KR20130024419A - 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법 - Google Patents

폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폐글리세롤(crude glycerol)을 이용하여 수소를 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 통성 혐기성 미생물을 고정화 담체에 고정화시키고 혐기성 조건에서 폐글리세롤(crude glycerol)을 포함하는 배지에서 상기 고정화된 통성 혐기성 미생물을 배양시켜 수소를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법{METHOD FOR PRODUCING HYDROGEN USING CRUDE GLYCEROL}
본 발명은 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법에 관한 것이다.
화석 연료의 제한된 매장량에 따라, 전세계적으로 이를 대체할 친환경적 에너지에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 이러한 추세에 따라 바이오 디젤 산업이 크게 성장하고 있다. 바이오 디젤 시장이 성장할수록, 그 부산물 중 하나인 폐글리세롤(crude glycerol)은 상당한 양이 발생되고 있지만, 현재 90%이상의 폐글리세롤은 사용되지 않고 버려져 2차적 환경오염이 일어나고 있다.
글리세롤은 미생물과의 반응을 통해 수소, 에탄올, 1,3-프로판다이올 및 숙신산 등으로 전환이 가능한 특징이 있다. 특히 생성물 중 수소는 연료로써 우수한 특성뿐만 아니라 연소 후 이산화탄소(CO2), 황산화물(SOX) 및 질산화물(NOX) 등의 지구 온난화 가스를 발생시키지 않는 청정 연료로 각광 받고 있다.
현재 대부분의 수소는 화석 연료를 기반으로 하는 공정을 통해 생산되고 있다. 상기 화석 연료를 기반으로 하는 공정을 통한 수소 생산 공정은 높은 온도 등 까다로운 공정 과정이 필요하며 추가적인 환경 오염을 유발할 수 있는 단점이 있다. 반면 생물학적 수소 생산 공정은 열화학적 및 전기화학 공정에 비해 수소를 생산하는데 적은 에너지를 필요로 하며 친환경적인 장점이 있다. 그러나 화석 연료를 기반으로 하는 공정에 비하여 수소 생산 속도와 수율이 낮은 단점이 있다.
생물학적으로 수소를 생산하는 공정은 크게 두 가지로 나눌 수 있으며, 첫째, 빛을 이용한 광합성 과정인 명반응에 의한 수소 생산(photosynthetic hydrogen production), 즉 명반응과 둘째, 암발효(dark fermentation)를 이용한 방법이 있다.
상기 명반응은 빛을 쬐어 물 및 부수적인 CO2를 저감시킴으로써 수소를 생산할 수 있는 방법이다. 상기 암발효(dark fermentation)는 혐기성 조건에서 다양한 유기 탄소에서 수소를 생산하기 위해 발효 세균을 이용하는 방법이다. 일반적으로 암발효는 빛의 전환 효율에 제한이 있는 명반응 보다 상대적으로 수소 생산 속도가 우수하고, 공정설비가 간단한 장점이 있다.
그러나 대한민국 특허공개번호 제2009-0082779호에 기재된 바와 같이 상기 암발효가 가능한 통성 혐기성 미생물을 이용하여 글루코스(glucose)에서 수소를 생산하는 다양한 연구가 진행되고 있으나, 폐글리세롤(crude glycerol)로부터 효율적으로 수소를 생산하는 연구는 활발하게 이루어지지 않고 있다.
대한민국 특허공개번호 제2009-0082779호
본 발명은 바이오 디젤의 사용량에 비례하여 늘어나는 폐글리세롤(crude glycerol)을 사용하여 최적화된 담체에 고정화된 통성 혐기성 미생물이 최적화된 반응 조건하에서 우수한 생산 효율로 수소를 생산하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 호기성 조건에서 통성 혐기성 미생물을 배양시키는 단계; (b) 상기 통성 혐기성 미생물을 고정화 담체에 고정화시키는 단계; 및 (c) 혐기성 조건에서 폐글리세롤(crude glycerol)이 포함되는 배지에서 상기 고정화된 통성 혐기성 미생물을 배양시키는 단계가 포함되는 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법을 제공한다.
