KR102407153B1 - 등온증폭용 프로브 및 이를 이용한 현장진단 장치 - Google Patents

등온증폭용 프로브 및 이를 이용한 현장진단 장치 Download PDF

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Abstract

휴대용 현장진단 장치가 소개된다.
이를 위해 본 발명은 사용자가 휴대할 수 있고 내부에 소정 공간이 마련된 케이스, 상기 케이스 내에 장착되고 일측이 개구되어 토출부가 형성되되 그 내부에는 표적 핵산에 대한 등온증폭을 시킬 수 있도록 라만 활성 분자가 포함된 프로브가 수용될 수 있는 등온증폭하우징, 상기 등온증폭하우징에 형성된 토출부에 인접된 상태로 상기 라만 활성 분자 이외에 물질을 흡착하기 위한 분리패드 및 상기 분리패드의 상측에 위치하고 상기 분리패드를 통과한 라만 활성 분자를 획득하는 검출패드를 포함하되, 상기 등온증폭하우징이 내장된 케이스의 역전시 중력에 의해 라만 활성 분자가 포함된 프로브가 하강하면서 상기 라만 활성 분자가 상기 검출패드에 의해 획득되는 것을 특징으로 한다.

Description

등온증폭용 프로브 및 이를 이용한 현장진단 장치{PROBE FOR ISOTHERMAL AMPLIFICATION AND ON-SITE DIAGNOSTIC APPARATUS USING THE SAME}
본 발명은 등온증폭용 프로브 및 이를 이용한 휴대용 현장진단 장치에 관한 것이다.
급성 호흡기 감염증을 유발하는 주요 바이러스로는 인플루엔자바이러스 A 및 B형; 코로나바이러스(OC43, NL63, 229E); 파라인플루엔자 바이러스 1, 2 및 3형; 호흡기세포융합바이러스 등이 있다.
호흡기 감염 질환은 감염 초기 임상 증상과 징후가 서로 비슷하여, 임상적 증상만으로 명확한 원인 바이러스의 규명이 어려울 뿐 아니라 세균성 호흡기 감염과 감별이 어렵기 때문에 정확한 진단에 많은 어려움이 있는 실정이다.
현재 급성호흡기감염증을 유발하는 바이러스의 진단법 중 보편적인 유전자 검출법인 PCR법은 민감한 방법으로 정확성이 높은 반면 확진을 위해 소요되는 시간이 길다는 단점이 있어 신속성 측면의 개선이 필요하다.
최근에는 이러한 제한점을 극복하기 위하여 각각의 바이러스에 특이적인 프라이머를 제작하여 환자 검체로부터 유전자를 추출한 후 동시에 여러 바이러스를 진단하는 멀티플렉스 PCR법이 연구되고 있다.
그러나 PCR법을 위해서는 고가의 크고 무거운 중합효소 연쇄반응기(Thermocycler)와 같은 전문적인 장비 및 전기영동 장치와 같은 추가적인 연계 장치, 이를 운용할 수 있는 숙련된 전문 인력이 요구된다. 또한 이러한 일련의 과정들을 수행하는데 있어서 많은 시간이 소요되며 분석 장비가 갖춰지지 않은 현장에서의 활용력은 현저히 떨어진다.
즉, 현장진단법이 갖추어야 하는 'ASSURED; Affordable (구하기 쉬운), Sensitive (민감한), Specific (특이적), User-friendly (사용자 친화적인), Rapid and robust (빠르고 정확한), Equipment-free (장비가 필요 없는), Deliverable (상용화된)' 와 같은 기준을 충족시키지 못한다.
따라서, 동시에 여러 호흡기 바이러스를 현장에서 검출할 수 있는 방법이 요구되고 있는 실정이다.
루프매개 등온증폭법 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)는 단순하고 빠른 등온 PCR로 기존 PCR 방법에 사용되는 Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase)를 사용하는 대신, 핵산말단가수분해(exonuclease) 기능을 갖고 있는 Bst DNA 중합효소(Bst DNA polymerase)를 이용한 방법이다.
