KR20130017527A - 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암의 진단 방법 - Google Patents

대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암의 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암이 의심되는 환자의 시료로부터 APOC1(Apolipoprotein C1), NSE(Neuron-specific enolase) 및 HIG2(Hypoxia-inducible gene 2) 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하여 정상인의 시료보다 APOC1, NSE 및 HIG2 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준이 높은 경우 갑상선암, 유방암 또는 신장암으로 진단하고, APOC1 및 HIG2 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준은 높고, NSE 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준은 낮은 경우 대장암으로 진단하는 단계를 포함하는 APOC1, NSE 및 HIG2 마커를 이용한 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암을 예측 또는 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암의 진단 방법{Method for diagnosis of colorectal cancer, thyroid cancer, breast cancer or renal cell carcinoma}
본 발명은 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암의 진단 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 암이 의심되는 환자의 시료로부터 APOC1(Apolipoprotein C1), NSE(Neuron-specific enolase) 및 HIG2(Hypoxia-inducible gene 2) 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하여 정상인의 시료보다 APOC1, NSE 및 HIG2 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준이 높은 경우 갑상선암, 유방암 또는 신장암으로 진단하고, APOC1 및 HIG2 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준은 높고, NSE 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준은 낮은 경우 대장암으로 진단하는 단계를 포함하는 APOC1, NSE 및 HIG2 마커를 이용한 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암을 예측 또는 진단하는 방법에 관한 것이다.
세계적으로 2003년 한해 암 발병 환자의 수는 300만명이 넘고, 국내에서의 발병율도 해마다 증가하여 2002년에는 한해 10만명에 이르고 있다. 그 중 폐암, 대장암, 유방암이 전체의 40%를 차지하고 있으며 식생활의 서구화로 국내 대장암, 유방암, 폐암의 발병율도 점차 증가하고 있는 추세이다.
지난 수년간 암에 대한 집중적인 연구가 이루어졌음에도 불구하고, 아직까지 암(특히 진행성 암)을 효과적으로 치료할 수 있는 확실한 치료제가 없는 상태로, 암을 초기 단계에 발견하여 외과적 수술로 암세포를 제거하는 것이 장기 생존율을 높이는 가장 효과적인 방법이라 할 수 있다.
기존 항암제는 작용 기작에 따라 크게 항암치료보조제(Adjunct therapies)와, cytotoxics, 호르몬제로 나뉘어진다. 항암치료보조제는 암세포를 타겟하는 것이 아니라 항암 치료 중에 빈번하게 발생하는 부작용을 줄이기 위한 보조적인 치료 방법으로, Anti-emetics, 비스포스포네이트(bisphosphonates), 조혈성장인자(hematopoietic growth factors), 진통제(analgesics) 등을 포함한다.
기존 항암제의 부작용 및 내성을 극복하기 위한 대안으로 암 특이적인 타겟을 대상으로 하는 새로운 기작의 치료제들이 개발되고 있다. Innovative therapies의 작용 기작은 매우 다양하지만, 정상세포가 암화되어가는 과정에 나타나는 암 특이적 마커(cancer specific marker)나 유전적 이상(genetic abnormality)을 이용하여 종양 세포에만 특이적으로 작용하는 치료제라는 공통점을 가진다. 현재 개발 중인 치료제들은 암치료 기작에 따라 크게 혈관 신생 억제제(angiogenesis inhibitors), 면역증강제(immunostimulators), 종양-타겟제제(tumor-targeted agents)로 나눌 수 있다. 항암제에 의한 독성을 최소화하기 위한 방안으로 떠오르는 암 타겟팅 치료(cancer targeted therapy)의 가장 중요한 포인트는 암세포 특이적인 유전자를 찾아내는 것이다. 이를 위하여 세계 유수의 바이오텍 회사들은 유전자 발현 프로파일(gene expression profiling), 유전자 맵핑(gene mapping), 프로테오믹스(proteomics), 인실리코 분석(in silico analysis) 등을 통하여 새로운 타겟 유전자를 찾는 작업을 진행 중이다. 일례로, 선두 바이오텍 중의 하나인 Genentech은 지난 27년간 genomics를 이용한 신규 타겟 발견(novel target discovery)을 위한 프로젝트를 진행하여 1,200여 개의 질병 관련 유전자 특허를 보유하고 있다. 최근에는 SPDI(Secreted Protein Discovery Initiative) 프로젝트를 진행하여(1996년-2001년) 250여개의 신규 단백질을 포함하여 1,000개 이상의 분비 단백질을 확보하였다.