본 발명의 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법에 따르면, 종래의 고온 및 복잡한 반응단계들이 필요한 화학적 방법을 이용한 수소 생산방법, 또는 반응시간이 200~300시간으로 상대적으로 길고 반응 조건이 까다로운 명반응을 이용한 수소 생산방법 보다 반응 조작 및 유지가 쉬운 환경에서 반응이 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 수소 생산방법은 글루코스를 탄소원으로 하는 생산방법 또는 명반응 미생물을 이용한 생산방법에 비해 공정이 간편하고, 경제적이며, 수소 생산 효율을 높일 수 있고, 폐글리세롤을 사용하여 수소를 생산함으로써 친환경적인 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 수소 생산 과정에 대한 모식도이다.
도 2는 고정화 담체의 종류 및 농도에 따른 수소의 발생량을 나타내는 그래프이다.
도 3은 고정화된 미생물의 함량에 따른 수소의 발생량을 나타내는 그래프이다.
도 4는 고정화된 미생물의 함량에 따른 수소의 발생량을 나타내는 그래프이다.
도 5는 고정화된 미생물 및 유리 미생물의 수소 발생량을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 (a) 호기성 조건에서 통성 혐기성 미생물을 배양시키는 단계; (b) 상기 통성 혐기성 미생물을 고정화 담체에 고정화시키는 단계; 및 (c) 혐기성 조건에서 폐글리세롤(crude glycerol)이 포함되는 배지에서 상기 고정화된 통성 혐기성 미생물을 배양시키는 단계를 포함하는 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법을 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 수소 생산 과정을 나타내는 모식도로서, 미생물을 고정화 담체에 고정시키고, 고정된 미생물을 폐글리세롤이 포함된 배지에 배양시켜 수소를 생산하는 과정을 나타낸다. 구체적으로 37℃의 호기성 조건에서 200rpm으로 교반하여 통성 혐기성 미생물을 배양시키고, 배양된 미생물을 흡착법(Adsorption) 또는 포괄법(Entrapment)으로 고정화시키는 단계를 거쳐, 고정된 미생물을 pH6.5, 37℃, 혐기성 조건에서 150rpm으로 교반하며 폐글리세롤이 포함된 배지에서 배양함으로써, 수소를 생산하는 과정을 나타낸다.
바이오 디젤은 바이오 에탄올과 더불어 화석연료를 대체할 수 있는 액체 연료 에너지원으로서 각광받고 있다. 상기 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법은 상기 바이오 디젤을 생산하는 공정에서 부산물로 고농도의 글리세롤을 포함하는 폐액이 발생하게 되며, 상기 글리세롤 즉, 폐글리세롤을 포함하는 배지에서 통성 혐기성 미생물을 배양하여 그에 대한 부산물로 수소를 생산하는 것이다.
상기 (a) 단계는 호기성 조건에서 미생물을 배양시키는 단계로서, 상기 미생물은 미생물은 통성 혐기성 미생물(facultative anaerobes)을 사용하며, 구체적으로 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes) 또는 대장균(Escherichia coli) 등이 있으며, 보다 바람직하게는 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes)인 것이 좋다. 상기 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes) 및 대장균(Escherichia coli)은 글루코스(glucose) 뿐만 아니라 글리세롤(glycerol)을 수소로 전환시킬 수 있으며, 특히 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes)는 글리세롤(glycerol)에 의한 수소 발생량이 글루코스(glucose)에 의한 수소 발생량 보다 많아 글리세롤을 이용하여 수소를 발생시키는데 이용되는 통성 혐기성 미생물로서 우수한 수소 발생량을 나타낸다.
상기 호기성 조건에서 배양시킨 통성 혐기성 미생물의 흡광도(Optical density, O.D.)가 600nm의 파장에서 1.5 내지 2.0인 것이 바람직하다. 상술한 범위를 만족할 경우, 상기 통성 혐기성 미생물이 미생물생장곡선의 지수성장기로서 미생물에 의한 수소 생산성이 우수하며, 상기 미생물의 O.D.가 2.0을 초과할 경우, 상기 미생물이 생장과정 중 유지기 단계에 해당하게 되어 고정화 시 미생물의 활성이 감소하고, 수소의 생산성이 저하되는 문제점이 있다.
