KR20130040655A - 곤충 글라이코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 지방간 또는 고지혈증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 곤충 글라이코사미노글리칸의 신규 용도에 관한 것으로 보다 곤충에서 유래한 곤충 글라이코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 및 치료용 조성물, 및 고지혈증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 곤충 글라이코사미노글리칸은 지방간 또는 고지혈증의 예방, 치료/개선의 목적으로 사용할 수 있다. 본 발명의 글라이코사미노글리칸은 새로운 지방간 또는 고지혈증의 치료제의 개발에 유용하게 이용될 수 있는 효과를 가진다.

Description

곤충 글라이코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 지방간 또는 고지혈증 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating fatty liver or hyperlipidemia comprising insent glycosaminoglycan}
본 발명은 곤충 글라이코사미노글리칸의 신규한 용도에 관한 것으로 보다 곤충에서 유래한 곤충 글라이코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 및 치료용 조성물, 및 고지혈증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
글라이코사미노글리칸(glycosaminoglycans, GAGs)은 당(glyco), 아민기(amino), 단당류(glycan)가 글라이코시드 결합으로 연결된 다당류를 의미한다. 이는 혈관 내벽을 구성하는 탄수화물성 분자 물질의 일종으로, 저밀도 지단백 콜레스테롤의 대사와 혈액 응고, 세포 간질의 형성 등 다양한 기능에 직, 간접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다. 상기 GAGs는 생합성 과정에서 부분적인 변화를 통해 구조적으로 다양하고 복잡한 형태를 지니게 된다. GAG 류는 우론산과 글루코사민이 반복되면서 부분적으로 황산화가 이루어져 있는 기본적인 골격을 가지고 있으며, 이러한 복잡한 화학구조에 의해 여러 종류의 생물활성을 나타낼 수 있게 된다. 동물에 포함된 GAG류로는 히알우론산, 콘드로이틴 황산, 케라틴 황산, 헤파란 황산, 헤파린 등이 알려져 있고, 이 중 헤파린은 간, 허파, 피부 점막 내의 동맥을 따라서 있는 대식세포에만 존재하고 나머지 GAG류는 연결 조직에 분포하고 있다.
GAG의 생리활성에 대해서는 그 동안 다양하게 연구되어 왔다.
예를 들어, 대한민국 특허출원 제10-2004-7010488호에는 임부의 효과적인 분만을 유도하기 위한 자궁 경부 및 자궁근의 예방적 초회 자극 또는 치료적 처치용의 약학 제제가 기재되어 있다. 대한민국 특허출원 제10-2009-0071072호에는 곤충글라이코자미노글라이칸의 소염, 항당뇨, 항응혈, 항암, 혈관신생억제 용도, 및/또는 혈관확장반응의 기능장애로 인한 질환 치료 및/또는 예방 조성물에 대해서 기재되어 있다. 대한민국 특허출원 제10-2007-0020818호에는 곤충에서 유래한 글라이코자미노글리칸의 혈압강하, 체중조절, 혈관신생억제, 피부세포의 UV 손상 억제 효과가 있음이 기재되어 있다.
아울러, GAG류가 약물로 쓰이는 예로서, 콘드로이틴 황산은 점안제, 관절염치료제, 최근에 들어서 강장드링크류 등에도 사용된다. 또한 히얄우론산은 화장품의 첨가물로 많이 쓰이고 있다. 임상에서 글리칸 의약품으로서 널리 사용되는 것은 헤파린으로, 헤파린은 항혈액응고제로서 혈전 치료제, 수술후, 신장투석, 인공혈관, 체외순환(extracorporeal circulation) 등에 광범위하게 사용되고 있다. 최근에는 항혈액응고작용 이외에 면역계의 보체활성, 말초혈관형성(angiogenesis)저해, 염기성 섬유모세포(fibroblast) 성장인자의 상호작용, 항바이러스작용 등 여러 생물 활성이 보고되고 있다.
하지만, 지방간 개선과 관련된 글라이코사미노글리칸의 효과에 대해서는 아직 보고된 바가 없다.
현재 지방간에 직접 작용하여 진정한 지방간을 분해 치료제는 없으며 우회적으로 더 이상의 지방간이 생기는 것을 막기 위하여 지방분해제인 올리스타(제니칼, 상품명, 항비만제용도), 담즙산성분으로 콜레스테롤생성억제제인 우루소데옥시콜린산이 지방분해제로, 인슐린민감제로 로식리타죤, 피투리타존, HMC저해제로 아톨바스타틴 등이 사용되어지고 있다. 지방분해시키면서 유리지방산분비를 억제시키며 체내혈중의 지질을 낮추며 혈관내피부착인자(VCAM, ICAM)을 억제하며 히얄우론산(hyaluronic acd)을 분비하여 간이 딱딱해지는 것을 막는 효과적인 지방간치료제를 곤충추출물, 더 나아가서 곤충글라이코자미노글라이칸에서 찾고자 하였다. 즉, 혈관내피세포의 면역글로블린, 림파구 부착을 매개하는 단백인자인 ICAM-1(Intercellular adhesion molecule, Rothelin et al., 1988)의 침착과 각종혈액세포의 내피성 침윤부착인자인 VCAM-1(Vasculalr cell adhesion moecule-1, Cybulsky et al., 1991)을 동시에 저해하여 염증을 완화하고 염증매개인자인 프로스타글란딘 E2를 억제하여 암의 표지인자인 MMP(matrix metalloprotease)-2, MMP(matrix metalloprotease)-9는 를 억제하여 간암의 초기화를 예방하는 지 조사하였다. 이에 본 발명자들은 글라이코사미노글리칸의 새로운 생리활성을 찾기 위하여 연구를 거듭한 결과, 글라이코사미노글리칸이 지방간에 효과적이고, 간 지방 축적을 억제한다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 글라이코사미노글리칸의 새로운 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 곤충 글라이코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 곤충 글라이코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 조성물은 곤충 글라이코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하며, 지방간 예방 및 치료의 효과를 가지고 있는 것을 특징으로 한다. 아울러, 곤충 글라이코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하며, 고지혈증 예방 및 치료의 효과를 가지고 있다.
본 발명의 글라이코사미노글리칸은 바람직하게는 곤충에서 유래된 것이다. 곤충은 누에수번데기, 쇠똥구리, 매미눈꽃동충하초, 귀뚜라미, 호박벌여왕벌, 서양뒤영벌여왕벌, 쇠등에(맹충), 호박벌 봉군껍질, 호박벌유충번데기봉군껍질, 서양뒤영벌일벌, 누에(Bomyx mori), 누에수번데기, 광대노린재(노린재류, Poecilocoris lewisi), 흰점박이꽃무지성충( Protaetis brevitarsis )과 유충, 장수풍뎅이유충, 장수풍뎅이 성충 및 사슴벌레 성충으로부터 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 바람직하게는 곤충은 호박벌유충번데기봉군껍질 또는 서양뒤영벌 일벌일 수 있다.
정상 간의 경우 지방이 차지하는 비율은 5% 정도인데, 이보다 많은 지방이 축적된 상태를 지방간이라고 한다. 지방간은 크게 과음으로 인한 알코올성 지방간과 비만, 당뇨병, 고지혈증, 약물 등으로 인한 비알코올성 지방간으로 나눌 수 있으며, 본 발명의 지방간은 바람직하게는 알코올성 지방간 및 선천성 또는 식이 등에 의한 비알콜성 지방간 일 수 있다.
누에수번데기 글라이코자미노글라이칸은 누에수번데기에서 추출한 글라이코자미노글라이칸인 이상 제한되는 것은 아니며 조(crude)상태의 것 등일 수 있으나, 바람직하게는 ΔUA-2S-[1-4]GlcN(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid-2-sulfo-[1-4]glucosamine) 및 UA-[1-4]GlcN-6S(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronicacid-[1-4] glucosamine 6-sulfate) 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이며. 헤파리나제와 같이 배양시 I-H와 II-H의 헤파린 이당류로 변환한다. 그 단당류조성은 acethylation 부가 온도변화에 따라 아세틸기부가의 변동으로 조성비율의 변화가 있을 수 있으며 대략수치는 주로 D-Glucosamine 44% 와 17.5 % uronic acid(glucosaminic acid 1.8% + galactosaminic acid 7.3% + galacturonic acid 2.4% + glucuronic acid 6.0%)의 비율로 ΔUA-2S-[1-4]GlcN 및 UA-[1-4]GlcN-6S로 존재한다.
누에 글라이코자미노글라이칸은 헤파리나제와 같이 배양시 헤파린 이당류 I-H과 IV-H를 가진다. 가수분해시릴화로 Glucosamine (65.5%), N-Acethylglucosamine, D-Galactosaminic acid (10.2%), D-Glucosamine-6-sulfate, D-galacturonic acid, D-Glucuronic acid로 존재한다.