이러한 등온 PCR법은 유전자를 증폭하는 동안 온도의 변화를 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 손쉽게 고정된 온도에서 유전자 증폭을 가능하게 한다.
최근 랩온어칩(Lab-on-a-chip) 등으로 등온 PCR을 미세유체칩 상에서 구현하려는 연구들이 많이 진행되고 있지만, 소형화, 비용절감, 단순한 구조의 실현 등 다양한 문제가 있다.
구체적으로, 루프매개 등온PCR을 이용하여 하나의 바이러스를 검출하기 위해서는 4개~6개의 프라이머 세트가 필요하여 다중 진단에 적용에 어려움이 따른다.
또한, 기존의 형광 기반의 검출 기술은 표지하는 형광에 따라 상이한 레이저 파장을 가지는 광원이 필요하여 장비의 소형화가 어렵고 형광 스펙트럼의 밴드폭이 상대적으로 넓어서 다중 표적에 대한 동시 검출에 근본적인 한계가 있다.
한편, 라만 산란 신호는 형광에 비해 1천배 이상의 좁은 신호 대역폭으로 나타나므로 높은 민감성 및 특이성을 가지며, 라만 활성분자에 따라 단일 채널에서 수백 가지 이상 상이한 라만 산란 신호 발산이 가능하여 다중 검출에 적합한 검출법이다.
KR 제10-2063864호
본 발명은 상기와 같은 종래 기술을 해결하기 위해 등온증폭 기술과 표면-증강 라만 산란 기법을 이용하여 생체 시료로부터 단일 용기(One-pot)에서 현장 진단이 가능한 등온증폭용 프로브 및 이를 이용한 휴대용 표적 핵산 현장진단 검출 장치를 제공함에 그 목적이 있다.
휴대용 표적 핵산 현장진단 검출 장치가 소개된다.
이를 위해 본 발명은 사용자가 휴대할 수 있고 내부에 소정 공간이 마련된 케이스, 상기 케이스 내에 장착되고 일측이 개구되어 토출부가 형성되되 그 내부에는 표적 핵산에 대한 등온증폭을 시킬 수 있도록 라만 활성 분자가 포함된 프라이머 프로브가 수용될 수 있는 등온증폭하우징, 상기 등온증폭하우징에 형성된 토출부에 인접된 상태로 상기 라만 활성 분자 이외에 물질을 흡착하기 위한 분리패드 및 상기 분리패드의 상측에 위치하고 상기 분리패드를 통과한 라만 활성 분자를 획득하는 검출패드를 포함하되, 상기 등온증폭하우징이 내장된 케이스의 역전시 중력에 의해 라만 활성 분자가 포함된 프로브가 하강하면서 상기 라만 활성 분자가 상기 검출패드에 의해 획득되는 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 구성으로 이루어진 본 발명에 의한다면 실시간으로 현장에서 바로 유전체 증폭 및 다중 분자 진단이 가능하고 분광시스템의 소형화가 가능한 현장 진단 시스템이 제공되는 이점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단을 위한 표적 핵산 검출 장치를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 또 다른 실시예인 현장진단을 위한 표적 핵산 검출 장치를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 있어서 등온증폭용 프로브를 이용한 라만 활성 분자의 방출 과정을 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 있어서 라만 분석 장치의 분리패드 및 검출패드를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 있어서 라만 분석 장치를 이용한 분석 공정을 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서 제한효소의 유무와 표적 핵산의 유무에 따른 표면-증강 라만 산란 신호 차이를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서 표적 핵산과의 상보적 결합이 가능한 등온증폭용 프라이머 프로브 종류에 따른 특이적 표면-증강 라만 산란 파장을 측정하여, 다중 검출이 가능함을 확인할 수 있는 도이다.
이하 첨부된 도면을 참조로 본 발명인 등온증폭용 프로브 및 이를 이용한 휴대용 표적 핵산 현장진단 검출 장치의 바람직한 실시 예를 설명한다.