상기 통성 혐기성 미생물을 고정화 담체에 고정화시키는 단계를 거쳐 고정화된(immobilized) 통성 혐기성 미생물은, 유리(free) 미생물에 비하여 미생물의 재이용을 용이하게 하고, 활성을 증대시키며, 활성을 유지시키는 것이 유리하다.
상기 통성 혐기성 미생물을 고정화 담체에 고정시키는 단계는, 상기 통성 혐기성 미생물 및 고정화 담체를 가열하고, 냉각시켜 고정화시키는 것이 바람직하고, 구체적으로 흡착법(Adsorption) 또는 포괄법(Entrapment)에 따르는 것이 좋다.
구체적으로 상기 흡착법(Adsorption)에 의한 고정화 단계는 상기 통성 혐기성 미생물 및 고정화 담체를 가열하며 혼합하고, 냉각시키는 과정을 통해 이루어진다. 이후, 미생물이 고정화된 담체를 원하는 크기로 잘라(cutting way) 혐기성 조건에서 미생물을 배양할 수 있다. 또한, 상기 포괄법(Entrapment)에 의한 고정화 단계는 상기 통성 혐기성 미생물 및 고정화 담체를 가열하며 혼합하고, 냉각시키는 과정을 통해 이루어진다.
이때, 상기 가열은 140 내지 170℃ 조건으로 가열시키는 것이 바람직하다. 상기 통성 혐기성 미생물 및 고정화 담체의 혼합 시 온도가 140℃ 미만인 경우 냉각시키기 전에 경화가 시작되어 고정화된 미생물의 수율이 낮아지며, 수소 생산성에 영향을 미치고, 온도가 170℃를 초과할 경우 미생물의 활성이 감소되어 수소 생산성이 저하되는 문제점이 있다.
또한, 상기 포괄법에서 가열된 미생물 및 고정화 담체를 냉각은 -10℃ 내지 25℃ 오일(oil)에서 60분 이하로 침적시켜 상기 통성 혐기성 미생물을 고정화 담체에 고정화시키 것이 바람직하다. 상기 오일은 특별히 한정되지 않지만, 올리브오일 등을 사용할 수 있으며, 통성 혐기성 미생물 및 고정화 담체를 냉각시키기 위하여 침적하기 전 0℃ 이하인 오일을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 오일에 60분 이하로 침적시키는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 30분 이하로 침적시키는 것이 좋다. 오일로 침적시키는 시간이 60분을 초과할 경우 고정화된 미생물의 활성이 감소하며, 오일의 온도가 25℃를 초과할 경우 고정화 담체의 형태가 냉각 후 일정한 형태를 이루기 어려운 문제가 있다.
상기 고정화 담체는 한천(agar) 용액, 알지네이트(alginate) 용액 및 κ-카라기난(κ-carrageenan) 용액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 한천(agar) 용액인 것이 좋다. 상기 한천(agar)용액은 미생물을 고정화 시키는 과정에서 흡착법 및 포괄법을 모두 적용할 수 있고, 고정화 과정 중 균주의 손실이 적어 수소의 생산성을 높일 수 있다.
이때, 상기 한천(agar)용액은 1 내지 5%(w/v)의 한천(agar)용액인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 2 내지 4%(w/v)의 한천(agar)용액이 좋고, 나아가 3%(w/v)의 한천(agar)용액을 사용한 경우 수소의 생산성이 가장 우수하다.
또한, 상기 통성 혐기성 미생물 및 고정화 담체의 중량비가 5:1 내지 20:1인 것이 바람직하며, 상술한 범위의 통성 혐기성 미생물의 함량을 만족할 때 수소의 생산성이 우수하고, 상술한 범위를 넘어 통성 혐기성 미생물을 더 포함하더라도, 수소의 생산성에 영향을 미치지 않는다.