쇠똥구리 글라이코자미노글라이칸은 ΔUA-2S-[1-4]GlcN과 ΔUA-[1-4]GlcN-6S 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다. I-H, II-H, IV-H, IV-A의 헤파린 2당류의 헤파리나제의 분해산물로 변환이 가능하다. 아세틸레이션 부가조작 온도에 따라 그 비율은 다르지만 그 기본 단위 분자구조는 아세틸레이션 40℃ 2차반응표에서 보는 것처럼 D-Glucosamine 40.4%, D-galactosamine 4.3% 과 N-acethylgalactosamine 20.0%의 아미노당과 우론산을 가지는 산성당으로 D-glucuronic acid 18.6%, D-galactosaminic acid 11.5%, D-glucosamic acid 4,1% 등이다. glucosaminic acid 1.8%, galactosaminic acid 7.3%, galacturonic acid 2.4%, glucouronic acid 6.0%의 비율로 ΔUA-2S-[1-4]GlcN 및 UA-[1-4]GlcN-6S로 존재한다.
매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸은 매미눈꽃동충하초에서 추출한 글라이코자미노글라이칸인 이상 제한되는 것은 아니며 II-H, IV-H헤파린 2당류의 헤파리나제의 분해산물로 변환이 가능하다. chondroitin sulfate(ΔUA-[1-.3]-N-acethylgalactosamine-N-sulfate 계열) 일부를 포함하는 조(crude)상태의 것 등일 수 있으나, 바람직하게는 UA-[1-4]GlcN-6S, ΔUA-GlcNS(glucuronic 또는 galacturonuc acid-N-glucosamine-N-sulfate 계열) 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 ΔUA-2S-GlcN(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronicacid-2-sulfo-glucosamine)의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다. 역시 아세틸레이션 부가조작 온도에 따라 그 비율은 다르지만 그 기본 단위 분자구조는 아세틸레이션 40℃ 2차반응표에서 보는 것처럼 D-Glucosamine 73.9.%과 N-acethylglucosamine 7.4%의 아미노당과 우론산을 가지는 산성당으로 D-glucuronic acid 2.0%, D-galactosaminic acid 4.1%, D-galcturonic acid 10.8%, D-glucosamine 6-sulfate 1.1% 등이다.
귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸은 ΔUA-[1-4]GlcN-6S와 ΔUA--[1-4]GlcN반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다. 아세틸레이션 부가조작 온도에 따라 그 비율은 다르지만 II-H, IV-H의 헤파린 2당류의 헤파리나제의 분해산물로 변환이 가능하다. 그 기본 단위 분자구조는 아세틸레이션 40℃ 2차반응표에서 보는 것처럼 D-Glucosamine 73.9.%과 N-acethylglucosamine 7.4%의 아미노당과 우론산을 가지는 산성당으로 D-glucuronic acid 2.0%, D-galactosaminic acid 4.1%, D-galcturonic acid 10.8%, D-glucosamine 6-sulfate 1.1% 등이다.
호박벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸은 ΔUA-[1-4]GlcN-6S(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronicacid-[1-4] glucosamine 6-sulfate), UA-2S-[1-4]GlcN-6S(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid-2-sulfo-[1-4] glucosamine-6-sulfate) 및 ΔUA-[1-4]GlcN 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다. II-H, IV-H, I-H의 헤파린 2당류의 헤파리나제의 분해산물로 변환이 가능하다. 아세틸레이션 부가조작 온도에 따라 그 비율은 다르지만 그 기본 단위 분자구조는 아세틸레이션 40℃ 2차반응표에서 보는 것처럼 D-Glucosamine 42.0%과 D-galactosamine 2.7%, N-acethylglucosamine 9.3%의 아미노당과 우론산을 가지는 산성당으로 D-glucuronic acid 4.3%, D-glucosaminic acid 3.0%, D-galactosaminic acid 3.3%, D-galcturonic acid 24.0%, D-glucosamine 6-sulfate 7.2% 등이다.
서양뒤영벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸은 ΔUA-GlcN-6S(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid-glucosamine 6-sulfate), UA-[1-4]GlcNAC(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronicacid-N-cetyl-[1-4] glucosamine) 및 UA-[1-4]GlcNS-6S(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronicacid-N-sulfo-[1-4] glucosamine 6-sulfate) 및 ΔUA--[1-4]GlcN 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다. IV-H, III-S, II-H 헤파린 2당류의 헤파리나제의 분해산물로 변환이 가능하다. 역시 아세틸레이션 부가조작 온도에 따라 그 비율은 다르지만 그 기본 단위 분자구조는 아세틸레이션 40℃ 2차반응표에서 보는 것처럼 D-Glucosamine 59.8%과 D-galactosamine 3.9%, N-acethylglucosamine 15.0%의 아미노당과 우론산을 가지는 산성당으로 D-glucuronic acid 3.9%, D-glucosaminic acid 0.7%, D-galactosaminic acid 7.9%, D-galcturonic acid 7.1%, D-glucosamine 6-sulfate 1.4% 등이다.
쇠등에(맹충) 글라이코자미노글라이칸은 ΔUA-2S-GlcN-6S(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid-2-sulfo-glucosamine 6-sulfate), UA-[1-4]GlcN-6S(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronicacid-[1-4] glucosamine 6-sulfate) 및 ΔUA-[1-4]GlcN 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다. II-H, IV-H, I-H 헤파린 2당류의 헤파리나제의 분해산물로 변환이 가능하다. 아세틸레이션 부가조작 온도에 따라 그 비율은 다르지만 그 기본 단위 분자구조는 아세틸레이션 40℃ 2차반응표에서 보는 것처럼 D-Glucosamine 51.1%과 D-galactosamine 0.1%, N-acethylglucosamine 13.3%의 아미노당과 우론산을 가지는 산성당으로 D-glucuronic acid 5.2%, D-glucosaminic acid 0.8%, D-galactosaminic acid 5.8%, D-galcturonic acid 22.1%, D-glucosamine 6-sulfate 1.4% 등이다.
호박벌봉군껍질 글라이코자미노글라이칸(IgpcG)은 부가조작 온도에 따라 그 비율은 다르지만 그 기본 단위 분자구조는 아세틸레이션 60℃ 4차반응표에서 보는 것처럼 D-glucosamine 7.9%, D-glucuronic acid 6.0%, N-acetyl-D-galactosamine-4-sulfate 5.4%, D-galactosaminic acid 46.7%, D-galacturonic acid 12.0% 등을 가지며 ΔUA-[1-4]GlcN-6S, Δuronic acid-[1-4] glucosamine 6-sulfate 및 ΔUA--[1-4]GlcN 반복구조의 글라이코자미노글라이칸이다. II-H, IV-H, I-H 헤파린 2당류의 헤파리나제의 분해산물로 변환이 가능하다.
서양뒤영벌일벌(worker of B. terrestris) 글라이코자미노글라이칸은 ΔUA-2S-GlcN-6S(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid-2-sulfo-glucosamine 6-sulfate), UA-[1-4]GlcN-6S(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronicacid-[1-4] glucosamine 6-sulfate) 및 ΔUA--[1-4]GlcN 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다. II-H, IV-H, I-H 헤파린 2당류의 헤파리나제의 분해산물로 변환이 가능하다. 역시 아세틸레이션 부가조작 온도에 따라 그 비율은 다르지만 그 기본 단위 분자구조는 D-Glucosamine 3.6%과 D-galactosamine 1.3%, N-acethylglucosamine 6-sulfate 2.3%, N-acethylglucosamine 3.3%의 아미노당과 우론산을 가지는 산성당으로 D-galacturonic acid 8.2%, D-glucosaminic acid 1.8%, D-galactosaminic acid 55.1%, D-glucosamine 6-sulfate 0.5% 등이다.
광대노린재 글라이코자미노글라이칸은 광대노린재에서 추출한 글라이코자미노글라이칸인 이상 제한되는 것은 아니며 조(crude)상태의 것 등일 수 있으나, 바람직하게는ΔUA-GlcNAC 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 ΔUA-GlcNAC의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다. 역시 아세틸레이션 부가조작 온도에 따라 그 비율은 다르지만 그 기본 단위 분자구조는 N-acetylglucosamine 18.0%과 D-galacturonic acid 15.8%, N-acethyl D-galactosaminitol 11.5%, acid 16.2%의 아미노당과 우론산을 가지는 산성당등 으로 구성되어 있다.
흰점박이꽃무지 Protaetia brevitarsis (Kolbe)의 성충글라이코자미노글라이칸은 바람직하게는ΔUA-GlcNAC 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 ΔUA-GlcNAC의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다. 역시 아세틸레이션 부가조작 온도에 따라 그 비율은 다르지만 그 기본 단위 분자구조는 D-Glucosamine 26.1%, N-acetylgalactosamine 5.7%의 아미노당과 D-glucuronic acid 21.5% D-galacuturonic acid 9.0%과 D-galactosaminic acid 5.8%와 D-glucosaminic acid 7.7% 등 우론산 등을 포함하는 산성당 등으로 구성되어 있다.
