KR20130027989A - 모나스커스속균을 이용한 검정콩 발효물을 이용한 비만개선제 - Google Patents

모나스커스속균을 이용한 검정콩 발효물을 이용한 비만개선제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 검정콩에 모나스커스속균 배양액을 접종하고 발효시켜 얻은 검정콩 발효물의 추출물로부터 분리한 하기 다이드진 또는 제니스틴을 유효성분으로 포함하는 비만개선제에 대한 것이다. 상기 물질은 인슐린에 의해 분화 촉진된 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 억제하고 지방의 축적을 억제 활성을 가지고 있다.

Description

모나스커스속균을 이용한 검정콩 발효물을 이용한 비만개선제{COMPOSITON FOR IMPROVING OBESITY USING BLACK SOYBEAN FERMENTATION BY MONASCUS SP.}
본 발명은 모나스커스속균을 이용한 검정콩 발효물의 추출물로부터 분리한 유효 물질을 이용한 비만 개선제에 관한 것이다.
최근 경제 발전에 따른 생활 수준의 향상, 바쁜 생활 환경에 따른 운동 부족, 영양의 과잉 섭취 등으로 비만 인구가 급속히 늘고 있다. 우리나라의 비만 인구 비율은 성인 여성의 경우 1995년 11.7%이던 것이 2001년 29.4%, 성인 남성의 경우 1995년 18.0%이던 것이 2001년 32.6%로 빠른 증가세를 보이고 있다(보건복지부, 2007).
비만은 에너지의 섭취와 소모의 불균형으로 인하여 체내에 에너지가 과잉으로 축적되어 지방조직이 비정상적으로 증가된 상태를 말한다(Clinical Endocrinology 28:675-689, 1998; Clinical Obesity (eds. Kopelman PG, Stock MJ) 248-89 (Blackwell Science, Oxford 1998). 임상적으로는 남자는 체지방이 체중의 25%, 여자는 체중의 30% 이상일 때 비만으로 보며, 임상적으로는 BMI(Body Mass Index: 체질량지수)가 30.0 이상인 경우를 비만으로 정의한다.
비만의 원인으로는 고지방·고열량의 식생활, 바쁜 사회적 환경에 따른 운동 부족, 내분비 이상 등 환경적 요인과 유전적 요인을 들 수 있는데, 이 중 비만의 50 내지 70% 정도가 환경적 요인에 의한 것으로 알려져 있고, 나머지가 유전적 요인에 의한 것으로 알려져 있다.
체내 에너지는 지방세포에 중성지방(triglyceride) 형태로 저장되었다가 체내 에너지원이 고갈되면 저장되었던 지방이 유리지방산과 글리세롤로 분해되어 에너지원으로 사용되게 되지만, 에너지의 과잉 섭취는 지방세포의 분화를 촉진하고 체내 저장 지방량을 증가시켜 비만의 직접적인 원인이 된다.
지방세포는 지방전구세포로부터 분화하여 만들어지는데, 이러한 전구지방세포의 분화를 억제하면 지방세포수의 증가를 막을수 있고 지방세포와 더불어 발생하는 지방량의 축적도 억제시킬수 있다.
따라서 지방전구세포의 지방세포로의 분화 억제 및/또는 지방세포에서 지방 축적을 억제하는 활성을 나타내는 것을 비만 개선제로 활용될 수 있으며, 유효성분으로서 징코라이드 에이(ginkgolide A) 또는 빌로발라이드(bilobalide)를 개시하고 있는 대한민국 특허 제920648호, 유효성분으로서 진세노사이드(ginsenoside)-Rf 또는 화합물 K(Compound K)를 개시하고 있는 대한민국 특허 제847252호, 유효성분으로서 올티프라즈를 개시하고 있는 대한민국 특허 제576157호 등이 이러한 예에 속한다.
홍국(red yeast rice, red koji)은 붉은색의 사상균인 모나스커스(Monascus)속의 균을 곡류에 접종하여 제조한 것이다. 이 균은 중국을 중심으로 동아시아의 여러 지역에서 천연의 식품 착색제나 가공품 및 소화 촉진과 혈류 개선의 소재로서 오랫동안 사용되어 왔다.
