KR20130024223A - 다파장 균일 조사기와 검출센서를 이용하여 형광물질을 검출 가능한 회전 실시간 ｐｃｒ장치, 이를 위한 실시간 ｐｃｒ 칩, 이를 이용한 회전 실시간 ｐｃｒ 방법 - Google Patents

Abstract

다파장 균일 조사기와 검출센서를 이용하여 형광물질을 검출 가능한 회전 실시간 ＰＣＲ장치, 이를 위한 실시간 ＰＣＲ 칩, 이를 이용한 회전 실시간 ＰＣＲ 방법이 제공된다.

Description

다파장 균일 조사기와 검출센서를 이용하여 형광물질을 검출 가능한 회전 실시간 ＰＣＲ장치, 이를 위한 실시간 ＰＣＲ 칩, 이를 이용한 회전 실시간 ＰＣＲ 방법{Rotary real-time PCR capable of sensing fluorescent material using light emitter with multiple wave-length and sensor}

본 발명은 다파장 균일 조사기와 검출센서를 이용하여 형광물질을 검출 가능한 회전 실시간 PCR 장치, 이를 위한 실시간 PCR 칩, 이를 이용한 회전 실시간 PCR 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 PCR 칩 자체의 회전에 의하여 원하는 온도 조건으로 PCR 공정 단계를 실시간으로 진행할 수 있을 뿐만 아니라, 형광 디텍터를 이용해 실시간으로 측정 가능한 다파장 균일 조사기와 검출센서를 이용하여 형광물질을 검출 가능한 회전 실시간 PCR 장치, 이를 위한 실시간 PCR 칩, 이를 이용한 회전 실시간 PCR 방법에 관한 것이다.

일반적으로, DNA 증폭기술은 생명과학, 유전공학 및 의학 분야 등의 연구개발 및 진단 목적으로 광범위하게 활용되고 있으며, 특히 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction: PCR)에 의한 DNA 증폭기술이 널리 활용되고 있다. 그러나 통상의 PCR을 정량에 이용하기에는 증폭산물이 반드시 주형(template) DNA의 양을 반영하는 것이 아니기 때문에 주형의 양을 측정하기에 곤란한 문제가 있었다. 이에 기존의 PCR법 보다 신속하고, 고감도로 증폭되고, 오염을 줄일 수 있는 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)법이 이용되고 있다. 종래 일반적으로 사용되고 있는 실시간 중합효소연쇄반응 (real time PCR)으로 타크만 프로브(Taqman probe) 방법을 주로 이용하고 있으나, 그 외에도 에스와이비알 그린 1, 사이버 그린, 헤어 핀 프로브, RNase H를 이용한 브로브 법, 나노파티클을 이용하는 방식 등의 다양한 방법이 이용되고 있다. 또한 여러 종류의 형광물질을 동시 또는 각각 여기 시킬 수 있는 다파장 균일 광원의 개발로 각각의 파장대별 결과 자료를 동시에 송신하는, 이른바 멀티플렉스 검출이 가능하다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 분석 대상인 표적 시료를 포함하는 칩 자체를 회전시키는 방식으로 실시간 PCR 공정을 수행하는 회전 방식의 실시간 PCR 장치 및 이를 위한 실시간 PCR 칩을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 회전 방식으로 표적 시료의 전처리, 실시간 PCR 공정, 생성산물의 형광 분석을 동일 플랫폼에서 수행하는 실시간 PCR 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 PCR 공정이 진행되는 PCR 칩; 상기 PCR 칩과 연결되어 상기 PCR 칩을 회전시키기 위한 회전수단; 상기 PCR 칩으로부터 이격되어, 상기 PCR 칩에 열 에너지를 인가할 수 있으며, 상기 회전하는 PCR 칩이 상이한 온도 영역을 지나가도록 구성된 온도영역 형성수단; 및 상기 회전되는 PCR 칩에서의 반응정도를 실시간으로 분석하기 위한 광학 측정 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 장치를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 광학 측정 수단은 상기 PCR 칩에 광을 조사하기 위한 여기광원; 및 상기 여기광원으로부터 조사되는 광에 의한 형광 물질을 측정하기 위한 측정 수단을 포함하며, 상기 여기광원으로부터 다파장의 광이 상기 PCR 칩에 조사된다.