물론, 성충과 글라이코자미노글라이칸 아미노당과 산성당 구성비율은 비슷하겠지만 흰점박이꽃무지 Protaetia brevitarsis (Kolbe)의 유충글라이코자미노글라이칸은 바람직하게는ΔUA-GlcNAC 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 ΔUA-GlcNAC의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다. 역시 아세틸레이션 부가조작 온도에 따라 그 비율은 다르지만 그 기본 단위 분자구조는 N-acetylgalactosaminitol 24.3%, D-Glucosamine 17.0%, 성충보다 5%적은 N-acetylgalactosamine 0.7% 그리고 N-acetylglucosamine 0.4%의 아미노당과 D-glucuronic acid 26.3% D-galacuturonic acid 10.8%과 D-galactosaminic acid 7.4%와 D-glucosaminic acid 3.9% 등 우론산 등을 포함하는 산성당 등으로 구성되어 있다.
장수풍뎅이 유충 글라이코자미노글라이칸은 바람직하게는ΔUA-GlcNAC 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 ΔUA-GlcNAC의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다. 역시 아세틸레이션 부가조작 온도에 따라 그 비율은 다르지만 그 기본 단위 분자구조는 D-Glucosamine 20.8%, N-acetylgalactosaminitol 12.2%, Galactosamine 7.7%의 아미노당과 D-glucuronic acid 7.6% D-galacuturonic acid 14.4%과 D-galactosaminic acid 12.7%와 D-glucosaminine2-sulfate 3.8% 등 우론산 등을 포함하는 산성당 등으로 구성되어 있다.
장수풍뎅이 성충 글라이코자미노글라이칸은 바람직하게는ΔUA-GlcNAC 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 ΔUA-GlcNAC의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다. 역시 아세틸레이션 부가조작 온도에 따라 그 비율은 다르지만 그 기본 단위 분자구조는 D-Glucosamine 24.3%, N-acetylgalactosaminitol 17.4%, D-glucosamine 6-phosphate 6.3%의 아미노당과 D-glucuronic acid 16.3% D-galacuturonic acid 20.9%과 D-galactosaminic acid 7.7%와 D-glucosaminine2-sulfate 9.6%, D-glucosaminic acid 3.3% 등 우론산 등을 포함하는 산성당 등으로 구성되어 있다.
사슴벌레 성충 글라이코자미노글라이칸은 바람직하게는 ΔUA-GlcNAC 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 ΔUA-GlcNAC의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다. 역시 아세틸레이션 부가조작 온도에 따라 그 비율은 다르지만 그 기본 단위 분자구조는 D-Glucosamine 26.5%, N-acetyl-D-galactosaminitol 8.7%, D-glucosamine 6-phosphate 15,6%의 아미노당과 D-glucuronic acid 26.4% D-galacuturonic acid 7.4%과 D-galactosaminic acid 7.7%와 D-glucosaminine2-sulfate 9.6% 등 우론산 등을 포함하는 산성당 등으로 구성되어 있다.
본 발명에서 ΔUA 또는 δUA는 4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid를 의미하고, GlcN은 D-glucosamine을 의미하고, Ac는 Acetyl을 의미하고, NS, 2S, 6S는 각각 N-sulfo, 2-sulfate 또는 6-sulfate로 각각의 위치에 황산기가 붙은 것을 의미한다.
본 발명의 곤충 글라이코사미노글리칸 추출물은 당업계에 공지된 용매 추출법에 의해 제조할 수 있다. 추출용매로는 예를 들어, 물, 에탄올 및 메탄올과 같은 탄소수 1 내지 6개의 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, n-핵산, 디에틸에테르, 아세톤, 벤젠과 같은 유기용매 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 물, 탄소수 1개 내지 6개의 알코올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출할 수 있다.
가장 바람직하게는 상기 추출용 용매는 에탄올 또는 에탄올과 물의 혼합물일 수 있으며 물과 에탄올 혼합물인 경우 에탄올의 농도는 70%일 수 있다. 추출방법은 상기 용매를 사용하여 냉침, 온침, 가열 등 통상의 추출방법이 사용 가능하다. 70% 에탄올을 이용한 추출시 곤충을 마쇄한 시료와 70% 에탄올의 비율은 특별히 한정되지 아니하나, 곤충을 마쇄한 시료에 에탄올을 중량기준 2배 내지 20배로 첨가할 수 있다. 바람직하게는 추출효율을 증가시키기 위하여 곤충을 마쇄한 시료에 대하여 에탄올을 5배 내지 10배로 첨가할 수 있다. 추출시 온도는 추출성분의 파괴가 일어나지 않는 한 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는 4℃ 내지 120℃일 수 있다. 가장 바람직하게는 55℃ 내지 65℃일 수 있다. 추출시간은 추출온도 및 추출용매에 따라 달라지나 0.5시간 내지 48시간, 바람직하게는 5시간 내지 10시간 동안 추출한다.
추출에 사용되는 다양한 곤충들은 포획한 후 세척하여 그대로 사용하거나 건조하여 사용 할 수 있다. 건조방법으로는 양건, 음건, 열풍건조 및 자연 건조하는 방법을 모두 사용할 수 있다. 또한, 추출효율을 증대시키기 위해 곤충을 분쇄기로 분쇄하여 사용할 수 있다.
본 발명의 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제, 가공 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 여과지를 이용한 침전물 분리, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리,원심분리, 탈색과정, 탈수, 진공건조, 동결건조 등 추가적으로 실시된 다양한 정제, 가공 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 곤충 추출물에 포함된다. 바람직하게는 본 발명의 추출물은 추가로 원심분리를 이용한 침전물 분리과정 및 진공건조 과정을 거쳐 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 제조방법에 의해서 제조된 곤충 글라이코사미노글리칸을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기에서 ‘약학적으로 유효한 양’이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 지방간 또는 고지혈증을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명의 제조방법에 의해서 제조된 곤충 글라이코사미노글리칸 또는 헤파린 단편의 유효한 양으로는 0.001 내지 1000mg/day/kg체중이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. 경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 "경피 투여"는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.
이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA).
아울러, 본 발명의 제조방법에 의해서 제조된 곤충 글라이코사미노글리칸은 지방간 또는 고지혈증 억제/예방 또는 개선의 목적으로 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 제조방법에 의해서 제조된 곤충 글라이코사미노글리칸을 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법에 의해서 제조된 곤충 글라이코사미노글리칸과 지방간 또는 고지혈증 억제 또는 개선 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 제조방법에 의해서 제조된 곤충 글라이코사미노글리칸을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 제조방법에 의해서 제조된 곤충 글라이코사미노글리칸의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%이다.
또한, 본 발명의 본 발명의 제조방법에 의해서 제조된 곤충 글라이코사미노글리칸을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 곤충 글라이코사미노글리칸은 지방간 또는 고지혈증의 예방, 치료/개선에 사용되어질 수 있으며 새로운 지방간 또는 고지혈증의 치료제의 개발에 유용하게 이용될 수 있는 효과를 가진다. 첫째로 알콜을 흰쥐에 투여하고 3일간 곤충초음파추출엑기스를 투여하는 알콜성급성간염에서, 풍뎅이류 등 곤충 성충과 유충 6종의 곤충알콜추출물(엑기스)이 유의적으로 효과를 가지는 곤충엑기스 선발하였고 유리지방산(FFA, free fat acid)을 혈청 중에 49.3% 감소시키고 히얄우론산(hyaluronic aid)을 213.3% 증가시켜 간염호전을 유도하여 유리지방산억제를 통한 알콜성간염억제용 엑기스 효과를 제공하였다. 또한, 혈관내피세포 부착인자 (VCAM-1:56.1%, ICAM-1:82.3% 감소)저해효과도 나타내었다. 구체적으로 풍뎅이류의 곤충 3종(흰점박이꽃무지, 장수풍뎅이, 넙적사슴벌레) 유충과 성충 및 양성대조곤충으로 귀뚜라미를 알콜추출하여 엑기스로 지방간개선효과의 재료로 사용하고 잔사를 마쇄하여 정제물인 기본반복단위구조를 가지는 글라이칸을 제조하여 글루크로닉산과 글루코자민을 주성분으로 그 유도체의 산성당, 아미노당 및 미량의 중성당의 배합비율을 가지는 글라이칸 조성물로 특허를 완성하였다.