본 발명은 모나스커스속균을 이용한 검정콩 발효물의 추출물로부터 분리한 유효 물질이 지방세포의 분화 억제 및 지방 축적 억제 활성을 가진다는 점에 기초하여 완성된 것이다.
대한민국 등록특허공보 제10-920648호 대한민국 등록특허공보 제10-847252호
본 발명의 목적은 모나스커스속균을 이용한 검정콩 발효물의 추출물로부터 분리한 유효물질을 이용한 비만 개선제 조성물을 개시하는 데 있다.
본 발명은 모나스커스속균을 이용한 검정콩 발효물의 추출물로부터 분리한 화합물인 다이드진(daidzin)과 제니스틴(genistin)이, 인슐린에 의해 분화 촉진된 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 억제하여 지방의 축적을 억제하는 활성을 확인함으로써 완성된 것이다.
본 발명은 검정콩에 모나스커스속균 배양액을 접종하고 발효시켜 얻은 검정콩 발효물의 추출물로부터 분리한 하기 화학식 1의 다이드진(daidzin) 또는 화학식 2의 제니스틴(genistin)을 유효성분으로 포함하는 비만개선제를 제공한다:
Figure pat00001
Figure pat00002
상기 모나스커스속균은 모나스커스 퍼푸레우스(M. purpureus), 모나스커스 필로수스(M. pilosus), 모나스커스 루버(M. ruber) 및 모나스커스 카올리앙(M. kaoliang) 중에서 선택될 수 있다.
상기 비만 개선제는 약제학적 조성물일 수 있다.
상기 비만 개선제는 식품 조성물일 수 있다.
본 명세서에서, 상기 "추출물"이란 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 조추출물과 그 추출물을 상기 열거한 용매 중 하나 이상으로 분획하여 얻어진 분획물을 말한다. 추출 방법은 유효성분의 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사 등 임의의 방식이 적용될 수 있다. 분획된 추출물의 경우 상기 조추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카 겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다.
또한 본 명세서에서, 상기 "비만"이란, 그것이 유전적 요인에 의한 비만이든 또는 환경적 요인에 의한 비만이든 지방조직이 비정상적으로 증가된 상태를 의미하며, 체질량지수의 구분에 따른 비만(BMI이 30.0 이상인 경우)과 과체중(BMI이 25~30인 경우)을 포함하는 의미이다.
또한 본 명세서에서, 상기 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
또한 본 명세서에서, 상기 "비만 개선"이란 비만의 예방, 비만의 치료를 포함하여, 체지방의 감소 및/또는 체중의 감소를 포함하는 의미이다.
본 발명의 비만 개선제 조성물은 그 유효성분을 비만 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.990 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 비만 개선 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 모나스커스속균을 이용한 발효물의 추출물로부터 분리한 상기 [화학식 1]의 화합물 및/또는 [화학식 2]의 화합물을 유효성분으로 포함하는 다이어트용 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 "다이어트"란 체중 상태가 비만이나 과체중은 아니지만 미용이나 건강 목적으로 체중/체지방의 감소가 바람직하거나 필요한 상태로서 정의된다. 통상 본 발명의 다이어트용 조성물은 정상인의 미용이나 건강 목적으로 사용하기 위하여 제조·사용될 것이다.
본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강 보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.
감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.
풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.
생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.
미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.
이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.
사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.
사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.
사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.
사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.
