 일부 구체예에서, 폴리머는 덱스트란, 폴리아크릴아미드, 피콜, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐 알콜, 또는 폴리 D-글루탐산/D-리신이다. 일부 구체예에서, 폴리머 플랫폼은 피콜이다. 일부 구체예에서, 폴리머 플랫폼은 피콜 400이다. 일부 구체예에서, 폴리머 플랫폼은 피콜 70이다. 일부 구체예에서, 폴리머 플랫폼은 Ficoll?PM 70 (폴리(수크로스-코-에피클로르히드린))이다. 일부 구체예에서, 폴리머 플랫폼은 Ficoll?PM 400이다. 일부 구체예에서, 약 1 내지 약 200, 약 1 내지 약 150, 약 1 내지 약 125, 약 1 내지 약 100, 약 1 내지 약 75, 약 1 내지 약 50, 또는 약 1 내지 약 25의 IRP 및/또는 IRC 중 어느 것도 폴리머 플랫폼에 결합된다. 일부 구체예에서, 약 1 내지 약 100 IRP 및/또는 IRC는 폴리머 플랫폼에 결합된다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 변형된 IRS를 포함한다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 변형되지 않은 IRS를 포함한다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 변형되지 않은 및 변형된 IRS를 포함한다.
플랫폼 분자의 사용 원칙은 업계에 잘 이해되어있다. 일반적으로, 플랫폼은 IRP 및/또는 IRC에 대한 적절한 결합 부위를 함유하거나, 함유하도록 유도된다. 추가로, 또는 대안으로, IRP 및/또는 IRC는 적절한 연결기를 제공하도록 유도된다. 예를 들어, 단일 플랫폼은 이기능성 결합자, 예를 들어, 펩티드 (즉, 2개의 결합 부위를 갖는다)이다. 추가의 예는 하기 논의된다.
플랫폼 분자는 생물학적으로 안정할 수도 있다, 즉, 그것들은 치료적 효능을 수여하기 위해 흔한 시간 내지 일 내지 월의 생체 내 배출 반감기를 나타내고, 바람직하게 합성 단일 사슬로 한정된 조성물로 구성된다. 그것들은 일반적으로 약 200 내지 약 10,000,000의 범위, 바람직하게 다음 범위 중 어느 것의 의 분자량을 갖는다: 약 200 내지 약 500,000; 약 200 내지 약 200,000; 약 200 내지 약 50,000 (이하, 예를 들어, 300). 원자가 플랫폼 분자의 예는 폴리머, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG; 바람직하게 약 200 내지 약 80,000의 분자량을 갖는다), 폴리-D-리신, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, D-글루탐산 및 D-리신 (3:2의 비율로)이다 (또는 폴리머로 구성된다). 사용될 수도 있는 다른 분자는 알부민 및 IgG이다.
사용에 적합한 다른 플랫폼 분자는 미국 특허 번호 5,552,391에 개시된 화학적으로-한정된, 비-폴리머 원자가 플랫폼 분자이다. 사용에 적합한 다른 동종의 화학적으로-한정된 원자가 플랫폼 분자는 유도된 2,2'-에틸렌디옥시디에틸아민 (EDDA) 및 트리에틸렌 글리콜 (TEG)이다.
추가의 적합한 워자가 플랫폼 분자는 테트라아미노벤젠, 헵타아미노베타시클로덱스트린, 테트라아미노펜타에리트리톨, 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸 (Cyclam) 및 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 (Cyclen)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로, 이 플랫폼들은 표준 화학적 합성 기술에 의해 만들어진다. PEG는 유도되고 만들어진 다원자가여야 하며, 이것은 표준 기술을 사용하여 이루어진다. 콘쥬게이트 합성에 적합한 일부 물질, 예를 들어, PEG, 알부민, 및 IgG는 상업적으로 이용 가능하다.
IRP 및/또는 IRC와 플랫폼 분자의 결합은 IRP 및/또는 IRC 및 플랫폼 분자에 전형적으로 하나 이상의 가교제 및 작용기를 수반하는, 여러 가지의 방법으로 영향을 받을 수도 있다. 플랫폼 및 IRP 및/또는 IRC는 적절한 연결기를 가져야 한다. 연결기는 표준 합성 화학 기술을 사용하여 플랫폼에 추가된다. 연결기는 표준 고체상 합성 기술 또는 재조합 기술을 사용하여 폴리펩티드 플랫폼 및 IRP 및/또는 IRC에 추가될 수도 있다. 재조합 접근법은 링커를 부착하기 위해 번역 후 변형을 필요로 할 수도 있고, 이러한 방법은 업계에 알려져 있다.
예로서, 폴리펩티드는 폴리펩티드와 플랫폼의 결합 부위의 역할을 하는 작용기, 예를 들어, 아미노, 카르복실 또는 술프히드릴기를 함유하는 아미노산 측쇄 모이어티를 함유한다. 폴리펩티드가 이미 이 기들을 함유하지 않으면, 이러한 작용기를 갖는 잔기는 폴리펩티드에 추가될 수도 있다. 이러한 잔기는 고체상 합성 기술 또는 재조합 기술에 의해 포함될 수도 있으며, 이것들 모두는 펩티드 합성 업계에 잘 알려져 있다. 폴리펩티드가 탄수화물 측쇄를 가질 때 (또는 플랫폼이 탄수화물이면), 작용성 아미노, 술프히드릴 및/또는 알데히드기는 통상적인 화학법에 의해 그 안에 포함될 수도 있다. 예를 들어, 주요 아미노기는 나트륨 시아노보로히드리드의 존재시 산화된 당과 에틸렌디아민의 반응에 의해 포함될 수도 있고, 알데히드기가 페리오데이트 산화에 의해 발생할 수도 있지만, 술프히드릴은 시스테아민 디히드로클로리드의 반응 후 표준 이황화 환원제로 환원에 의해 도입될 수도 있다. 유사한 방식으로, 플랫폼 분자는 또한 그것이 이미 적절한 작용기를 소유하지 않으면 작용기를 함유하도록 유도될 수도 있다.
다양한 길이의 친수성 결합자는 IRP 및/또는 IRC와 플랫폼 분자의 결합에 유용하다. 적합한 결합자는 에틸렌 글리콜의 선형 올리고머 또는 폴리머를 포함한다. 이러한 결합자는 식 R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2를 갖는 결합자를 포함하며, n = 0-200, m = 1 또는 2, R1 = H 또는 보호기, 예를 들어, 트리틸, R2 = H 또는 알킬 또는 아릴, 예를 들어, 4-니트로페닐 에스테르. 이 결합자들은 티올 에테르를 통해 올 반응기, 예를 들어, 할로아세일, 말레이미드, 등을 함유하는 분자와 아미드 결합을 통한 아미노기를 함유하는 두 번째 분자와 연결에 유용하다. 이 결합자들은 부착의 순서에 관하여 유연하다, 즉, 티오에테르는 처음에 또는 마지막에 형성될 수 있다.
IRP 및/또는 IRC가 표면상에 흡착에 의해 근위에 결합되는 구체예에서, 표면은 무기 또는 유기 코어로 만들어진 담체 입자 (예를 들어, 나노입자)의 형태로 있을 수도 잇다. 이러한 나노 입자의 예는 나노결정 입자, 알킬시아노아크릴레이트의 폴리머에 의해 만들어진 나노입자 및 메틸리덴 말로네이트의 폴리머화에 의해 만들어진 나노입자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. IRP 및/또는 IRC가 흡착될 수도 있는 추가적인 표면은 활성화된 탄소 입자 및 단백질-세라믹 나노입자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 담체 입자의 다른 예가 여기에 제공된다.
세포에 흡착된 분자를 전달할 목적으로 표면에 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 흡착은 업계에 잘 알려져 있다. 참조예, Douglas et al. (1987) Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 3: 233-261; Hagiwara et al. (1987) In Vivo 1: 241-252; Bousquet et al. (1999) Pharm. Res. 16: 141-147; 및 Kossovsky et al., 미국 특허 번호 5,460,831. 바람직하게도, 흡착성 표면을 포함하는 물질은 생물학적 분해 가능하다. 표면에 IRP 및/또는 IRC의 흡착은 이온성 및/또는 소수성 상호작용을 포함하는, 비-공유 상호작용을 통해 발생할 수도 있다.
일반적으로, 담체, 예를 들어, 나노입자의 성질, 예를 들어, 표면 전하, 입자 크기 및 분자량은 폴리머화 과정 중에 폴리머화 조건, 모노머 농도 및 안정화제의 존재에 의존한다 (Douglas et al., 1987). 담체 입자의 표면은 IRP 및/또는 IRC의 흡착을 허용하거나 향상시키기 위해, 예를 들어, 표면 코팅으로 변형될 수도 있다. 흡착된 IRP 및/또는 IRC를 갖는 담체 입자는 다른 물질로 더 코팅될 수도 있다. 여기에 설명된 바와 같이, 이러한 다른 물질의 예는, 예를 들어, 대상체에 한 번 투여된 입자의 반감기를 연장시킬 수도 있고 및/또는 특이적 세포 타입 또는 조직으로 입자를 표적화할 수도 있다.
IRP 및/또는 IRC가 흡착될 수도 있는 나노결정 표면이 설명된다 (참조예, 미국 특허 번호 5,460,831). 나노결정 코어 입자 (1 μm 이하의 직경을 가짐)는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및/또는 다른 약제의 흡착을 촉진하는 표면 에너지 변형층으로 코팅된다. 또 다른 흡착 표면은 알킬시아노아크릴레이트의 폴리머화에 의해 만들어진 나노 입자이다. 알킬시아노아크릴레이트는 음이온 폴리머화의 과정에 의해 산성화된 수성 배지에서 폴리머화될 수 있다. 폴리머화 조건에 의존하여, 작은 입자는 20 내지 3000 nm의 범위의 크기를 갖는 경향이 있고, 나노입자 특이적 표면 성질을 만들고 특이적 표면 전하를 갖게 하는 것이 가능하다 (Douglas et al., 1987). 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 소수성 양이온, 예를 들어, 염화 테트라페닐포스포늄 또는 4기 암모늄염, 예를 들어, 브롬화 세틸트리메틸 암모늄의 존재시 폴리이소부틸 및 폴리이소헥실시아노아크릴레이트에 흡착될 수도 있다. 이 나노입자상에 올리고뉴클레오티드 흡착은 핵산 사슬의 음전하를 띈 인산기 및 소수성 양이온 사이에서 이온쌍의 형성에 의해 매개되는 것으로 나타난다. 참조예, Lambert et al. (1998) Biochimie 80: 969-976, Chavany et al. (1994) Pharm. Res. 11: 1370-1378; Chavany et al. (1992) Pharm. Res. 9: 441-449. 또 다른 흡착 표면은 메틸리덴 말로네이트의 폴리머화에 의해 만들어진 나노입자이다.
IRP 또는 IRC는 미세담체 (MC) 복합체의 형태로 투여될 수도 있다. 따라서, 여기에 제공된 것은 IRP/MC 복합체 또는 IRC/MC 복합체를 포함하는 조성물이다. IRP/MC 복합체는 미세담체의 표면에 결합된 IRP를 포함하고 (즉, IRP는 MC에 캡슐화되지 않는다), 바람직하게 각각의 미세담체에 결합된 IRP의 다양한 분자를 포함한다. 특정, 구체예에서, 다른 IRP의 혼합물은 미세담체와 복합체를 이룰 수도 있다, 즉, 미세담체가 하나 이상의 IRP 종과 결합된다. IRP 및 MC 사이의 결합은 공유 또는 비-공유일 수도 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, IRP는 변형되거나 유도될 수도 있고 미세담체의 조성물은 IRP/MC 복합체 형성에 필요한 원하는 타입의 결합을 제공하도록 선택되고 및/또는 변형될 수도 있다. 이 같은 설명은 IRC/MC 복합체에 대하여 적용된다. 특정 구체예에서, IRC 및 IRP의 혼합물은 미세담체와 복합체를 이룰 수도 있다, 즉, 미세담체는 적어도 하나의 IRC 및 IRP 종과 결합된다.
유용한 미세담체는 크기가 약 150, 120 또는 100 μm보다 작고, 더 일반적으로 크기가 약 50-60 μm보다 작고, 바람직하게 크기가 10 μm보다 작고, 순수한 물에 불용성이다. 생물학적 분해 가능하지 않은 미세담체가 허용 가능하지만, 사용된 미세담체는 바람직하게 생물학적 분해 가능하다.
생물학적 분해 가능한 폴리머 또는 오일을 포함하는 액체상 미세담체, 예를 들어, 수중유 에멀젼이 또한 고려되지만, 미세담체는 일반적으로 고체상, 예를 들어, "비드" 또는 다른 입자이다. 미세담체로서 사용에 대하여 허용 가능한 다양한 생물학적 분해 가능한 및 생물학적 분해 가능하지 않은 물질은 업계에 알려져 있다.
여기에 설명된 조성물 또는 방법에 사용된 미세담체는 일반적으로 크기가 약 10 μm보다 작고 (예를 들어, 약 10 μm보다 작은 직경을 갖거나, 97%의 입자가 10 μm 선별 필터를 통과한다), 및 나노담체 (즉, 1 μm보다 작은 크기의 담체)를 포함한다. 바람직하게도, 미세담체는 약 9, 7, 5, 2, 또는 1 μm 또는 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 또는 100 nm의 상한 내의 크기를 갖는 것이 선택되고 하한이 상한보다 작은 경우, 약 4, 2, 또는 1 μm 또는 약 800, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 25, 또는 10 nm, 의 독립적으로 선택된 하한이 선택된다. 일부 구체예에서, 미세담체는 약 1. 0-1. 5 μm, 약 1. 0-2. 0 μm 또는 약 0.9-1. 6 μm의 크기를 갖는다. 특정 바람직한 구체예에서, 미세담체는 약 10 nm 내지 약 5 μm 또는 약 25 nm 내지 약 4. 5 μm, 약 1 μm, 약 1. 2 μm, 약 1. 4 μm, 약 1. 5 μm, 약 1. 6 μm, 약 1. 8 μm, 약 2. 0 μm, 약 2. 5 μm 또는 약 4. 5 μm의 크기를 갖는다. 미세담체가 나노담체일 때, 바람직한 구체예는 약 25 내지 약 300 nm, 50 내지 약 200 nm, 약 50 nm 또는 약 200 nm의 나노담체를 포함한다.
고체상 생물학적 분해 가능한 미세담체는 생물학적 분해 가능한 폴리에스테르, 예를 들어, 폴리(젖산), 폴리(글리콜산), 및 이들의 코폴리머 (차단 코폴리머를 포함), 뿐만 아니라 폴리(젖산) 및 폴리(에틸렌 글리콜)의 차단 코폴리머; 폴리오르토에스테르, 예를 들어, 3, 9-디에틸리덴-2, 4, 8, 10-테트라옥사스피로[5. 5]운데칸 (DETOSU)에 기초한 폴리머;
상대적으로 친수성 모노머, 예를 들어, 세바스산에 기초한 폴리무수물, 예를 들어, 폴리무수물 폴리머; 아미노산, 예를 들어, 글리신 또는 알라닌을 포함하는 세바스산-유래 모노머 (즉, 아미노-말단 질소를 통한 이미드 결합에 의해 세바스산과 결합함)에 기초한 폴리무수물 이미드, 예를 들어, 폴리무수물 폴리머; 폴리무수물 에스테르; 폴리포스파젠, 특히 가르복실산기의 발생을 통해 폴리머 백본의 분해를 촉진할 수 있는 가수분해-민감 에스테르기를 함유하는 폴리(포스파젠) (Schacht et al., (1996) Biotechnol. Bioeng. 1996: 102); 및 폴리아미드, 예를 들어, 폴리(젖산-코-리신)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 생물학적 분해 가능한 폴리머로부터 제조될 수도 있다.
폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 실리카, 세라믹, 폴리아크릴아미드, 덱스트란, 히드록시아파티트, 라텍스, 금, 및 강자성 또는 상자성 물질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 미세담체의 제조에 적합한 다양한 생물학적 분해 가능하지 않은 물질이 또한 알려져 있다. 특정 구체예는 금, 라텍스, 및/또는 자성 비드를 제외한다. 특정 구체예에서, 미세담체는 2차 물질 (예를 들어, 폴리스티렌)로 캡슐화된 1차 물질 (예를 들어, 자성 물질)로 만들어질 수도 있다. 고체상 미소구체를 업계에 알려진 기술을 사용하여 제조하였다. 예를 들어, 그것들은 에멀젼-용매 추출/증발 기술에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이 기술에서, 생물학적 분해 가능한 폴리머, 예를 들어, 폴리무수물, 폴리(알킬-시아노아크릴레이트) 및 폴리(히드록시 에스테르), 예를 들어, 폴리(젖산), 폴리(글리콜산), 폴리(D, L-락틱-코-글리콜산) 및 폴리(카프로락톤)은 에멀젼의 분산상 (DP)을 구성하기 위해 적합한 유기 용매, 예를 들어, 메틸렌 클로리드에서 용해된다.
DP는 고속 균질화에 의해 용해된 계면활성제, 예를 들어, 폴리비닐알콜 (PVA) 또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 함유하는, 초과량의 수성 연속상 (CP)으로 에멀젼화된다. CP의 계면활성제는 별개의 및 적합하게 큰 에멀젼 방울의 형성을 보장하는 것이다. 유기 용매는 CP로 추출된 후 시스템 온도를 증가시킴으로써 증발된다. 4℃에 저장 전에, 고체 미세입자는 원심분리 또는 여과에 의해 분리되고, 예를 들어, 동결건조 또는 진공의 적용에 의해 건조된다.
건조된 미소구체의 물리-화학적 성질, 예를 들어, 평균 크기, 입도 분포 및 표면 전하가 결정될 수도 있다. 크기 성질은, 예를 들어, 동적 광산란 기술 (dynamic light scattering technique)에 의해 결정되고 표면 전하는 제타 전위 (zeta potential)를 측정함으로써 결정되었다.
액체상 미세담체는 리포솜, 미셀, 오일 방울 및 생물학적 분해 가능한 폴리머 또는 오일을 포함하는 다른 지질 또는 오일-기반 입자를 포함한다. 특정 구체예에서, 생물학적 분해 가능한 폴리머는 계면활성제이다. 다른 구체예에서, 액체상 미세담체는 생물학적 분해 가능한 오일, 예를 들어, 스쿠알렌 또는 식물성 오일의 포함으로 인해 생물학적 분해 가능하다. 한 바람직한 액체상 미세담체는 수중유 에멀젼 내의 오일 방울이다. 바람직하게도, 미세담체로 사용된 수중유 에멀젼은 생물학적 분해 가능한 치환기를 포함한다.
공유 결합된 IRP/MC 복합체는 업계에 알려진 어느 공유 교차 결합 기술을 사용하여 만들어질 수도 있다. 전형적으로, IRP 부분은 IRP 부분이 미세담체에 결합될 수도 있는 부위를 제공하기 위해 추가적인 모이어티 (예를 들어, 자유 아민, 카르복실 또는 술프히드릴기)를 포함하거나 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함하도록 변형될 것이다. 복합체의 IRP 및 MC 부분 사이의 결합은 IRP의 3' 또는 5' 말단에서, 또는 IRP의 내부 위치에서 적합하게 변형된 염기에서 만들어질 수 있다. 미세담체에 존재하는 작용기가 또한 일반적으로 활용될 수도 있지만, 미세담체는 또한 일반적으로 공유 결합이 형성될 수도 있는 모이어티를 포함하도록 변형된다. IRP/MC는 공유 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 미세담체를 가진 IRP를 배양함으로써 (예를 들어, 가교제의 존재시 또는 IRP와 공유 결합을 형성할 활성화된 모이어티를 포함하는 활성화된 미세담체의 사용에 의해) 형성된다.