한편, 명세서 전체에서, 용어 "라만 산란"은 빛이 어떤 매질을 통과할 때 빛의 파장을 변화시켜 빛의 일부가 진행 방향에서 이탈해 다른 방향으로 진행하는 현상을 의미한다.
명세서 전체에서, 용어 "라만 분광법"은 시료에 단파장의 레이저를 조사하여 산란된 빛을 검출하여 분자 수준의 정보를 얻어내는 유용한 분광법으로, 기존의 적외선(Infrared) 분광법에서 얻을 수 있는 정보와 서로 상보적인 화학구조 정보를 얻을 수 있는 방법으로 생화학/화학/소재 분야에 광범위하게 사용되고 있으며, 적외선 분광법에 비해 시료 측정이 매우 간단하다.
라만 분광법은 분자들의 진동 상태(vibrational state)에 대한 정보를 제공한다. 대부분의 경우, 흡수된 광선(radiation)이 동일한 파장에서 재-방사(re-radiated)되는데, 이를 레일레이 산란(Rayleigh scattering) 또는 탄성 산란(elastic scattering)의 과정이라고 한다.
이때, 재-방사된 광선간의 에너지 차이는 이들 간의 파장에서의 이동(shift)으로 나타나고 이러한 차이의 정도는 파수(파장의 역수)의 단위로서 측정되어 라만 쉬프트(Raman shift, RS)로 표현된다. 만일 투사 광선이 단파장이고 레이저를 그 소스로 이용하는 경우, 주파수 상에 차이를 가지는 산란된 광선(빛)은 레일레이 산란된 광선(빛)과 좀더 용이하게 구별될 수 있다.
즉, 라만 쉬프트는 분자의 진동 주파수에 해당한다. 따라서, 라만 분광법은 적외선 분광법과 같이 분자의 진동 형태, 회전상태에 대한 정보를 얻기 위해 사용되지만 적외선 분광법에서와는 다른 메커니즘과 선택 규칙에 근거하며 측정방법도 다르다.
명세서 전체에서, 용어 “등온증폭”은 “등온핵산증폭법(isothermal nucleic acid amplification)”이라고도 하며, 일정한 반응온도 조건하에서 목적으로 삼는 핵산배열(주형)을 증폭시키는 방법으로서, PCR법과 같이 증폭회로에서 주형을 열변성하는 것과 같은 온도변화를 수반하지 않는다.
명세서 전체에서, 용어 “루프 매개 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 주형을 변성시키지 않으면서 유전자 증폭(복제)를 등온에서 달성하기 위한 등온핵산증폭법(isothermal nucleic acid amplification) 중 하나이며 루프 매개 등온증폭법(LAMP)의 구체예는 N. Tsugunori 등의 문헌("Loop-mediated isothermal amplification of DNA," Nucleic Acids Research, Vol. 28, No. 12, June 15, 2000) 및 K. Nagamine 등의 문헌(Accelerated reaction by Loop-mediated isothermal amplification using loop primers," Molecular and Cellular Probes, Vol. 16, No. 3, p. 223-229, June 2002)와 같은 문헌들에서 상세하게 기술되어 있다.
우선, 본 발명의 등온증폭용 프라이머 프로브에 대해 설명하면 다음과 같다.
라만 활성 분자 (SERS active dye), 제한효소 활성 사이트 및 비오틴을 포함한다.