또한 본 발명의 식품 조성물은 향미나 기호성을 향상시키고 그 기능성을 상승 보강하거나 다른 기능성(예컨대 지방간 개선 활성, 숙취 해소 활성 등)을 부가하기 위하여 이미 비만 개선 활성이나 간 기능 개선 활성 등이 있다고 알려진 임의의 천연물 유래의 분말 또는 추출물을 포함할 수 있는데, 선지 분말 또는 추출물, 콩나물 분말 또는 추출물, 조개 분말 또는 추출물, 굴 분말 또는 추출물, 산미나리 분말 또는 추출물, 무 즙 또는 추출물, 오이 즙 또는 추출물, 부추 즙 또는 추출물, 시금치 즙 또는 추출물, 연근 즙 또는 추출물, 칡 즙 또는 추출물, 솔잎 즙 또는 추출물, 인삼 즙 또는 추출물, 백화사설초 분말 또는 추출물, 감초 분말 또는 추출물, 갈화 분말 또는 추출물, 갈근 분말 또는 추출물, 사인 분말 또는 추출물, 박 분말 또는 추출물, 생강 분말 또는 추출물, 대추 분말 또는 추출물, 인진 분말 또는 추출물, 지구자 분말 또는 추출물, 수비계 분말 또는 추출물, 백출 분말 또는 추출물, 저령 분말 또는 추출물, 진피(진귤의 껍질) 분말 또는 추출물, 구기자 분말 또는 추출물, 녹차 분말 또는 추출물, 오미자 분말 또는 추출물, 헛개나무 추출물, 지치 추출물, 노근 추출물, 계피 추출물, 데커시놀 등이 예시될 수 있다. 상기에서 추출물의 의미는 밀겨 추출물과 관련하여 앞서 설명한 바와 같다. 이러한 추출물은 추출 대상을 혼합하여 얻어질 수도 있다.
본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.
상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다 의미이다.
약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등) 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.
부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 경우에 따라서는 국소적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 비만 개선제 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 비만 개선제 조성물등은 기능성 식품, 약품 등으로 제품화될 수 있다.
도 1은 모나스커스속균을 이용한 검정콩 발효물의 추출물로부터 [화학식 1]의 화합물과 [화학식 2]가 분리되는 과정을 보여주는 결과이다.
도 2은 [화학식 1]의 화합물과 [화학식 2]의 화합물을 포함하는, 모나스커스속균을 이용한 검정콜 발효물의 추출물이 농도 의존적으로 지방세포의 지방 축적 억제 활성을 가짐을 보여주는 결과이다.
도 3는 모나스커스속균을 이용한 검정콜 발효물의 추출물 중 부탄올 분획에서 농도 의존적으로 지방세포의 지방 축적 억제 활성을 가짐을 보여주는 결과이다.
도 4는 [화학식 1]의 화합물이 농도 의존적으로 지방세포의 지방 축적 억제 활성을 가짐을 보여주는 결과이다.
도 5는 [화학식 2]의 화합물이 농도 의존적으로 지방세포의 지방 축적 억제 활성을 가짐을 보여주는 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 모나스커스속균 배양
한국종균협회에서 분양받은 Monascus pilosus KCCM 60084를 사용하였다. 상기 균주를 PDA배지(potato dextrose agar, Difco, MI, USA)를 이용하여 28℃에서 4일 배양한 다음, S-INAE 배지(쌀가루 2,0g, 글루코오스 3.0 g, 펩톤 2.0 g, KH2PO4 0.8 g, MgSO4ㅇ7H2O 0.05 g, 소듐니트레이트 0.2 g, NaCl 0.1 g, d-워터 100 mL, pH 6.0)를 넣은 캡시험관에, 앞서 언급한 균주를 이식하여 30℃의 쉐이킹 인큐베이터(150 rpm)에서 10일간 배양한 후, 동일 배지 1 L에 접종하여 Jar Fermenter(Value kio-Reactor, kiotron, Korea)에서 30℃를 유지하면서 10일간 통기 배양하여 스타터로 사용하였다.
[실시예 2] 모나스커스속균을 이용한 검정콩 발효물의 제조
검정콩은 2010년에 수확한 것을 시중에서 구입하여 사용하였다. 상기 검정콩을 3배수의 물에 16시간 침지한 후 분쇄하여 탈수한 후, 함유 수분함량을 50 ~60%로 하여 분쇄한 다음 90~120분 증자한 다음 실시예 1의 배양 종균을 5 중량% 접종하였다. 그 다음 이 혼합물을 20일간 항온 항습기에서 28℃로 고정하여 일식 개무 밧드를 이용하여 고체 배양하였다. 발효물의 성상은 종전의 발효물과 비교하여 색상이 더욱 뚜렷하게 붉은 빛을 띄운다. 이하에서는 모나스커스속균을 이용한 검정콩의 발효산물을 "B2MA"라 부르기로 한다.