다양한 교차 결합 기술은 업계에 알려져 있고, 아미노, 카르복실 및 술프히드릴기와 반응성인 가교제를 포함한다. 당업자에 명백한 바와 같이, 가교제 및 교차 결합 프로토콜의 선택은 IRP 및 미세담체의 배열뿐만 아니라 IRP/MC 복합체의 원하는 최종 배열에 의존할 것이다. 가교제는 동종 이기능성 또는 이종 이기능성이다. 동종 이기능성 가교제가 사용될 때, 가교제는 IRP 및 MC에서 같은 모이어티를 이용한다 (예를 들어, 알데히드 가교제는 IRP 및 MC 모두가 하나 이상의 자유 아민을 포함하는 경우 IRP 및 MC를 공유 결합시키기 위하여 사용될 수도 있다). 이종 이기능성 가교제는 IRP 및 MC에서 다른 모이어티를 활용하고 (예를 들어, 말레이미도-N-히드록시숙신이미드 에스테르는 IRP의 자유 술푸히드릴 및 MC의 자유 아민을 공유 결합시키기 위하여 사용될 수도 있다), 미세담체 간 결합의 형성을 최소화하는 것이 바람직하다. 대부분의 경우에서, 두 번째 교차 결합 모이어티가 미세담체에 존재하지 않는 경우, 미세담체의 첫 번째 교차 결합 모이어티 및 IRP의 두 번째 교차 결합 모이어티를 통해 교차 결합하는 것이 바람직하다. IRP/MC 복합체를 생산하는 한 바람직한 방법은 이종 이기능성 가교제와 함께 배양함으로써 미세담체를 '활성화'한 후, IRP 및 활성화된 MC를 배양함으로써 IRP/MC 복합체의 형성에 의한 것이다. 가교제는 반응성 모이어티 사이의 "스페이서" 팔을 포함할 수도 있거나, 가교제의 2개의 반응성 모이어티는 직접적으로 결합할 수도 있다.
한 바람직한 변이에서, 미세담체가 자유 아민기를 포함하지만, IRP 부분은 미세담체와 교차 결합을 위하여 적어도 하나의 자유 술프히드릴 (예를 들어, 5'-티올 변형된 염기 또는 결합자에 의해 제공된)을 포함한다. 이 2개의 기와 반응성인 이종 이기능성 가교제 (예를 들어, 말레이미드기 및 NHS-에스테르를 포함하는 가교제), 예를 들어, 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트는 IRP/MC 복합체를 형성하기 위하여 MC를 활성화한 후, IRP와 공유 교차 결합시키기 위하여 사용된다.
비-공유 IRP/MC 복합체는 이온 (정전) 결합, 소수성 상호작용, 수소결합, 반더반스 인력, 또는 둘 이상의 다른 상호작용의 조합을 포함하는, 어느 비-공유 결합 또는 상호작용에 의해서도 결합될 수 있고, 결합 쌍이 IRP 및 MC를 결합시키는 것일 때와 정상적인 같은 경우이다.
바람직한 비-공유 IRP/MC 복합체는 전형적으로 소수성 또는 정전 (이온) 상호작용, 또는 이들의 조합에 의해 복합체를 구성한다 (예를 들어, IRP 및 결합쌍을 사용하는 MC와 결합된 폴리뉴클레오티드 사이의 염기쌍을 통해). 폴리뉴클레오티드의 백본의 친수성 특성으로 인해, 복합체를 형성하기 위해 소수성 상호작용에 의존하는 MC 복합체는 일반적으로 높은 소수성 모이어티를 포함하기 위해 복합체의 IRP 부분의 변형을 필요로 한다. 바람직하게도, 소수성 모이어티는 생체 적합하고, 비면역원성이고, 조성물이 대상으로 하는 개인에서 자연적으로 발생한다 (예를 들어, 포유동물, 특히 사람에서 발견된다). 바람직한 소수성 모이어티의 예는 지질, 스테로이드, 스테롤, 예를 들어, 콜레스테롤, 및 테르펜을 포함한다. 소수성 모이어티와 IRP의 결합 방법은, 물론, IRP의 배열 및 소수성 모이어티의 본질에 의존한다. 소수성 모이어티는 IRP의 어느 편리한 부위, 바람직하게 5' 또는 3' 말단에서 에서도 추가될 수 있다; IRP에 콜레스테롤 모이어티의 추가의 경우에, 콜레스테롤 모이어티는 통상적인 화학 반응을 사용하여 바람직하게 IRP의 5' 말단에 추가된다 (참조예, Godard et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232: 404-410). 바람직하게도, 소수성 모이어티를 포함하도록 변형된 친수성 물질이 또한 활용될 수도 있지만, 소수성 결합에 의해 결합된 IRP/MC 복합체에 사용되는 미세담체는 소수성 물질, 예를 들어, 오일 방울 또는 소수성 폴리머로부터 만들어진다. 미세담체가 리포솜 또는 루멘을 포함하는 다른 액체상 미세담체이고 IRP가 MC의 외부 표면과 결합하려고 할 때, MC 제조 과정 중에 IRP의 캡슐화를 방지하기 위하여 IRP/MC 복합체는 MC의 제조 후 IRP 및 MC를 혼합함으로써 형성된다.
정전 결합에 의해 결합된 비-공유 IRP/MC 복합체는 전형적으로 폴리뉴클레오티드 백본의 고도로 음전하를 이용한다. 따라서, 비-공유결합 IRP/MC 복합체에 사용되는 미세담체는 일반적으로 생리학적 pH (예를 들어, 약 pH 6. 8-7. 4)에서 양전하를 띈다 (양이온). 미세담체는 본질적으로 양전하를 소유하지만, 정상적으로 양전하를 소유하지 않는 화합물로부터 만들어진 미세담체는 양전하를 띄도록 유도되거나 달리 변형될 수도 있다 (양이온성). 예를 들어, 미세담체를 만들기 위해 사용된 폴리머는 양전하의 기, 예를 들어, 1차 아민으로 유도될 수도 있다. 대안으로, 양전하를 띈 화합물은 결과로 얻은 미세담체 입자에 양전하를 수여하는 폴리(젖산)/폴리(글리콜산) 코폴리머의 제조 중에 미세담체의 형성에 포함될 수도 있다.
예를 들어, 양이온성 미소구체를 제조하기 위하여, 양이온성 지질 또는 폴리머, 예를 들어, 1,2-디올레오일-1,2,3-트리메틸암모니오프로판 (DOTAP), 브롬화 세틸트리메틸암모늄 (CTAB) 또는 폴리리신은 DP 또는 CP에 이 상들에서 그것들의 용해도에 따라 추가된다.
IRP/MC 복합체는 바람직하게, 수성 혼합물에서 폴리뉴클레오티드 및 입자의 배양에 의한 양이온성 미소구체로의 흡착에 의해 수행될 수 있다. 이러한 배양은 주위 온도 (실온) (예를 들어, 약 20℃)를 포함하는 어느 원하는 조건 하에 또는 냉장 하에 (예를 들어, 4℃) 수행될 수도 있다. 양이온성 미소구체 및 폴리뉴클레오티드가 상대적으로 신속하게 결합하기 때문에, 배양은 하룻밤 및 더 긴 배양을 포함하는, 어느 편리한 기간, 예를 들어, 5, 10, 15분 이상 동안 일 수도 있다. 예를 들어, IRP는 4℃에서 폴리뉴클레오티드 및 입자의 하룻밤 동안 수성 배양에 의해 양이온성 미소구체에 흡착될 수 있다. 하지만, 양이온성 미소구체 및 폴리뉴클레오티드가 자발적으로 결합하기 때문에, IRP/MC 복합체는 폴리뉴클레오티드 및 MC의 간단한 동시-투여에 의해 형성될 수 있다. 미소구체는 폴리뉴클레오티드 결합 전 및 후 크기 및 표면 전하를 특징으로 한다. 선택된 배치는, 예를 들어, 사람 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 마우스 비장 세포 검정에서 적합한 대조군에 대한 활성이 평가될 수도 있다. 제형은 또한 적합한 동물 모델에서 평가될 수도 있다.
뉴클레오티드 염기쌍에 의해 결합된 비-공유 IRP/MC 복합체는 통상적인 방법론을 사용하여 생산될 수도 있다. 일반적으로, 염기쌍을 이룬 IRP/MC 복합체는 결합, 바람직하게 공유 결합을 포함하는 미세담체, IRP에 대하여 적어도 부분적으로 상보성인 폴리뉴클레오티드 ("캡쳐 폴리뉴클레오티드")를 사용하여 생산된다. IRP 및 캡쳐 뉴클레오티드 사이의 상보성의 세그먼트는 바람직하게 적어도 6, 8, 10 또는 15개의 인접한 염기쌍, 더 바람직하게 적어도 20개의 인접한 염기쌍이다. 캡쳐 뉴클레오티드는 업계에 알려진 어느 방법에 의해서도 MC와 결합될 수 있고 바람직하게 5' 또는 3' 말단에서 IRP와 공유 결합된다.
다른 구체예에서, 결합쌍은 IRP/MC 복합체에서 IRP 및 MC를 결합시키기 위해 사용될 수도 있다. 결합쌍은 수용체 및 리간드, 항체 및 항원 (또는 에피토프), 또는 높은 친화도 (예를 들어, 약 10-8보다 작은 Kd)로 결합하는 어느 다른 결합 쌍일 수도 있다. 한 바람직한 타입의 결합쌍은 비오틴 및 스트렙타비딘 또는 비오틴 및 아비딘이며, 이것은 아주 단단한 복합체를 형성한다. IRP/MC 복합체 결합을 매개하기 위해 결합쌍이 사용될 때, IRP는, 전형적으로 공유 결합에 의해, 결합쌍의 한 멤버로 유도되고, MC는 결합쌍의 다른 멤버로 유도된다. 2개의 유도된 화합물의 혼합은 IRP/MC 복합체 형성을 일으킨다.
면역 조절 폴리뉴클레오티드의 분리 및 합성
여기에 설명된 면역 조절 폴리뉴클레오티드를 만드는 방법이 또한 여기에 제공된다. 일부 구체예에서, 면역 조절 폴리뉴클레오티드는 변형된 면역 조절 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 조절 폴리뉴클레오티드는 변형되지 않은 면역 조절 서열을 포함한다. 방법은 여기에 설명된 것들 중 어느 것도 될 수 있다. 예를 들어, 방법은 IRP를 합성할 수 있고 (예를 들어, 고체 상태 합성) 어느 정제 단계도 더 포함할 수 있다. 정제 방법은 업계에 알려져 있다.
면역 조절 폴리뉴클레오티드 (IRP)를 분리하고 합성하는 방법이 또한 제공된다. 일부 구체예에서, IRP는 변형된 IRP이다. 일부 구체예에서, IRP는 변형되지 않은 IRP이다.
IRP는 효소의 방법, 화학적 방법, 및 더 큰 올리고뉴클레오티드 서열의 분해를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 업계에 잘 알려진 기술 및 핵산 합성 장치를 사용하여 합성될 수 있다. 참조예, Ausubel et al. (1987); 및 Sambrook et al. (1989). 효소로 조립될 때, 개개의 단위는, 예를 들어, 리가제, 예를 들어, T4 DNA 또는 RNA 리가제로 결찰될 수 있다. 미국 특허 번호 5,124,246. 올리고뉴클레오티드 분해는 미국 특허 번호 4,650,675에 예시된 바와 같이, 뉴클레아제에 올리고뉴클레오티드의 노출을 통해 이루어질 수 있다.
IRP는 통상적인 폴리뉴클레오티드 분리 과정을 사용하여 분리될 수 있다. 이러한 과정은 공용 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위해 게놈 또는 cDNA 라이브러리에 프로브의 히브리드화, 공용 구조적 특징을 검출하기 위하여 발현 라이브러리의 항체 선별 및 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 특정 고유의 서열의 합성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
원형 면역 조절 폴리뉴클레오티드가 분리되고, 재조합 방법을 통해 합성되거나, 화학적으로 합성될 수 있다. 원형 IRP를 분리를 통해 또는 재조합 방법을 통해 얻은 경우, IRP는 바람직하게 플라스미드일 것이다. 더 작은 원형 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성을 문헌에 설명된 어느 방법을 사용해서 수행할 수 있다. 참조예, Gao et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 2025-2029; 및 Wang et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 2326-2333.
폴리뉴클레오티드 및 변형된 폴리뉴클레오티드를 만드는 기술은 업계에 알려져 있다. 자연적으로 발생한 DNA 또는 RNA는 일반적으로 적절한 뉴클레오시드 포스포르아미디트와 3'-말단의 고체 지지대에 부착된 성장하는 올리고뉴클레오티드의 5'-히드록시기를 연속적으로 결합시킨 후, 중간의 포스피트 트리에스테르를 포스페이트 트리에스테르로 산화시킴으로써 합성된다. 한 번 원하는 폴리뉴클레오티드 서열이 합성되면, 폴리뉴클레오티드는 지지대로부터 제거되고, 포스페이트 트리에스테르기는 포스페이트 디에스테르로 탈보호되고 뉴클레오시드 염기는 수성 암모니아 또는 다른 염기를 사용하여 탈보호된다. 참조예, Beaucage (1993) "Oligodeoxyribonucleotide Synthesis" in Protocols for Oligonucleotide and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, Totowa, NJ; Warner et al . (1984) DNA 3: 401 및 미국 특허 번호 4,458,066.
변형된 포스페이트 결합 또는 비-포스페이트 결합을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 합성은 또한 업계에 알려져 있다. 재검토를 위하여, Matteucci (1997) "Oligonuclotide Analogs: an Overview" in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (D. J. Chadwick and G. Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NY 참고. 폴리뉴클레오티드의 당 또는 당 유사체 모이어티에 부착될 수 있는 아인산 유도체 (또는 변형된 포스페이트기)는 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트 등일 수 있다. 상기-지시된 포스페이트 유사체의 제조, 및 그것들의 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드로 통합, 그 자체는 또한 알려져 있고 여기에 상세히 설명할 필요가 없다. Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848; Chaturvedi et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2318-2323; 및 Schultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2966-2973. 예를 들어, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성은 산화 단계가 황화 단계로 대체되는 것을 제외하고, 자연적으로 발생한 올리고뉴클레오티드에 대하여 상기 설명된 것과 유사하다 (Zon (1993) "Oligonucleoside Phosphorothioates in Protocols for Oligonucleatides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, pp. 165-190). 유사하게 다른 포스페이트 유사체, 포스포트리에스테르의 합성 (Miller et al. (1971) JACS 93: 6657-6665), 비-브리징 포스포르아미데이트 (Jager et al. (1988) Biochem. 27: 7247-7246), N3' 내지 P5' 포스포르아미디에이트 (Nelson et al. (1997) JOC 62: 7278-7287) 및 포스포로디티오에이트 (미국 특허 번호 5,453,496)가 또한 설명된다. 다른 비-아인산 기반의 변형된 올리고뉴클레오티드가 또한 사용될 수 있다 (Stirchak et al . (1989) Nucleic Acids Res. 17: 6129-6141).
당업자들은 다양한 헤테로 고리형 염기 및 다양한 당 모이어티 (및 당 유사체)를 포함하는 많은 수의 "합성" 비-자연적 뉴클레오시드가 업계에 이용 가능하고, 본 발명의 다른 기준이 만족하는 동안, IRP는 자연적으로 발생한 핵산의 원칙적인 5개의 염기 성분 외에 하나 또는 여러 헤테로 고리형 염기를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 하지만, 바람직하게도, 퓨린이 9-위치를 통해 IRP의 당 모이어티에, 1-위치를 통해 피리미딘에, 7-위치를 통해 피롤로피리미딘에 및 1-위치를 통해 피라졸로피리미딘에 부착되는 경우, IRP의 헤테로 고리형 염기는 우라실-5-일, 시토신-5-일, 아데닌-7-일, 아데닌-8-일, 구아닌-7-일, 구아닌-8-일, 4-아미노피롤로 [2. 3-d] 피리미딘-5-일, 2-아미노-4-옥소피롤로 [2, 3-d] 피리미딘-5-일, 2-아미노-4-옥소피롤로 [2. 3-d] 피리미딘-3-일 기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
염기-변형된 뉴클레오시드의 제조 및 전구체로서 염기-변형된 뉴클레오시드를 사용하여 변형된 올리고뉴클레오티드의 합성은, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,910,300, 4,948,882, 및 5,093,232에 설명된다. 이 염기-변형된 뉴클레오시드는 그것들이 화학적 합성에 의해 올리고뉴클레오티드의 말단 또는 내부 위치로 포함될 수 있도록 설계되었다. 올리고뉴클레오티드의 말단 또는 내부 위치에 존재하는 이러한 염기-변형된 뉴클레오시드는 펩티드의 부착을 위한 부위의 역할을 할 수 있다. 당 모이어티에서 변형된 뉴클레오티드가 또한 설명되고 (미국 특허 번호 4,849,513, 5,015,733, 5,118,800, 5,118,802를 포함하지만, 이에 제한되지 않는) 유사하게 사용될 수 있다.
투여 및 면역 반응의 평가
면역 반응을 조절하는 모든 조성물과 같이, 특정 IRP 및/또는 IRC 제형의 유효량 및 투여 방법은 개인, 무슨 질환이 치료되는지 및 당업자에 분명한 다른 인자에 따라 달라질 수 있다. 고려되는 인자는 IRP 및/또는 IRC가 전달 분자와 함께 투여되거나 이에 공유 결합으로 부착될 것인지, 투여의 경로 및 투여되는 량의 수를 포함한다. 이러한 인자는 업계에 알려져 있고 과다한 실험 없이 이러한 결정을 하는 것은 당업자의 범위 내에 있다. 적합한 투약 범위는 면역 반응의 원하는 조절을 제공하는 것 (예를 들어, IFN-α 또는 면역 자극 핵산에 반응하는 다른 시토킨 생산의 억제)이다. 면역 자극 핵산에 대한 면역 반응의 억제가 필요할 때, 적합한 투약 범위는 면역 자극 핵산에 의한 면역 반응의 원하는 억제를 제공하는 것이다. 일반적으로, 투약은 투여되는 IRP-함유 조성물의 전체 량 대신 환자에게 투여되는 IRP 및/또는 IRC의 양에 의해 결정된다. 전달되는 IRP 및/또는 IRC의 양에서 주어진, IRP 및/또는 IRC의 유용한 투약 범위는, 예를 들어, 다음 중 약 어느 것일 수도 있다: 0.5 내지 10 mg/kg, 1 내지 9 mg/kg, 2 내지 8 mg/kg, 3 내지 7 mg/kg, 4 내지 6 mg/kg, 5 mg/kg, 1 내지 10 mg/kg, 또는 5 내지 10 mg/kg. 각각의 환자에게 주어지는 절대량은 약학적 성질, 예를 들어, 생물학적 이용 가능성, 제거율 및 투여 경로에 의존한다.
여기에 설명된 바와 같이, 원하지 않는 면역 활성화가 일어나거나 일어날 가능성이 큰 조직은 IRP 및/또는 IRC에 대한 바람직한 표적이다. 따라서, 바이러스에 노출된 림프절, 비장, 골수, 혈액, 뿐만 아니라 조직에 IRP 및/또는 IRC의 투여는 투여의 바람직한 부위이다.