또한, 상기 회전수단은 상기 PCR 칩이 연결된 샤프트; 및 상기 샤프트를 회전시키는 모터를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 온도영역 형성수단은 복수 개의 히팅블록을 포함하는 디스크 형태이며, 상기 히팅블록은 전기적 에너지에 의하여 가열되며, 상기 복수 개의 히팅블록은 독립적으로 제어된다. 또는 상기 히팅블록은 광 에너지를 발생시키는 광원을 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 상기 PCR 칩은 PCR 공정이 진행되는 PCR부와 상기 PCR 공정의 표적 물질이 분리되는 전처리부를 포함한다. 상기 전처리부는 시료 용액을 저장하는 시료 챔버, 세척 버퍼액을 저장하는 세척 버퍼 챔버, 용리액을 저장하는 용리액 챔버; 및 상기 챔버 각각에 연결되어, 상기 시료 용액 중 표적 물질을 포획하기 위한 포획수단으로 상기 용액들을 흘리도록 구성된 소수성 통로를 포함하며, 여기에서 상기 PCR 칩의 회전 속도에 따라 상기 포획수단으로 흘러들어가는 용액 종류가 결정되며, 각 챔버에 연결된 소수성 통로는 상이한 단면적을 갖는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 소수성 통로로부터의 용액은 상기 소수성 통로의 후단에 연결된 포획수단으로 흐르며, 상기 포획수단은 실리카 비드이다. 더 나아가, 상기 PCR 칩의 회전속도 증가에 따라 순차적으로 시료 용액, 세척 버퍼액, 용리액이 상기 실리카 비드로 흐른다. 본 발명은 또한 상술한 PCR 장치용 PCR 칩을 제공한다.

본 발명은 또한 표적 물질을 포함하는 PCR 칩을 상이한 온도가 형성된 복수 개의 온도영역을 지나도록 회전시켜 PCR 공정을 진행하는 단계; 상기 회전되는 PCR 칩에 다파장 광을 조사하는 단계; 및 상기 조사되는 다파장 광에 의하여 형광물질을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 회전 실시간 PCR 장치 및 방법은 표적 물질을 포함하는 칩 자체의 회전에 의하여 원하는 온도조건 및 싸이클 수로 실시간 PCR 공정을 진행할 수 있다. 따라서 경제적인 방식으로 고수율 실시간 PCR 공정의 구현이 가능하며, 회전하는 플랫폼에 의하여 발생하는 회전력에 의하여 표적 물질을 효과적으로 분리 정제할 수 있으므로, 별도의 외부 장치에서 분리정제를 진행하는 종래 기술에 비하여 경제적이라는 장점이 있다. 회전수단으로 상기 모터와 연결되어 회전하는 샤프트, 암수가 맞는 톱니바퀴를 상기 회전수단으로 하는 기어형태의 것을 사용함으로써 좀 더 안정적이고 정확한 회전수와 회전량을 가지게 된다. 또한 실시간으로 생성산물의 다수의 형광을 다파장 균일 조사기 및 검출 센서를 이용하여 측정함으로써 한번의 실험으로 시료의 분리정제, 다수의 실시간 PCR 생성산물의 분석까지 가능하다는 장점을 가진다.

도 1은 사용 가능한 형광물질에 관한 표이다.
도 2 및 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 온도영역 형성수단 및 다파장 균일 조사기와 검출 센서에 대한 정면도 및 측면도이다.
도 4는 도 1의 상기 온도영역 형성수단 및 다파장 균일 조사기와 검출 센서, PCR칩을 포함하는 PCR칩의 사시도이다.
도 5은 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 PCR 장치의 암수가 맞는 톱니바퀴를 상기 회전수단으로 하는 기어형태의 정면도이다.

이하, 본 발명의 도면을 참조하여 상세하게 설명하고자 한다. 다음에 소개되는 실시예들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 이하 설명된 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 그리고 도면들에 있어서, 구성요소의 폭, 길이, 두께 등은 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.