비알콜성간염을 유전적으로 가지는 비만당뇨(db) 만성 지방간을 가지는 동물모델쥐에서 곤충글라이칸 투여로 간 병리조직학적으로 지방간(fatty acid)을 호전시키는 것을 발견 곤충 글라이칸의 용도발명을 완성하였다. 즉, 당뇨병성비만쥐(db)의 간조직의 병리조직을 조사하던 중, 간을 둘러싸고 있는 지방알갱이들이 곤충에서 추출분리정제한 정제물(곤충글라이칸, 곤충글루코사민류) 10 mg/kg 한달간 복강투여시 대조약물과 비교시 동등하게 현저히 지방알갱이들이 줄어듬을 알 수 있었다. 3종(맹충, 매미눈꽃동충하초, 귀뚜라미)의 곤충의 글라이칸이 간조직의 지방침착을 억제함으로써 알콜올성간염과 비알코올성간염인 지방간개선효과를 가지는 곤충글라이칸 제조방법특허를 완성하였다.
도 1은 알콜성 간염에 대한 본 발명의 곤충 엑기물의 간 보호 효과를 나타낸 것으로 풍뎅이류 곤충 엑기스 투여 급성 알콜성간염랫트 혈청 생화학적 수치변화이다. 알콜을 투여한 랫트의 혈청 내 FFA, ALP ,ALT, 전체 단백질, 히알우론산의 함량을 나타낸 것이다
FFA: free fatty acid, ALP: 알카라인 포스포타제, T. protein: 혈청 중의 단백질 총량, Hyaluronate: 히얄우로닉산
A: 흰점박이꽃무지성충 에탄올추출물 100 mg/kg
B: 흰점박이꽃무지유충 에탄올추출물 100 mg/kg
C: 장수풍뎅이유충 에탄올추출물 100 mg/kg
D: 장수풍뎅이성충 에탄올추출물 100 mg/kg
E: 사슴벌레성충에탄올추출물 100 mg/kg
F: 귀뚜라미(G. bimaculatus) 에탄올추출물 100 mg/kg
G: 귀뚜라미(G. bimaculatus) 물추출물 100 mg/kg
A～G: 곤충에탄올추출물 투여 후 에탄올 2 g/kg투여 후 2일간 매일 100 mg/kg 투여, 총3일시료투여 해당
도 2는 풍뎅이류 및 귀뚜라미 곤충 추출물의 HUVEC 세포에 VEGF(vascular endothelial growth factor)에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
A: 흰점박이꽃무지성충 에탄올추출물
B: 흰점박이꽃무지유충 에탄올추출물
C: 장수풍뎅이유충 에탄올추출물
D: 장수풍뎅이성충 에탄올추출물
E: 사슴벌레성충 에탄올추출물
F: 귀뚜라미(G. bimaculatus) 에탄올추출물
CON: PBS 완충용액
도 3은 풍뎅이류 및 귀뚜라미 곤충 추출물의 HUVEC 세포에 내피성산화질소합성효소(eNOS)가 미치는 효과를 나타낸 것이다.
A: 흰점박이꽃무지성충 에탄올추출물
B: 흰점박이꽃무지유충 에탄올추출물
C: 장수풍뎅이유충 에탄올추출물
D: 장수풍뎅이성충 에탄올추출물
E: 사슴벌레성충 에탄올추출물
F: 귀뚜라미(G. bimaculatus) 에탄올추출물
CON: PBS 완충용액
도 4는 풍뎅이류곤충엑기스의 용량의존적 혈관내피세포(HUVEC) 부착인자(VCAM-1:파란색계열, ICAM-1:노랑빨강계열) 저해효과를 나타낸 것이다.
A: 흰점박이꽃무지성충 에탄올추출물
B: 흰점박이꽃무지유충 에탄올추출물
C: 장수풍뎅이유충 에탄올추출물
D: 장수풍뎅이성충 에탄올추출물
E: 사슴벌레성충 에탄올추출물
F: 귀뚜라미(G. bimaculatus) 에탄올추출물
TNF(CON): HUVEC 세포에 TNF-α 30 ng/ml만 처리하고 곤충에탄올추출물 무처리군
A군에서F군까지: HUVEC 세포에 TNF-α 30 ng/ml만 처리하고 곤충에탄올추출물 처리군
도 5는 풍뎅이류곤충엑기스의 프로스타글란딘E2 저해효과를 나타낸 것이다.
A: 흰점박이꽃무지성충 에탄올추출물
B: 흰점박이꽃무지유충 에탄올추출물
C: 장수풍뎅이유충 에탄올추출물
D: 장수풍뎅이성충 에탄올추출물
E: 사슴벌레성충 에탄올추출물
F: 귀뚜라미(G. bimaculatus) 에탄올추출물
TNF(CON): TNF-α 30 ng/ml만 처리하고 곤충에탄올추출물 무처리군
A군에서F군까지: TNF-α 30 ng/ml만 처리하고 곤충에탄올추출물 처리군
도 6은 비알콜성간염 (db mice)에 대한 곤충글라이코자미노글라이칸의 효과를 나타낸 비만형 마우스 간조직 사진이다.
CON: 생리식염수처치군
ISG: 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸 5 mg/kg
GbG: 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸 5 mg/kg
TbG: 쇠등에(맹충) 글라이코자미노글라이칸 5 mg/kg
도 7은 비알콜성간염 (db mice)에 대한 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸 효과를 나타낸 비만형 마우스 간조직 사진이다.
CON: 생리식염수처치군
ISG: 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸 5 mg/kg
ISMC: 매미눈꽃동충하초자실체메탄올추출물 20 mg/kg
Acarbose: 아카르보스 5 mg/kg
도 8은 곤충글라이코자미노글라이칸의 VCAM, ICAM, MMP-2, MMP-9 저해효과를 나타낸 것이다.
CON: PBS 완충액투여군
CFA: Freund's adjuvant complete 투여 염증유발군
SPG: 누에수번데기 글라이코자미노글라이칸 10 mg/kg 투여군
IGPCG: 호박벌유충번데기 들어낸 봉군껍질 글라이코자미노글라이칸 10 mg/kg 투여군
BTWG: 서양뒤영벌일벌 글라이코자미노글라이칸 10 mg/kg 투여군
IQG: 호박벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸 10 mg/kg 투여군
IND: 인도메타신 1.5 mg/kg 투여군
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
곤충 알콜추출물의 알콜성 지방간 개선 효과
<실험방법>
광대노린재, 풍뎅이상과에 속하는 꽃무지과(Cetoniidae) 곤충 흰점박이꽃무지 Protaetia brevitarsis (Kolbe)의 성충과 유충(굼벵이), 장수풍뎅이 유충과 성충, 넙적사슴벌레 성충, 귀뚜라미과에 속하는 귀뚜라미를 -90℃에서 동결 건조한 후 미세하게 시료를 마쇄하였다. 마쇄한 시료를 70% 에탄올에 10배 용량으로 담가 저온(섭씨 30도 이하) 초음파로 각각 60분간 3회 추출하여 성분을 용출시켰다. 여과시킨 추출물인 70% 에탄올용출액을 60±5℃에서 5시간 동안 환류냉각 추출하여 진공 농축한 다음 동결 건조하여 실험 시료로 사용하였으며 사용한 곤충명과 양 및 수율은 표 1과 같다. 즉 초음파 알콜추출하여 간독성보호효과 및 각종 cytokine 활성평가의 재료로 사용하여 효과를 확인하였다. 또한, 알콜추출물에 존재하는 글라이코자미노글라이칸의 성분을 조사하기 위하여 알콜추출한 것을 환류증발농축하여 알콜추출물로 알콜성간염유발 랫트의 투여와 인간혈관내피세포(HUVEX)에 대한 투여시료로 사용하였다. 알콜추출물제조시 여과되지 않는 잔사부분에 대해서 미세마쇄 후 글라이코자미노 글라이칸을 제조하여 실험에 사용하였다.