한국공개특허 제2009-0043851호에는 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커가 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2009-0105394호에는 대장암 진단용 마커와 이에 의해 코드되는 단백질 및 이를 이용한 대장암 진단 키트가 개시되어 있으나, 본 발명의 마커와는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자는 대장암, 갑상선암, 유방암 및 신장암 환자의 혈액과 정상인의 혈액에서 APOC1, NSE 및 HIG2 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하여 APOC1, NSE 및 HIG2 단백질의 수준이 정상인보다 높은 경우 갑상선암, 유방암 또는 신장암으로 진단하고, APOC1 및 HIG2 단백질의 수준은 높고, NSE 단백질의 수준은 낮은 경우 대장암으로 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 암이 의심되는 환자의 시료로부터 APOC1, NSE 및 HIG2 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하여 정상인의 시료보다 APOC1, NSE 및 HIG2 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준이 높은 경우 갑상선암, 유방암 또는 신장암으로 진단하고, APOC1 및 HIG2 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준은 높고, NSE 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준은 낮은 경우 대장암으로 진단하는 단계를 포함하는 APOC1, NSE 및 HIG2 마커를 이용한 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암을 예측 또는 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 APOC1, NSE 및 HIG2 마커를 이용한 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 진단 방법은 혈액으로부터 샘플을 수집하여 진단이 가능하므로 다른 방법에 비해 실시가 용이하며 통증이 비교적 적고, 정확한 진단을 가능하게 하므로, 4종 암에 대해 적절히 대응할 수 있게 하여, 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암에 의한 사망률을 낮추는데 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 유방암, 신장암 및 대장암 환자의 혈액에서 APOC1, NSE 및 HIG2 단백질의 발현을 나타낸다.
도 2는 대장암, 갑상선암, 유방암 및 신장암 환자의 혈액에서 APOC1 단백질의 발현을 나타낸다.
도 3은 대장암, 갑상선암, 유방암 및 신장암 환자의 혈액에서 NSE 단백질의 발현을 나타낸다.
도 4는 대장암, 갑상선암, 유방암 및 신장암 환자의 혈액에서 HIG2 단백질의 발현을 나타낸다.
도 5는 대장암 환자의 혈액에서 연령 및 성별에 따른 APOC1, NSE 및 HIG2 단백질의 발현을 나타낸다.
도 6은 갑상선암 환자의 혈액에서 연령 및 성별에 따른 APOC1, NSE 및 HIG2 단백질의 발현을 나타낸다.
도 7은 대장암 환자의 혈액에서 암 진행 단계(0 ~ Ⅳ)에 따른 APOC1, NSE 및 HIG2 단백질의 발현을 나타낸다.
도 8은 대장암, 갑상선암, 유방암 및 신장암 환자의 혈액에서 APOC1, NSE 및 HIG2 단백질의 발현양의 범위를 나타낸 분석 그리드(grid)이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 암이 의심되는 환자의 시료로부터 APOC1(Apolipoprotein C1), NSE(Neuron-specific enolase) 및 HIG2(Hypoxia-inducible gene 2) 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하여 정상인의 시료보다 APOC1, NSE 및 HIG2 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준이 높은 경우 갑상선암, 유방암 또는 신장암으로 진단하고, APOC1 및 HIG2 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준은 높고, NSE 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준은 낮은 경우 대장암으로 진단하는 단계를 포함하는 APOC1, NSE 및 HIG2 마커를 이용한 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암을 예측 또는 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 APOC1, NSE 및 HIG2의 유전자 및 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있으나(APOC1 GeneBank CAG33188, NM_001645 : NSE Genebank M22349; HIG2 NCBI Ref. NM_001098786), APOC1, NSE 및 HIG2와 대장암, 갑상선암, 유방암 및 신장암과의 상호 연관성은 전혀 알려지지 않았다.
또한, NSE (Neuron-specific enolase)는 감마 엔돌라제 (Gamma enolase) 또는 엔돌라제 2 (Enolase 2, ENO2)로 상호 교환하여 사용할 수 있다.
보다 구체적으로는, 유전자의 발현 수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어 "환자의 시료"란 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 마커 유전자인 APOC1, NSE 및 HIG2의 발현 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하고, 바람직하게는 환자의 혈액이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 유전자 발현 수준을 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 의심 환자에서의 유전자 발현 수준과 비교함으로써 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 의심 환자의 실제 암 환자 여부를 진단할 수 있다. 즉, 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암으로 추정되는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, APOC1, NSE 및 HIG2 마커 발현 수준이 정상인보다 높은 경우 갑상선암, 유방암 또는 신장암으로 진단하고, APOC1 및 HIG2 단백질의 수준은 높고, NSE 단백질의 수준은 낮은 경우 대장암으로 진단할 수 있는 것이다.
mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 의심 환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 APOC1, NSE 및 HIG2 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가 여부를 진단하여 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 의심 환자의 실제 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 발병 여부를 진단할 수 있다.
mRNA 발현 수준 측정은 바람직하게는, 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.