본 발명은 실시간 PCR 공정의 대상 물질, 즉 표적 물질(DNA, RNA)을 포함하는 칩(이하 실시간 PCR 칩)을 복수 개의 상이한 온도영역 및 다파장 균일 조사기와 검출센서를 지나도록 하는 방식의 실시간 PCR 장치 및 방법을 제공한다. 상기 실시간 PCR 장치 및 방법은 이를 위하여 원형의 온도영역과 다파장 균일조사기, 검출센서를 실시간 PCR 칩이 삽입된 디스크가 회전하며 지나는 회전 방식을 이용한다.

본 명세서에서 사용되는 다파장 균일 조사기 및 검출센서는 생성산물의 생성과 함께 형광물질을 이용하여 측정하는 장비를 의미하며, 에스와이비알 그린 1, 사이버 그린, 헤어핀 프로브, 타크만 프로브, RNaseH를 이용한 프로브법 등의 여러 방법을 사용할 수 있고, 헤어핀 프로브, RNaseH를 이용한 프로브법의 사용 형광 물질로 도 1에 예시된 물질이 사용될 수 있으나, 이러한 형광물질들은 상기 예들에 제한되지는 않는다.

이하 도면을 이용하여 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간 PCR 장치를 보다 상세히 설명한다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 온도영역 수단의 정면도이고, 도 3은 본 발명에 따른 PCR 장치의 전체 측면도이다.

또한, 도 4는 도 2, 3의 상기 온도영역 수단 및 3개의 실시간 PCR 칩을 포함하는 본 발명에 따른 PCR 장치의 사시도, 도 5는 회전수단에 결합된 PCR 칩에 대한 평면도이다.

도 2 및 3을 참조하면 본 실시예에 따른 실시간 PCR 장치의 온도영역 형성수단은 독립적으로 온도가 제어, 조절되는 복수 개의 가열금속블록(이하 히팅 블록)을 포함하는 휠 또는 디스크 형상이며, 상기 히팅블록(200a, 200b, 200c) 사이에는 상기 히팅블록간의 열 전도를 막기 위한 절연체(200d) 및/또는 냉각블록이 구비될 수 있다. 본 명세서에서 온도영역은 상기 히팅 블록으로부터 이격된 공간에서 회전하는 PCR 칩이 일정한 열 에너지를 받게 되는 영역을 의미한다. 하지만, 이러한 히팅방식 이외에 광을 조사하는 복사열 방식으로도 PCR 칩이 회전하는 공간에서의 온도영역을 형성할 수 있으며, 이는 본 발명의 범위에 속한다.

이하, 히팅블록을 예시로 하여 본 발명에 따른 PCR 장치 및 방법을 설명한다.

먼저, 히팅블록 200a에서 변성(denaturation), 200b에서 결합(annealing), 200c에서 신장(elongation)이 일어나고, 200c에서 다파장 균일 조사기(도 300a 참조) 및 검출 센서(도 300b 참조)를 이용하여 실시간 PCR 결과물 분석 시에 다수의 형광물질을 측정할 수 있는 방법을 제공한다. 상기 측정 방법은 카메라에 의한 사진분석, 디텍터에 의한 정량적 분석 방법등이 있지만, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않는다.

도 5를 참조하면, 본 발명에 따른 실시간 PCR 장치는 도 4의 실시간 PCR 디스크를 회전시키기 위한 회전수단을 포함하는데, 본 발명의 일 실시예에서 상기 장치는 모터와 상기 모터와 연결되어 회전하는 샤프트, 암수가 맞는 톱니바퀴를 상기 회전수단으로 하는 기어형태의 것을 포함한다.

본 발명에 따른 PCR 장치는 암수가 맞는 톱니바퀴와 같은 기어형태의 회전법을 사용함에 따라 좀 더 안정적이고 정확한 회전수와 회전량을 가지게 된다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 샤프트에는 상기 샤프트 회전에 대응하여 회전하는 실시간 PCR 칩이 하나 이상 결합될 수 있다. 도 4에서는 3개의 실시간 PCR 칩이 연결된 칩 디스크가 도시된다.