알콜(에탄올)엑기스추출 후 곤충껍질잔사에서 정제한 곤충글라이코자미노글라이칸 수득률
Insect 알콜추출물 잔사 물추출
P1 A(HA) B(HL) C(JL) D(JA) E(NA) F(GbE) G(GbW)
Used amount
(g)		 16.27 10.8 19 115 32 9.3 20 20
Accuquired Extract amount (g) 1.27 2.96 1.99 12.43 10.40 3.4 14.32 12.4
Glycosaminoglycan (mg) 50 3 3 10 3 4 6
Yield
(%)		 0.04 0.10 0.15 0.08 0.03 0.12 0.04
P1: 광대노린재
A: 흰점박이꽃무지성충
B: 흰점박이꽃무지유충
C: 장수풍뎅이유충
D: 장수풍뎅이성충
E: 사슴벌레성충
F: 귀뚜라미(G. bimaculatus) (에탄올추출물, 양성대조 1)
G: 귀뚜라미(G. bimaculatus) (물추출물, 양성대조 2)
<1-1> 랫트에 곤충엑기스 시료처치 및 혈청분석, 간조직검사
알콜성간독성보호효과에 대한 연구(동물실험에서의 활성)풍뎅이류 곤충 추출물에 대한 알콜성간염 보호효과를 조사하여 혈청 중의 alcohol, α-antitrypsin, SGOT, SGPT, δ-GT, bilirubin, ALP, total protein, hyaluronic acid, free fatty acid, LDH를 혈청자동분석기(Hitachi 7060 automatic clinical analyzer)를 사용 로슈(Roche)진단시약을 사용하여 조사하였으며 재단법인 녹십자임상센터의 혈청분석방법에 준하였다. hyaluronic acid는 LIA(Latex immunoaglutination tubidmetric immunoassay)방법, Free fatty acid는 ACS-ACOD colorimetric 방법으로 측정되었다. 즉, 체중이 157.17±5.25 g, SD 웅성 랫트에 50% 에탄올을 2ml/kg용량으로 투여하고 3일간 곤충초음파추출엑기스 100 mg/kg을 투여한 후 도태후 혈청을 채취하여 혈청 중의 alcohol, α-antitrypsin, SGOT, SGPT, δ-GT, bilirubin, ALP, total protein, hyaluronic acid, free fatty acid(유리지방산), LDH의 양적변화를 분석하였다. 또한 혈청에서 VCAM-1(Millipore, USA), ICAM-1(Millipore, USA), VEGF(R&D, USA), ENOS(R&D), MMP-2(Chemicon, USA), MMP-9(Chemicon, USA), IL-6(R&D, USA), PGE2(Cayman, USA), NO(Cayman, USA), COX-2(Cayman, USA), SPLA2(Cayman, USA), VEGF(R&D)를 각각의 키트를 제조회사의 매뉴얼에 따라 실시하여 효과를 살펴보았다.
<1-2> 혈관내피세포에 대한 NO 산생능 조사
NO 산생은 Griess 시약(Cayman, MI, USA)을 사용하여 세포 배지내로 아질산이온의 축적양을 측정하였다. 즉, 에탄올추출물을 인간혈관내피세포(HUVEC)에 0.2 mg을 기준으로 10배씩 희석해가면서세포에 처치하여 24시간 배양하고 VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA)를 사용하여 540 nm에서 아질산나트륨량을 흡광도를 측정하여 계산하였다(Nims et al., 1995). 대조약물로는 생체 내에서 NO를 산생하여 혈관이완에 관여하는 sodium nitroprusside dihydrate (SNP)를 사용하였다.
<1-3> 혈관내피세포에 대한 내피성산화질소합성효소 ( e NOS ) 활성 조사
내피성 산화질소합성효소의 활성조사는 비단벌레 에탄올 추출물을 1 mg/ml, 100 μg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml을 처리하여 24시간 배양한 내피세포인 HUVEC (ATCC CCL-2519, Manassas, VA, USA)를 R&D systems (Minneapolis, USA)의 매뉴얼에 따라 lysis buffer로 세포막을 터트려 나오는 세포액 중의 내피성 산화질소 합성효소를 항원항체반응인 enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) kit로 결정하였다.
<1-4> 혈관내피세포로부터 Cytokine 의 분비 측정
HUVEC세포(1.0 × 107 cells/ml) 에탄올 추출물 각각의 농도와 함께 96-well plate에서 37 ℃, 5% CO2 및 가습 조건으로 24시간 배양하였다. 이들 상등액 중에서 분비된 cytokine류 중 염증 부착인자억제능을 측정하기 위해 TNF-α를 30 ng/ml씩 96 well에 가해 미리 분주해 놓았던 혈관내피세포(HUVEC)에 손상을 준 후, 준비된 각 well에 에탄올 추출물 각 1, 10, 100, 1000 ug/ml씩 첨가하여 48시간 배양 후 염증매개인자인 Prostaglandin E2는 프로스타글란딘 측정 키트 (Cayman, MI, USA) 매뉴얼에 따라 실험하였고 혈관내피염증억제능에 관계하는 내피부착단백인자인 ICAM-1과 혈관세포부착인자 VCAM-1 (ICAM-1, VCAM-1. Millipore, USA)도 같은 세포처치 방법으로 조사하였다. 또한 혈관내피성장인자로서 암 전이인자의 하나인 VEGF를 ELISA assay kit (R&D systems, Minneapolis, USA)으로 측정하였다(안미영외, 비단벌레에탄올추출물의 NO증강 및 염증인자억제활성, 한국응용곤충학회지 50(3), 227-233, 2011)
<실험결과>
<1-5> 랫트에 곤충엑기스 시료처치 및 혈청생화학적 분석, 간조직검사 , 혈청 내 지질 억제 효과 확인
SD 웅성 랫트에 50% 에탄올을 2ml/kg용량으로 투여하고 3일간 곤충초음파추출엑기스 100 mg/kg을 투여한 후 도태후 혈청을 채취하여 혈청 중의 alcohol, α-antitrypsin, SGOT(AST), SGPT(ALT), δ-GT, bilirubin, ALP(알카라인포스파타제), total protein, hyaluronic acid, free fatty acid, LDH의 양적변화를 조사한 결과 FFA(free fat acid, 유리지방산), ALP(알카라인포스파타제)이 혈청 중에 감소하고, 히얄우론산 증가하는 것을 알 수 있었다(도 1). 간조직 검사결과 알콜에 의한 간조직손상이 호전되어 세포과산화가 억제되어 간세포지질침착이 방지됨을 병리조직검사로 확인할 수 있었다(도 3).
<1-6> 곤충엑기스 처치 혈청의 면역학적 사이토카인 분석결과
알콜성간염을 유발하기위해 에탄올 50%를 투여한 후 엑기스를 3일투여한 혈청 중에 COX-2, IL-6, PGE2, SPLA2(분비형 포스포리파제A2), MMP-2, MMP-9 수치에서 에탄올처리 알콜성간염군과 무처치군(CON)과 곤충엑기스처치군(A군～G군) 별다른 특이한 변화를 발견하지 못하였다 (표 2,3).
풍뎅이류 곤충 엑기스 투여 급성 알콜성간염 랫트 혈청 중의 싸이토카인수치변화 1 -Cox-2, IL6 , PGE2 , sPLA2 , MMP -2, MMP -9 수치조사
Group COX-2 IL-6 PGE2 sPLA2 MMP-2 MMP-9
(ng/ml) (ng/ml) (pg/ml) μ(mol/min/ml) (ng/ml) (ng/ml)
CON 11.47±2.2 2.26±1.02 79.9±36.7 0.19±0.5 66.85±28.1 61.2±64.0
EtOH 19.27±5.1 1.21±0.41 42.4±4.8 1.75±0.2 87.94±31.7 47.4±10.0
G 23.41±2.9 2.17±0.60 68.2±2.1 1.84±0.2 77.48±27.3 53.6±51.5
A 21.90±5.8 1.39±0.33 137.4±83.8 2.33±0.3 127.59±14.8 50.9±12.3
B 29.94±6.4 0.90±360.7 45.0±3.9 2.46±0.6 72.12±47.7 97.8±39.8
C 31.56±0.7 2.38±1.84 60.7±9.2 2.44±0.3 163.89±0.5 73,6±35.10
D 33.21±4.1 0.97±0.10 55.7±34.0 1.94±0.2 89.04±38.5 53.9±74.5
E 37.37±7.4 1.49±0.26 47.8±7.1 2.51±0.6 99.83±37.1 145.3±101.9
F 38.30±2.2 1.63±0.92 79.6±25.3 2.52±0.3 102.95±66.3 126.7±70.2
venom
(양성대조)		 12.00±0.6
A: 흰점박이꽃무지성충 에탄올추출물 100 mg/kg
B: 흰점박이꽃무지유충 에탄올추출물 100 mg/kg
C: 장수풍뎅이유충 에탄올추출물 100 mg/kg
D: 장수풍뎅이성충 에탄올추출물 100 mg/kg
E:사슴벌레성충 에탄올추출물 100 mg/kg
F: 귀뚜라미(G. bimaculatus) (에탄올추출물, 양성대조 1) 100 mg/kg
G: 귀뚜라미(G. bimaculatus) (물추출물, 양성대조 2) 100 mg/kg
venom: PLA2 키트에 들어 있는 독(양성대조)
풍뎅이류 곤충 엑기스 투여 급성 알콜성간염 랫트 혈청 중의 싸이토카인수치변화 2 -VCAM-1, ICAM -1, VEGF , NOS 수치조사( in vivo )
Group VCAM-1 ICAM-1 VEGF NOS
(ng/ml) (ng/ml) (pg/ml) (pg/ml)
CON 50.73±3.6 10.60±1.13 45.01±29.6 40.02
EtOH 27.55±4.8 11.04±2.54 33.38±9.4 28.03
G 43.26±16.1 14.13±3.35 20.90±8.7 44.15
A 30.77±6.3 18.42±8.23 58.15±38.2 55.13
B 32.35±13.5 23.06±6.98 25.90±4.3 58.42
C 24.12±7.7 13.51±0.0 14.50±6.7 48.09
D 29.00±6.5 15.07±5.73 34.89±5.5 57.36
E 22.41±4.1 7.19±2.32 6.35±16.5 25.74
F 22.11±2.2 15.78±8.63 23.88±17.3 42.00
A: 흰점박이꽃무지성충 에탄올추출물 100 mg/kg
B: 흰점박이꽃무지유충 에탄올추출물 100 mg/kg
C: 장수풍뎅이유충 에탄올추출물 100 mg/kg
D: 장수풍뎅이성충 에탄올추출물 100 mg/kg
E:사슴벌레성충 에탄올추출물 100 mg/kg
F: 귀뚜라미(G. bimaculatus) (에탄올추출물, 양성대조 1) 100 mg/kg
G: 귀뚜라미(G. bimaculatus) (물추출물, 양성대조 2) 100 mg/kg
<1-7> 혈관내피세포( HUVEC )에서의 곤충엑기스에 대한 면역학적 사이토카인 분석결과
풍뎅이류 곤충 추출물의 HUVEC 세포에 TNF 염증유발시 혈관내피부착인자억제효과를 살펴보면 HUVEC cell에 TNF-α 30 ng/ml 처리시 56.05% 감소된 VCAM-1과 82.32% ICAM 감소수치를 나타내어 염증시 생기는 내피부착인자( molecule)인 VCAM-1, ICAM-1의 50%이상의 확연한 감소를 확인하였다(표 4).