[실시예 3] B2MA 발효산물의 추출물로부터 항비만 활성을 갖는 유효성분의 분리
실시예 2의 B2MA에 에탄올을 가하고 24시간 3회 냉침 추출 하였다. 추출액을 여과한 후에 여액을 감압 농축기를 이용하여 에탄올 추출물을 얻었으며, 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 CH2Cl2로 용매 분획한 후 물층에 대해서 다시 부탄올로 용매 분획하였다. 이들 분획물 중에서 항비만 활성을 나타낸 부탄올 층을 감압상태에서 증발시켜 부탄올 추출물을 얻었고, 부탄올 분획(G44-17-5)에 대하여 극성도가 유사한 화합물군으로 나누고자 XAD-7 레진을 이동상 MeOH/H2O를 이용하여 크로마토그래피를 진행하여 6개의 소분획 (G44-35-1 ~ 6)으로 나누었다. 이들 소분획중 G44-35-5에 대하여 실리카겔을 이동상 CHCl3/MeOH/H2O (15:4:1, 10:3:1, 10:5:1, 6:4:1; 하층을 이동상으로 사용)의 스텝와이즈 그래디언트(stepwise gradient)로 크로마토그래피를 진행하여 7개의 소분획 (G44-36-1 ~ 7)을 얻었으며, G44-36-4 분획에 대하여 RP-18 크로마토그래피를 진행하여 2 종의 화합물 (화합물 1과 2)을 분리하였다.
상기 화합물 1과 2의 분리 과정의 모식도를 도 1에 도시하였다.
[실시예 4] B2MA 발효산물의 추출물로부터 분리한 항비만 활성을 갖는 유효성분의 동정
4-1: 화합물 1의 동정
상기 분리한 화합물 1에 대해 물리화학적 및 분광학적 분석을 실시하였다.
Colourless needles; ESIMS (negative mode) m/z 415 [M - H]-;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ : 8.39 (1H, s, H-2), 8.05 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-5), 7.41 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-2', 6'), 7.23 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-8), 7.14 (1H, dd, J = 2.3, 8.6 Hz, H-6), 6.82 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-3', 5'), 5.17 (1H, d, J = 3.9 Hz, OH-3"), 5.11 (1H, d, J = 7.0 Hz, H-1"), 3.72 (1H, m, H-6"), 3.47 (2H, m, H-5", 6"), 3.31 (2H, m, H-2", 3"), 3.17 (1H, t, J = 9.0 Hz, H-4");
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ : 174.7 (C-4), 161.4 (C-7), 157.3 (C-4'), 157.0 (C-9), 153.3 (C-2), 130.1 (C-2', 6'), 127.0 (C-5), 123.7 (C-3), 122.3 (C-1'), 118.5 (C-10), 115.6 (C-6), 115.0 (C-3', 5'), 103.4 (C-8), 100.0 (C-1"), 77.2 (C-2"), 76.5 (C-3"), 73.1 (C-4"), 69.6 (C-5"), 60.6 (C-6").
화합물 1은 무색의 침상결정(colourless needles)의 형태로서 FeCl3 테스트에 양성을 나타내었고, ESI-MS (m/z 415 [M - H]-)로부터 분자량은 416 amu로 확인하였다. 1H-NMR 스펙트럼에서는 δ 8.39 (1H, s)에서 나타나는 프로톤 신호는 전형적인 이소플라본(isoflavone)의 2번 프로톤임을 알 수 있었으며, δH 7.41 (2H, d, J = 8.6 Hz)과, δH 6.82 (2H, d, J = 8.6 Hz)의 프로톤 신호를 4'위치가 치환된 B-링의 ortho 커플링 (J = 8.6 Hz)에 기인한 것으로 δ 7.41의 프로톤 신호를 2'과 6'위치의 수소로, δ 6.82의 프로톤 신호를 3'과 5'위치의 수소로 추정하였다. 또한 δH 8.05 (1H, d, J = 8.6 Hz)과 δH 7.14 (1H, dd, J = 8.6, 2.3 Hz) 및 δH 7.23 (1H, d, J = 2.3 Hz)의 프로톤 신호들은 7-oxygenated A-링에서 나타나는 ABX 타입의 프로톤 신호로 ortho 커플링하는 δH 8.05의 프로톤 신호를 5위치의 수소로, ortho 커플링 및 meta 커플링 (J = 2.3 Hz)을 하는 δH 7.14의 프로톤 신호를 6위치의 수소로, meta 커플링 (J = 2.3Hz)하는 δH 7.23의 프로톤 신호를 8위치의 수소로 추정하였다. 또한, δH 5.11-3.17 범위에서 당에 기안하는 신호를 확인하였다. 13C-NMR 스펙트럼에서는 4번 탄소에 기인하는 탄소 신호를 δC 174.7에서 확인하였으며, 이 탄소 신호의 위치로 보아 이 화합물은 5-deoxyflavone임을 추정할 수 있었다. 또한, δC 130.1 및 115.0에서 나타나는 탄소 신호는 4'-C가 치환되어서 기인하는 2 탄소 세기의 비치환 방향족 탄소(unsubstitued aromatic carbon)로써, δC 130.1에 나타나는 탄소 신호를 2', 6' 탄소로, δC 115.0에 나타나는 탄소 신호를 3', 5'탄소로 동정할 수 있었다. 이상의 결과를 종합하여 문헌(Kor. J. Pharmacogn., 2009 40(1), 46-50, Anti-proliferative Components in the Roots Extract from Pueraria thunbergiana)과 비교 검토한 결과 화합물 1의 화학구조는 [화학식 1]의 다이드진(daidzin)으로 결정하였다.