라만 활성 분자는 특정 라만 스펙트럼을 보이는 형광물질, 라만 활성 물질 또는 SERS 리포터(SERS reporter)이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, FAM(5'-Fluorescein phosphoramidite), TAMRA(5'-TAMRA phosphoramidite), VIC(2′-chloro-7′'phenyl-1,4-dichloro-6-carboxy-fluorescein), Cy5(2-[5-[1,3-Dihydro-1-[3-(4-methoxytriphenylmethoxy)propyl]-3,3-dimethyl-2H-indol-2-ylidene]-1,3-pentadien-1-yl]-1-[3-[N,N-diisopropylamino(2-cyanoethoxy)phosphinoxy]propyl]-3,3-dimethyl-3H-indolium), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein, Succinimidyl Ester), HEX([6 - carboxy - 2',4,4',5',7,7' -hexachlorofluorescein]), ROX(Rhodamine X, Rhodamine 101), 4-MBA(4-mercaptobenzoic acid), MMC(2,7-mercapto-4-methylcoumarin), MMTAA(2-mercapto-4-methyl-5-thiazoleacetic acid), TFMBA(2,3,5,6-Tetrafluoro-4-mercaptobenzoic acid), 및 MGITC(malachite Green Isothiocyantate) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있다.
라만 활성 분자는 변형 등온증폭용 프로브의 5' 말단에 결합된 것일 수 있으며, 예를 들어, 프로브 말단의 제한효소(restriction enzyme) 활성 사이트에 결합된 것일 수 있다.
라만 활성 분자는 도 3에 도시된 바와 같이, 등온 조건에서 주형의 등온증폭 반응이 진행되면서 제한효소 활성 사이트의 상보적 서열의 합성에 의해 등온증폭 제한효소가 제한효소 사이트 부위를 절단하여 라만 활성 분자가 결합된 프로브의 부위와 비오틴이 결합된 나머지를 분리하면서 방출된다.
등온증폭 반응은 단일가닥으로 된 주형 DNA 상의 개개 프라이밍 사이트(priming site) (예를 들어, F2c 또는 B2c)에 대한 각 내부 프라이머(예를 들어, FIP 또는 BIP)의 혼성화에 의해 개시될 수 있다.
본 발명에서는 표면-증강 라만 산란 기법을 이용한 단일 용기(One-pot) 현장 진단을 위하여 라만 활성 분자 (SERS active dye), 제한효소 활성 사이트 및 비오틴을 포함하는 변형 등온증폭 프라이머 프로브(modified forward inner primer; mFIP 또는 modified backward inner primer; mBIP)를 개시한다.
변형 등온증폭용 프로브는 검출하고자 하는 대상에 따라 다양한 서열 구조를 가질 수 있으며, 주형 DNA 상의 개개 프라이밍 사이트(priming site)에 대한 내부 프라이머 FIP 또는 BIP에 라만 활성 분자 (SERS active dye), 제한효소 사이트 및 비오틴을 포함한다.
예를 들어, 등온증폭용 프로브는 NCBI basic local alignment search tool(BLAST)를 기반으로 설계될 수 있으며, 표적 질환 및 유전자에 따른 염기서열 변형을 통해 분자진단 분야에 폭넓은 적용이 가능하며, 변형 등온증폭용 프로브는 modified forward inner primer (mFIP) 또는 modified backward inner primer (mBIP) 또는 이 둘 모두를 포함할 수 있다.
일 실시예로 등온증폭용 프로브 (modified forward inner primer; mFIP)의 혼성화 이후 외부프라이머(예를 들어, F3 또는 B3)는 2차적으로 주형 DNA 상의 프라이밍 사이트(예를 들어, F3c 또는 B3c)에 혼성화하고 내부 프라이머로부터 이미 연장된 DNA 서열들을 변위시키는 상보적 서열의 합성을 개시한다.
이때, 변형 등온증폭용 프로브(modified forward inner primer; mFIP)의 제한효소(restriction enzyme) 활성 사이트의 상보적 서열 합성에 따른 제한효소 활성으로 이중결합 DNA를 절단을 개시하여 상기 라만 활성 분자를 방출하고, 양 단부에서 줄기-루프(stem-loop) 구조를 형성한다.
줄기-루프 구조는 루프 매개 등온증폭 사이클링의 출발 물질로 상기 내부 프라이머(예를 들어, mFIP)의 혼성화에 의해 상기의 과정이 반복되며, 일련의 제한효소 활성 사이트의 절단에 의하여 라만 활성 분자가 연쇄적으로 방출된다.