풍뎅이류 및 귀뚜라미 곤충 추출물의 HUVEC 세포에 TNF 염증유발시 혈관내피부착인자억제효과 ( in vitro )
Item Group 10 mg/ml 1 mg/ml 100 ug/ml 10 ug/ml
VCAM-1 A 9.87±2.96 15.86±3.53 17.00±7.43 9.29±0.69
B 7.96±0.25 17.82±0.33 16.58±6.73 13.70±1.48
C 11.13±0.77 15.72±1.60 13.14±2.57 12.80±3.86
D 13.28±4.12 25.99±5.29 15.41±2.74 13.14±3.58
E 15.95±4.03 17.48±10.16 18.09±4.74 15.32±3.57
F 16.94±1.80 22.71±1.49 22.02±8.79 14.61±2.74
Control 18.11±2.91 18.11±2.91 18.11±2.91 18.11±2.91
ICAM-1 A 12.88±4.32 13.27±0.55 48.72±0.68
B 18.10±7.38* 46.55±15.45 59.87±6.32
C 19.31±2.21 49.71±0.21 54.06±0.58
D 18.57±9.43* 42.16±11.33 52.72±7.73
E 22.26±6.75* 57.78±1.87 59.76±9.01
F 31.71±10.92* 49.48±4.04 73.21±11.52
Control 72.85±10.91 72.85±10.91 72.85±10.91
평균±표준편차. 이표에서 Control은 negative control을 말하며 TNF-α 30 ng/m을 HUVEC 세포에 처치하여 염증을 유발시키고 치료를 처치 안한 군을 말한다. 유의성은 염증유발군 대비(*P <0.05)
A: 흰점박이꽃무지성충 에탄올추출물
B: 흰점박이꽃무지유충 에탄올추출물
C: 장수풍뎅이유충 에탄올추출물
D: 장수풍뎅이성충 에탄올추출물
E:사슴벌레성충 에탄올추출물
F: 귀뚜라미(G. bimaculatus) (에탄올추출물, 양성대조 1)
또한, VEGF(도 2)는 F군(귀뚜라미에탄올엑기스처치군)의 용량의존적 감소와 eNOS(도 3)는 모든 풍뎅이 및 귀뚜라미 엑기스 처치군의 용량의존적 증가를 관찰할 수 있었다(도 4). 혈관내피세포의 산화질소합성효소(eNOS)의 용량의존적 증가로 염증유발요인인 NO의 생성을 조절 하고(표 5) 이산화질소가 세포저해를 일으켜 염증매개인자(PGE2)(도 5)를 감소시킴으로써 항염증작용을 촉진하고 cytokine 중의 하나인 VEGF 활성을 억제하며 혈관내피세포에 임파구 및 혈액세포덩어리들의 부착(ICAM-1, VCAM-1)(도 4)을 차단함으로써 항암제나 항염증제의 소인을 가졌다고 사려 된다(도 5).
또한, matrix metalloprotease(MMP)-2와 MMP-9을 흰점박이성충에탄올추출물에서도 저해함을 알 수 있다(표 5).
풍뎅이류 곤충 추출물의 HUVEC 세포에 산화질소( NO )와 내피성산화질소합성효 소( sPLA 2 ), MMP ( metalloprotease )-2, MMP -9에 미치는 효과
Item group 10 mg/ml 1 mg/ml 100 ug/ml 10 ug/ml
NO A 7.160.91 2.210.07* 1.960.11*
B 3.600.36* 1.860.03* 2.320.82*
C 3.770.30* 2.140.36* 1.910.05*
D 3.360.06* 1.930.04* 1.880.01*
E 3.910.25* 2.170.31* 2.580.97*
F 3.220.42* 2.010.17* 1.950.04*
Control 2.080.18 2.080.18
Pos.CON SNP 66.142.94 10.580.27
sPLA2 A 0.270.01* 0.260.0* 0.190.12*
B 0.830.02* 0.740.04* 0.300.05*
C 0.420.03* 0.280.02* 0.280.03*
D 0.280.02* 0.250.02* 0.250.01*
E 0.310.03* 0.260.0* 0.260.0*
F 0.280.07* 0.260.0* 0.260.02*
Control (venom) 12.000.60
Item Group 10 mg/ml Item Group 10 mg/ml
MMP-9 A 55.913.23 MMP-2 A 37.7322.76
B 153.089.12 B 30.6425.47
C 84.210.18 C 85.5022.62
D 61.541.88 D 66.430.00
E 117.570.71 E 19.510.00
F 144.60.0 F 46.520.00
Control(TNF-) 58.740.00
평균±표준편차. 이표에서 Control은 negative control을 말하며 TNF-α 30 ng/m을 처치하여 염증을 유발시키고 치료를 처치 안한 군을 말한다. 유의성은 염증유발군 대비(*P <0.05)
A: 흰점박이꽃무지성충 에탄올추출물
B: 흰점박이꽃무지유충 에탄올추출물
C: 장수풍뎅이유충 에탄올추출물
D: 장수풍뎅이성충 에탄올추출물
E:사슴벌레성충 에탄올추출물
F: 귀뚜라미(G. bimaculatus) (에탄올추출물, 양성대조 1)
< 실시예 2>
곤충 알콜추출물 및 글라이코자미노글라이칸의 비알콜성 지방간 개선 효과
비알콜성간염을 유전적으로 가지는 비만당뇨(db) 만성 지방간을 가지는 동물모델쥐에서 곤충글라이칸 투여로 간 병리조직학적으로 지방간(fatty acid)을 호전시키는 것을 발견 곤충 글라이칸의 용도발명을 완성하였다. 즉, 당뇨병성비만쥐(db)의 간조직의 병리조직을 조사하던 중 간을 둘러싸고 있는 지방알갱이들이 곤충에서 추출분리정제한 정제물(곤충글라이칸, 곤충글루코사민류) 10 mg/kg 한달간 복강투여시 대조약물과 비교시 동등하게 현저히 지방알갱이들이 줄어듬을 알 수 있었다. 3종(맹충, 매미눈꽃동충하초, 귀뚜라미)의 곤충의 글라이칸이 간조직의 지방침착을 억제함함으로써 알콜올성간염과 비알코올성간염인 지방간개선효과를 가지는 곤충글라이칸 제조방법특허를 완성하였다.
<실험방법>
<2-1> 곤충껍질잔사에서 곤충글라이코자미노글라이칸의 정제
신선한 곤충(사용한 곤충 종류의 기재)에서 지질 성분을 제거하기 위하여 유기용매인 아세톤에 이틀 동안 방치 후 실온에서 말렸다. 시료 50 g (건조중량)을 각각 0.05 M 탄산염 완충액(pH 9.0) 500 mL에 넣고 내열성 프로테아제의 일종인 알칼라제 8 mL를 가하여 60℃ 에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 최종 농도가 5%가 되도록 트리클로로아세트산을 첨가하여 냉장고 4℃에서 1시간 동안 방치한 후 8000 RPM 으로 원심분리하여 상등액을 모은 다음, 상등액에 1% 초산 칼륨염 (potassium acetate)를 함유한 알코올을 3배 부피로 첨가하여 침전시키고 건조시켜 곤충 엑기스를 제조하였다.