4-2: 화합물 2의 동정
상기 분리한 화합물 2에 대해 물리화학적 및 분광학적 분석을 실시하였다.
Colourless needles; ESIMS (negative mode) m/z 431 [M - H]-;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ : 12.9 (1H, s, OH-5), 8.43 (1H, s, H-2), 7.40 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-2', 6'), 6.82 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-3', 5'), 6.72 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8), 6.47 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-6), 5.06 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-1"), 3.71 (1H, m, H-6"), 3.46 (2H, m, H-5", 6"), 3.27 (2H, m, H-2", 3"), 3.17 (1H, t, J = 8.1 Hz, H-4");
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ : 180.5 (C-4), 163.0 (C-7), 161.6 (C-5), 157.5 (C-9), 157.2 (C-4'), 154.5 (C-2), 130.2 (C-2', 6'), 122.6 (C-3), 121.0 (C-1'), 115.1 (C-3', 5'), 106.07 (C-10), 99.8 (C-1"), 99.6 (C-6), 94.5 (C-8), 77.2 (C-5"), 76.4 (C-3"), 73.1 (C-2"), 69.6 (C-4"), 60.6 (C-6").
화합물 2는 무색의 침상결정(colourless needles)의 형태로서 FeCl3 테스트에 양성을 나타내었고, ESI-MS (m/z 431 [M - H]-)로부터 분자량은 432 amu로 확인하였다. 1H-NMR 스펙트럼에서는 δH 8.43 (1H, s)에서 나타나는 프로톤 신호는 전형적인 이소플라본(isoflavone)의 2번 프로톤임을 알 수 있었으며, δH 7.40 (2H, d, J = 8.6 Hz)과 δ 6.82 (2H, d, J = 8.6 Hz)의 프로톤 신호는 4'위치가 치환된 B-링의 2'와 3' 및 5'와 6'수소의 ortho 커플링에 기인한 것으로 δH 7.40의 프로톤 신호를 2'과 6'위치의 수소로, δH 6.82의 프로톤 신호를 3'과 5'위치의 수소로 추정하였다. 또한 δH 6.72 (1H, d, J = 2.2 Hz)과 δH 6.47 (1H, d, J = 2.20 Hz)의 프로톤 신호는 5 및 7위치가 치환된 A-ring의 6 및 8위치의 수소가 meta 커플링하는 것에 기인하는 것으로 보아 δH 6.72의 프로톤 신호를 8위치의 수소로, δH 6.47의 프로톤 신호를 6위치의 수소로 추정하였다. 또한, δH 5.06-3.17 범위에서 당에 기안하는 신호를 확인하였다. 13C-NMR 스펙트럼에서는 4번 탄소에 기인하는 탄소 신호를 δC 180.5에서 확인하였으며, 따라서 이 화합물은 5번 탄소가 치환되어 있는 것을 확인할 수 있었으며 δC 130.2 및 δ 115.1에 나타나는 탄소 신호는 4'-탄소가 치환되어서 기인하는 2 탄소 세기의 비치환 방향족 탄소(unsubstitued aromatic carbon)로써, δC 130.2에 나타나는 탄소 신호를 2', 6' 탄소로, δC 115.1에 나타나는 탄소 신호를 3', 5' 탄소로 동정할 수 있었다. 이상의 결과를 종합하여 문헌(Kor. J. Pharmacogn., 2010 41(3), 180-184, DPPH Free Radical Scavenging Effect of the Aerial Parts of Desmodium oldhami)과 비교 검토한 결과 화합물 2의 화학구조는 [화학식 2]의 제니스틴(genistin)으로 결정하였다.