생리학적으로 허용 가능한 임플란트, 연고, 크림, 린스 및 겔을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 국부적 적용에 적합한 IRP 및/또는 IRC 제형이 여기에 제공된다. 피부 투여의 전형적인 경로는 최소의 침습성인 것들, 예를 들어, 경피성 전달, 표피 투여 및 피하 주사이다.
여기에 제공된 조성물은 IRP 또는 IRC 및 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함할 수도 있다. 완충액을 포함하는, 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 여기에 설명되고 업계에 잘 알려져 있다. Remington: The Science 및 Practice of Pharmacy, 20th edition, Mack Publishing (2000).
경피성 투여는 IRP 및/또는 IRC가 피부를 투과하고 혈류에 들어가는 것을 허용할 수 있는, 크림, 린스, 겔, 등의 적용에 의해 이루어진다. 경피성 투여에 적합한 조성물은 피부에 직접적으로 적용되거나 보호 담체, 예를 들어, 경피성 장치 (소위 "패치")에 통합되는 약학적으로 허용 가능한 현탁액, 오일, 크림 및 연고를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 크림, 연고 등의 예는, 예를 들어, Physician's Desk Reference에서 발견될 수 있다. 경피성 전달은 또한 이온토포레시스에 의해, 예를 들어, 계속해서 몇일 이상의 기간 동안 손상되지 않은 피부를 통해 생성물을 전달하는, 상업적으로 이용 가능한 패치를 사용하여 이루어질 수도 있다. 이 방법의 사용은 상대적으로 높은 농도로 약학적 조성물의 조절된 전달을 허용하고, 조합 약물의 주입을 허용하고 흡착 프로모터의 동시 사용을 허용한다.
투여의 비경구 경로는 전기적 (이온토포레시스) 또는 직접적인 주사, 예를 들어, 중심정맥관으로 직접 주사, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피부 내, 또는 피하 주사를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 비경구 투여에 적합한 IRP 및/또는 IRC의 제형은 일반적으로 USP 물 또는 주사용수에서 조제되고 pH 완충액, 염 증량제, 보존제, 및 다른 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수도 있다. 비경구 투여를 위한 면역 조절 폴리뉴클레오티드는 약학적으로 허용 가능한 무균 등장성 용액, 예를 들어, 주사를 위해 식염수 및 포스페이트 완충된 식염수에서 조제될 수도 있다.
위장 투여의 경로는 섭취 및 직장의 경로를 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 섭취용 분말, 알약 또는 액체 및 직장 투여용 좌약의 사용을 포함할 수 있다.
코-인두 및 폐 투여는 흡입에 의해 이루어지고 전달 경로, 예를 들어, 비강 내, 기관지 내 및 치조정 경로를 포함한다. 발포 에어로졸을 위한 액체 현탁액뿐만 아니라 건조 분말 흡입 전달 시스템을 위한 분말 형태를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 흡입에 의한 투여에 적합한 IRP 및/또는 IRC의 제형이 제공된다. IRP 또는 IRC 제형의 흡입에 의한 투여에 적합한 장치는 분무기, 기화기, 흡입기, 및 건조 분말 흡입 전달 장치를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
업계에 잘 알려진 바와 같이, 여기에 설명된 투여의 경로에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음 성분 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 무균 희석액, 예를 들어, 주사용수, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항세균제, 예를 들어, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 또는 아황산수소 나트륨; 킬레이트 시약, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충액, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장력 조정용 시약, 예를 들어, 염화 나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예를 들어, 염산 또는 수산화 나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다회수 용량 바이알에 동봉될 수 있다.
업계에 알려진 바와 같이, 주사 가능한 사용에 적합한 약학적 조성물은 무균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산 및 무균 주사 가능한 용액의 즉시 제조를 위한 무균 분말 또는 분산을 포함한다. 정맥 내 투여를 위하여, 적합한 담체는 생리학적 식염수, 정세균성 (bacteriostatic) 물, Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ) 또는 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 무균이어야 하고 쉬운 주사 가능하게 존재하는 범위에 대한 유동체여야 한다. 그것은 제조 및 저장의 조건 하에 안정해야 하고 미생물, 예를 들어, 박테리아 및 균류의 오염 작용에 대하여 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예를 들어, 레시틴의 사용에 의해, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살, 등에 의해 이루어질 수 있다. 조성물에 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것은 바람직할 수도 있다. 조성물에 흡착을 지연시키는 시약, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함함으로써 주사 가능한 조성물의 연장된 흡착을 일으킬 수 있다.
업계에 알려진 바와 같이, 무균 주사 가능한 용액을 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합을 가진 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 포함하고, 필요한 경우, 여과 살균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산은 활성 화합물을 염기성 분산 배지 및 상기 열거된 것들의 필요한 다른 성분을 함유하는 무균 비히클에 포함함으로써 제조된다. 무균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에서, 바람직한 제조 방법은 이들의 이전에 무균-여과된 용액의 활성 성분 플러스 어느 추가적인 원하는 성분을 수득하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 상기-언급된 조성물 및 투여 방법은 여기에 설명된 IRP 및 IRC의 제형을 투여하는 방법을 설명하지만, 이에 제한되지 않는다는 것을 의미한다. 다양한 조성물 및 장치를 생산하는 방법은 당업자의 능력 내에 있고 여기에 상세히 설명되지 않는다.
조합 요법
여기에 설명된 바와 같이, IRP 및/또는 IRC 는 다른 치료제와 조합으로 투여될 수 있고, 이들의 생리학적으로 허용 가능한 담체와 결합될 수 있다 (및 여기에 설명된 이 조성물들을 포함한다). 여기에 설명된 방법은 장애에 대한 관리, 예를 들어, 항-염증제의 투여의 표준을 만든다. 여기에 설명된 바와 같이, IRP 및/또는 IRC는 코르티코스테로이드와 조합으로 투여될 수 있고, 이들의 생리학적으로 허용 가능한 담체와 결합될 수 있다 (및 여기에 설명된 이 조성물들을 포함한다). IRP 및/또는 IRC는 여기에 설명된 것들 중 어느 것도 될 수 있다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 변형된 IRS를 포함한다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 변형되지 않은 및 변형된 IRS 모두를 포함한다.
일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 코르티코스테로이드와 조합으로 투여된다. 일부 구체예에서, 코르티코스테로이드는 미네랄로코르티코이드이다. 코르티코스테로이드는 코르티코스테론 및 유도체, 프로드러그, 이소머 및 이들의 유사체, 코르티손 및 유도체, 프로드러그 이소머 및 이들의 유사체 (즉, Cortone), 알도스테론 및 이들의 유도체, 프로드러그, 이소머 및 유사체, 덱사메타손 및 이들의 유도체, 프로드러그, 이소머 및 유사체 (즉, Decadron), 프로드니손 및 이들의 유도체, 프로드러그, 이소머 및 유사체 (즉, Prelone), 플루드로코르티손 및 이들의 유도체, 프로드러그, 이소머 및 유사체 (즉 Florinef?), 히드로코르티손 및 이들의 유도체, 프로드러그, 이소머 및 유사체 (즉, 코르티솔 또는 Cortef), 히드록시코르티손 및 이들의 유도체, 프로드러그, 이소머 및 유사체, 베타메타손 및 이들의 유도체, 프로드러그, 이소머 및 유사체 (즉, Celestone), 부데소니드 및 이들의 유도체, 프로드러그, 이소머 및 유사체 (즉, Entocort EC), 메틸프로드니솔론 및 이들의 유도체, 프로드러그, 이소머 및 유사체 (즉, Medrol), 프레드니솔론 및 이들의 유도체, 프로드러그, 이소머 및 유사체 (즉, Deltasone, Crtan, Meticorten, Orasone, 또는 Sterapred), 트리암시놀론 및 이들의 유도체, 프로드러그, 이소머 및 유사체 (즉, Kenacort 또는 Kenalog), 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 코르티코스테로이드는 플루드로코르티손 또는 이들의 유도체, 프로드러그, 이소머 및 유사체이다. 일부 구체예에서, 코르티코스테로이드는 플루드로코르티손이다. 일부 구체예에서, 코르티코스테로이드는 히드록시코르티손 또는 이들의 유도체, 프로드러그, 이소머 및 유사체. 일부 구체예에서, 코르티코스테로이드는 히드록시코르티손이다.
일부 구체예에서, 코르티코스테로이드는 하루에 약 0.001 mg 내지 약 1 mg, 약 0.5 mg 내지 약 1 mg, 약 1 mg 내지 약 2 mg, 약 2 mg 내지 약 20 mg, 약 20 mg 내지 약 40 mg, 약 40 내지 약 80 mg, 약 80 내지 약 120 mg, 약 120 mg 내지 약 200 mg, 약 200 mg 내지 약 500 mg, 약 500 mg 내지 약 1000 mg 중 어느 것으로도 투여된다. 일부 구체예에서, 코르티코스테로이드는 하루에 약 0.1 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 약 15 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 20 mg/kg 내지 약 25 mg/kg, 약 25 mg/kg to 35 mg/kg, 또는 약 35 mg/kg 내지 약 50 mg/kg 중 어느 것으로도 투여된다.
일부 구체예에서, 조합 요법으로 사용되고 전달된 IRP 및/또는 IRC의 양으로 주어진 IRP 및/또는 IRC는, 예를 들어, 약 다음 중 어느 것도 될 수 있다: 0.5 내지 10 mg/kg, 1 내지 9 mg/kg, 2 내지 8 mg/kg, 3 내지 7 mg/kg, 4 내지 6 mg/kg, 5 mg/kg, 1 내지 10 mg/kg, 또는 5 내지 10 mg/kg.
일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 코르티코스테로이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다른 치료제와 동시에 투여된다 (동시 투여). 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 코르티코스테로이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다른 치료제와 순차적으로 투여된다 (순차적 투여). 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 다른 치료제와 같은 투여 경로로 투여된다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC는 다른 치료제와 다른 투여 경로로 투여된다. 일부 구체예에서, 다른 치료제는 비경구로 (예를 들어, 중심정맥관, 동맥 내, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피부 내, 또는 피하 주사), 경구로, 위장으로, 국부적으로, 코-인두 및 폐에 (예를 들어 흡입 또는 비강 내) 투여된다. 일부 구체예에서, 다른 치료제는 코르티코스테로이드이다.
일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC와 다른 치료제의 조합은 IRP 및/또는 IRC 또는 다른 치료제가 단독으로 투여될 때 유효량과 비교하여 IRP 및/또는 IRC 및/또는 다른 치료제의 유효량 (투약 부피, 투약 농도, 투여되는 전체 약물 용량을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다)을 감소시킨다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC와 코르티코스테로이드의 조합은 단독으로 투여되는 코르티코스테로이드와 비교하여 유효량을 감소시킨다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC와 다른 치료제의 조합은 다른 치료제 단독의 투여와 비교하여 다른 치료제의 투여의 빈도를 감소시킨다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC와 다른 치료제의 조합은 다른 치료제 단독의 투여와 비교하여 치료의 전체 기간을 감소시킨다. 일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC와 다른 치료제의 조합은 다른 치료제 단독의 투여에 관련된 부작용을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 다른 치료제는 코르티코스테로이드이다. 일부 구체예에서, 코르티코스테로이드는 플루드로코르티손 또는 이들의 유도체, 프로드러그, 이소머 및 유사체이다. 일부 구체예에서, 코르티코스테로이드는 플루드로코르티손이다.
일부 구체예에서, IRP 및/또는 IRC 및 코르티코스테로이드의 조합을 포함하거나 이에 제한되지 않는 조합 요법은 염증성 질환의 치료에 사용된다. 일부 구체예에서, 염증성 질환은 자가 면역 질환이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 류마티스성 관절염이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 루푸스이다. 일부 구체예에서, 자가 면역 질환은 전신 홍반성 루푸스 (SLE)이다. 일부 구체예에서, 루푸스는 신부전과 관련된다. 일부 구체예에서, 신부전은 보통 신부전이다. 일부 구체예에서, 신부전은 심각한 신부전이다.
키트
키트가 여기에 제공된다. 특정 구체예에서, 여기에 설명된 키트는 일반적으로 여기에 설명된 바와 같이 IRP 및/또는 IRC 중 어느 것을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 변형된 IRS를 갖는 IRP 및/또는 IRC를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 변형되지 않은 IRS를 갖는 IRP 및/또는 IRC를 포함한다. 일부 변이에서, 키트는 변형된 및 변형되지 않은 IRS 모두를 갖는 IRP 및/또는 IRC를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 다른 치료제를 더 제공할 수도 있다. 일부 구체예에서, 다른 치료제는 코르티코스테로이드이다.
키트는 여기에 설명된 방법 중 어느 것 (예를 들어, 면역 자극 핵산에 대한 반응 억제, TLR7 및/또는 TLR9 의존적 반응의 억제, 자가 면역 질환의 하나 이상의 증상의 개선, 만성 염증성 질환의 증상의 개선, 바이러스에 반응하여 시토킨 생산의 감소)에 대한 IRP 및/또는 IRC의 사용에 관련된, 적합한 세트의 설명서, 일반적으로 서면 설명서를 더 포함할 수도 있다.
키트는 어느 편리한, 적절한 포장재에 포장된 IRP 및/또는 IRC를 포함할 수도 있다. 예를 들어, IRP 또는 IRC가 건조 제형 (예를 들어, 동결 건조된 또는 건조 분말)이면, 탄성 마개를 가진 바이알을 일반적으로 사용해서, IRP 또는 IEC가 쉽게 탄성 마개를 통해 주사용 유동체에 의해 쉽게 재현탁될 수도 있다. 비-탄성, 제거 가능한 뚜껑을f가진 앰플 (예를 들어, 밀봉된 유리) 또는 탄성 마개는 IRP 또는 IRC의 액체 제형에 가장 편리하게 사용된다. 특이적 장치, 예를 들어, 흡입기, 코 투여 장치 (예를 들어, 분무기), 주사기 또는 주입 장치, 예를 들어, 미니펌프와 조합으로 사용되는 패키지가 또한 고려된다.
IRP 및/또는 IRC의 사용과 관련된 설명서는 일반적으로 의도된 사용 방법을 위해 투여량, 투여 계획, 및 투여의 경로에 관한 정보를 포함한다. IRP 또는 IRC의 용기는 단위 투여량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다회수 투여 패키지) 또는 부단위 투여량일 수도 있다. 여기에 설명된 키트에 공급되는 설명서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트)의 서면 설명서이지만, 기계로 읽을 수 있는 설명서 (예를 들어, 자기 또는 광 저장 디스크에 담긴 설명서)가 또한 허용 가능하다.
일부 구체예에서, 여기에 설명된 키트는 투여용 복합체와 같은 IRP 및/또는 IRC의 생산을 위한 물질, 예를 들어, 캡슐화 물질, 미세담체 복합 물질 등을 포함한다. 일반적으로, 키트는 IRP 및 IRC 및 복합 물질의 별도의 용기를 포함한다. IRP 및 IRC 및 복합체는 바람직하게 공급된 IRP 또는 IRC 및 복합 물질의 혼합에서 IRP-또는 IRC-복합체의 형성을 허용하는 형태로 공급된다. 이 배치는 IRP-또는 IRC-복합체가 비-공유 결합에 의해 결합될 때 바람직하다. 이 배치는 또한 IRP-또는 IRC-복합체가 이종 이기능성 가교제를 통해 교차결합되는 것일 때 바람직하다; IRP/IRC 또는 복합체는 "활성화된" 형태로 (예를 들어, IRP/IRC와 반응성인 모이어티가 이용 가능한 이종 이기능성 가교제와 결합된) 제공된다.
실시예
다음 실시예는 본 발명을 도시하기 위해 제공되지만, 제한하지 않는다. 실시예에 사용된 IRP는, 달리 지시되지 않으면, 모든 포스포로티오에이트 결합으로 2'-데옥시리보 폴리뉴클레오티드 서열로 합성되었다 (예를 들어, 2'-O-메틸 당 변형으로 지시된 특정 뉴클레오티드).
약자: ELHA (효소-결합 히브리드화 검정); ELISA (효소-결합된 면역 흡착 검정); GC (글루코코르티코이드); IC50 (최대 억제제 농도의 절반); IC90 (최대 억제제 농도의 90%); IFN (인터페론); IP (복강 내); IRP (면역 조절 폴리뉴클레오티드); ISS (면역 자극 서열); IV (정맥 내); MOI (감염 다중도); PBMC (말초 혈액 단핵 세포); PDC (형질세포양 수지상세포s); SC (피하); SLE (전신 홍반성 루푸스); TLR (toll-유사 receptor).
실시예 1: IRP 의 존재시 배양된 사람 B-세포
B-세포 자극 활성에 대한 IRP의 효과를 더 조사하기 위하여, 다양한 서열 또는 대조군 샘플을 IL-6에 대하여 검정하였다.
사람 B-세포 검정을 위하여, B-세포를 마그네틱 비드를 사용하여 건강한 기증자로부터 얻은 전체 혈액 세포에서 정제하였다 (CD19 양성). 세포를 신선한 배지에 재현탁하였다 (10% 태아 소 혈청, 50 유닛/ml 페니실린, 50 μg/ml 스트렙토마이신, 및 2 μm 글루타민이 들어있는 RPMI 1640). 이후 세포를 도에 나타난 바와 같이 다양한 농도의 IRP 또는 대조군 서열과 함께 배양하였다. 48시간에, 계면활성제를 수거하였고 시토킨 수준, IL-6을 면역 검정을 사용하여 측정하였다. 테스트된 IRP에 대한 설명은 표 1-1에서 발견된다.
도 1a 및 1b는 테스트된 IRP 또는 대조군의 존재시 생산된 IL-6 (pg/ml)을 나타낸다. 포스포로티오에이트-매개된 올리고데옥시뉴클레오티드는 시험관 내에서 백본으로 인해 일부 사람 B-세포 반응을 유발하지만, B-세포 활성화의 증거는 영장류의 생체 내에서 나타나지 않는다. 하지만, B-세포는 설치류의 기관에 침윤할 수 있다. C532, DV177, 및 SEQ ID NO: 109는 증가된 IL-6에 의해 입증되는 바와 같이 B-세포 반응을 유발하였다. 놀랍게도, SEQ ID NO: 42는 다르고 어느 B-세포 반응도 유발하지 않았다.
도 1c는 ISS (TLR9 리간드) 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 자극된 CpG-ISS의 퍼센트 IL-6을 나타낸다. SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144는 낮은 B-세포 자극 활성을 갖고 있었다.
표 1-1: IRP 및 대조군의 서열
Figure pct00006
* I = 데옥시-이노신
실시예 2: IRP 의 모노머 및 테트라머 형성
이론상으로 4-G 반복을 함유하는 IRP는 평행 가닥의 G-4분자를 형성할 수 있다. 테트라머 형성을 더 조사하기 위하여, 4-G 반복에서 구아닌을 이노신으로 치환하는 효과를 평가하였다.
용액을 PBS 및 0.5M KCl에 IRP 서열 100 mg/ml을 혼합하고 상온에서 3 내지 5주 동안 보관함으로써 제조하였다. 용액을 크기-배제 HPLC로 순차적으로 분석하였다.
상온에서 3주 동안 저장 후, 단지 54. 01%가 모노머 형태로 있지만, 5'-GGGG-3'을 포함하는 SEQ ID NO: 42의 45. 99%는 용액에서 테트라머 형태로 있었다. 반대로 5'-GIGG-3'을 포함하는 SEQ ID NO: 109의 100%는 모노머 형태로 있었다.