상기 고정화된 통성 혐기성 미생물을 배양시키는 단계는 혐기성 조건에서 4 내지 8g/L 인산이수소칼륨(KH2PO4), 4 내지 8g/L 펩톤(peptone) 및 160 내지 200mM 폐글리세롤(crude glycerol)을 포함하는 배지에서 상기 고정화된 통성 혐기성 미생물을 배양시키는 단계인 것이 바람직하다. 또한, 상기 배지는 12 내지 16g/L 인산수소칼륨(K2HPO4), 1 내지 3g/L 황산암모늄((NH4)2SO4), 0.1 내지 2 g/L 시트르산 삼나트륨 이수화물(trisodium citrate dehydrate) 및 1 내지 3g/L 황산마그네슘(MgSO4)을 더 포함하는 것이 바람직하다. 상술한 범위의 배지조성을 만족할 경우 수소의 생산 효율이 가장 우수하다.
상기 고정화된 통성 혐기성 미생물을 배양시키는 단계는 30 내지 40℃에서 50 내지 200rpm으로 교반하는 것이 포함되는 것이 바람직하며, 상기 교반은 축교반 또는 임펠러 교반에 의하여 교반될 수 있고, 바람직하게는 임펠러 교반에 의하여 교반된다.
예를 들어, 고정화된 통성 혐기성 미생물을 상기 미생물을 배양하기 위한 배지가 담긴 160mL 시험관(working volume 50mL)에 넣고, 질소 가스를 투입한 후, 이를 반응온도 37℃의 혐기성 조건에서 150rpm으로 교반하여 반응시킬 수 있다.
또 다른예로, 고정화된 통성 혐기성 미생물을 상기 미생물을 배양하기 위한 배지가 담긴 3L 반응기(working volume 1L)에 넣고, 질소 가스를 투입한 후, 이를 반응온도 37℃의 혐기성 조건에서 100rpm으로 교반하여 반응시킬 수 있다.
상기 배양시키는 과정에서 50rpm 미만으로 교반시 미생물에 의해 생산된 수소가 배지에서 밖으로 충분이 나올 수 없어 수소의 생산성이 저하되며, 200rpm을 초과할 경우 미생물이 고정된 한천, 즉 미생물이 고정된 담체가 깨져 수소의 생산성이 저하되는 문제점이 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
(a) 단계: 호기성 조건에서 통성 혐기성 미생물 배양
통성 혐기성 미생물의 배양을 위한 쇠고기 추출물(Beef extract) 3g 및 펩톤(Peptone) 5g을 포함하는 생장 배지(Nutrient Broth, BD Difco)를 준비하였다.
통성 혐기성 미생물로 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes, ATCC 29007 ; Enterobacter aerogenes Hormaeche and Edwards, ATCC 29007, KORAM BIOTECH CORP., 대전)를 사용하여 상기 배지에 접종하고 반응 온도 37℃, 호기성 조건에서 200rpm으로 교반하며 배양하였다.
(b) 단계: 고정화 담체에 통성 혐기성 미생물 고정화
배양된 통성 혐기성 미생물 4g 및 2.0%(w/v) 한천(agar)용액 10mL을 혼합하고, 이때 혼합 후 한천(agar)용액은 상기 통성 혐기성 미생물의 영향에 따라 1.5%(w/v) 한천(agar)용액이 되며, 상기 혼합액을 반응 온도 160℃ 조건에서 충분히 혼합시킨다. 이후 펌프에 연결된 고무관을 통과시켜 구의 형태를 나타내는 미생물을 포함하는 한천을 0℃의 올리브 오일에 30분간 침적시켜 미생물이 고정화된 담체를 제조하였다.
(c) 단계: 혐기성 조건에서 고정화된 미생물 배양
인산수소칼륨(K2HPO4) 14g, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 6g, 황산암모늄((NH4)2SO4) 2g, 시트르산 삼나트륨 이수화물(trisodium citrate dehydrate) 0.2g, 펩톤(peptone) 5g, 황산마그네슘(MgSO4) 0.1g, 184mM 폐글리세롤(crude glycerol)을 혼합하여 고정화된 미생물을 배양하기 위한 배지를 조성하였다.
이때, 상기 폐글리세롤은 ㈜단석산업으로부터 공급받은 것으로, 폐글리세롤 및 순수한 글리세롤의 조성은 하기 표 1과 같다.