상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 진단 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다.
한편, DNA 칩은 상기 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 APOC1, NSE 및 HIG2 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암의 발병 여부를 판독할 수 있다.
단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 의심 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 APOC1, NSE 및 HIG2 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 진단하여, 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 의심 환자의 실제 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 발병 여부를 진단할 수 있다.
본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 APOC1, NSE 및 HIG2 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-락타마제 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8, [Os(bpy)3 ]2+, [RU(bpy)3 ]2+, [MO(CN)8]4- 등이 포함되며 이에 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이에 제한되지 않는다.
단백질 발현 수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 발병 여부를 확인할 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
또한, 바람직하게는, 상기 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 대장, 정상 갑상선, 정상 유방 또는 정상 신장 상피 조직 및 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.
또한, 바람직하게는, 상기 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암 발병 여부를 확인할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 종양 세포주에서 3종 마커의 발현량 분석
본 발명은 2종의 비 종양 정상세포, 4종의 암세포를 대상으로 동일 세포 (104 cells)의 48시간 배양 후 배양액으로부터 분비된 3종 마커인 APOC1, NSE 및 HIG2 단백질의 농도를 분석하였다. APOC-1 (정상세포 대비 평균 2.6배 증가), HIG-2 (정상세포 대비 평균 1.73배 증가)의 경우 정상세포에 비하여 유의미하게 높은 농도의 단백질이 분석되었으며, NSE의 경우 유방암세포, 신장암 세포에서는 유의미하게 높은 농도 (정상세포 대비 평균 1.7배 증가)를 보인 반면, 대장암 세포 (정상세포 대비 평균 2.75배 감소)에서는 정상세포보다 낮은 양의 NSE가 검출되었는데, 이는 환자 혈액을 이용한 시험 결과와 일치하는 결과이다(도 1).
실시예 2. 4종 고형암 환자의 혈액내 3종 마커의 농도 분석
신장암, 유방암, 대장암, 갑상선암등 4종 고형암의 혈액내 APOC1, NSE, HIG2 의 농도를 특이적 항체를 이용하여 분석하였다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 정상인 (n=134)의 경우 APOC1, NSE 및 HIG2의 혈중 평균 농도는 각각 APOC1: 2.323 ng/ml (STEDV 0.188 ng/ml), NSE: 2.307ng/ml (STDEV 0.541 ng/ml), HIG2: 2.296 ng/ml (STDEV 0.323ng/ml)으로 비교적 높은 수치의 값을 보이고 있다.
Figure pat00001
암종별 혈중 APOC-1 단백질 농도는 공통적으로 4종 암에서 정상에 비해 높은 수치로 검출되었다(표 1 및 도 2).
혈중 NSE 단백질 농도는 대장암 환자에서는 정상인과 유의미한 차이를 보이고 있지 않다. 그러나 갑상선암, 유방암, 신장암 환자 혈액에서 유의미하게 높은 수치를 보였다(표 1 및 도 3).
혈중 HIG-2 단백질 농도는 4종 암환자의 혈액에서 공통적으로 정상인에 비하여 높은 농도를 보여주었다(표 1 및 도 4).
실시예 3. 성별 및 연령에 따른 4종 고형암 환자의 혈액내 3종 마커의 감수성 분석
대장암 환자 혈액을 이용한 APOC1, NSE 및 HIG-2의 3종 마커의 감수성 분석에서 성별 및 연령에 따른 유의미한 차이점을 나타내지 않았다(도 5). 이 결과는 본 진단 방법이 연령대, 성별에 관계없이 종양 예측력을 가지고 있음을 의미한다. 다만 해당 암의 발병 경향상 남, 여 모두에서 50세 미만의 환자의 경우 수가 적어 통계적 의미는 제한될 수 있다.
갑상선암 환자 혈액을 이용한 APOC1, NSE 및 HIG-2의 3종 마커의 감수성 분석에서 성별 및 연령에 따른 유의미한 차이점을 나타내지 않았다(도 6). 이 결과는 본 진단 방법이 연령대, 성별에 관계없이 종양 예측력을 가지고 있음을 의미한다.다만 갑상선암은 여성 환자의 비율이 전체 시료의 87%에 달하고 있으며, 50세 이하 환자의 수가 전체의 61%에 달하고 있어, 상대적으로 50세 이상 환자에서, 특히 50세 이상 남성 환자에서 통계적 유의미성은 제한될 수 있다.