상온에서 5주 동안 저장 후, 모두 5'-GIGG-3'을 포함하는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144는 모노머 형태로 있었다.
실시예 3: 래트에 IRP 의 높은 투여량
래트에 높은 투여량에서 IRP의 활성을 테스트하기 위하여, IRP (SEQ ID NO: 42 및 SEQ ID NO: 109) 또는 대조군 (PBS)을 8-9주령, 암컷 Sprague Dawley 래트에 제0일, 제3일, 제6일, 및 제9일에 100 mg/kg 또는 10 mg/kg의 투여량으로 피하 투여하였다 (그룹당 n=6). 래트를 투여 전 및 제1일, 제3일, 제4일, 제6일, 제7일, 및 제9일에 칭량하였다. 연구의 끝에 기관을 수확하였고, 기관 중량 및 올리고뉴클레오티드의 조직 수준을 결정하였다. 추가로, 간, 신장, 및 심장의 조직학적 평가를 수행하였다.
SEQ ID NO: 42 및 SEQ ID NO: 109의 10 mg/kg 또는 100 mg/kg의 투여시 간, 심장, 신장, 또는 비장의 기관 중량에서 유의한 차이는 없었다. SEQ ID NO: 109의 100 mg/kg에서, 도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이 전체 중량 및 % 체중 증가/손실의 감소를 관찰하였다.
높은 투여량에서 IRP의 활성을 더 테스트하기 위하여, IRP (SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144) 또는 대조군 (식염수)을 8-9주령, 암컷 Sprague Dawley 래트에 제0일, 제3일, 제6일, 및 제9일에 90 mg/kg의 투여량으로 피하 투여하였다 (그룹당 n=6). 래트를 투여 전 및 제1일, 제3일, 제4일, 제6일, 제7일, 및 제9일에 칭량하였다. 연구의 끝에 기관을 수확하였고, 기관 중량 및 올리고뉴클레오티드의 조직 수준을 결정하였다. 추가로, 간, 신장, 및 심장의 조직학적 평가를 수행하였다.
SEQ ID NO: 109가 투여된 그룹에서, 1마리의 래트가 1차 투여량의 투여 2일 후 죽었다. SEQ ID NO: 79가 투여된 그룹에서, 2마리의 래트가 1차 투여량의 투여 2일 후 죽었고 1마리의 래트가 2차 투여량의 투여 2일 후 죽었다. 래트 전체 체중 및 퍼센트 중량 증가/손실은 도 2c 및 2d에 나타난다.
간, 신장 및 심장의 조직학적 평가는 표 3-1에 나타난다.
표 3-1. 래트 조직학
Figure pct00007
() = 평균 심각성 점수 0 = 변화 없음, 1 = 최소, 2 = 가벼움, 3 = 중간 및 4 = 심각함.
SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 134는 바람직한 독성 프로파일을 갖는다. 확률적인 치료-관련된 변화는 심장, 신장 및 간에 나타났다. 심장의 변화는 출혈, 괴사 및 세포의 공포형성을 특징으로 하였다. 출혈 및 괴사는 SEQ ID NO: 109 (90 mg/kg) 및 SEQ ID NO: 79 (90 mg/kg) 그룹에서 나타났다. 세포의 공포형성 (공포형성된 청록색 세포질을 가진 수 개의 사이 세포)은 그룹 SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144 (90 mg/kg)의 일부 동물에서 나타났다. 신장의 변화는 관의 변화, 관의 호염기구 이상증 (basophilia) 및 괴사로 구성된다. 관의 변화 (간위의 세관의 일부 세포질 점조각을 가진 증가된 호산 백혈구 증가증 (eosinophilia)을 특징으로 하는)는 처리된 모든 그룹에서 다양한 발생률도 발생하였다. 관의 호염기구 이상증 및 위축은 피질의 세관을 수반하였고 다초점에서 확산의 범위에 있었고, 또한 가끔 개개의 세관 세포 괴사 및 가벼운 사이 단핵 세포 침윤과 관련되었다. 관의 호염기구 이상증은 그룹 SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144 (90 mg/kg) 및 SEQ ID NO: 109 (90 mg/kg 및 10 mg/kg)에서 발생하였다. 신장 괴사는 단지 SEQ ID NO: 109 및 SEQ ID NO: 79 (90 mg/kg) 그룹에서만 나타났다. 간 변화는 다음을 특징으로 하였다: a) 그룹 SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 79, 및 SEQ ID NO: 144 (90 mg/kg)의 간세포 괴사 (개개의 세포 괴사 또는 괴사의 초점); 및 b) SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144 (90 mg/kg) 및 SEQ ID NO: 134 및 SEQ ID NO: 144 (10 mg/kg) 그룹에서 간세포 세포질 공포형성.
실시예 4: 마우스에 IRP 의 높은 투여량
마우스에 높은 투여량에서 IRP의 활성을 테스트하기 위해, IRP 또는 대조군 (식염수)을 제1일, 제4일, 제7일, 및 제10일에 4 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg, 또는 100 mg/kg의 투여량으로 BALB/c 마우스에 피하 투여하였다 (그룹당 n=6). 마우스를 투여 전 및 제2일, 제4일, 제7일, 제9일, 및 제11일에 칭량하였다. 혈청 시토킨을 1차 주사 및 3차 주사 2시간 전에 및 4차 주사 24시간 전에 검정하였다. 연구의 끝에 기관을 수확하였고, 기관 중량 및 올리고뉴클레오티드의 조직 수준을 결정하였다. 추가로, 간, 신장, 및 심장의 조직학적 평가를 수행하였다.
100 mg/kg에서 SEQ ID NO: 109는 도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이 마우스에서 % 증가 대 사전-투여량에 의해 나타난 바와 같이 중량 손실을 유발하였지만, SEQ ID NO: 42는 아니다.
높은 투여량에서 IRP의 활성을 더 테스트하기 위하여, IRP (100 mg/kg에서 SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143, 및 SEQ ID NO: 144) 또는 대조군 (식염수 및 ISS (5 mg/kg))을 제0일, 제3일, 제6일, 및 제9일에 BALB/c 마우스에 피하 투여하였다 (그룹당 n=6). 마우스를 투여 전 및 제1일, 제3일, 제4일, 제6일, 제7일, 및 제9일에 칭량하였다. 연구의 끝에 기관을 수확하였고, 기관 중량 및 올리고뉴클레오티드의 조직 수준을 결정하였다. 추가로, 간, 신장, 및 심장의 조직학적 평가를 수행하였다.
도 3c에 나타난 바와 같이, 테스트된 IRS 서열은 % 증가 대 사전-투여량에 의해 결정된 바와 같이 체중에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 게다가, 도 4a-4d에 나타난 바와 같이 간, 심장, 신장, 또는 비장의 기관 중량의 유의한 차이가 없었다. 간, 신장 및 심장의 조직학적 평가는 도 4-1에 나타난다.
치료-관련된 변화는 심장에서 나타나지 않았다. 관찰관 심장의 변화는 무기화를 포함하였고, 및/또는 우심실의 심막하 영역의 만성 염증은 마우스의 일부 종에서 일반적으로 발견된다. 확률적인 치료-관련된 간 변화는 다음을 특징으로 하였다: a) 세포질의 공포형성을 가진 일부 사인곡선 세포의 비대 및 사인곡선 세포의 세포질의 청록색 염색, b) 조혈 요소 및 염증성 성분인 것으로 나타나는 것 모두를 특징으로 하는, 혼합된 세포 침윤 (이 변화는 정상 초점의 혼합된 세포 침윤과 구분하기 어려웠으며, 이것은 일반적으로 마우스에 나타나지만, 절대 치료와 관련되지 않았다), 및 c) 지방과 일치하는 세포질의 공포형성의 가벼운 증가. 아마 치료와 관련된 신장 변화는 다음을 특징으로 하였다: a) 복잡한 관의 세포질에서, 특히 피막 아래 영역에서 검은 좀조직의 변화하는, 일반적으로 최소 내지 가벼운 정도로 구성되는 관의 변화 및 b) 피질 영역에서 가벼운 관의 호염기구 이상증의 초점 영역 (이것은 가끔 마우스에서 발견되고 그러므로 치료 효과가 배제되지 않지만, 치료와 관련되지 않을 수도 있다).
표 4-1. 마우스 조직학
Figure pct00008
** = 2마리의 동물에서 손실된 조직
() = 평균 심각성 점수 0 = 변화 없음, 1 = 최소, 2 = 가벼움, 3 = 중간 및 4 = 심각함.
실시예 5: IRP 의 존재시 1018 ISS ( TLR9 리간드 ) 또는 R848 ( TLR7 리간드 )로 자극된 마우스 비장 세포
IRP 또는 대조군 샘플을 마우스 세포에서 면역 조절 활성에 대하여 검정하였다. 마우스 세포 검정에 대하여, 6-12주령 BALB/c 마우스 비장에서 비장 세포를 수확하였고 금속 스크린을 통해 분해된 파편에 힘을 가함으로써 기계적으로 분산하였다. 분산된 비장 세포를 원심분리에 의해 펠렛을 만들었고, 이후 신선한 배지 (10% 태아 소 혈청, 플러스 50 단위/mL 페니실린, 50 μg/mL 스트렙토마이신, 2 mM 글루타민, 및 0.05 mM β-메르캅토에탄올을 가진 RPMI 1640)에 재현탁하였다. 투여량-의존적인 방식으로, 세포를 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 1 mM의 CpG-ISS 1018 ISS (TLR9 리간드; 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3' (SEQ ID NO: 157)) 또는 1 μm의 R848 (TLR7 리간드; 레시퀴모드로 또한 불리는 작은 분자 이미다조퀴놀린)로 자극하였다. 48시간에, 상층액을 수거하였고 시토킨 수준, IL-6을 면역 검정을 사용하여 결정하였다. 3번의 별도의 실험을 수행하였다.
도 5a는 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 R848 (TLR7 리간드)과 함께 자극될 때 R848 단독과 비교하여 생산된 IL-6의 퍼센트를 나타낸다. 도 5b는 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 CpG-ISS (TLR9 리간드)와 함께 자극될 때 CpG-ISS 단독과 비교하여 생산된 IL-6의 퍼센트를 나타낸다.
실시예 6: IRP 의 존재시 1018 ISS ( TLR9 리간드 ) 또는 R848 ( TLR7 리간드 )로 자극된 래트 비장 세포
IRP 또는 대조군 샘플을 마우스 세포에서 면역 조절 활성에 대하여 검정하였다. 마우스 세포 검정에 대하여, 8-9주령, 암컷 Sprague Dawley 래트 비장에서 비장 세포를 수확하였고 금속 스크린을 통해 분해된 파편에 힘을 가함으로써 기계적으로 분산하였다. 분산된 비장 세포를 원심분리에 의해 펠렛을 만들었고, 이후 신선한 배지 (10% 태아 소 혈청, 플러스 50 단위/mL 페니실린, 50 μg/mL 스트렙토마이신, 2 mM 글루타민, 및 0.05 mM β-메르캅토에탄올을 가진 RPMI 1640)에 재현탁하였다. 투여량-의존적인 방식으로, 세포를 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 1 mM의 CpG-ISS 1018 ISS (TLR9 리간드; 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3' (SEQ ID NO: 157)) 또는 1 μm의 R848 (TLR7 리간드; 레시퀴모드로 또한 불리는 작은 분자 이미다조퀴놀린)로 자극하였다. 48시간에, 상층액을 수거하였고 시토킨 수준, IL-6을 면역 검정을 사용하여 결정하였다. 비장 세포에 대하여 2번의 별도의 실험을 수행하였고 B-세포에 대하여 1번의 실험을 수행하였다.
도 6a 및 6b는 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 R848 (TLR7 리간드)과 함께 자극될 때 R848 단독 또는 생산된 IL-6의 수준 (pg/ml)과 비교하여 생산된 IL-6의 퍼센트를 나타낸다. 도 6c 및 6d는 비장 세포 및 B-세포에서 각각, 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 CpG-ISS (TLR9 리간드)와 함께 자극될 때 CpG-ISS 단독 또는 생산된 IL-6의 수준 (pg/ml)과 비교하여 생산된 IL-6의 퍼센트를 나타낸다.
실시예 7: IRP 의 존재시 자극되는 사람 B-세포
TLR7 및 TLR9 활성화에 대한 IRP의 효과를 더 조사하기 위하여, 다양한 IRP 또는 대조군 샘플을 사람 B-세포에서 면역 조절 활성에 대하여 검정하였다. 사람 B-세포를 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 1 mM의 CpG-ISS 1018 ISS (TLR9 리간드; 5'-GACTGTGAACGTTCGAGATGA-3' (SEQ ID NO: 157)) 또는 1 μm의 R848 (TLR7 리간드; 레시퀴모드로 또한 불리는 작은 분자 이미다조퀴놀린)로 자극하였다.
도 7a는 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 CpG-ISS (TLR9 리간드)로 자극될 때 CpG-ISS 단독과 비교하여 생산된 IL-6의 퍼센트를 나타낸다. 도 7b는 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 R848 (TLR7 리간드)로 자극될 때 R848 단독과 비교하여 생산된 IL-6의 퍼센트를 나타낸다.
실시예 8: IRP 의 존재시 자극되는 사람 형질세포양 수지상세포 ( PDC )
TLR7 및 TLR9 활성화에 대한 IRP의 효과를 더 조사하기 위하여, 다양한 IRP 또는 대조군 샘플을 사람 PDC에서 면역 조절 활성에 대하여 검정하였다.
단순 헤르페스 바이러스 타입 1 (HSV-1 KOS 균주)으로 감염된 사람 PDC는 IFN-α의 생산으로 반응하였고 이 반응은 TLR-9 신호 전달에 의존적이다. 인플루엔자 바이러스 (FLU H1N1 균주, 1934년 Puerto Rico의 환자로부터 A/PR/8/34; ATCC 카탈로그 xVR-95 참조)로 감염된 사람 PDC는 또한 IFN-α로 반응하지만, 이 반응은 TLR-7 신호 전달에 의존적이고 TLR-9에 독립적이다. 감염된 세포에 의한 선천성 면역 반응 시토킨 생산에 대한 IRP의 효과를 조사하였다. 투여량-의존적인 방식으로, 1차 세포 PDC를 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 HSV-1 (4 MOI) 또는 인플루엔자 (2 MOI)로 자극하였다. 24시간에, 상층액을 수거하였고 시토킨 수준, IFN-알파를 면역 검정에 의해 측정하였다.
16-18명의 기증자의 사람 PDC를 정제하였고 인플루엔자 바이러스 (균주 PR/8) 또는 HSV-1로 감염시켰다. 인플루엔자 바이러스를 2 MOI에서 사용되었지만, HSV를 4 MOI에서 사용하였다. 세포에 의해 생산된 IFN-α의 양을 측정하였고 감염을 위해 사용된 바이러스의 양과 비교하였다.
도 7c 및 7d는 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 각각 인플루엔자 바이러스 (TLR7 리간드)로 자극될 때 또는 HSV (TLR9 리간드)로 자극될 때 바이러스 단독과 비교하여 생산된 IFN-α의 퍼센트를 나타낸다.
사람 PDC를 단독으로 또는 1 μm의 테스트된 IRP의 존재시 TLR9L CpG-ISS 274 (5'-TCG TCG AAC GTT CGA GAT GAT-3' (SEQ ID NO: 158)) 또는 TLR9L DNA-IC 또는 TLR7L RNP-IC로 자극하였다. DNA-IC (항-이중 가닥 DNA 면역 복합체)는 IFN-α의 방출을 유발함으로써 사람 PDC의 TLR9를 유발한다. DNA-IC를 SLE 환자의 항-dsDNA 양성 혈장으로부터 얻었고 10% 배양 웰 부피로 사용하였다. RNP-IC (항-리보뉴클리어 단백질 면역 복합체)는 IFN-α의 방출을 유발함으로써 사람 PDC의 TLR7을 유발한다. RNP-IC는 SLE 환자의 항-RNP 양성 혈장으로부터 정제된 IgG였고 0.5 mg/ml으로 사용하였다. 37℃에서 배양 24시간 후, 상층액을 수확하였고 면역 검정에 의해 IFN-α를 측정하였다.
도 8a는 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 CpG-ISS로 자극될 때 생산된 IFN-α의 수준을 나타낸다. 도 8b 및 8c는 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 각각 DNA-IC로 자극될 때 DNA-IC 단독과 비교하여 생산된 IFN-α의 퍼센트를 나타낸다.
실시예 9: TLR7 -및 TLR9 -자극된 사람 PDC 에 대한 IRP 의 IC50 및 IC90 값
TLR7 및 TLR9 활성화에 대한 IRP의 유효성을 더 조사하기 위하여, 실시예 8에 설명된 바와 같이 다양한 IRP 또는 대조군 샘플을 사람 PDC에서 면역 조절 활성에 대하여 평가하였다.
도 9a 및 9b는 HSV (TLR9 리간드)로 자극될 때 IC50 (최대 억제제 농도의 절반) 값을 나타낸다. 도 9c 및 9d는 FLU (TLR7 리간드)로 자극될 때 IC90 (최대 억제제 농도의 90%) 값을 나타낸다.
도 10a는 단독으로 또는 다양한 농도의 SEQ ID 73 존재시 TLR9L HSV 또는 TLR7l FLU로 자극된 사람 PDC의 투여량 반응 곡선을 나타낸다. IC50 (nM) 값은 HSV 및 FLU에 대하여 각각 25 및 13이다. IC90 (nM) 값은 HSV 및 FLU에 대하여 각각 99 및 101이다.
실시예 10: IRP 의 존재시 자극되는 원숭이 PBMC
TLR7 및 TLR9 활성화에 대한 IRP의 효과를 더 조사하기 위하여, 다양한 IRP 또는 대조군 샘플을 원숭이 PBMC에서 면역 조절 활성에 대하여 검정하였다.
히말라야 원숭이 (Rhesus Macque monkey)의 PBMC를 단독으로 또는 다양한 농도의 테스트된 IRP의 존재시 MOI 10에서 TLR7L FLU로 자극하였다. 상층액을 24시간 후 수거하였고 면역검정으로 IFN-α에 대하여 검정하였다.
도 10b는 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시, 인플루엔자 바이러스 (TLR7 리간드)로 자극될 때 바이러스 단독과 비교하여 생산된 IFN-α의 퍼센트를 나타낸다.
실시예 11: ISS 에 의해 자극될 때 변형된 IRP 의 생체 내 활성
TLR7 및 TLR9 활성화에 대한 IRP 효과를 6 내지 12주령 BALB/c 마우스의 생체 내에서 검정하였다. 마우스를 25 μg의 1018 ISS (5'-TGACTGTGAACGTTCG AGATGA-3' (SEQ ID NO: 157)) 단독으로 또는 다양한 농도의 테스트된 IRP의 존재시 피하 (SC) 주사하였다. 주사 후 2시간에, 혈액을 수확하였고 표준 과정을 사용하여 혈청을 제조하였다. IL-6 수준을 측정하였다.
도 10c 및 10d는 단독으로 또는 테스트된 IRP의 존재시 CpG-ISS (TLR9 리간드)로 자극될 때 CpG-ISS 단독과 비교하여 생산된 IL-6의 수준 (pg/ml) 또는 생산된 IL-6의 퍼센트를 나타낸다. 테스트된 IRP는 생체 내에서 강한 활성을 갖는다.
표 11-1은 마우스에서 테스트된 IRP 의 요약을 제공한다.