일반적으로 실시간 PCR 공정에서는 대상 물질, 예를 들어 DNA, RNA를 분리, 정제하는 전처리 공정이 요구되며, 일반적인 전처리 방식은 대상 시료만을 선택적으로 포획할 수 있는 포획 수단, 예를 들면 실리카 비드를 이용하는 고상 포획 방식이다. 상기 방식은 먼저 포획하고자 하는 대상물질(표적물질)을 포함하는 시료를 상기 실리카 비드에 흘림으로써 대상물질을 포획 수단에 흡착시키는 제 1 단계, 증폭시키고자 하는 표적물질을 제외한 나머지 성분 등을 상기 포획수단으로부터 제거, 세척하는 제 2 단계 및 상기 포획수단에 포획된 표적물질을 분리하는 제 3 단계로 이루어진다. 일반적으로 제 2 단계는 세척 버퍼 용액을 실리카 비드에 흘리는 방식으로 수행되며, 제 3 단계는 용리액을 실리카 비드에 흘리는 방식으로 수행된다.

본 발명에 따른 실시간 PCR 공정에서 DNA, RNA와 같은 표적 물질을 분리하기 위한 전처리는 표적물질을 포함하는 혼합액을 실리카 비드와 같은 포획수단으로 흘리는 방식으로 진행된다. 본 발명은 특히 혼합액을 흘리는 단계와 세척액을 흘리는 단계, 그리고 용리액을 흘리는 단계는 모두 하나의 포획 수단 방향으로 진행되는 점에 주목하여, 상기 용액들을 각기 함유, 저장하는 용액 챔버로부터의 용액이동 통로의 단면적을 각기 달리함으로써, 회전 속도에 따라 원하는 종류의 용액만을 상기 포획수단으로 유동, 흐르게 하는 기술구성을 제공한다. 이에 따라 표적물질의 분리부터 표적물질의 실시간 PCR 과정, 측정이 모두 하나의 과정으로 수행되게 된다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 히팅블록은 적어도 세 개의 온도영역을 형성시킬 수 있도록 3개의 단위 히팅블록을 갖는 히팅블록군을 적어도 하나 이상 갖는 것이 바람직하다. 그 이유는 실시간 PCR 공정의 1 싸이클이 일반적으로는 세 개의 온도 단계를 거치기 때문이다. 즉, 본 발명의 일 실시예에서 상기 복수 개의 히팅 블록(도 4 참조)에 의하여 형성되는 온도영역은 3개이며, 각각 섭씨 95, 72, 55의 온도 영역이다. 상기 온도영역을 지나, 회전하는 PCR 칩은 지나는 영역의 온도 조건에 따라 실시간 PCR 공정이 진행된다. 도 2의 실시예에서는 히팅 블록에 의하여 형성되는 온도구배영역이 세 개이지만, 이 수는 확장가능하며, 이 경우 실시간 PCR 칩의 360도 회전에 의해 복수 싸이클의 실시간 PCR 공정이 진행될 수 있다. 따라서 다수의 실시간 PCR 칩을 간단히 1회 회전시킴으로써 복수 개의 실시간 PCR 공정 싸이클을 동시에 진행할 수 있다.