조성 폐글리세롤(Crude glycerol) 순수한 글리세롤(Pure glycerol)
글리세롤(Glycerol, %) 80.9 96
칼륨(K, %) - -
나트륨(Na, %) - -
염소 (Cl, %) - -
황 (S, %) - -
재 (Ash, %) 7.7 -
기타 유기물(Matter of Organic Non Glycerol (%) 1.0 0.2
수분(Moisture, %) 10.4 3.8
이후, 160mL 바이알(Serum bottle)에 상기 미생물이 고정화된 담체 1mL와 고정화된 미생물을 배양하기 위한 배지(pH 6.5)를 넣어 전체 working volume 50ml로 만든 후, 질소가스를 3분간 충진하여 혐기 조건을 만든 후, 반응 온도 37℃, 150rpm으로 시험관을 교반하였다.
< 실시예 2>
상기 실시예 1의 (b) 단계에서, 2.0%(w/v) 한천(agar)용액 10mL 대신에 4.0(w/v)% 한천(agar)용액 10mL을 혼합하고, 이때 혼합 후 한천(agar)용액은 상기 통성 혐기성 미생물의 영향에 따라 3.0%(w/v) 한천(agar)용액이 되는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 3>
상기 실시예 1의 (b) 단계에서, 2.0%(w/v) 한천(agar)용액 10mL 대신에 5.0(w/v)% 한천(agar)용액 10mL을 혼합하고, 이때 혼합 후 한천(agar)용액은 상기 통성 혐기성 미생물의 영향에 따라 3.8%(w/v) 한천(agar)용액이 되는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 4>
상기 실시예 1의 (b) 단계에서, 2.0%(w/v) 한천(agar)용액 10mL 대신에 1.0(w/v)% 알지네이트(alginate) 용액 10mL을 혼합하고, 이때 혼합 후 상기 알지네이트(alginate) 용액은 상기 통성 혐기성 미생물의 영향에 따라 0.7%(w/v) 알지네이트(alginate) 용액이 되는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 5>
상기 실시예 1의 (b) 단계에서, 2.0%(w/v) 한천(agar)용액 10mL 대신에 2.0(w/v)% 알지네이트(alginate) 용액 10mL을 혼합하고, 이때 혼합 후 상기 알지네이트(alginate) 용액은 상기 통성 혐기성 미생물의 영향에 따라 1.5%(w/v) 알지네이트(alginate) 용액이 되는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 6>
상기 실시예 1의 (b) 단계에서, 2.0%(w/v) 한천(agar)용액 10mL 대신에 4.0(w/v)% 알지네이트(alginate) 용액 10mL을 혼합하고, 이때 혼합 후 상기 알지네이트(alginate) 용액은 상기 통성 혐기성 미생물의 영향에 따라 3.0%(w/v) 알지네이트(alginate) 용액이 되는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 7>
상기 실시예 1의 (b) 단계에서, 2.0%(w/v) 한천(agar)용액 10mL 대신에 2.0(w/v)% 젤라틴(gelatin) 용액 5mL 및 2.0%(w/v) 알지네이트(alginate) 용액 5mL을 혼합하고, 이때 혼합 후 상기 젤라틴(gelatin) 용액 및 알지네이트(alginate) 용액은 상기 통성 혐기성 미생물의 영향에 따라 1.5%(w/v) 젤라틴(gelatin) 용액 및 1.5%(w/v) 알지네이트(alginate) 용액이 되는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 8>
상기 실시예 1의 (b) 단계에서, 2.0%(w/v) 한천(agar)용액 10mL 대신에 2.0(w/v)% 젤라틴(gelatin) 용액 5mL 및 2.0%(w/v) κ-카라기난(carrageenan) 용액 5mL을 혼합하고, 이때 혼합 후 상기 젤라틴(gelatin) 용액 및 κ-카라기난(carrageenan) 용액은 상기 통성 혐기성 미생물의 영향에 따라 1.5%(w/v) 젤라틴(gelatin) 용액 및 1.5%(w/v) κ-카라기난(carrageenan) 용액이 되는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 9>
상기 실시예 1의 (b) 단계에서, 2.0%(w/v) 한천(agar)용액 10mL 대신에 2.0(w/v)% 젤라틴(gelatin) 용액 10mL을 혼합하고, 이때 혼합 후 상기 젤라틴(gelatin) 용액은 상기 통성 혐기성 미생물의 영향에 따라 1.5%(w/v) 젤라틴(gelatin) 용액이 되는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 10>