실시예 4. 종양 발달 단계에 따른 혈액내 3종 마커의 감수성 분석
종양의 발달단계(진행단계)는 전문의의 의료적 진단에 의하여 Stage O (정상인), Stage I, Stage II, Stage III, Stage IV로 구분되었다. 본 종양단계에 따른 분석은 대장암, 갑상선암 혈액에 대하여 분석하였다 (신장암의 경우 확보된 환자 전원이 Stage IV로 판정되어 별도의 단계별 분석을 실행하지 않았다). 대장암 환자 혈액에서 단계에 관계없이 혈중 2종 마커 (APOC1, HIG-2)의 고발현이 관찰되었다(도 7). NSE의 경우 환자의 종양 단계에 관계없이 정상인과 유사한 값을 보였다. 본 결과를 통하여 중기-말기 환자에서 뿐만 아니라 조기 암환자의 진단에 매우 유용할 가능성을 보여주고 있다.
실시예 5. 혈액내 3종 마커를 이용한 암 진단법
혈액 분석을 이용한 암 스크린에서 취할 수 있는 분석법으로 정상인 대비 특정 마커의 발현양 증가/감소 비율의 비교에 의한 판정, 또는 특정 마커의 혈중농도 구간의 지정에 의한 예측으로 나눌 수 있다.
환자 이력이 확보된 혈액 샘플의 분석 결과 도 8의 진단표를 제안할 수 있다. 시제품(또는 동일 방법)을 통한 분석에서 미지 시료의 분석은 키트에 포함된 Reference (정상인 혈중 평균 +/- 95% 이내 신뢰성 구간농도) 및 미지의 혈액시료의 농도를 대입하여 높은 예측력을 확보하는 것이 가능하다. 다만 본 진단표는 3종 마커의 농도를 4종 암에 대하여 시험한 결과에 기초하고 있어, 본 결과에서 포함되지 않은 타종 암에 대하여 예측하기는 어렵다. 본 결과에 의하면 4종 암환자의 혈액 내 3종 마커의 농도는 제안된 진단표 상에서 특정 구간에 나타나고 있어 암종의 구별이 가능하다. 상기 진단표는 각 마커의 혈중 농도가 암종별로 다르게 나타나는 범위를 기초로 하여 제작이 가능하다. 예를 들어, 상기 진단표의 활용은 미지 혈액에서 3종의 마커의 농도가 측정 되었을때 다음과 같은 분석을 하는데 효과적이다. 첫째, 암의 존재 유무를 판단하는데 유용하다. 혈중 마커의 농도가 정상인의 범위 (검정색 막대)에서 모두 분석될 때 암 또는 실시예의 4종 암을 가지고 있지 않음을 판정할 수 있다. 둘째, 혈중 마커의 상대 농도 범위 (진단표에서 APOC1: 적색 막대, NSE: 청색 막대, HIG2: 황색 막대)의 구간을 이용하여 특정 암, 또는 실시예의 4종 암을 통계적으로 진단할 수 있다. 진단표의 제작은 4종 암의 농도구간을 기초하여 4종 암을 구분할 수 있는 최대-최소 구간을 설정하여 제작할 수 있다. 실시예에서는 실험군 내의 농도분포에서 각각 약 90%의 시료에서 분포되는 농도구간을 이용하였다.
정상인 대비 암환자에서 나타나는 마커의 농도의 분포를 이용하여 통계적으로 분석할 시 암의 유무 뿐 아니라 각 암종에서 상이한 농도 범위를 가지는 마커의 농도구간을 고려할 때 보다 정밀하게 특정 암의 진단을 가능하게 한다.

Claims (6)

  1. 암이 의심되는 환자의 시료로부터 APOC1(Apolipoprotein C1), NSE(Neuron-specific enolase) 및 HIG2(Hypoxia-inducible gene 2) 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하여 정상인의 시료보다 APOC1, NSE 및 HIG2 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준이 높은 경우 갑상선암, 유방암 또는 신장암으로 진단하고, APOC1 및 HIG2 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준은 높고, NSE 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준은 낮은 경우 대장암으로 진단하는 단계를 포함하는 APOC1, NSE 및 HIG2 마커를 이용한 대장암, 갑상선암, 유방암 또는 신장암을 예측 또는 진단하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 환자의 시료는 환자의 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 중 어느 하나를 이용하는 것인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111712713A (zh) * 2018-02-18 2020-09-25 马尔克斯·马尔克斯·利迪亚 用于乳腺癌的早期检测的方法、装置和试剂盒

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