한편, 본 발명은 위에서 설명한 등온증폭용 프로브를 이용한 현장진단을 위한 휴대용 표적 핵산 검출 장치가 개시된다.
이하 도 1을 참조로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
도시된 바와 같이, 사용자가 휴대할 수 있고 내부에 소정 공간이 마련된 케이스(17)가 마련된다.
케이스(17)는 반드시 어떤 형상에 한정되지는 않지만, 그 내부에 이하 설명할 등온증폭하우징, 분리패드 및 검출패드가 내부에 위치할 수 있으면 본 발명에 적용 가능하다.
한편, 케이스(17) 내에 장착되고 일측이 개구되어 토출부가 형성되되 그 내부에는 표적 핵산에 대한 등온증폭을 시킬 수 있도록 라만 활성 분자가 포함된 프로브가 수용될 수 있는 등온증폭하우징(11)이 개시된다.
등온증폭하우징의 전체적인 형상은 용기 모양으로 되어 있으나, 이 역시 이러한 형상에 한정되는 것은 아니고, 내부에 등온증폭 대상인 반응용액이 침적될 수 있으면 본 발명에 적용 가능하다.
또한, 등온증폭하우징의 일측(도면상에는 상측)에는 개구된 토출부가 형성되는데, 이 토출부를 통해 등온증폭된 반응용액이 토출되면서 필터링 되고, 최종적으로 라만 활성 분자를 획득하게 된다.
이러한 필터링 작용이 이루어지기 위해 등온증폭하우징에 형성된 토출부에 인접된 상태로 라만 활성 분자 이외에 물질을 흡착하기 위한 분리패드(12)가 개시되고, 이어서 분리패드의 상측에 위치하고 분리패드를 통과한 라만 활성 분자를 획득하는 검출패드(13)가 위치한다.
이때, 도 1의 우측 도면에 도시된 바와 같이, 사용자가 등온증폭하우징이 내장된 케이스를 역전시키게 되면 중력에 의해 등온증폭된 반응용액이 하강하게 됨과 동시에 토출부를 통해 1차적으로 분리패드를 거치게 되어 라만 활성 분자 이외에 성분들이 분리되고, 분리패드를 통과한 라만 활성 분자가 2차적으로 검출패드에 의해 검출되는데, 그 후 검출된 라만 활성 분자를 표면-증강 라만 산란(surface-enhanced Raman scattering, SERS) 신호를 측정하게 되고, 검출의 재현성을 확보하기 위해 일정 영역의 라만 산란 신호의 평균값을 도출하게 된다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 있어서 라만 분석 장치의 분리패드 및 검출패드를 나타내는 도면으로 도시된 바와 같이 분리패드(12)에는 비오틴이 결합된 등온증폭 산물이 존재하고, 검출패드(13)에는 라만활성분자(16)가 획득된다.
더 나아가 도 5에 도시된 바와 같이, 소형 라만 분광기와 결합시켜 실시간으로 현장 다중 진단을 할 수도 있다.
한편, 도 2에 도시된 바와 같이, 그 내부로 분리패드와 검출패드가 안착되어 고정될 수 있도록 분리패드와 검출패드를 감싸는 고정틀(14)이 더 포함되는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 고정틀의 내측면을 따라 고정력과 밀폐력을 향상시키도록 메쉬망이 더 형성된 것을 특징으로 한다.
더 나아가 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이 등온증폭하우징 내에서 등온증폭되는 부분을 감싸 등온증폭이 유도될 수 있도록 별도의 열차단블록(10)이 더 포함되는 것을 특징으로 하는데, 구체적으로 이 열차단블록은 핵산의 등온증폭을 위하여, 이용하는 제한효소, 프로브 종류, 타겟 핵산의 종류에 따라 온도가 조절될 수 있고, 반응이 수행시에는 동일한 온도를 유지하게 만들 수 있다.
한편, 등온증폭하우징에는 등온증폭 반응을 위한 프라이머 및 제한효소가 더 수용되는 것을 특징으로 한다.