본 발명에 따른 실시간 PCR 칩은 상술한 바와 같이 DNA, RNA를 분리, 정제 하는 전처리부와 실시간 PCR 공정이 진행하는 실시간 PCR부로 구분될 수 있으며, 상기 전처리부에 의하여 분리된 표적 물질은 다시 온도 하강에 따라 개방되는 온도반응성 밸브를 통하여 실시간 PCR부로 유입된다. 이후, 상기 실시간 PCR부로 유입된 표적 물질은 히팅 블록에 의하여 단계별로 가열되어, 상기 표적 물질에 대한 실시간 PCR 공정이 진행되고, 다파장 균일 조사기를 이용하여(도 3 참조) 실시간 PCR 칩에 들어 있는 표적물질의 반응 정도를 실시간으로 모니터링 하기 위해 투명창을 갖는 고정커버 상으로 여기광원을 조사 후 형광물질의 형광을 카메라 및 정량적 분석기 등의 측정법을 통하여 측정된다. 본 발명의 일 실시예에서 샤프트에는 상기 샤프트 회전에 대응하여 회전하는 PCR 칩이 하나 이상 구비된다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서 상기 히팅블록은 적어도 세 개의 온도영역을 형성시킬 수 있도록 3 개의 단위 히팅블록을 갖는 히팅블록군을 적어도 하나 이상 갖는 것이 바람직하다. 그 이유는 PCR 공정의 1 싸이클이 일반적으로는 세 개의 온도 단계를 거치기 때문이다. 즉, 본 발명의 일 실시예에서 상기 복수 개의 히팅 블록(도 2 참조)에 의하여 형성되는 온도영역은 3개이며, 각각 섭씨 95도, 72도, 55도의 온도 영역이다. 상기 온도영역을 지나, 회전하는 PCR 칩은 지나는 영역의 온도 조건에 따라 PCR 공정이 진행된다. 본 발명의 일 실시예에서는 히팅 블록에 의하여 형성되는 온도 구배 영역이 세 개이지만, 이 수는 확장가능하며, 이 경우 PCR 칩의 360도 회전에 의하여 복수 싸이클의 PCR 공정이 진행될 수 있다. 따라서 다수의 PCR 칩을 간단히 1회 회전시킴으로써도 복수 개의 PCR 공정 싸이클을 동시에 진행할 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (13)

1. PCR 공정이 진행되는 PCR 칩과 연결되어 상기 PCR 칩을 회전시키기 위한 회전수단;
   상기 PCR 칩으로부터 이격되어, 상기 PCR 칩에 열 에너지를 인가할 수 있으며, 상기 회전하는 PCR 칩이 상이한 온도 영역을 지나가도록 구성된 온도영역 형성수단; 및
   상기 회전되는 PCR 칩에서의 반응정도를 실시간으로 분석하기 위한 광학 측정 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 광학 측정 수단은 상기 PCR 칩에 광을 조사하기 위한 여기광원; 및
   상기 여기광원으로부터 조사되는 광에 의한 형광 물질을 측정하기 위한 측정 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
3. 제 2항에 있어서,
   상기 여기광원으로부터 다파장의 광이 상기 PCR 칩에 조사되는 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 회전수단은 상기 PCR 칩이 연결된 샤프트; 및
   상기 샤프트를 회전시키는 모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 온도영역 형성수단은 복수 개의 히팅블록을 포함하는 디스크 형태인 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
6. 제 5항에 있어서,
   상기 히팅블록은 전기적 에너지에 의하여 가열되며, 상기 복수 개의 히팅블록은 독립적으로 제어될 수 있는 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
7. 제 5항에 있어서,
   상기 히팅블록은 광 에너지를 발생시키는 광원을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 PCR 장치에 사용되는 PCR 칩.
9. PCR 칩을 이용한 PCR 방법에 있어서,
   표적 물질을 포함하는 PCR 칩을 상이한 온도가 형성된 복수 개의 온도영역을 지나도록 회전시켜 PCR 공정을 진행하는 단계;
   상기 회전되는 PCR 칩에 다파장 광을 조사하는 단계; 및
   상기 조사되는 다파장 광에 의하여 형광물질을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 방법.
10. 제 9항에 있어서,
    복수 개의 온도영역은 상기 회전하는 PCR 칩에 이격되며, 디스크 형태의 히팅 블록에 의하여 형성되는 것을 특징으로 하는 PCR 방법.
11. 제 10항에 있어서,
    상기 다파장 광은 상기 히팅 블록 중 어느 하나 이상에 구비된 여기광원으로부터 조사되는 것을 특징으로 하는 PCR 방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 방법은
    상기 조사되는 다파장 광에 의한 형광물질을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 방법.
13. 제 12항에 있어서,
    상기 다파장 광에 의한 형광물질 검출은 실시간으로 진행되는 것을 특징으로 하는 PCR 방법.

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