Figure pct00009
실시예 12: pK 연구
다양한 IRP 후보물질의 약물동력학 (pK)를 조사하기 위하여, 하기 설명된 바와 같이 IRP를 BALB/c 마우스 또는 암컷 Sprague Dawley 래트에 피하 주사하였다.
조직 샘플을 약 30-60 mg의 조직 조각을 에펜도르프 튜브에 배치함으로써 제조하였다. 조직 균질화 완충액 (20 mM 트리스, pH 8, 20 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.2% SDS; 조직의 20 μl/mg)을 추가하였고 조직을 TissueLyzer (Qiagen)에서 균질화하였다. 프로테이나제 K를 추가하였고 (조직의 2 μg/mg) 및 샘플을 50℃에서 2-18시간 동안 배양하였다. 이후 프로테이나제 K를 열-불활성화시켰고 각각의 조직 균질액의 3번 희석액을 효소-결합 히브리드화 검정 (ELHA)으로 분석하였다.
프로테이나제 K-처리된 균질액 샘플의 희석은 검출 프로브 (50 μg/mL 최종 농도)와 혼합된다. 검출 프로브는 표적 서열 또는 분석물의 3' 말단에 상보성인, 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드이다. 이 프로브-균질액 혼합물을 웰이 캡쳐 프로브로 코팅된 검정 플레이트 (NUNC Immobilizer Amino plate)에 추가하였다. 캡쳐 프로브는 표적 서열 또는 분석물의 5' 말단에 상보성이고 검정 플레이트에 공유 결합으로 부착을 허용하는 아미노 작용기를 갖는다. 배양 (1시간 동안 37℃) 후, 플레이트를 세척한 (트리스-완충된 식염수, 0.05% Tween-20) 다음 스트렙타비딘-홀스 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 함께 배양하였다 (상온, 30분). 결합하지 않은 스트렙타비딘-HRP를 씻어내고 표적 서열 또는 분석물의 양을 검출하고 정량하기 위해 HRP 기질을 추가하였다. 검정의 범위 내의 값을 제공하는 균질액의 희석은 표적 서열 또는 분석물의 농도를 결정하기 위해 사용하였다. 분석물 (올리고뉴클레오티드)의 양을 조직 값의 그램당 분석물 (올리고뉴클레오티드)의 미크로그램을 제공하는 표준 곡선에 대하여 역으로 계산하였다.
도 11a 및 11b에서, IRP를 BALB/C 마우스에 5 mg/kg의 투여량으로 피하 투여하였다 (그룹당 n=6). 기관을 주사 후 제1일, 제3일, 제6일 및 제9일에 수확하였다. 간 및 신장 조직을 테스트된 IRP에 대하여 분석하였다. 간 및 신장에 대한 조직 농도는 도 11a 및 도 11b에 나타난다.
도 11c 및 도 11d에 나타난 바와 같이, SEQ ID NO: 73 및 SEQ ID NO: 109를 BALB/c 마우스에 50 mg/kg 또는 100 mg/kg의 투여량으로 제0일, 제3일, 제7일, 및 제10일에 피하 투여하였다 (그룹당 n=6). 기관을 최종 주사 후 24시간에 수확하였다. 간, 신장, 비장, 및 심장 조직을 상기 설명된 바와 같이 SEQ ID NO: 73 및 SEQ ID NO: 109에 대하여 분석하였다. 간, 신장, 비장, 및 심장에 대한 조직 농도는 도 11c 및 11d에 나타난다.
도 12a 및 12b에 대하여, SEQ ID NO: 73을 암컷 Sprague Dawley 래트에 5 mg/kg의 투여량으로 제0.25일, 제1일, 제3일, 제6일, 및 제9일에 피하 투여하였다 (그룹당 n=6). 연구의 끝에 기관을 수확하였다. 간, 신장, 비장, 및 심장 조직을 SEQ ID NO: 73에 대해 분석하였고 상기 설명된 바와 같이 분석하였다. 간, 신장, 비장, 및 심장에 대한 조직 농도는 도 12a 및 12b에 나타난다.
도 12c 및 12d에 대하여, SEQ ID NO: 73 및 SEQ ID NO: 109를 암컷 Sprague Dawley 래트에 10 mg/kg 또는 90 mg/kg의 투여량으로 제0일, 제3일, 제7일, 및 제10일에 피하 투여하였다 (그룹당 n=6). 연구의 끝에 기관을 수확하였다. 간, 신장, 비장, 및 심장 조직을 상기 설명된 바와 같이 SEQ ID NO: 73 및 SEQ ID NO: 109에 대해 분석하였다. 간, 신장, 비장, 및 심장에 대한 조직 농도는 도 12c 및 12d에 나타난다.
실시예 13: 실시예 14 내지 17에 사용된 방법 및 시약.
시약.
포스포로티오에이트 ODN을 이전에 설명된 바와 같이 제조하였다 (Duramad et al, 2005). ISS 등급 C에 대한 원형은 다음과 같았다: CpG-ISS (C274): 5'-TCGTCGAACG TTCGAGATGA T (SEQ ID NO: 158). 사용된 TLR7 및 9의 억제제에 대한 원형은 5'-TGCTCCTGGA GGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 42)였다. 대조군 올리고뉴클레오티드는 5'-TCC TGC AGG TTAAGT-3' (SEQ ID NO: 160)였다. 열 불활성화된 인플루엔자 바이러스 (FLU H1N1, 균주 A/PR/8/34)를 ATCC (Manassas, VA)에서 얻었다. 히드로코르티손 및 덱사메타손을 SIGMA에서 샀다. 항-RNP IC의 정제를 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (Barrat et al., 2005). 사람 IFN-α ELISA 세트를 PBL Biomedical Laboratories (Piscataway, NJ)에서 샀다. PI3K 억제제 LY294002 (LY), p38 MAPK 억제제, SB203580 및 p38 MAPK III 및 NF-kB 억제제 (IKK-2 IV)를 Calbiochem에서 샀다. P50 및 NEMO 억제 펩티드를 Imgenex에서 샀다.
환자 및 건강한 기증자
소아 환자들을 모두 Dallas에 있는 Baylor University Medical Center, Texas Scottish Rite Hospital, 및 Children's Medical Center에 모집하였다. 연구는 세 기관 모두의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었다. 정보 동의를 모든 환자로부터 얻었다 (10세 이상 법적 대표 및 환자). 71명의 SLE 환자의 인구학적 특징은 표 13-1에 나타난다. 간단히, 85% 여성, 15% 여성; 42% 히스패닉계, 32% 아프리카계 미국인, 15% 백인이 있었다. 평균 환자 나이는 14. 1 ± 2. 4살이었다 평균 SLEDAI는 8. 2 ± 6. 1이었다. 41명의 건강한 나이-및 민족성-일치하는 아이들을 대조군으로서 미크로어레이 및 나노스트링 실험에 포함하였다.
표 13-1: 환자 정보
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
혈액 샘플 수거
유전자 발현 분석을 위한 혈액 샘플을 Tempus 튜브에 수거하였고 실온에서 즉시 Baylor Institute for Immunology Research (Dallas, TX)에 전달하였고 가공 전-20℃에서 저장하였다. 유동세포 분석을 위해, 혈액 100 μl 및 각각의 항체 3-10 μl를 30분 동안 배양하였다. 혈액을 FACS Lysing Solution (BD Biosciences)으로 용해시켰고, PBS로 세척하였고, 300g에서 10분 동안 원심분리하였고, 1% 파라포름알데히드에 재현탁하였다. 샘플을 FACSCalibur 유동 세포 분석기로 얻었고 CellQuest 소프트웨어 (BD Biosciences)로 분석하였다. 다음 플루오로크롬-결합된 항-사람 항체를 전체 혈액 염색에 사용하였다: LINEAGE-플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 칵테일 (CD3, CD 14, CD 16, CD 19, CD20, 및 CD56 함유), CD123-피코에리트린 (PE), HLA-DR-페리딘 클로로필 단백질 (PerCP), CD11c-알로피코시아닌 (APC), CD4-FITC, CD8-PE, CD3-PerCP, 및 CD14-APC (BD Biosciences).
모듈 분석
전사 모듈의 세트를 미크로어레이 데이터의 분석을 위한 골격으로 사용하였다. 이러한 골격의 구조에 사용된 접근법은 이전에 보고되었다 (Chaussabel et al., 2008). 간단히 말해서, 전사 모듈 골격을 형성하기 위하여 여러 라운드의 클리크 및 파라클리크 군집화에서 선택되는 경우 9명의 사람 질환에 해당하는 전체 혈액 데이터세트 내에 또는 이에 걸쳐 동등한 발현을 갖는 유전자. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA), PUBMED 및 iHOP 데이터베이스를 모듈 주석 및 기능의 분석에 사용하였다. 모듈 발현 수준은 모듈의 모든 유전자에 대한 평균 표준화된 데이터로 한정된다 (표 I). 색깔 강도는 SLE 환자에서 유의적으로 다른 수준으로 발현되는 각각의 모듈 내에 유전자의 비율을 나타낸다. 빨간색: 과발현. 파란색: 저발현. 발현을 나이-및 민족성-일치 대조군 그룹에 대하여 표준화하였다 (n=9).
NanoString nCounter 검정
nCounter Analysis System (나노스트링 기술)의 상세한 내용은 이전에 설명되었다 (Geiss et al., 2008). nCounter 암호 세트는 240개의 원하는 유전자 및 20개의 대조군 유전자를 포함한다. 샘플을 전체 RNA 100ng을 사용하여 히브리드화하였다. 각각의 유전자의 발현 수준을 20개의 대조군 유전자들의 그것에 대하여 표준화하였다.
정제된 PDC 의 분리 빛 시험관 내 자극 및 세포 생존률의 측정
연막을 Stanford 혈액 Center (Palo Alto, CA)로부터 얻었고 세포를 내부의 Institutional Review Board-승인된 프로토콜 하에, 모든 기증자가 연구 목적으로 그들의 혈액의 사용을 허용하는 정보 동의에 서명한 경우 성인 건강한 기증자 (Saint-Antoine Crozatier Blood Bank, Paris, France)로부터 사용되었다. 이전에 설명된 바와 같이 BDCA-4 결합된 비드를 사용하는 양성 선택을 사용함으로써 또는 부정적인 고갈을 사용함으로써 (Miltenyi Biotech) PDC를 분리하였다 (Guiducci et al., 2006). PDC는 유동 세포 분석법으로 결정된 바와 같이 94-99 % BDCA2+ CD123+였다. 생존률에 대해, 96-웰 U-바닥 플레이트에서 1 x 105개의 PDC를 다른 투여량의 히드로코르티손의 존재시 CpG-C (0.5 μm), 또는 FLU (2 MOI)로 자극하였다. 대안으로, 1 x 105개의 PDC를 항-RNP-양성 SLE 환자의 정제된 IgG의 0.5 mg/ml의 존재시 50,000 UV-조사된 (60 mJ) U937 세포와 함께 배양하였다 (Barrat et al., 2005). 나타날 때, 가용성 IFN-α를 20 ng/ml로 사용하였고 IFN의 차단은 항-IFN-α (5000 중화 U/ml), 항-IFN-β (2000 중화 U/ml) 및 마우스 항-IFN-α/β 수용체 MAb (20 μg/ml)의 조합을 사용하여 이루어졌다. 세포 생존률을 24-48시간에 Invitrogen의 "살아있는 또는 죽은 세포 생존률 키트"를 사용하여 제조사의 지시에 따라 유동 세포 분석법으로 평가하였다.
NF - kB 전사 활성의 측정
원래 그대로의 나이브 PDC를 Miltenyi Biotech의 PDC 음성 선택 키트를 사용하여 정제하였고 지시된 바와 같이 3시간 동안 자극하였다. 대안으로 단핵 백혈구를 CD14-결합된 비드 (Miltenyi Biotech)를 사용하여 사람 혈액으로부터 정제하였고 지시된 바와 같이 1시간 동안 자극하였다. 핵 추출물을 Active Motif 핵 추출 키트를 사용하여 제조사의 지시에 따라 제조하였다. 핵 추출물 (2 μg)을 NF-kB p65 부단위의 결합 활성에 대하여 TransAM NF-kB 키트 (Active Motif)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 분석하였다.
마우스의 치료 및 세포의 분석
8-1주령 C57BL/6 및 129 마우스를 Charles River Laboratories에서 샀다. (NZBxNZW)F1 암컷 마우스를 Jackson laboratories에서 샀고 16-17주령에 사용하였다. 일부 실험에서 암컷 마우스를 3주령에 사용하였다. TLR7을 과발현하는 TLR7. 6 형질전환된 마우스 (C57BL/6 배경)는 이전에 설명되었고 (Deane et al., 2007) 8주령에 사용되었다. 마우스를 아침에 사전-채혈하였고 즉시 복강 내로 (IP) 글루코코르티코이드, 덱사메타손 (DEX, SIGMA)를 처리하였다. 일부 실험에서 도의 설명에 명시된 바와 같이 복강 내로 DEX를 SC TLR7 및 TLR9 억제제 (IRP)와 함께 투여하였다. 마우스를 DEX 투여 18시간 후 분석하였다. 마우스 CD3, CD1 1b, GR1, B220, CD11c (BD bioscience), PDCA1 (Miltenyi Biotech) 및 120G8 (Invivogen)에 대한 유동 세포 분석을 플루오로크롬-결합된 단클론성 항체를 사용하여 수행하였다. 특이적 게이팅을 다음과 같이 수행하였다: PDC는 CD11c 낮음, B220+, GR1+, PDCA1+이다; 통상적인 DC를 CD1 1c 높은 B220-이다; B 세포는 B220+이다; T 세포를 CD3+이다; 과립구 GR1+. 비장에서 세포의 부단위의 정량을 위하여, 유동 세포 분석의 수행 전 콜라게나제 D 처리된 비장 세포 현탁액의 수를 세었고 특이적 부단위의 전체 숫자를 %로 계산하였다. 유동 세포 분석 샘플에 내부의 미소구체 카운팅 표준을 추가함으로써 혈액의 절대 세포 숫자를 계산하였다 (CountBright 카운팅 비드; Invitrogen).
실시간 양적 PCR ( TaqMan ) 분석
PCR 반응을 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (Barrat et al., 2005). 간단히 말해서, RNA를 Qiagen RNA가 들어있는 콜라게나제 D-처리된 비장 세포 현탁액으로부터 추출하였고 SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen)으로 cDNA를 생성하였다. ECT는 식 Eq.1.8(HSKGENE) (100,000)를 사용하여 각각의 유전자가 하우스키핑 유전자 유비퀴틴 또는 β-액틴으로 표준화하기 위한 임계 주기 (CT) 값이었고, HSK가 3배의 하우스키핑 유전자 수행의 평균 CT인 경우, GENE는 원하는 유전자의 2배 수행의 평균 CT이고, 100,000은 0 이상의 모든 값을 가져오는 인자로서 임의로 선택된다.
통계적 분석
Mann-Whitney U-테스트 (독립적인 샘플에 대하여 비모수적 기준을 사용하는 양측 Student's t 테스트)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 모든 분석을 Prism 소프트웨어 (GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하여 수행하였다. 차이는 0.05보다 낮은 P 수준으로 유의하게 고려되었다.
실시예 14: 순환 혈액 PDC 와 관련된 GC -처리된 SLE 환자에서 PDC -유발된 IFN 군 의 발현 수준
치료되지 않거나 히드록시클로로퀸 (HCQ) 치료 (200-400 mg/일)를 유지하는 루푸스 환자는 그들의 혈액 세포에서 특유의 전사 변화를 나타낸다. 이 변화는 전사 동시-조절 유전자의 "모듈"을 사용하여 분석될 수 있다 (Chaussabel et al., 2008). 도 38a 및 b에서, 축소된 모듈은 대조군 유전자와 관련된 감소된 발현에 해당하고 축소되지 않은 모듈은 증가된 발현에 해당한다. 이전에 공개되고 (Bennett et al. J. Exp. Med, 2003) 여기에 확인된 바와 같이 (도 38 참조), 다양한 전사 모듈은 경구 글루코코르티코이드 (GC) (5-20 mg/일) 및/또는 SLE 환자의 조절되지 않는 대부분의 경로에 영향을 주는 GC의 강한 면역 억제 효과를 반영하는 미코페놀레이트 모페틸을 받는 환자에서 표준화되었다 (Bennett et al, 2003 및 도 38a). 하지만, 경구 GC로 처리된 환자에서 IFN 경로는 영향을 받지 않았다 (Bennett et al, 2003 및 도 38a 및 71명의 SLE 환자의 데이터를 요약하는 도 13b 상위 패널). 이것과 일치하게, GC는 TLR7 및 TLR9 리간드 인플루엔자 바이러스 (FLU) 또는 CpG-ISS로, 또는 SLE 환자에서 IC로 PDC 활성화시 IFN-α의 생산을 유의하게 감소시키지 않았다 (도 13a 및 도 17). 이것은 IFN-α 단백질 수준을 측정함으로써 확인되었다 (도 18b). 하지만, 이기능성 TLR7/9 억제제의 추가 (IRS, 점선) (Barrat et al., 2005)는 IFN-α 생산의 차단에 효과적이었다 (도 13a 및 도 17).
반대로, 정맥 내 펄스 요법은 IFN 군를 표준화하였다 (Bennett et al, 2003, 도 38b (*는 펄스 요법 후) 및 도 13b). 이것은 또한 PDC의 감소와 관련되지만 다른 세포, 예를 들어, 혈액의 CD14+ 단핵 백혈구는 아니다 (도 13b). PDC의 유사한 감소를 건강한 기증자에서 관찰하였지만 매우 낮은 GC 투여량 (15 mg/일)에서 관찰되었고 (Shodell et al., 2003) SLE 환자에서 IC로 PDC의 TLR7 및 TLR9의 연이은 유발은 IFN 상에 GC의 활성화를 방해한다는 것을 제안한다. 경구 GC 처리된 PDC 수의 부분적 감소는 IFN에 의해 다양한 민감도로 유발된 유전자를 나타내는 IFN 모듈 발현에 유의하게 영향을 미치지 않았고, 펄스 요법에 의한 IFN-군의 억제는 일시적이었고, 제8일에 사전-펄스 수준으로 돌아왔다 (도 13d 및 도 38b). 유사하게, PDC의 수는 펄스 요법 1일 후 많이 감소되었지만 제6일에 재결합하였다 (도 13c, d).
실시예 15: GC 는 TLR -유발된 NF - kB 활성화에 대한 활성의 결핍으로 인해 TLR7 및 TLR9-활성화된 PDC 의 생존률에 영향을 미치지 않는다.
TLR 신호 전달이 부분적인 보호를 제안하는 경우, GC는 PDC를 포함하는, 많은 세포 타입에서 세포사멸을 유발한다 (Montague et al., 1995). TLR7 또는 TLR9 리간드로 자극된 건강한 기증자로부터 신선하게 분리된 PDC를 GC-유발된 세포사로부터 보호하였다 (도 14a, 및 도 18a, b). 이 투여량-의존적인 보호는 단일 세포 수준에서 얻은 데이터 (도 13a)를 지지하는, PDC에 의한 IFN-α의 생산 (도 18b)과 관련되었다. IRS 자체가 세포 독성이 아니었지만 (도 18c), SEQ ID NO: 42로 이 경로를 차단하는 것은 시험관 내에서 PDC에 대한 GC의 민감도를 회복시켰다 (도 14a, b). 유사하게, SLE 환자의 RNP-IC는 PDC를 보호하였고 (도 14a), SLE에 직접적으로 관련된 발견이다. 타입 I IFN에 대한 중화 항체가 보호를 억제하지 않고 (도 14b) IRS-매개된 세포사는 외인성 IFN-α에 의해 바뀌지 않기 때문에 (도 14b) 타입 I IFN은 TLR7 및 TLR9 리간드에 의한 보호를 필요로 하지 않는다. 따라서 TLR7 또는 TLR9를 통한 신호 전달은 사람 GC-유발된 세포사로부터 PDC를 보호한다.