구체적으로는, 등온증폭부하우징에는 타겟 핵산에 대한 등온증폭반응용 프라이머, 증폭반응 효소, 증폭반응에 따라 라만 활성 분자를 방출하는 등온증폭용 프로브 및 제한효소를 포함하는 반응용액을 포함할 수 있다.
등온증폭용 프로브는 증폭반응 효소 및 증폭반응에 따라 라만 활성 분자를 방출하고, 등온증폭 반응 프라이머는 표적 핵산의 특정 서열에 상보적으로 결합하여 증폭 반응을 진행할 수 있다.
또한, 등온증폭하우징에는 여러 개의 표적 핵산을 다중 검출하기 위해 하나 이상의 등온증폭용 프로브를 포함할 수 있다.
또한, 반응 용액에 생체 시료를 첨가하여 등온증폭 반응을 실시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
등온증폭 반응은 도 3에 도시된 바와 같이 실시될 수 있으며, 등온증폭 반응에 의해 제한효소가 활성화되어 등온증폭용 프로브에 결합된 라만 활성 분자가 분리되는 것일 수 있다.
생체 시료는 개체의 생물학적 시료로부터 수득될 수 있으며, 예를 들어, 조직 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액 또는 복막액에서 확보된 핵산 샘플일 수 있다.
분리패드는, 스트렙타비딘(streptavidin), 아비딘(avidin) 또는 BSA(bovine serum albumin)으로 코팅된 실리카 나노입자로 성분으로 구성된 것을 특징으로 한다.
구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
분리패드(12)는 등온증폭하우징 내에서 증폭된 생성물로부터 라만 활성 분자가 결합된 프로브 조각과 나머지 비오틴이 결합된 등온증폭 산물을 분리하기 위한 것이다.
이 경우 분리패드(12)는 스트렙타비딘 또는 아비딘으로 코팅된 실리카 나노입자 혹은 이를 포함하는 유리섬유, 셀룰로오스, 겔 등의 소재로 이루어진 것일 수 있다.
분리패드(12)는 등온증폭 산물을 분리하기 위한 것으로, 구체적으로 도 4에 도시된 바와 같이, 등온증폭 반응에 의해 라만 활성 분자가 분리된 등온증폭 산물의 비오틴이 분리패드의 스트렙토아비딘 또는 아비딘과 결합하여 분리패드(12)에 남게 되고, 라만 활성 분자가 분리패드(12)를 통과하게 된다.
한편, 검출패드는 플라즈모닉 금속 나노 입자가 흡착된 매트릭스로 구성된 것을 특징으로 한다.
검출패드(13)는 다중 분석을 위한 복수의 패턴이 형성된 것으로, 플라즈모닉 금속 나노입자를 포함할 수 있으며, 입자화된 플라즈모닉 금속 나노입자들이 유리섬유, 셀룰로오스, 종이 등의 매트릭스 상에 형성되어 있다.
금속 나노입자는 국소 표면 플라즈몬 공명을 유도할 수 있는 은(Ag), 금(Au), 백금(Pt), 알루미늄(Al), 철(Fe), 아연(Zn), 구리(Cu), 주석(Sn), 니겔(Ni), 또는 이들 중 두 종류 이상 금속을 혼성화한 합금(alloy) 물질일 수 있다.
플라즈모닉 금속 나노 입자 간의 이격 거리는 라만 산란의 유도를 위해 광파장 이하의 크기로 이격되어 형성되는 것이 바람직하나, 시험 목적 및 주변 환경에 따라 다양한 크기로 이격되어 형성될 수 있다. 또한, 입자의 형태 및 크기 또한 시험 목적 및 주변 환경에 따라 다양하게 형성될 수 있다.
또한, 플라즈모닉 금속 나노 입자는 Aminopropyltriethoxysilane(APTES), Mercaptopropyl trimethoxysilane(MPTES), polyethylene glycol(PEG) 등을 이용한 검출 패드의 표면 개질을 통해 플라즈모닉 금속 나노 입자의 균일한 분포와 밀도를 증가시킬 수 있다.