<2-2> 곤충 엑기스로부터 다당질의 정제
곤충엑기스를 물에 녹이고, 물에 녹지 않은 물질을 원심분리로 제거한 후 5% 세틸피리디움 클로라이드(cetylpyridinium chloride)를 1/4 부피로 첨가하여 복합체를 만들어 침전시켰다. 침전물을 원심분리하여 2.5 M 염화나트륨에 녹여 다시 알코올로 침전시켜 정제하였다. 정제한 시료를 다시 소량의 물에 녹여 투석시킨 후 동결건조시켜 다당질을 정제하였다.
<2-3> 결합단백질의 제거
다당질에 결합된 결합단백질을 제거하기 위하여 β-일리미네니션(β-elimination)반응을 수행하였다. 정제된 다당질 75 mg 을 4 mL의 물에 녹이고 1 mL의 1.2 M 수산화나트륨과 0.9 M의 나트륨 보로하이드라이드(NaBH4)를 가하여 21시간 동안 25℃에서 반응시켰다. 반응후 pH를 1.2 M 염산으로 맞춘 후 4배의 에틸알코올을 가하여 냉장고에 방치하여 침전을 모았다. 침전을 P2O5 하에서 감압건조시켰다.
<2-4> 다당질의 구조 분석-다당질의 메틸화와 메타놀리시스에 의한 당조성 분석
효소분해물의 성분분석을 위해 시료에 메탄올 용매로 녹인 3M HCl에 시료를 녹인 후 120℃ 2시간 가온 후 실온으로 식힌 후 질소가스하 40℃에서 건조 후 0.3 ml 아세트 무수물(acetic anhydride)를 가한 후 30분동안 실온에서 방치한 후 40℃에서 질소가스 하에서 건조한 후 P2O5 하에서 진공 펌프로 완전히 건조시킨 후 50 ㎕의 피리딘/N,O-비스(트리메틸시릴)트리플로로아세트아마이드(2:1, v/v)를 가하여 30분 동안 80℃에서 시릴(silyl)화를 시키고 시릴화가 이루어진 시료를 가스크로마토그라프{5973N 매스 디텍터를 구비한 Agilent 6890(Agilent Technologies)}로 분석을 하였다. 칼럼은 미국 휴렛팩커드사의 HP-5 모세관 칼럼으로 규격은 0.53 mm x 30m로 주입부의 온도는 250℃, 검출기의 온도는 280℃를 각각 유지하며 칼럼의 온도는 180℃에서 1분당 10℃씩, 220℃로 1분당 2℃씩, 300℃로 분당 100℃ 증가되도록 프로그램하여 분석하였다. 가수분해, 아세틸기 당부가와 TMS유도체화하여 새로운 곤충 글라이코사미노글라이칸 성분을 아미노당, 산성당 GC-MS 분석 단당류, 표준품과 비교구명 하였다.
곤충 유래 글라이코자미노글라이칸의 단위구조의 단당류조성과 아미노당조성을 GC-MS를 이용한 다당질의 메틸화와 메타놀리시스에 의한 당조성 분석하였다.
<실험결과>
<2-5> 광대노린재글라이코자미노글라이칸의 아미노당분석( 당부가아세틸레이 션 80℃)
표 6의 P1, P2는 정제시기와 정제순도가 다른 광대노린재의 글라이코자미노글라이칸이다. 시료의 농도는 5 mg/ml이고 acetylation은 80 ℃에서 행해졌다.
표 6의 P1에서 많이 측정된 compounds는 N-acetyl-glucosamine, D-glucuronic acid, D-galacturonic acid, N-acetyl-D-galactosaminitol, D-glucosamine, D-galactosamic acid고 반면 D-glucosamine-6-phosphate, D-glucosamine-6-sulfate, N-acetylglucosamine-6-sulfate, D-glucosamine-2-sulfate, N-acetyl-D-galactosamine-4-sulfate는 적게 측정되었다. P2에서 많이 측정된 compounds는D-glucosamine, N-acetyl-glucosamine, D-glucosaminic acid이고, 적게 측정된 compounds는 D-glucosamine-6-phosphate, D-glucosamine-6-sulfate, N-acetylglucosamine-6-sulfate, N-acetyl-D-galactosamine-4-sulfate이다.
Figure pat00001
<2-6> 곤충조( crude , 색소무제거 )글라이코자미노글라이칸의 중성당 함량
Figure pat00002
PSWG: 누에수번데기의 조(crude, 색소제거안한)글라이코자미노글라이칸
ㅅoㅈ: 조(crude, 색소제거안한)서양뒤영벌여왕벌글라이코자미노글라이칸
ㅎㅇㅈ: 조(crude, 색소제거안한)호박벌여왕벌글라이코자미노글라이칸
곤충글라이코자미노글라이칸은 자체단맛을 내는 소르비톨, 항균성을 나타내는 자이리톨을 소량함유하여 조미료나 각종 기호식품, 과자류등에 사용될 수 있다.
<2-7> 곤충글라이코자미노글라이칸(1-4 & P)의 중성당 함량
Figure pat00003
1. PSG: 누에수번데기글라이코자미노글라이칸
2. IgpcG: 호박벌유충번데기 들어낸 봉군껍질 글라이코자미노글라이칸
3. BtwG: 서양뒤영벌일벌글라이코자미노글라이칸
4. IqG: 호박벌여왕벌글라이코자미노글라이칸
5. P2: 광대노린재글라이코자미노글라이칸
알파글루코스를 비롯한 마노스, 과당등을 소량으로 주로 함유하며 기호를 충족하여 상대적으로 미량인 자이리톨과 소르비톨을 함유하여 제과산업 및 식품첨가물로 가능하다
<2-8> 풍뎅이류곤충 (A-E) 글라이코자미노글라이칸의 아미노단당류 함량
Figure pat00004
A: 흰점박이꽃무지성충 글라이코자미노글라칸
B: 흰접박이유충글라이코자미노글라이칸
C: 장수풍뎅이유충글라이코자미노글라이칸
D: 장수풍뎅이성충글라이코자미노글라이칸
E: 사슴벌레성충글라이코자미노글라이칸
상기 풍뎅이상과 곤충글라이코자미노글라이칸의 아미노당과산성당을 살펴보면 D-글루쿠로닉산과 D-글루코자민의 주 배합을 가지는 이당류의 반복단위로 이루어져 있음을 알 수 있으며 일부 갈락투로닉산과 N-아세틸 갈라토자민이 혼용되어 있다. N-아세틸자미니톨과 D-갈락토자미닉산과 D-글루코자미닉산의 특징적 성분을 가진다.
<2-9> 풍뎅이류 곤충글라이코자미노글라이칸의 중성단당 함량 (A-E, crude C & crude E)
Standard (ng/mg) 1A 2B 3C 4D 5E Crude C Crude E
Glycerol 140.36±2.10 120.75±12.22 143.26±32.91 842.35±69.53 171.59±1.85 47.08±15.11 142.05±1.03
Arabinose 70.24±0.27 28.54±0.02 3.82±0.75 11.67±2.75 8.99±0.21 17.27±0.41 6.33±0.91
Rhamnose 47.00±1.05 10.10±0.18 49.69±4.74 13.27±0.73 89.25±2.86 22.18±4.29 3.58±0.14
Ribose 12.83±1.59 3.79±0.10 10.71±7.57 1.49±0.26 0.00±0.00 1.42±0.30 3.07±0.02
Xylose 2.18±0.14 3.02±0.21 6.62±0.79 3.53±0.06 2.43±0.07 8.07±1.08 1.66±0.27
xylitol 3.61±0.04 9.55±0.13 29.50±0.91 1.33±0.03 4.71±0.00 27.36±2.69 3.16±0.05
Mannose 3.12±0.04 1.01±0.13 12.21±0.91 0.72±0.03 1.00±0.00 26.78±2.69 1.61±0.05
Fructose 11.68±0.47 1.50±0.30 1.47±0.21 5.06±0.74 8.97±0.83 11.31±0.94 10.21±0.28
Galactose 1.80±0.15 0.24±0.02 3.51±0.12 0.49±0.09 0.18±0.02 3.73±0.12 0.11±0.03
α-glucose 0.49±0.03 0.36±0.04 0.77±0.23 0.25±0.02 0.47±0.06 0.30±0.07 0.95±0.05
Mannitol 43.02±0.77 1.10±0.12 3.59±2.26 1.04±0.03 0.00±0.00 7.33±0.15 2.95±0.10
Sorbitol 37.15±1.95 5.75±0.39 7.42±0.05 4.61±0.03 5.15±0.36 9.10±0.14 6.49±0.17
β-glucose 39.19±9.30 17.35±0.46 5.07±0.15 4.26±0.27 1.62±0.35 1.46±0.12 21.82±0.43
Inositol 14.52±0.46 9.13±0.53 8.44±0.03 12.53±0.79 16.51±0.40 18.15±0.12 5.28±0.48
Total(ng/mg) 445.08 226.50 337.73 977.44 317.48± 299 212.78
A: 흰점박이꽃무지성충 글라이코자미노글라칸
B: 흰접박이유충글라이코자미노글라이칸
C: 장수풍뎅이유충글라이코자미노글라이칸
D: 장수풍뎅이성충글라이코자미노글라이칸
E: 사슴벌레성충글라이코자미노글라이칸
Crude C: 장수풍뎅이유충에탄올추출물
Crude E: 사슴벌레성충에탄올추출물
상기 풍뎅이류 곤충글라이코자미노글라이칸은 나무껍질인 섬유소를 갉아먹고 사는 관계로 글리세롤, 만니톨, 자이리톨, 이노시톨등 알콜성 단당류 많이 함유하여 차후 다가알콜성 음료, 술, 제과 등의 식품첨가물로 이용될 수 있다.