TLR-매개된 PDC 생존률의 신호 전달 경로를 TLR 신호 전달에 수반되는 분자의 특이적 억제제로 조사하였다: PI-3키나제, P38 MAPK 및 NF-kB. NF-kB의 억제제는 TLR9 (도 14c) 및 TLR7 (미도시)를 통한 자극에 의해 유발된 PDC 생존률을 차단했지만, p38 또는 PI-3키나제의 억제제는 아니다. 이 관찰은 3개의 다른 NF-kB 억제제로 확인되었다 (도 14d). 또한 외인성 IFN-α는 효과가 없었다 (도 18e). 자극되지 않은 세포에 관하여 증가된 NF-kB 전사 활성을 TLR9-자극된 PDC에서 관찰하였다 (도 14e). GC가 많은 세포 시스템에서 NF-kB를 억제하지만 (도 14g 및 Parker et al., 2003), PDC에서 TLR7 및 TLR9 유도 후 DNA-결합 활성 또는 p65 인산화에 의해 측정된 NF-kB의 억제 (도 14f)는 관찰되지 않았다. PDC의 NF-kB 경로를 방해하는 GC의 무능력은 왜 TLR-활성화된 PDC가 GC-매개된 죽음에 저항성이었는지를 설명할 수도 있다.
실시예 16: 생체 내에서 TLR 활성화는 PDC 가 GC 처리에 대하여 더 저항성으로 만든다.
다음, 마우스 모델에서 PDC에 대한 GC의 효과를 생체 내에서 조사하였다. 정상 마우스에서, PDC는 GC 처리에 매우 민감하였고 신속하게 혈액 (도 15a) 및 비장 (도 15b)에서 사라졌다. 통상적인 DC (CD 11 c+) 및 B 세포 (B220+)을 포함하는 다른 TLR9+ 세포 타입은 유사하게 감소되었다 (도 15a, b). 반대로, 호중구 (GR1+)는 GC 처리에 반응하지 않았고, GC가 시험관 내에서 사람 호중구의, 죽음이 아닌, 생존을 촉진한다는 관찰과 일치한다. CpG-IDD로 생체 내 TLR9 활성화는 비장 및 혈액 (도 15c, d) 모두에서 통상적인 및 형질세포양 DC에 대한 GC-유발된 세포사로부터 유의한 보호를 하지 않는다. 비장 B 세포는 TLR9 활성화에 의해 죽음으로부터 유사하게 보호되었지만, 순환 혈액 B 세포는 아니었다 (도 15c, d). IRS의 동시-주사는 CpG-ISS-유발된 활성화를 방지하였고 (도 20), 혈액 및 비장 모두에서 증가된 GC-유발된 세포사를 일으킨다 (도 15c, d). 따라서, 나이브 순환 PDC는 생체 내에서 TLR-활성화된 PDC보다 GC-유발된 세포사에 유의하게 더 민감하다.
실시예 17: 루푸스에 걸리기 쉬운 마우스의 PDC 는 자체 핵산에 의한 TLR7 및 TLR9 활성화로 인해 야생형 마우스와 비교된 바와 같이 GC -유발된 세포사에 고유한 저항성을 갖는다
루푸스에 걸리기 쉬운 마우스 종 (NZBxNZW)F1 및 TLR7.Tg.6. (NZBxNZW)F1을 사용하는 질환 모델에서 이 현상을 더 연구하였다. 이 마우스는 자발적으로 증가된 핵산-함유 IC로 사람 SLE와 유사한 질호나을 개발한다. 타입 I IFN은 질환의 개발과 관련되고 (Rozzo et al., 2001; Santiago-Raber et al., 2003; 및 Mathian et al., 2005) TLR7 및 TLR9의 차단은 자동항체 적정 및 종말기관 손상을 감소시켰다 (Barrat et al., 2007). TLR7.Tg.6 종은 사람 SLE와 유사한 증가된 TLR7 발현, 항-RNA 자동항체의 축적, 타입 I DNA 유전자 군의 상향 조절 및 자가 면역 증후군을 나타낸다 (Deane et al., 2007). 두 종 모두는 SLE 환자에서와 같이 TLR7 및 TLR9에 의한 내인성 핵산의 인식으로 인한 자발적인 자가 면역의 모델이다.
TLR7 및 TLR9 함유 세포, 예를 들어, PDC, cDC 및 B 세포는 정상 종, 예를 들어, 129 또는 C57/BL6과 비교하여 루푸스에 걸리기 쉬운 마우스의 GC-유발된 죽음에 유의하게 더 저항성이었으며, 0.5 mg GC는 살아있는 PDC에서 50-75% 감소를 유발했다 (도 16a, b). 따라서, 루푸스 종 모두에서, SLE 환자에서와 같이, 만성 활성화된 세포는 GC 처리에 대한 감소된 반응을 갖고 있었다. 생체 내에서 SEQ ID NO: 42로 TLR7 및 TLR9의 차단은 비장 (도 16c, d) 및 혈액 (도 21a, b) 모두의 PDC, cDC 및 B 세포의 GC에 대한 민감도를 향상시켰다. GC 처리에서 호중구의 확장 (도 21a, b)은 GC 투여에 따른 마우스 및 사람의 과립구의 확장 (Shodell et al., 2003; Athens et al., 1961; Laakko et al., 2002; 및 Trottier et al., 2008) 및 SLE 환자에 높은 투여량의 스테로이드 투여 후 낮은 밀도의 호중구 유전자 군의 지속 (Bennet et al., 2003)과 일치한다. 흥미롭게도, GC-유발된 호중구 확장의 감소를 IRS 투여시 관찰하였고 (도 21a, b) 아마 TLR7 및 TLR9의 차단이 DLE에서 불규치기한 과립구형성에 영향을 줄 수 있다는 것을 나타낸다. TLR7 및 TLR9의 억제는 루푸스에 걸리기 쉬운 마우스 종 모두에서 유사하였고 및 i) IRS가 GC 없이 세포사를 유발하지 않았고 (도 22a, b), ii) TLR7 및 TLR9 차단은 GC가 주사된 정상 마우스에서 PDC에 대하여 효과가 없었고 (도 22c) iii) 어린 (NZBxNZW)F1 마우스의 PDC (질환 발병 전)는 늙은 마우스의PDC보다 GC에 더 민감하였기 때문에 (도 22d) 핵산-유발된 염증에 특이적이다. IRS가 전처리된 마우스의 증가된 GC 활성은 정상 마우스의 lPDC 생존에 효과가 없는 GC 투여량에서 유의하였다 (도 23a). 이 발견은 자체 핵산 인식을 통한 선천성 면역이 GC 처리에 대한 SLE 환자의 반응 없음의 우세한 특징이라는 가설을 지지한다. 사람 SLE에서 관찰된 바와 같이, 타입 I IFN-조절된 유전자는 (NZBxNZW)F1 및 TLR7.Tg.6 모델 모두에서 어느 정도 자극된다 (Trottier et al., 2008; 및 Rozzo et al., 2001). 루푸스에 걸리기 쉬운 종 모두에서, IRS 전처리는 IFN-조절 유전자의 발현을 감소시키지만 TNF-조절 유전자는 아니고 (도 23b, c), TLR7 및 TLR9를 통한 활성화는 이 마우스들의 염증의 핵심이라는 것을 입증한다.
시험관 내 및 생체 내에서, 이 결과들은 TLR7 및 TLR9를 통한 PDC의 자극이 SLE 환자 및 두 루푸스에 걸리기 쉬운 마우스 종의 IFN 경로를 억제하는 GC의 감소된 활성화를 설명할 수 있다는 것을 입증한다. 핵산-함유 면역 복합체에 의한 또는 합성 리간드에 의한 TLR7 및 TLR9를 통한 PDC의 유도는 PDC 생존에 필수적인 NF-kB 경로를 활성화한다. GC는 PDC에서 NF-kB 활성화에 영향을 미치지 않고, PDC 죽음 및 전신 IFN-α 수준의 결과적인 감소의 GC 유발을 방지한다. 이 발견은 SLE의 중요한 염증 증폭제로서 TLR에 의한 DNA 및 RNA의 자체 인식의 역할의 새로운 이해를 발표하고 TLR7 및 TLR9 신호 전달의 억제제는 효과적인 코르티코스테로이드-남는 약물인 것을 입증할 수 있다는 것을 나타낸다. 이 데이터는 또한 코르티코스테로이드-남는 약물로서 이기능성 TLR7/9 억제제 (예를 들어, IRS)의 잠재적 활용을 강조한다.
실시예 18: 실시예 19 내지 23에 사용된 방법 및 시약
시약
포스포로티오에이트 ODN을 이전에 설명된 바와 같이 제조하였다 (Duramad et al., 2003). 사용된 원형 TLR7 및 TLR9 억제제는 5'-TGCTCCTGGA GGGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 42) 및/또는 5'-UGC TGC TCC TTG AGI GGT TGT TTG T-3' (SEQ ID NO: 109)이며, I=데옥시-이노신 (Barrat et al., 2005). 사용된 대조군 올리고뉴클레오티드는 5'-TCCTGCAGGTTAAGT-3 (SEQ ID NO: 160)였다. 마우스 IFN-α ELISA 세트를 PBL Biomedical Laboratories (Piscataway, NJ)에서 샀다.
동물 및 생체 내 처리
C57BL/6 및 129 마우스를 Charles River Laboratories에서 샀다. (NZBxNZW)F1 암컷 마우스를 Jackson Laboratories에서 샀고 18-22주령을 사용하였다. MyD88/KO 및 TLR9/KO 마우스 콜로니를 Simonsen Laboratories에서 유지하였고 8-12주령으로 나이가 맞춰진 C57BL/6 야생형 대조군과 함께 사용하였다. 강력 접착 테이프로 10번의 스트로크를 사용하여 등 영역 (3x3 cm)을 면도한 후 테이프 스트리핑을 수행하였다. 먼 부위에 피하 테이프 스트리핑 직전 IRS를 투여하였다. 대안으로, (NZBxNZW)F1 마우스에서, IRS를 장기간 투여하였다. 특정 실험에서, 제-2일 및 제0일에 테이프 스트리핑 8시간 전, 복강 내 주어진 250 μg의 항체로 PDC 및 호중구는 고갈되었다. 항-120G8 (Imgenex)를 PDC의 고갈을 위해 사용하였고 (Asselin-Paturel et al., 2003), 항-GR1-LY6G (클론 1A8; Biolegend)을 호중구의 고갈을 위해 사용하였다 (Daley et al., 2008). 혈류 및 피부 침윤 모두에서 95%가 넘는 세포의 고갈을 이루었다. 실험에서, PDC가 고갈된 경우, 장기간 120G8 고갈 항체를 투여하였다. (NZBxNZW)F1의 실험을 각각의 실험에서 처리되지 않은 그룹의 병변의 진행에 의존하여, 초기 테이프 스트리핑 후 15-23일에 종료하였다. (NZBxNZW)F1 및 정상 마우스의 아물지않은 병변이 있는 영역의 퍼센트를 Nikon 소프트웨어 NIS-요소로 평가하였다.
피부 염증의 조직학적 분석 및 조직 병리학
생체 조직 표본을 포르말린에서 고정하였고 파라핀에 넣었다. 절편을 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다. 그룹당 12-30마리의 다양한 피부 절편을 블라인드 방식으로 평가하였다. 다음 조직학적 특징을 평가하였고 1 내지 3의 등급으로 분류하였다: i) 표피 두께 ii) 궤양의 정도 iii) 상피 염증, iv) 진피 염증, 및 v) 지방조직 염증. 조직학적 분류를 다음과 같이 배치하였다: 0, 정상 피부 건축, 몇 개의 진피 백혈구 및 규칙적인 부속기 (adnexa); 1, 가벼운 염증, 약간의 표피 과형성 및 진피 섬유아세포 증식의 징후; 2, 중간 염증, 각막비후증이 있는 뚜렷한 표피 과형성 (표피 두께의 2 내지 4배 증가), 유의적인 백혈구/몇 개의 대식 세포와 함께 호중구-과립구 진피 침윤, 진피의 중간 섬유경화증, 부속기의 수의 감소, 피하 지방 조직의 약간의 퇴행성 변화; 3, 심각한 염증, 각막비후증이 있는 현저한 표피 과형성 (표피 두께의 4배 이상 증가), 케라틴이 채워진 크레이터 및 낭종, 표피층의 분산 중단 (궤양), 풍부한 호중구 및 대식세포를 가진 진피의 광범위한 침윤, 현저한 진피 섬유경화증, 부속기의 소실 및 피하 지방 조직의 분명한 퇴행성 변화. 다른 파라미터를 별도로 채점하였고 얻은 전체 질환 점수를 합계하였다 (표 22-1). 그룹 사이에서 통계적 유의성을 Mann-Whitney U-테스트로 계산하였다.
피부 샘플 가공 및 유동 세포 분석법
세포의 침윤의 분석을 위하여 마우스는 24시간 후에 희생되었고 표피 및 진피를 기계적으로 분리한 후 37℃에서 20분 동안 0.28 U/ML의 리버라제 3 (Roche)으로 효소 분해되었고, 혈청이 없는 RPMI에서 세척된 70 μm 필터를 통과하였고, 유동 세포 분석을 위해 계산되고 염색되었다. 마우스 CD3, CD8, CD4, B220, CD1 1c (BD bioscience), GR1-LY6G (1A8 클론), F4/80 (Biolegend), PDCA1 (Miltenyi Biotech) 및 120G8 (Imgenex)에 대한 플루오로크롬-결합된 단클론성 항체를 사용하여 유동 세포 분석법을 수행하였다. 피부 침윤을 특징으로 하는 특이적 게이팅을 다음과 같이 수행하였다: PDC는 CD1 1c+, PDCA1+였다; 120G8+, Ly-6C+, 골수의 DC는 CD11c+ PDCA1-120G8-Ly-6C-였다; T 세포는 CD3+ CD4+였다; CD3+CD8+, 호중구는 GR1-Ly6-G 높은 F4/80-였고, 대식세포는 GR1-Ly6-G 낮은 F480+였다. 이 실험들에서 PDC에 의한 IFN-α 생산을 FACS 분석에 의해 평가하였고, 5 μg/ml의 브레필딘 A의 존재시에만 피부를 상기 설명된 바와 같이 가공하였다. 세포의 침윤을 2시간 동안 5 μg/ml의 브레펠딘 A와 함께 RPMI 배지에 (10% FCS로 보충된) 1 x 106/ml의 농도로 코팅되지 않은 플라스틱 플레이트에 분주하였다. PDC를 확인하기 위해 항-CD1 1c 플러스 항-PDCA1 결합된 항체와 함께 표면 마커에 대하여 세포를 염색하였다. 세포를 2% 파라포름알데히드에서 고정하였고 PBS에 0.5% 사포닌 1% BSA에서 10분 동안 투과시켰고 항-IFN-α 결합된 항체 (5 μg/ml) (PBL Biomedical Laboratories)가 들어있는 같은 완충액에서 염색하였다. 양성 대조군으로서, BM-유래한 PDC를 CpG-C ISS로 4시간 동안 자극하였고, 5 μg/ml의 브레펠딘 A를 자극의 마지막 2시간에 추가하였다. 일부 실험에서, NET를 생산하는 피부 투과 호중구의 능력을 이전에 설명된 바와 같이 검정하였다 (Brinkmann et al., 2004; Fuchs et al., 2007; Kessenbrock et al., 2009; 및 Wartha and Henriques-Normark, 2008). 간단히 말해서, 피부 투과 세포를 2% FCS가 들어있는 RPMI에 37℃에서 10분 동안 1 x 106 /ml의 농도로 코팅된 유리 (0.001% 폴리리신; SIGMA)에 분주하였다. 이후에 세포를 얼음에서 10분 동안 항-LY6G 결합된 항체로 염색하였고 즉시 2% 파라포름알데히드에서 고정하였고 DNA에 대하여 SYTOX 그린 (1 내지 5000 Invitrogen)으로 대비 염색하였다 (Fuchs et al., 2007). 일부 실험에서, 고정 후, 호중구를 항-LL37/CRAMP 항체 (Innovagen) (5 μg/ml)로 더 염색하였고 DNA에 대하여 SYTOX 그린 (1 내지 5000 Invitrogen)으로 또는 특이적 RNA 염료 SYTO RNA Select (1 내지 5000 Invitrogen)으로 대비 염색하였다.
실시간 양적 PCR ( TaqMan ) 분석
PCR 반응을 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (Barrat et al., 2005). 간단히 말해서, 제조사의 지시에 따라 RNA 미크로 키트 (Qiagen)을 사용하여 피부 침윤 세포로부터 및 섬유 조직 RNA 추출 키트 (Qiagen)로 피부 조직으로부터 RNA를 추출하였다. SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen)으로 RNA 및 cDNA를 생성하였다. ECT는 식 Eq. 1. 8(HSKGENE) (100,000)를 사용하여 각각의 유전자가 하우스키핑 유전자 유비퀴틴 또는 β-액틴으로 표준화하기 위한 임계 주기 (CT) 값이었고, HSK가 3배의 하우스키핑 유전자 수행의 평균 CT인 경우, GENE는 원하는 유전자의 2배 수행의 평균 CT이고, 100,000은 0 이상의 모든 값을 가져오는 인자로서 임의로 선택된다. 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다:
IFI202R 5'-CTAGGATGCCACTGCTGTTG-3' (SEQ ID NO: 184),
IFI202F 5'-CAAGCCTCTCCTGGACCTAA-3' (SEQ ID NO: 185),
IRF7R 5'-TCCAAGCTCCCGGCTAAGT-3' (SEQ ID NO: 186),
IRF7F 5'-ACAGGGCGTTTTATCTTGCG-3' (SEQ ID NO: 187),
ISG15R 5'-CCCCTTTCGTTCCTCACCAG-3' (SEQ ID NO: 188),
ISG15F 5'-ACGGTCTTACCCTTTCCAGTC-3' (SEQ ID NO: 189),
ISG20R 5'-CCACCAGCTTGCCTTTCAGAA-3' (SEQ ID NO: 190),
ISG20F 5'-GTCACGCCTCAGCACATGGT-3' (SEQ ID NO: 191),
NMIR 5'-AATGCCTTCTAATCCGGTCA-3' (SEQ ID NO: 192),
NMIF 5'-AGTGGAAAGCGTGGATTATGA-3' (SEQ ID NO: 193),
IFIT1R 5'-TCTGGATTTAACCGGACAGC-3' (SEQ ID NO: 194),
IFIT1F 5'-AGGCTGGAGTGTGCTGAGAT-3' (SEQ ID NO: 195),
IL-1AR 5'-CCGACAGCACGAGGCTTT-3' (SEQ ID NO: 196),
IL-1*F 5'-TGGTGTGTGACGTTCCCATT-3' (SEQ ID NO: 197),
TNF-AR 5'-GGTCTGGGCCATAGAACTGATG-3' (SEQ ID NO: 198)
TNF-AF 5'-GCCACCACGCTCTTCTGTCT-3' (SEQ ID NO: 199),
IL-1-BR 5'-AAACCGTTTTTCCATCTTCTTCTTT-3' (SEQ ID NO: 200),
IL-1-BF 5'-GACGGCACACCCACCCT-3' (SEQ ID NO: 201),
IP-10F 5'-GACGGTCCGCTGCAACTG-3' (SEQ ID NO: 202), 및
IP-10R 5'-GCTTCCCTATGGCCCTCATT-3' (SEQ ID NO: 203).