상기 실시예 1의 (b) 단계에서, 2.0%(w/v) 한천(agar)용액 10mL 대신에 2.0(w/v)% κ-카라기난(carrageenan) 용액 10mL을 혼합하고, 이때 혼합 후 상기 젤라틴(gelatin) 용액은 상기 통성 혐기성 미생물의 영향에 따라 1.5%(w/v) κ-카라기난(carrageenan) 용액이 되는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 11>
상기 실시예 1의 (b) 단계에서, 2.0%(w/v) 한천(agar)용액 10mL 대신에 4.0(w/v)% κ-카라기난(carrageenan) 용액 10mL을 혼합하고, 이때 혼합 후 상기 젤라틴(gelatin) 용액은 상기 통성 혐기성 미생물의 영향에 따라 3.0%(w/v) κ-카라기난(carrageenan) 용액이 되는 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 12>
상기 실시예 1의 (b) 단계에서, 2.0%(w/v) 한천(agar)용액 10mL 대신에 유리 비드(glass bead) 10g을 이용하여 미생물이 고정화된 담체를 제조한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 13>
상기 실시예 2의 (b) 단계에서, 배양된 통성 혐기성 미생물 4g 및 4.0%(w/v) 한천(agar)용액 10mL 대신에 배양된 통성 혐기성 미생물 2g 및 4.0%(w/v) 한천(agar)용액 5mL을 혼합하여 미생물을 고정화시키는 것을 제외하고 실시예 2와 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 14>
상기 실시예 13의 (b) 단계에서, 배양된 통성 혐기성 미생물 2g 대신에 배양된 통성 혐기성 미생물 4g을 혼합하여 미생물을 고정화시키는 것을 제외하고 실시예 13과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 15>
상기 실시예 13의 (b) 단계에서, 배양된 통성 혐기성 미생물 2g 대신에 배양된 통성 혐기성 미생물 8g을 혼합하여 미생물을 고정화시키는 것을 제외하고 실시예 13과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 16>
상기 실시예 13의 (b) 단계에서, 배양된 통성 혐기성 미생물 2g 대신에 배양된 통성 혐기성 미생물 12g을 혼합하여 미생물을 고정화시키는 것을 제외하고 실시예 13과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 17>
상기 실시예 13의 (b) 단계에서, 배양된 통성 혐기성 미생물 2g 대신에 배양된 통성 혐기성 미생물 16g을 혼합하여 미생물을 고정화시키는 것을 제외하고 실시예 13과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 18>
상기 실시예 2의 (b) 단계에서, 배양된 통성 혐기성 미생물 4g 및 4.0%(w/v) 한천(agar)용액 10mL 대신에 배양된 통성 혐기성 미생물 2g 및 4.0%(w/v) 한천(agar)용액 5mL을 혼합하여 미생물을 고정화시키고, 상기 고정화된 미생물 배양에서 184mM 글리세롤(glycerol) 대신에 240mM 글리세롤(glycerol)이 포함되는 것을 제외하고 실시예 2와 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 19>
상기 실시예 18의 (b) 단계에서, 배양된 통성 혐기성 미생물 2g 대신에 배양된 통성 혐기성 미생물 4g을 혼합하여 미생물을 고정화시키는 것을 제외하고 실시예 18과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 20>
상기 실시예 18의 (b) 단계에서, 배양된 통성 혐기성 미생물 2g 대신에 배양된 통성 혐기성 미생물 8g을 혼합하여 미생물을 고정화시키는 것을 제외하고 실시예 18과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 21>
상기 실시예 18의 (b) 단계에서, 배양된 통성 혐기성 미생물 2g 대신에 배양된 통성 혐기성 미생물 12g을 혼합하여 미생물을 고정화시키는 것을 제외하고 실시예 18과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 22>
상기 실시예 18의 (b) 단계에서, 배양된 통성 혐기성 미생물 2g 대신에 배양된 통성 혐기성 미생물 16g을 혼합하여 미생물을 고정화시키는 것을 제외하고 실시예 18과 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 실시예 23>
상기 실시예 2의 (c) 단계에서, 고정된 미생물을 160mL 바이알(working volume 50mL) 대신에 3L 반응기(working volume 1L)에서 배양시키는 것을 제외하고 실시예 2와 동일하게 실시하여 고정화된 미생물을 배양하였다.