플라즈모닉 나노 입자에 집적된 라만 활성 분자는 표면-증강라만산란 신호를 이용하여 검출한다.
라만 신호의 세기는 상기 등온 핵산 증?G 산물에서 분리된 라만 활성 분자의 양에 따라 증가하므로 정량이 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다.
[실시예]
실시예 1. 등온증폭반응용 프라이머 및 변형 등온증폭용 프로브의 제작
일 구체에서, 등온증폭반응용 프라이머 및 변형 등온증폭용 프로브는 검출하고자 하는 대상에 따라 다양한 서열 구조를 가질 수 있다.
본 실시예에서는 일 예로서 표 1에 도시된 바와 같이, 변형 등온증폭용 프로브는 주형 DNA 상의 개개 프라이밍 사이트(priming site)에 대한 내부 프라이머 FIP 또는 BIP에 라만 활성 분자 (SERS active dye), 제한효소 사이트 및 비오틴을 포함하도록 통상의 방법에 따라 제작 의뢰하여 제작하였다.
Figure 112020032148824-pat00001
실시예 2. 제한효소의 유무와 표적 핵산의 유무에 따른 표면-증강 라만 산란 신호차이
실시예 1에서 제작된 등온증폭반응용 프라이머 및 변형 등온증폭용 프로브를 이용하여 등온증폭 반응 수행 시 제한 효소의 유무와 표적 핵산의 유무에 따른 표면-증강 라만 산란 신호차이를 확인하였다.
라만 신호는 633 nm 레이저를 이용하여 300~1800 cm-1 영역에서 30초 동안 스펙트럼을 수집하였다.
도 6 및 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서 표적 핵산과의 상보적 결합이 가능한 변형 등온증폭용 프로브 종류에 따른 특이적 표면-증강 라만 산란 파장을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
즉, 일 양상에 따른 방법에 의하면 변형 등온증폭용 프로브에 따라 도입된 라만 활성 분자에 따라 단일 레이저 광원에서 다중 진단이 가능하다.
1 : 라만 분석 장치 10 : 열차단블록
11 : 등온증폭하우징 12 : 분리패드
13 : 검출패드 14 : 고정틀
15 : 비오틴이 결합된 등온증폭 산물 16 : 라만 활성 분자
17 : 케이스
<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> PROBE FOR ISOTHERMAL AMPLIFICATION AND ON-SITE DIAGNOSTIC APPARATUS USING THE SAME <130> PN2001-040 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-F3 <400> 1 gagacttcaa ctgaacaagt t 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-B3 <400> 2 acaggagttt cctgtaagg 19 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-LF <400> 3 gcagcagccc actcgtc 17 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-LB <400> 4 agaagcacaa ccagtagaag tacc 24 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-FIP <400> 5 cgagagggaa cgcttcatca agtttctcat gagacttctg ac 42 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-BIP <400> 6 acaggagttt cctgtaagg 19 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-F3 <400> 7 agtaagatta gcctagtttc tgt 23 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-B3 <400> 8 tccatatgtc caaagagaga c 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-LF <400> 9 caggcacgaa aacagtggaa ac 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-LB <400> 10 cgtttaagca gctctgcgct ac 22 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-FIP <400> 11 gaggaactga atcgcgcgtt gacttctcct taaacggca 39 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2-BIP <400> 12 ttcacataat cgccccgagc taatggatta gcctctacac g 41

Claims (11)

  1. 사용자가 휴대할 수 있고 내부에 소정 공간이 마련된 케이스;