< 실시예 3>
곤충 유래 다당류의 지방간 억제 활성 확인
<3-1> 곤충글라이칸간의 지방간 효과 비교
10주령당뇨(C57BL db/db)마우스(평균체중 38.36±0.62 g)가 14주령때 까지 한 달간 각각의 분리정제한 글라이코사미노글라이칸, 즉, 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸(ISG) 5 mg/kg; 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸(GbG) 5 mg/kg , 쇠등에(맹충) 글라이코자미노글라이칸 5 mg/kg의 한 달간 경구 용량투여 마우스 혈청의 빌리루빈(bilirubin)의 혈청수치감소를 확인하였다(표 11).
그리고 해당 간조직 사진(도 6)을 통해 3종의 곤충의 글라이코자미노글라이칸이 간조직의 지방침착을 억제함을 관찰할 수 있었다.
곤충글라이코자미노글라이칸의 한 달 투여 당뇨쥐 혈청 빌리루빈함량
Item Unit/Group CON
(PBS 용액)		 ISG 5 mg/kg GbG 5 mg/kg TbG 5 mg/kg
Bilirubin mg/dL 0.225±0.15 0.175±0.050 0.150±0.058 0.200±0.20
ISG: 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸
GbG: 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸
TbG: 쇠등에(맹충) 글라이코자미노글라이칸
<3-2> 선발된 매미눈꽃동충하초 자실체 메탄올추출물, 매미눈꽃동충하초글라이코자미노글라이칸 , 아카이보스(양성대조)간의 지방간 개선 효과 비교
2차 동물실험으로 매미눈꽃동충하초글라이코자미노글라이칸의 당뇨병의 약이면서 알파글라이코시다제저해제로 생체소장 당분해억제제인 양성대조군인 아카이보스와 간개선효과를 비교하기위하여 C57BL db/db당뇨쥐[7주령시작 33.17±1.08(표준편차)g～11주령까지]에 한 달간 연속 매일 한번 당뇨마우스에 시료투여 후 마지막일에 혈청 data와 병리조직고정, 슬라이드제작, 헤파토실린 & 에오신염색, 현미경검경조사를 실시하였다.
<3-3> 간 내 지질 억제 효과 확인
매미눈꽃동충하초 자실체 메탄올 추출물과 글라이코자미노글라이칸이 혈청 내 중성지질과 총콜레스테롤을 억제하며 빌리루빈수치를 낮게 하는 것을 확인하였다(표 12).
매미눈꽃동충하초글라이코자미노글라이칸 한달투여 비만형당뇨쥐의 혈청변화
Item Unit/
Group		 CON
(PBS 용액)		 ISMC
(20 mg/kg)		 ISG
(5 mg/kg)		 Acarbose
(5 mg/kg)
Total
-bilirubin		 mg/dL 0.57±0.06 0.23±0.13* 0.23±0.12 0.20±0.10*
LDH
 IU/L 12456.00±3267.95 11548.25±2622.50 10385.67±4074.94 5995.00±102.21
Total
-cholesterol		 mg/dL 353.00±14.80 266.25±40.42 274.67±40.80 280.67±47.65
Triglyceride
 mg/dL 311.33±11.24 262.00±23.21* 220.67±12.86* 190.67±21.08*
SGPT
 IU/L 909.67±379.93 616.00±267.48 734.67±167.06 501.67±245.63
ISMC(매미눈꽃동충하초 자실체 메탄올추출물) 20 mg/kg
ISG(매미눈꽃동충하초글라이코자미노글라이칸) 5 mg/kg
Acarbose(아카보스) 5 mg/kg
수치는 평균±표준편차 *대조(무처치)군 대비 유의성(P<0.05).
<3-4> 간 내 지방 축적 억제 효과 확인
조직병리학적 관찰에서는 선천적 당뇨쥐에 기인한 지방간세포가 대조군을 비롯한 전 실험군에서 관찰되었으며, 곤충에서 추출분리정제한 정제물(매미눈꽃동충하오글라이코자미노글라이칸 5 mg/kg 또는 매미눈꽃동충하초메탄올추출물 20 mg/kg)을 경구 투여시, 당뇨병성비만쥐(db)의 간조직을 둘러싸고 있는 지방알갱이들이 줄어 30% 정도의 지방간억제, 간조직의 지방침착억제를 관찰할 수 있었다(도 7, 표 13).
매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸 , 매미눈꽃동충하초자실체메탄올추출물의 한 달경구투여한 비만형당뇨 마우스의 간조직병리조직학적 관찰

Sex
Organs
 Pathologic finding
Dose (g/kg)
0 (CON) ISG ISMC Acarbose
Male Liver(당뇨쥐) 10a 7a3c 7a3c 10a
a: 조직 중심 부분의 약간 변성되고 팽창한 혈관과 함께 부푼 간세포들
c: 약간 변성된 조직 일부와 간세포의 지방변화
ISMC(매미눈꽃동충하초 자실체 메탄올추출물) 20 mg/kg
ISG(매미눈꽃동충하초글라이코자미노글라이칸) 5 mg/kg
Acarbose(아카보스) 5 mg/kg
<3-5> 혈관내피세포 부착인자 저해효과
발부종(염증) 모델 쥐를 만들기 위해 SD rat 170.7±3.6 g 웅성 쥐 발바닥에 Freund's adjuvant complete(CFA)로 주사로 발적 및 부종을 가진 염증을 유도하면서 곤충글라이코자미노글라이칸(GAG)을 3일간 투여하여 혈관내피성염증에 혈청시료를 적용하여 보았다. 누에수번데기글라이코자미노글라이칸(SPG), IGPCG, 호박벌유충번데기 들어낸 봉군껍질 글라이코자미노글라이칸); 서뒤일GAG (BTWG, 서양뒤영벌일벌글라이코자미노글라이칸) (p<0.05 vs CFA) 각각10 mg/kg, 인도메타신 1.5 mg/kg을 만성관절염모델 쥐CFA 발부종에 대해 총3일간 시료를 투여하고 도태시킨 랫트 혈청에서 전술한 방법과 같이 고마바이오텍의 VCAM-1(Millipore, USA), ICAM-1(Millipore, USA), MMP-2(Chemicon, USA), MMP-9(Chemicon, USA)을 키트매뉴얼에따라 실시한 결과 도 8과 같이 염증유발한 CFA에 비해 혈관내피세포부착인자인 VCAM-1, ICAM-1이 각 글라이코자미노글라이칸에 의해 억제되어 피가 둔탁해진 고지혈증억제기능 으로 혈관내피에 각종 염증성 혈관질환에 유용하게 사용되어질 수 있으며 암 또는 염증의 표지인자인 matrix metalloprotease 2와 9(MMP-2, MMP-9) 저해효과를 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 곤충 글라이코사미노글리칸은 지방간 또는 고지혈증의 예방, 치료/개선의 목적으로 사용할 수 있다. 본 발명의 글라이코사미노글리칸은 새로운 지방간 또는 고지혈증의 치료제의 개발에 유용하게 이용될 수 있는 효과를 가진다.

Claims (6)

  1. 곤충유래 글라이코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 및 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 곤충은 누에수번데기, 쇠똥구리, 매미눈꽃동충하초, 귀뚜라미, 호박벌여왕벌, 서양뒤영벌여왕벌, 쇠등에(맹충), 호박벌 봉군껍질, 호박벌유충번데기봉군껍질, 서양뒤영벌일벌, 누에(Bomyx mori), 누에수번데기, 광대노린재(노린재류, Poecilocoris lewisi), 흰점박이꽃무지성충( Protaetis brevitarsis)과 유충, 장수풍뎅이유충, 장수풍뎅이 성충 및 사슴벌레 성충으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 지방간은 알코올성 또는 비알콜성 지방간인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 곤충 유래 글라이코사미노글리칸을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물.
  5. 곤충 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 및 치료용 조성물.
  6. 곤충 추출물을 유효성분으로 포함하는 고지혈증 예방 및 치료용 조성물.
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