통계적 분석
양측 Student's t 테스트를 사용하여 데이터를 분석하였다. 모든 분석을 Prism 소프트웨어 (GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하여 수행하였다. 차이는 0.05보다 낮은 P 수준으로 유의하게 고려되었다.
실시예 19: 테이프 스트리핑 후 활성화된 PDC 및 호중구는 피부를 신속하게 투과한다
가벼운 피부 손상 및 염증을 유발하는 방법으로서 테이프-스트리핑을 활용하였다. 이 방법을 건선 및 아토피성-피부염의 마우스 모델에서 질환을 유발하기 위해 이전에 사용하였다 (Inoue et al., 2005; Jin et al., 2009; 및 Sano et al., 2005). 건강한 개인과 비교하여 루푸스 환자가 이 가벼운 피부 손상에 과잉 반응하기 때문에, 테이프 스트리핑을 또한 루푸스를 검출하고 진단하는 비-침습성 방법으로서 사용하였다. 하지만 테이프-스트리핑에 대한 염증성 반응의 특징은 세포 또는 분자 수준에서 잘 특징지어지지 않는다. 테이프 스트리핑 후 24시간에, 치료되지 않은 피부와 비교하여 PDC 마커, CD1 1c+ 및 PDCA1+ (도 24A)뿐만 아니라 120G8+, Ly-6C (미도시)를 발현하는 세포 집단을 포함하는, 피부에서 염증 세포의 현저한 증가를 관찰하였다 (도 24A). PDC는 그것들이 피부로부터 분리된 세포에서 세포 내 염색에 의해 측정된 IFN-α를 생산하는 것으로 기능적으로 활성이었다 (도 24B). 유동 세포 분석은 또한 CD4+ 및 CD8+ T 세포와 함께, 호중구 (Ly6G+ 세포)의 거대한 유입 및 대식세포 (F4/80+ 세포)의 더 적은 증가를 나타낸다 (도 24A).
활성화된 호중구는 호중구 세포 트랩 (neutrophil extracellular trap; NET)을 생산하며, 이것은 생체 내에서 박테리아를 살해하기 위해 필수적이다 (Brinkmann et al., 2004; Fuchs et al., 2007; 및 Wartha and Henriques-Normark, 2008). 호중구 침윤 테이프-스트리핑된 피부는 활성화되고, 긴 염색질 섬유를 가진 풍부한 NET를 생산하지만 (도 24D), 대조군으로 사용된 자극되지 않은 골수 호중구에서 NET 형성은 관찰되지 않았다 (도 24C). 피부 호중구에서, NET의 긴 섬유는 DNA 및 RNA를 함유하였고 LL37/CRAMP (도 24E 및 F), 활성화된 호중구에 의해 분비된 양이온성 항미생물 펩티드와 관련된다 (Kessenbrock et al., 2009; 및 Wartha 및 Henriques-Normark, 2008).
실시예 20: TLR7 및 TLR9 를 통한 신호전달은 피부 손상 부위에서 IFN -조절된 및 염증 유발 유전자의 신속한 유발로 이어진다
세포 침윤를 동반하는, 표피 손상은 피부 생체 조직 및 침윤 백혈구로부터 분리된 mRNA에서 많은 중요 염증 유전자의 강한 발현을 일으켰다 (도 25 및 도 31). MyD88-결핍 마우스에서 유전자 유발의 결핍에 의해 나타난 바와 같이, 이 유전자들의 유발은 MyD88이 필요하였다. 이 유전자들의 조절을 한정하기 위하여, 타입 I IFN 수용체 중 하나의 사슬이 결핍된 IFNAR-/-마우스를 사용하여 실험을 반복하였다. 이 IFNα/β에 반응하지 않는 마우스에서, IFN-조절 유전자인, IFIT1, ISG15, IRF7 및 ISG20 모두는 구획에서 유발되지 않았고 (도 25B 및 도 31B) IP-10을 피부에서 감소시켰지만 (도 25B) 침윤 세포에서는 아니다 (도 31B). 또 다른 IFN-조절 유전자 IFI202가 IFNAR-/-마우스에서 유발되었고, 마우스의 이 유전자에 대한 IFN-의존적인 신호 전달 경로를 나타내는 이전 연구와 일치한다 (Asefa et al., 2004; 및 Choubey 및 Panchanathan, 2008). 반대로, IFNα/β 신호 전달의 결핍은 TNF-α 또는 IL-1α 또는 β의 유발을 감소시키지 않았다 (도 25B 및 도 31B). 대신에, 이 염증 유전자들의 발현은 전체 피부의 mRNA의 IFNAR-/-에서 약간 증가되었지만 (도 25B), 침윤 세포에서는 증가되지 않았고 (도 33B), 아마 이전에 보고된 타입 I IFN 및 TNF 경로의 상호 조절을 반영한다 (Banchereau et al., 2004). 3개의 염증 유발 유전자 모두의 유발에서 MyD88의 명백한 필요성은 IL-1R 또는 TLR 수용체 과의 멤버를 통한 신호 전달에 대한 중요한 역할을 입증한다.
2개의 핵산-특이적 TLR, TLR7 및 TLR9이 이 염증 유전자 군의 유발에 수반되는지 테스트하기 위해, 테이프-스트리핑된 마우스에 SEQ ID NO: 42 (IRS), 시험관 내에서 (Barrat et al., 2005) 및 생체 내에서 (Barrat et al., 2007) TLR7 또는 TLR9에 의한 활성화를 차단하는 이기능적 올리고뉴클레오티드 길항제를 처리하였다. SEQ ID NO: 42 (IRS)의 처리는 IFN-α 조절된 유전자 및 염증 유발 유전자 모두의 발현을 유의하게 감소시켰고, 일부 경우에서, 치료되지 않은 마우스 피부에서 발견되는 수준으로 발현을 감소시킨다 (도 26B 및 도 33). 따라서, TLR7 및/또는 TLR9를 통한 신호 전달은 테이프-스트리핑에 의해 유발된 주요한 유전자 발현 변화에 중요하다. 반대로, SEQ ID NO: 42 (IRS) 처리는 손상의 부위에 PDC 및 호중구를 포함하는, 세포의 침윤에 대한 측정 가능한 효과를 갖지 않는다 (도 26B 및 도 32). 이것은 명백하게 세포 이동 및 시토킨 분비는 그것들이 동등하게 조절되는 것으로 나타나지만, 조직 손상으로부터 발생하는 다른 자극에 의해 유발된다는 것을 나타낸다.
실시예 21: PDC 및 호중구는 테이프 스트리핑에 반응하여 다른 패턴의 시토킨 유발에 원인이 있다
피부 염증의 이 모델에서 이 2개의 중요 세포 타입 각각의 상대적 기여를 결정하기 위해, 테이프 스트리핑 전에 각각의 세포 타입을 명확하게 고갈시켰다. 120G8 단클론성 항체로 PDC의 고갈은 침윤 세포에서 (도 27A) 및 피부 생체 조직에서 (도 27B) 타입 I IFN-조절된 유전자 (IFI202, IFIT, ISG15, ISG20, IP-10)의 강한 감소로 이어졌지만, 이 유전자들은 상대적으로 호중구의 고갈에 의해 영향을 받지 않았다 (도 27). 반대로, 호중구 고갈은 TNF-α, IL1-α 및 IL1-β mRNA에 70-90% 감소를 일으켰지만, PDC의 고갈은 이 유전자들의 발현의 더 적당한 20-50% 감소를 일으켰다. 예상된 바와 같이, 두 가지 세포 타입의 동시 고갈은 유전자의 그룹 모두의 발현의 큰 감소를 일으켰다 (미도시). 종합하여, 이 결과들은 급성 피부 손상 모델에서, PDC 및 호중구는 TLR 7 및 TLR9, MyD88 의존적인 염증의 주요 성분이지만, 2개의 별도의 염증 반응, PDC에 의해 생산된 타입 I IFN에 의해 조절되는 것 및 호중구-의존적인 염증 유발 시토킨을 수반하는 것을 촉진한다.
실시예 22: 루푸스에 걸리기 쉬운 ( NZBxNZW )F1 마우스는 테이프 스트리핑 후 사람 CLE 와 유사한 만성 피부 병변을 발달시킨다
SLE 및 CLE에 걸린 환자는 종종 가벼운 피부 자극 및 손상에 훨씬 더 민감하며, 손상은 자가 면역 과정에 의해 약화되고 지속되는 과정을 개시한다는 것을 제안한다. 히브리드 (NZBxNZW)F1 마우스는 자발적으로 높은 수준의 순환 항-DNA 및 항-RNA 자동 항체를 발달시키고 (Furukawa 및 Yoshimasu, 2005), SLE 환자에서 관찰되는 것과 닮은 면역 복합체 형성 및 루푸스 신염으로 이어진다. 이 마우스들은 드물게 피부 병변의 자발적인 발달을 나타내지만, 사람 CLE에서 관찰된 것과 유사하게, 진피 표피 접합부에서 면역 복합체의 축적이 있다Furukawa 및 Yoshimasu, 2005; McCauliffe, 1996). 내인성 RNA 또는 DNA를 함유하는 면역 복합체가 각각 TLR7 및 TLR9에 대한 강한 리간드이기 때문에 (Barrat et al., 2005; 및 평균s et al., 2005), (NZBxNZW)F1 마우스는 테이프 스트리핑에 대한 연장되거나 약화된 반응을 나타낼 수도 있다.
(NZBxNZW)F1 마우스에서 테이프 스트리핑에 대한 초기 반응은 PDC 및 호중구의 수의 일정한 증가를 나타내는 수반된 피부를 가진 정상 마우스의 그것과 아주 유사하였다 (도 34a-c). 풍부한 세포 침윤물은 IFN-조절된 및 염증 유발 유전자의 증가된 발현에 의해 동반되었다. 테이프 스트리핑 전에 SEQ ID NO: 42 (IRS)의 단일 주사는 이 유전자 유발을 효과적으로 억제하였고, 이 종에서 급성 반응을 유도하는 TLR7 및 TLR9의 역할과 일치한다 (도 34D). 하지만, 정상 마우스의 염증의 일시적인 코스와 달리, 테이프 스트리핑 후 최대 3주 동안 유의하게 증가된 채로 남아있는 IFN-조절된 유전자 및 염증 유발 시토킨 모두에 대한 mRNA를 가진 (NZBxNZW)F1 마우스의 염증 반응은 많은 날 동안 유지되었다 (도 28A). 이것은 이 마우스들이 테이프 스트리핑의 손상에 의해 개시되는 경우 염증성 신호를 영구화하기 위해 존재하는 염증 또는 질환을 적절히 해결하는 데 실패한다는 것을 제안한다. 테이프 스트리핑 3주 후, (NZBxNZW)F1 마우스의 피부 병변은 테이프 스트리핑된 영역의 50%가 넘게 확장되었지만, 정상 마우스에서 병변은 치유되었다 (도 28C). 매우 빠른 시점, 테이프 스트리핑 후 제1일 및 제4일에, (NZBxNZW)F1 마우스는 표피 괴사가 있는 표피의 심각한 다초점 감소 및 주로 호중구 및 대식세포로 구성된 분산된 진피-표피 백혈구 침윤물을 갖고 있었다. 초기 테이프 스트리핑 후 약 3주까지, (NZBxNZW)F1 마우스는 각막비후증이 있는 중요 표피 과형성, 케라틴이 채워진 크레이터 및 낭종, 진피 섬유경화증, 피하 지방 조직의 퇴행성 변화를 나타냈다 (도 28F-H 및 도 35). 사람에서, 진피 표피 접합부의 표피의 변화 및 공포의 변성은 모든 형태의 CLE의 특징이지만 이 모델의 다른 특징, 예를 들어, 케라틴이 채워진 낭종 및 피하 지방의 변성은 원형 CLE (DLE) 및 사마귀 DLE에서 더 중요하다 (Baltaci 및 Fritsch, 2009). 표피, 진피 및 부속기, 뿐만 아니라 피하 지방을 수반하는, (NZBxNZW)F1 마우스의 피부 병변은 주로 호중구, 대식세포 및 T 세포로 구성된 지속적인 백혈구 침윤을 나타내었다 (도 28F-H 및 도 35). 비-자가 면역 마우스 종, 129 및 C57/BL6에서, 진피를 수반하는 일시적 염증이 관찰되었지만 (초기 시점 제1일 및 제4일), 그것은 자발적으로 경화성 병변의 생산 없이 해결하였고 동시에, 침윤 백혈구는 부족하였고 치료되지 않은 대조군 피부와 수가 유사하였다 (도 28D 및 E). 다양한 질환 파라미터의 세미-정량 평가에 기초한 조직병리학적 변화의 체계적인 재검토는 표 22-1에 나타난다: 표피 두께, 궤양의 정도, 상피의 정도, 진피 및 지방 조직 염증. 병변의 전체적인 질환 점수는 정상 마우스와 비교하여 (NZBxNZW)F1에서 유의하게 더 높았다.
표 22-1: 테이프 스트리핑 후 피부 병변의 병리학적 평가
Figure pct00013
실시예 23: TLR7 및 TLR9 를 통한 PDC 및 신호 전달은 ( NZBxNZW )F1 마우스에서 피부 병변의 개시 및 유지에 필요하다
PDC 및 TLR7 및 TLR9에 의한 핵산의 인식이 (NZBxNZW)F1 마우스의 테이프-스트리핑 반응에 중요하다는 것을 입증하기 위해, 도 36의 일정에 따라, 피부 손상 전 및 실험의 기간 동안 동물에 SEQ ID NO: 42 (IRS)를 처리하였다. 치료되지 않은 마우스 (도 29A 및 C)와 달리, IRS-처리된 마우스는 완벽하게 치유되었거나 작은 병변을 갖고 있었다 (스트리핑된 영역의 15%보다 작은) (도 29A). IRS 처리된 마우스의 피부는 각막비후증이 있는 아주 가벼운 상피의 과형성 및 궤양의 부재를 나타냈다. 진피의 염증 침윤물 및 섬유증 반응은 치료되지 않은 동물과 비교된 바와 같이 많이 감소하는 것으로 나타났고 표피에 세포 침윤이 존재하지 않았다 (도 29D 및 E). 테이프 스트리핑 전 시작하는 PDC의 고갈 (도 36)은 테이프-스트리핑에 대한 반응의 매우 유사한 억제를 생산하였다. PDC-고갈된 마우스는 정상 내지 약간 과형성 상피, 무시해도 될 정도의 진피의 변화, 표피 및 부속기 및 진피의 염증성 침윤의 최소의 존재 (도 29F 및 G)를 가진 정상 외관을 갖고 있었다 (도 29A). 조직학적 질환 점수는 결과를 확인시켜 주었고 치료되지 않은 마우스 및 IRS로 치료되거나 PDC가 고갈된 마우스 사이에서 유의적인 차이를 나타내었다 (표 22-1). 이 결과들은 PDC에 의해 발현되는 2개의 핵산-특이적 TLR을 통해 DNA 및 RNA를 감지하는 그것들의 능력을 통한 피부 손상에 대한 반응에서 PDC는 중요 세포인 것을 나타낸다.
TLR7 및 TLR9 신호 전달이 (NZBxNZW)F1 마우스에서 연장된 반응에 계속해서 필요한지, 또는 반응의 개시에 주로 수반되는지 평가하기 위해, 첫 번째 IRS 처리를 병변이 완전히 발달하는 시점인 테이프 스트리핑 4일 후까지 지연하였다. 두드러지게, 제4일에 시작한 IRS 처리된 마우스의 피부 병변은 제15-23일까지 아물지 않은 병변에 의해 덮인 표면의 단지 10%로 거의 완벽하게 치유되었다 (도 30A). 반대로, 치료되지 않은 동물은 이 시점에 실질적으로 치유되지 않은 병변을 갖고 있었다 (도 30A 및 B). IRS 처리된 마우스의 피부 표본은 매우 보통의 진피 염증 침윤 및 섬유경화증 및 섬유경화증 및 무시해도 될 정도의 지방 조직의 수반이 있는 중간 변화를 나타냈다 (도 30D 및 E 및 표 22-1). 이 발견은 PDC에서 TLR7 및/또는 TLR9의 만성 활성화가 (NZBxNZW)F1 마우스의 피부에서 염증을 시작하고 유지하기 위해 필요하다는 것을 입증한다. 이 결과들은 또한 특이적 TLR7/9 억제제로 이 과정의 차단이 진행중인 피부 염증을 해결하기 위한 치료적 세팅에 효과적이다는 것을 나타낸다.
CLE의 병원성 메카니즘의 연구 및 CLE에 대한 새로운 치료의 개발은 사람 질환의 중요 특징 및 경로를 복제하는 경계면 피부염의 동물 모델의 부재에 의해 방해되었다. 실시예 19 내지 23은 타입 I IFN-조절된 유전자 및 염증 유발 시토킨의 유발과 비교하여, 테이프-스트리핑으로 인한 피부 손상 후 PDC 및 호중구를 포함하는 선천성 면역 세포의 뚜렷한 침윤에 의해 급성 염증 반응이 동반된다는 것을 보고한다. 시토킨 유전자의 증가된 발현은 MyD88 결핍 마우스 및 특이적 TLR7 및 TLR9의 억제제가 처리된 마우스에서 완벽하게 폐지되고 RNA 및/또는 DNA에 의한 자극에 대한 중요한 역할을 나타낸다. 병변 피부를 침윤하는 백혈구 사이에서, PDC 및 호중구 모두는 TLR7 및 TLR9 수용체를 발현한다 (Edwards et al., 2003; Hayashi et al., 2003; 및 Kadowaki et al., 2001). 세포 침윤물의 규모 및 조성은 TLR7 및 TLR9 억제에 의해 유의적으로 변하지 않고 이 경로들은 분출 및 호밍 (homing)에 필요하지 않다는 것을 제안한다. 특이적 고갈 항체를 사용하여, 호중구가 아닌, PDC는 타입 I IFN 반응의 근원인 반면, 염증 유발 시토킨 IL1-α, IL1-β 및 TNF-α가 호중구 고갈에 의해 완전히 억제된다는 것을 입증한다. PDC 또는 호중구가 고갈된 피부에서 시토킨 유전자 발현의 감소는 침윤 백혈구로부터 또는 전체 피부 생체 조직으로부터 추출된 RNA 샘플에서와 유사하며, 케라틴 세포 또는 내피 세포가 이 유전자 발현 패턴에 주요 기여자가 아니라는 것을 나타낸다. IRS 및 호중구 고갈 모두가 염증 유발 시토킨을 유사한 정도로 억제한다는 발견은 호중구가 TLR7 및 TLR9 중 하나 또는 둘 다를 통해 직접적으로 반응한다는 것을 제안한다. 대안으로, TLR7 및 TLR9의 억제는 호중구를 활성화하는 또 다른 세포 타입 (PDC 아님)에 의해 만들어진 인자의 유발을 방지할 수도 있다.