[실험예] B2MA 발효산물 추출물의 분획물과 그 분획물로부터 분리한 화합물의 비만 개선 활성 실험
마우스 전구지방세포인 3T3-L1은 10 % BCS DMEM 배지를 넣고 37℃, 5 % CO2 의 조건에서 배양하였다.
3T3-L1 전구지방세포를 24 웰플레이트에 5X104/well의 세포수로 분주한 후 100% 컨플루언시(confluency) 시점이 되면 2일 동안 더 유지시켰다. 전구지방세포는 MDI(0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 1 uM dexamethasone, 1 ug/ml insulin)를 포함하는 10% FBS DMEM 배지로 지방세포 분화를 2일 동안 유도하였고, 배양 48 시간 후, 1 ug/ml 인슐린이 함유된 10% FBS DMEM으로 이틀 동안 배양하였다. 그 후 2일 마다 4일 동안 10% FBS DMEM 배양액으로 교체하였다. 지방세포 분화 유도 동안 시료(분획 G44A 80% 메탄올층, G44A 부탄올 층 분획물 그리고 화합물 1과 2)를 각 배양액에 농도별로 처리하였고, 분화가 완성되는 시점인 8일째에 지방세포 분화 정도를 관찰하였다. 지방세포 분화 정도는 Oil Red O 염색을 통해 1차적으로 현미경을 통해 확인하였고, 지방세포 염색 정도는 510 nm 흡광도에서 세포의 분화된 지방량을 측정하였다.
도 2, 3, 4 및 5를 참조하여 보면 모든 시료가 농도 의존적으로 전구지방세포가 지방세포로의 분화 억제 활성을 가짐을 알 수 있다.
[제조예] B2MA 발효산물 추출물을 함유한 기능성 식품 조성물
B2MA 발효산물 추출물인 다이드진과 제니스틴을 각각 정제수로 희석(1:1 희석)하여 분사가 잘 될 수 있도록 하였다. 액상의 분사 압력은 2.0 바(bar)이며, 분사 후 분말혼합물을 과립화한 다음 적정 수분 함유량까지 건조하였다. 건조된 과립은 고속혼합기(미원 중기, 20L용)로 분쇄하여 분말화하여 제조하였다.
통상의 건강 음료 제조방법에 따라, 하기 표 1 및 2의 비율대로 각 성분을 혼합하고 여기에 정제수를 가하여 전체를 100 ml로 만들어서 음료를 제조하였다.

성분 함량
실시예4의 다이드진 10 g
구연산 20 mg
올리고당 5 g
비타민 C 50 mg
성분 함량
실시예4의 제니스틴 10 g
구연산 20 mg
올리고당 5 g
비타민 C 50 mg

Claims (4)

  1. 검정콩에 모나스커스속균 배양액을 접종하고 발효시켜 얻은 검정콩 발효물의 추출물로부터 분리한 하기 화학식 1의 다이드진(daidzin)을 유효성분으로 포함하는 비만개선제:

    [화학식 1]
    Figure pat00003

  2. 검정콩에 모나스커스속균 배양액을 접종하고 발효시켜 얻은 검정콩 발효물의 추출물로부터 분리한 하기 화학식 2의 제니스틴(genistin)을 유효성분으로 포함하는 비만개선제:

    [화학식 2]
    Figure pat00004
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 모나스커스속균은 모나스커스 퍼푸레우스(M. purpureus), 모나스커스 필로수스(M. pilosus), 모나스커스 루버(M. ruber) 및 모나스커스 카올리앙(M. kaoliang) 중에서 선택된 것인 비만개선제.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비만 개선제는 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 비만개선제.







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