< 비교예 1>
(a) 단계: 호기성 조건에서 통성 혐기성 미생물 배양
통성 혐기성 미생물의 배양을 위한 쇠고기 추출물(Beef extract) 3g, 펩톤(Peptone) 5g을 포함하는 생장 배지(Nutrient Broth, BD Difco)를 준비하였다.
통성 혐기성 미생물로 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes, ATCC 29007 ; Enterobacter aerogenes Hormaeche and Edwards, ATCC 29007, KORAM BIOTECH CORP., 대전)를 상기 배지에 1% 접종하고 반응 온도 37℃, 호기성 조건에서 200rpm으로 교반하며 배양하였다.
(b) 단계: 혐기성 조건에서 유리 미생물 배양
인산수소칼륨(K2HPO4) 14g, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 6g, 황산암모늄((NH4)2SO4) 2g, 시트르산 삼나트륨 이수화물(trisodium citrate dehydrate) 0.2g, 펩톤(peptone) 5g, 황산마그네슘(MgSO4) 0.1g, 184mM 폐글리세롤(crude glycerol)을 혼합하여 미생물을 배양하기 위한 배지를 조성하였다.
이후, 상기의 배지(pH 6.5) 49mL를 넣은 160mL 바이알(working volume 50mL)에 통성 혐기성 미생물을 2% 접종하고, 3분간 질소가스를 충진하여 혐기조건을 만든 후, 반응 온도 37℃, 150rpm으로 시험관을 교반하였다.
< 실험예 >
상기 실시예 1 내지 23 및 비교예 1에서 생성된 수소의 양을 측정하기 위해 가스 크로마토그래피(영린(Younglin), 한국)를 이용하였고, 컬럼은 carboxen 1000 packed column (Supelco, 벨폰트, 미국)을 사용하였고, 검출기는 열전도도 검출기(thermal conductivity detector, TCD)을 사용하였다.
분석은 다음과 같은 조건에서 수행하였다.
주입기는 120℃이고, 오븐은 80℃로 등온조건으로 하였다. 검출기는 120℃ 조건에서 사용하였다. 주입부피는 250㎕로 하였다. 캐리어 가스는 아르곤(Ar)을 사용하였으며, 유속은 30 ㎝/분로 유지하였다. 수소의 단위는 mL/L이며, 하기 수학식 1을 사용하여 계산하였다.
Figure pat00001
V 는 누적된 총 수소 생산량, Vo 은 반응기 내부의 빈 공간의 부피, Vi 은 반응기로부터 배출된 총 가스의 양, γi 은 수소 가스의 분율이다.
상기 수학식 1을 통하여 얻을 결과를 도 2 내지 5에 나타내었다.
도 2는 고정화 담체의 농도에 따른 수소의 생산량을 비교한 그래프이다. 한천(agar) 용액, 알지네이트(alginate) 용액 및 κ-카라기난(κ-carrageenan)을 고정화 담체로 이용한 경우 특히 우수한 수소 생산성을 나타내었다. 다만, 상기 알지네이트(alginate) 용액을 사용하는 경우 배지 성분 중 포스페이트(phosphate)와의 반응으로 고정화 담체가 배지에 녹을 수 있어, 바람직하게는 3%(w/v) 한천(agar) 용액을 사용하는 것이 가장 높은 수소 생산성을 보이는 것을 알 수 있다.