손상된 피부의 TLR7 및 TLR9에 대하여 가장 가능성이 큰 리간드는 케라틴 세포 및 기계적 손상 또는 호중구 세포 독성으로 죽는 다른 세포 타입으로부터 방출되는 내인성 핵산이다. 두 번째 잠재적 근원은 NET의 형태로 호중구로부터 특이적으로 압출되는 DNA이다. 이것은 손상 전에 호중구 고갈은 PDC의 활성화를 감소시키지 않기 때문에, 초기 TLR 자극의 주요 근원일 가능성이 작지만 (도 27), 이것은 자가 면역 마우스에서 관찰된 만성 활성화의 적절한 근원일 수도 있다. 대체로 무균 환경에서 조직 손상은 유사한 핵산-의존적인 염증 반응을 자극하는 것으로 나타난다. 실제로, 괴사한 간세포로부터의 DNA 방출은 TLR9 의존적인 방식으로 호중구에 의한 시토킨 생산을 자극하고, 이것은 간 손상의 일부 형태에 따라서 간 손상의 주요 메카니즘으로 제안되었다 (Bamboat et al., 2010 및 Imaeda et al., 2009).
129 또는 C57/BL6 마우스에서, 염증 시토킨을 암호화하는 mRNA의 파열은 일시적이고 유전자 발현 수준은 테이프 스트리핑의 10일 내에 치료 전 수준으로 돌아간다. 이것은 세포 침윤의 감소 및 진행되는 부상 치유와 관련된다. 따라서, 이 모델은 루푸스, CLE 및 관련된 질환에서 만성으로 활성화되는 경로의 급성 활성화를 나타낸다. 반대로, 루푸스에 걸리기 쉬운 (NZBxNZW)F1 마우스의 테이프 스트리핑은 비-자가 면역 균주에서 그것과 매우 유사한 병변을 생산하지만, 자발적으로 치유하는 대신에, 그것은 임상적으로 및 조직학적으로 사람 CLE 상황을 닮은 병변으로 진화한다. TLR 리간드의 초기 근원이 정상 및 자가 면역 마우스와 유사할 수도 있지만, 중요한 차이는 계속해서 존재하는 (NZBxNZW)F1 마우스의 TLR7 및 TLR9에 대한 리간드, 특이적으로 진피-표피 접합부에 축적되는 IC (Furukawa 및 Yoshimasu, 2005; 및 McCauliffe, 1996), 및 이 마우스들에서 순환 항-DNA 및 항-RNA 자동 항체의 존재일 수도 있다 (Furukawa and Yoshimasu, 2005). 유사한 현상은 순환에서, 항-DNA 및 RNA IC인 경우, 사람 CLE에서 일어날 수도 있고 피부 조직에 증착되는 것이 널리 설명되었다 (McCauliffe, 1996; 및 Wenzel and Tuting, 2008). 이 계속되는 자극에 대한 DNA 및 RNA의 다른 근원은 호중구 자체일 수도 있다. 피부 호중구는 테이프 스트리핑 후 매우 활성화되고 DNA 및 RNA 분자를 함유하는 풍부한 NET 섬유를 생산한다. NET를 생산하는 호중구는 정상 마우스에서 염증 반응이 해결되기 전, 초기 시점에만 발견되었다. 하지만, (NZBxNZW)F1 마우스에서, NET를 생산하는 호중구의 유의한 침윤은 잘 형성된 병변에서 마지막 시점에 검출될 수 있으며, 그것들은 만성 TLR 신호 전달로 이어지는 내인성 핵산의 근원을 구성할 수도 있다는 것을 제안한다. 흥미롭게도, 항미생물 펩티드 LL37은 피부 호중구의 NET의 섬유와 관련되었다는 것을 발견하였다. LL37은 케라틴 세포에서 매우 유발성인 양이온성 항미생물 펩티드이고 시험관 내에서 AGG 응집 및 PDC에 의한 증가된 흡수를 촉진함으로써 내인성 DNA 및 RNA를 잠재적 TLR9 또는 TLR7 길항제로 전환한다는 것을 나타낸다 (Ganguly et al., 2009; 및 Lande et al., 2007).
루푸스에 걸리기 쉬운 마우스의 손상에 따라 피부 병변의 발달은 CLE 및 피부 외상 후 피부의 다른 자가 면역 질환에 걸린 환자에서 관찰되는 Koebner 현상과 유사하다 (Ueki, 2005). 실제로, 이 환자들은 피부 외상에 매우 민감하고 작은 피부 스크래치는 몇 주 내에 만성 병변의 발달을 일으킬 수 있다. (NZBxNZW)F1에서 병변의 발달은 지속적인 IFN-군 및 염증 유발 매개자, 예를 들어, IL-1α, IL-1β및 TNF-α의 높은 수준을 특징으로 한다. 유사하게, 사람 CLE에서, IFN-군, 뿐만 아니라 TNF-α 및 IL-1 과발현은 질환 심각성과 관련된다 (Clancy et al., 2004; Popovic et al., 2005; Werth, 2007; 및 Werth et al., 2002). 루푸수에 걸리기 쉬운 마우스에서 자발적인 거시적 병변의 부재는 다른 피부 질환, 예를 들어, 아토피성 피부염 또는 건선의 많은 마우스 모델이 가벼운 부상 후 독점적으로 병리학을 개발하기 때문에 놀라운 일이 아니다 (Matsunaga et al., 2007; Sano et al., 2005; 및 Spergel et al., 1999).
따라서 피부의 가벼운 손상에 따라 루푸스에 걸리기 쉬운 대 정상 마우스에서 결과의 차이는 피부에서 PDC 및 호중구에 의한 내인성 핵산에 대한 반응의 특성, 급성 대 만성을 반영한다. 염증은 TLR7 및 TLR9에 의해 특이적 TLR7/9 억제제로 (NZBxNZW)F1 마우스의 치료로서 조절된다. SEQ ID NO: 42 (IRS)는 피부의 육안적 소견, 조직학적 검사 및 유전자 군의 표준화에 의해 나타난 바와 같이 질환의 발병을 방지할 수 있다. PDC가 고갈된 마우스에서 결과는 유사했고 PDC는 TLR7 및 TLR9 리간드와 반응하는 주요 세포이고 질환의 확립의 원인이 있다는 것을 제안한다 (도 29-30). 하지만, 이것은 억제제 및 PDC의 고갈이 질환으로 이어지는 염증 고리를 파괴하는데 있어서 다르게 작용할 수도 있다는 가능성을 제외하지 않는다. TLR7 및 TLR9 활성화는 염증 반응의 유발뿐만 아니라 루푸스에 걸리기 쉬운 마우스에서 보이는 만성 반응의 지속도 필요하다. 이것은 초기 세포 침윤 및 피부 병변의 발달 후 시작되는 SEQ ID NO: 42 (IRS) 처리가 가속화된 치유로 이어진다는 사실에 의해 명확하게 나타난다. 이 발견은 CLE 및 관련된 피부 자가 면역 질환에서 치료를 위한 중요한 표적으로서 TLR7 및 TLR9를 확인한다.
결론적으로, 실시예 19-23에 나타난 결과는 TLR7 및 TLR9 모두의 만성 활성화로 이어지는 내인성 리간드에 대한 비정상 반응이 피부에서 자가 면역의 근본적인 계기를 구성하는 증거를 제공한다. 이 데이터들은 TLR7 및 TLR9 리간드에 대한 비정상, 만성 반응이 질환, 예를 들어, CLE 또는 경계면 피부염을 갖는 다른 질환으로 유도하는 저절로 계속되는 염증 고리를 확립할 수 있다. 이 연구들은 또한 새로운 올리고뉴클레오티드-기초한 TLR7 및 TLR9의 억제제가 피부 자가 면역 질환에 대하여 가치 있는 치료법인 것을 입증한다.
실시예 24: 반응에 대한 TLR7 및 TLR9 기여
염증 반응에서 TLR7 및 TLR9의 역할을 테스트하기 위해, 개개의 수용체 결핍 동물의 테이프 스트리핑에 대한 반응을 측정하였다. TLR7-(도 37a) 또는 TLR9-(도 37b) 결핍 마우스의 손상에 따라 피부에서 유전자 발현 수준의 부분적 감소를 관찰하였다. 하지만, 유전자 중 아무것도 독점적으로 이 수용체들 중 어느 하나에 의존하지 않았다. 예측된 바와 같이, 이기능적 TLR7/9 억제제 SEQ ID NO: 42의 추가는 TLR9-결핍 동물에서 억제를 완료하였다 (도 37b). 도 37은 타입 I IFN-조절된 및 염증 유전자의 상향 조절은 TLR7 및 TLR9 수용체 모두에 의존적이었다는 것을 나타낸다. 피부 염증의 약화는 TLR9-결핍 동물에서 관찰되지 않았다. TLR7 및 TLR9 모두는 반응에 기여하였고 이것들 중 하나만을 차단하는 것은 염증을 완벽히 방지하지 않는다.
실시예 25: IRP 의 존재시 배양된 사람 B-세포
B-세포 자극 활성에 대한 IRP의 효과를 더 조사하기 위해, 다양한 IRP 서열을 양성 및 음성 대조군과 함께, IL-6에 대하여 검정하였다. 실험을 4. 0 μm 또는 2. 0 μm의 IRP의 투여량을 사용하여 실시예 1에 설명된 바와 같이 수행하였다. 양성 대조군은 SEQ ID NO: 157을 가진 면역 자극 서열 (ISS)이었다. IRP에 의해 유발된 IL-6의 양을 개개의 실험에 걸쳐 결과를 표준화하기 위해 양성 대조군에 의해 유발된 것으로 나누었고 결과는 표 25-1 및 25-2에 나타난다. 결과는 여러 실험에 걸쳐 평균 표준화된 IL-6 반응으로 나타난다.
다음 표의 결과는 다른 IRP 서열이 양성 대조군의 IL-6 반응의 4%-63% 범위인, B 세포의 IL-6 반응의 범위를 유발한다는 것을 나타낸다. IRP는 최소량으로 B 세포를 활성화한다는 것은 바람직하다 (예를 들어, 양성 대조군에 비교하여 20% IL-6보다 더 작게 유발).
표 25-1 표준화된 IL -6 반응 (양성 대조군의 퍼센트)
Figure pct00014
Figure pct00015
표 25-2 표준화된 IL -6 반응 (양성 대조군의 퍼센트)
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 26: 전신 홍반성 루푸스 ( SLE ) 환자에 IRS 의 투여
수정된 American College of Rheumatology 분류 기준에 따라 SLE에 걸린 것으로 진단된 대사체에서 IRS의 안전성 및 효능을 결정하기 위해 임상 실험을 수행한다. 후보 대상체는 SELENA (홍반성 루푸스 국가적 평가에서 에스트로겐의 안전성)-변형된 SLEDAI (SLE 질환 활성 지수)로 분류된 활성 질환을 갖는다. 추가적으로 대상체는 나노스트링 분석에 기초한 선별 중에 향상된 엔터페론 군 점수를 갖는다. 인터페론 군는 염증 유전자 발현 패턴의 성분이다. 인터페론 군는 또한 SLE 군의 성분이다. 일부 예에서, 향상된 인터페론 군는 대조군 또는 참고 샘플의 적어도 1. 5-, 2. 0-, 2. 5-, 3. 0-, 4. 0-, 5. 0-, 7. 5-, 10-, 15-, 또는 30-배의 점수이다. 다른 예에서, 향상된 인터페론 군는 대조군 또는 참고 샘플의 평균의 적어도 +1, +2 또는 +3 표준 편차의 점수이다. 일부 예에서, 대조군 및 참고 샘플은 건강한 성인 대상체의 것이다.
IRS를 포함하는 약학적 조성물은 8주 동안 주 단위로 15, 30, 60, 120 이상 mg의 투여량으로 대상체에 피하 투여된다. SLE 환자에서 유전자 발현 수준에 대한 치료의 영향을 결정하기 위해 다음 샘플을 수거한다 (IFN-군 단독으로 또는 SLE 군의 일부로서): i) 혈장-사전 투여 및 처리의 시작 후 여러 시점; 및 ii) PBMC-베이스라인을 확립하기 위해 적어도 2번의 사전 투여, 및 이후 치료의 시작 후 적어도 4주, 8주 및 12주에 수거되고 분석될 것이다. 곡선을 위한 추가적인 데이터 점을 제공하기 위해 추가적인 시점이 추가될 수도 있다. 유전자 분석을 나노스트링으로 수행하였다.
종결점은 다음 목록을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 처음부터 8주 및 다른 시점까지 IFN-군 점수의 감소. 처음부터 8주 및 다른 시점까지 SLE 군 점수의 감소. 8주에 걸쳐 어느 유전자 군 점수의 감소를 갖는 대상체의 비율. 치료된 대 플라세포 (placebo)-처리 대상체의 곡선의 면적의 비교와 같은, 하지만 이에 제한되지 않는 다양한 통계적 접근을 사용하여 감소를 결정할 수 있다. SELENA-SELDAI 및 BILAG 지수를 포함하는 임상 질환 활성 측정의 변화 (예를 들어, 질환 심각성의 감소). 혈청학적 질환 측정의 변화, 예를 들어, 보체 또는 자동항체 (예를 들어, 항-핵 항원 항체: 항-dsDNA, 항-Sm [Smith 항원], 항-히스톤, 항-RNP, 항-Ro [SSA], 항-La [SSB], 등.; 참조예; Riemekasten and Hahn, Rheumatology, 44: 975-982, 2005)의 감소. 유동 세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이 8주에 걸쳐 말초 혈액에서 PDC의 증가. 플라세보 그룹과 비교된 바와 같이 코르티코스테로이드-부족 효과.
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Claims (30)

  1. 개인에게 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 개인의 자가 면역 질환을 치료하는 방법으로서, 건강한 대상체의 대조군 샘플과 비교하여 증가된 염증 유전자 발현 패턴이 치료의 시작시 개인으로부터의 샘플에 존재하고 TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 식 RγJGCKαGIGGβP-3' (SEQ ID NO: 146) (여기서 각각의 R, K, 및 L는 뉴클레오티드이고, J는 U 또는 T이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, α는 약 1 내지 약 20의 정수이고, β는 약 1 내지 약 20의 정수이다)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드인, 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 투여 단계 전에, 증가된 염증 유전자 발현 패턴을 갖는 개인을 선택하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제2항에 있어서, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제는 다음 결과
    a. 개인의 전처리 샘플에서 염증 유전자 발현 패턴의 감소;
    b. 자가 면역 질환의 임상 질환 활성 측정의 감소;
    c. 자가 면역 질환의 혈청학적 질환 측정의 감소; 및
    d. 개인의 전처리 말초 혈액 단핵 세포 샘플에서 형질세포양 수지상세포의 증가;
    중 하나 이상을 이루기 위한 유효량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법:
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 2차 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 2차 치료제는 코르티코스테로이드, 비스테로이드성 항-염증제 (NSAID), IFN-알파 억제제, 및 항-말라리아로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 개인에 의해 글루코코르티코이드 사용을 감소시키기 위해 개인에게 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 개인의 자가 면역 질환을 치료하는 방법으로서, 건강한 대상체의 대조군 샘플과 비교하여 증가된 염증 유전자 발현 패턴이 치료의 시작시 개인으로부터의 샘플에 존재하고 TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 식 RγJGCKαGIGGβP-3' (SEQ ID NO: 146) (여기서 각각의 R, K, 및 L는 뉴클레오티드이고, J는 U 또는 T이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, α는 약 1 내지 약 20의 정수이고, β는 약 1 내지 약 20의 정수이다)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드인, 방법.
  7. 개인으로부터의 샘플에서 염증 유전자 발현 패턴을 측정하는 단계를 포함하는 방법으로서, 자가 면역 질환에 걸린 개인이 TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 치료에 반응할 가능성이 큰지 평가하는 방법으로서, 건강한 대상체의 대조군 샘플과 비교하여 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 개인이 치료에 반응할 가능성이 크다는 것을 나타내고 TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 식 RγJGCKαGIGGβP-3' (SEQ ID NO: 146) (여기서 각각의 R, K, 및 L는 뉴클레오티드이고, J는 U 또는 T이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, α는 약 1 내지 약 20의 정수이고, β는 약 1 내지 약 20의 정수이다)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드인, 방법.
  8. 개인의 전 및 후처리의 샘플에서 염증 유전자 발현 패턴을 측정하는 단계를 포함하는, TLR7 억제제 및/또는 TLR9 억제제의 유효량을 포함하는 치료에 대한 자가 면역 질환에 걸린 개인의 반응성을 관찰하는 방법으로서, 전처리 샘플과 비교된 바와 같이 후처리 샘플에서 염증 유전자 발현 패턴이 감소될 때, 개인은 치료에 반응성으로 결정되고 TLR7 및/또는 TLR9 억제제는 식 RγJGCKαGIGGβP-3' (SEQ ID NO: 146) (여기서 각각의 R, K, 및 L는 뉴클레오티드이고, J는 U 또는 T이고, γ는 약 0 내지 10의 정수이고, α는 약 1 내지 약 20의 정수이고, β는 약 1 내지 약 20의 정수이다)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드인, 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 개인은 사람 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 자가 면역 질환은 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 또는 피부 홍반성 루푸스 (CLE)인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 143 및 SEQ ID NO: 144 [SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143 및 SEQ ID NO: 144]로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 변형은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 백본 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13항에 있어서, 변형은 2'-당 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 2'-당 변형은 2'-0-메틸 당 변형 또는 2'-0-메톡시에틸 당 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군 샘플과 비교하여, 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 대조군 샘플과 비교하여, BATF2, CMPK2, CXCL10, DDX60, EPSTI1, HERC5, HES4, IFI44, IFI44L, IFIT1, IFIT3, IFITM3, ISG15, LAMP3, LOC26010, LY6E, MX1, OAS1, OAS2, OAS3, OAS1, OTOF, RSAD2, RTP4, SERPING1, TRIM6, XAF1, c102h05 5, Agencourt-7914287 NIH-MCG_71, ISG20, IFI16, IRF7, 및 AIM2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생체 마커의 샘플의 증가된 수준을 포함하는 인터페론 (IFN) 군를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 대조군 샘플과 비교하여, BATF2, CMPK2, DDX60, EPSTI1, HERC5, HES4, IFI44, IFI44L, IFIT1, IFIT3, IFITM3, ISG15, LAMP3, LOC26010, MX1, OAS1, OAS2, OAS3, OAS1, OTOF, RSAD2, RTP4, SERPING1, TRIM6, XAF1, c102h05 5, Agencourt-7914287 NIH-MCG_71, ISG20, IRF7, 및 AIM2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생체 마커의 샘플의 증가된 수준을 포함하는 인터페론 (IFN) 군를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 대조군 샘플과 비교하여, IL-1알파, IL-1베타, TNF-알파, IL-6, IL-17, IFN-알파, IFN-오메가, IFN-람다1, IFN-람다2, 및 IP-10로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 시토킨의 샘플의 증가된 수준을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 피부 조직을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 9항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 건강한 대상체의 대조군 샘플은 적어도 10명의 건강한 사람 대상체의 PBMC를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 대조군 샘플과 비교하여, GTPBP2, PCTAIRE2BP, DNAPTP96, GPR84, B4GALT5, FRAT2, 및 PAFAHIB로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 생체 마커의 샘플의 증가된 수준을 포함하는 SLE 군를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 생체 마커의 유전자로부터 발현되는 mRNA를 측정함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 증가된 염증 유전자 발현 패턴은 생체 마커의 유전자로부터 발현되는 단백질을 측정함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  26. SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 143 및 SEQ ID NO: 144로 구성된 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드.
  27. 제 25항 또는 제26항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  28. 제 27항에 있어서, 변형은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 백본 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  29. 제 27항에 있어서, 변형은 2'-당 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  30. 제 29항에 있어서, 2'-당 변형은 2'-0-메틸 당 변형 또는 2'-0-메톡시에틸 당 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
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