    상기 케이스 내에 장착되고 일측이 개구되어 토출부가 형성되되 그 내부에는 표적 핵산에 대한 등온증폭을 시킬 수 있도록 라만 활성 분자가 포함된 프로브 및 제한효소가 수용될 수 있는 등온증폭하우징;
    상기 등온증폭하우징에 형성된 토출부에 인접된 상태로 상기 라만 활성 분자 이외에 물질을 흡착하기 위한 분리패드; 및
    상기 분리패드의 상측에 위치하고 상기 분리패드를 통과한 라만 활성 분자를 획득하는 검출패드를 포함하되,
    상기 프로브는 라만 활성 분자; 제한효소 사이트; 및 비오틴을 포함하는 등온증폭용 프로브이고,
    상기 라만 활성 분자는 상기 프로브의 5' 말단에 결합되고, 상기 제한효소 사이트는 상기 프로브에 결합된 라만 활성 분자와 비오틴의 사이에 위치하며,
    상기 등온증폭하우징에 등온 조건에서 증폭 반응이 진행될 경우 상기 제한효소에 의해 상기 제한효소 사이트가 절단되고, 제한효소 사이트 절단으로 인해, 상기 라만 활성 분자 및 상기 라만 활성 분자 이외에 물질이 분리되고,
    상기 등온증폭하우징이 내장된 케이스의 역전시 중력에 의해 라만 활성 분자가 포함된 프로브가 하강하며,
    분리된 라만 활성 분자가 상기 검출패드에 의해 획득되는 것을 특징으로 하는, 현장진단을 위한 휴대용 표적 핵산 검출 장치.
  2. 청구항 1에 있어서,
    그 내부로 상기 분리패드와 검출패드가 안착되어 고정될 수 있도록 상기 분리패드와 검출패드를 감싸는 고정틀이 더 포함되는 것을 특징으로 하되,
    상기 고정틀의 내측면을 따라 고정력과 밀폐력을 향상시키도록 메쉬망이 더 형성된 것을 특징으로 하는, 현장진단을 위한 휴대용 표적 핵산 검출 장치.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 등온증폭하우징 내에서 등온증폭되는 부분을 감싸 등온증폭이 유도될 수 있도록 별도의 열차단블록이 더 포함되는 것을 특징으로 하는, 현장진단을 위한 휴대용 표적 핵산 검출 장치.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 등온증폭하우징에는 등온증폭 반응을 위한 프라이머가 더 수용되는 것을 특징으로 하는, 현장진단을 위한 휴대용 표적 핵산 검출 장치.
  5. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분리패드는,
    스트렙타비딘(streptavidin), 아비딘(avidin) 또는 BSA(bovine serum albumin)으로 코팅된 실리카 나노입자로 성분으로 구성된 것을 특징으로 하는, 현장진단을 위한 휴대용 표적 핵산 검출 장치.
  6. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출패드는,
    플라즈모닉 금속 나노 입자가 흡착된 매트릭스로 구성된 것을 특징으로 하는, 현장진단을 위한 휴대용 표적 핵산 검출 장치.
  7. 삭제
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 라만 활성 분자는 FAM(5'-Fluorescein phosphoramidite), TAMRA(5'-TAMRA phosphoramidite), VIC(2′-chloro-7′'phenyl-1,4-dichloro-6-carboxy-fluorescein), Cy5(2-[5-[1,3-Dihydro-1-[3-(4-methoxytriphenylmethoxy)propyl]-3,3-dimethyl-2H-indol-2-ylidene]-1,3-pentadien-1-yl]-1-[3-[N,N-diisopropylamino(2-cyanoethoxy)phosphinoxy]propyl]-3,3-dimethyl-3H-indolium), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein, Succinimidyl Ester), HEX([6 - carboxy - 2',4,4',5',7,7' -hexachlorofluorescein]), ROX(Rhodamine X, Rhodamine 101), 4-MBA(4-mercaptobenzoic acid), MMC(2,7-mercapto-4-methylcoumarin), MMTAA(2-mercapto-4-methyl-5-thiazoleacetic acid), TFMBA(2,3,5,6-Tetrafluoro-4-mercaptobenzoic acid), 및 MGITC(malachite Green Isothiocyantate) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 현장진단을 위한 휴대용 표적 핵산 검출 장치.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 장치를 포함하는, 현장진단을 위한 표적 핵산 검출 키트.
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