도 3 및 4는 고정화 담체에 포함된 미생물의 함량의 증가 및 제공되는 폐글리세롤의 증가에 따른 수소의 생산성을 나타낸 그래프이다. 구체적으로 도 3은 실시예 13 내지 17에서 184mM 글리세롤이 포함된 배지에서 배양된 미생물에 의하여 발생된 수소의 양을 나타내고, 도 4는 실시예 18 내지 22에서 240mM 글리세롤이 포함된 배지에서 배양된 미생물에 의하여 발생된 수소의 양을 나타낸다. 도 3에서 알 수 있듯이, 고정화 담체에 함유되는 미생물의 양이 증가하더라도 수소의 생산성에 큰 영향을 미치는 것은 아니며, 도 4에서 글리세롤이 200mM을 초과하더라도 수소의 생산성이 증가되지 않고, 오히려 미생물이 증가함에 따라 수소의 생산성이 감소되는 것을 확인할 수 있다.
도 5는 고정화 되지 않은 미생물, 즉 유리 미생물(free cell)을 사용한 비교예 1, 고정화 담체에 미생물을 고정화 시켜 시험관(serum bottle)에서 수소를 생산한 실시예 2 및 3L 반응기(working volume 1L)를 사용한 실시예 23의 수소 생산성을 비교한 그래프이다. 상기 유리 미생물(free cell)을 사용한 경우 바이오 가스, 즉 수소의 발생량이 4000ml/L 미만인 반면, 고정화된 미생물에 의한 수소의 발생량은 4000ml/L 이상으로 측정되어 미생물을 고정화 시킬 경우 수소의 생산성에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. (a) 호기성 조건에서 통성 혐기성 미생물을 배양시키는 단계;
    (b) 상기 통성 혐기성 미생물을 고정화 담체에 고정화시키는 단계; 및
    (c) 혐기성 조건에서 폐글리세롤(crude glycerol)이 포함되는 배지에서 상기 고정화된 통성 혐기성 미생물을 배양시키는 단계를 포함하는 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 통성 혐기성 미생물을 고정화 담체에 고정화시키는 단계 (b) 는 상기 통성 혐기성 미생물 및 고정화 담체를 140 내지 170℃ 온도 조건에서 혼합하고, 냉각시키는 것을 특징으로 하는 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 고정화 담체는 한천(agar)용액, 알지네이트(alginate)용액, 젤라틴(gelatin)용액 및 κ-카라기난(κ-carrageenan)용액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 한천(agar)용액은 1 내지 5%(w/v) 한천용액인 것을 특징으로 하는 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법.
  5. 청구항 2에 있어서, 상기 냉각은 상기 통성 혐기성 미생물 및 한천(agar)용액을 -10℃ 내지 25℃ 오일(oil)에서 반응시간 60분 이하로 침적시키는 것을 특징으로 하는 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 통성 혐기성 미생물이 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes) 또는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 고정화된 통성 혐기성 미생물을 배양시키는 단계 (c) 는 혐기성 조건에서 4 내지 8g/L 인산이수소칼륨(KH2PO4), 4 내지 8g/L 펩톤(peptone) 및 160 내지 200mM 폐글리세롤(crude glycerol)을 포함하는 배지에서 상기 고정화된 통성 혐기성 미생물을 배양시키는 단계를 포함하는 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 배지는 12 내지 16g/L 인산수소칼륨(K2HPO4), 1 내지 3g/L 황산암모늄((NH4)2SO4), 0.1 내지 2 g/L 시트르산 삼나트륨 이수화물(trisodium citrate dehydrate) 및 1 내지 3g/L 황산마그네슘(MgSO4)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 고정화된 통성 혐기성 미생물을 배양시키는 단계 (c) 는 30 내지 40℃에서 50 내지 200rpm으로 교반하는 것이 포함되는 것을 특징으로 하는 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 호기성 조건에서 배양시킨 통성 혐기성 미생물의 흡광도(Optical density, O.D.)가 600nm의 파장에서 1.5 내지 2.0인 것을 특징으로 하는 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 통성 혐기성 미생물 및 한천(agar)용액의 중량비가 5:1 내지 20:1인 것을 특징으로 하는 폐글리세롤을 이용한 수소 생산방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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