KR20130007909A - 비만인 개체의 대사증후군의 발병 위험을 진단하기 위한 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도 - Google Patents

비만인 개체의 대사증후군의 발병 위험을 진단하기 위한 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비만인 개체의 대사증후군의 발병 위험을 효율적으로 진단하기 위한 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 조성물, 마이크로어레이 및 키트 및 대사증후군의 변경된 위험도를 갖는 개체를 효율적으로 확인하는 방법을 제공한다.

Description

비만인 개체의 대사증후군의 발병 위험을 진단하기 위한 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도{Polynucleotide for detecting a risk of developing metabolic disorder in a subject with obesity and use thereof}
본 발명은 비만인 개체의 대사증후군의 발병 위험을 효율적으로 진단하기 위한 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 조성물, 마이크로어레이 및 키트 및 대사증후군의 변경된 위험도를 갖는 개체를 효율적으로 확인하는 방법에 관한 것이다.
비만 (obesity)은 과도한 체지방이 건강에 유해한 영향을 미쳐, 수명을 감소시키고 및/또는 건강 문제를 증가시키게 하는 정도로 축적된 의약적 상태이다. 비만은 심장 질환, 2형 당뇨병, 수면 중 호흡곤란 등 다양한 질병의 발병 가능성을 높인다.
국내에서도 사회경제적인 발달과 함께 육식 위주의 식생활의 증가로 국민건강영양조사 결과 지속적으로 비만인구가 증가하고 있는 것으로 보고되고 있다. 비만 유병률 (만 19세 이상, 체질량지수 25kg/㎡ 이상)은 1998년 26.0%에서 2008년에는 30.7%로 증가하고 있으며 미국 (NHANES, 만 20세 이상, 체질량지수 30kg/㎡ 이상)의 비만 유병률 32.2%와 비슷한 수준이었다. 남자의 비만유병률은 35.6%, 여자는 26.5%로 남자가 더 높았다 (2008 국민건강통계, 보건복지부).
대사증후군 (metabolic syndrome)은 연합하여 (in concert), 심혈관 질환 및 당뇨병의 발병의 위험을 증가시키는 의학적 장애 (medical disorder)의 조합이다. 대사증후군의 발병 원인은 잘 알려져 있지 않으나 일반적으로 인슐린 저항성 (insulin resistance)이 근본적인 원인으로 작용한다고 추정하고 있다. 인슐린 저항성이란 혈당을 낮추는 인슐린에 대한 몸의 반응이 감소하여 근육 및 지방세포가 포도당을 잘 섭취하지 못하게 되고 이를 극복하고자 더욱 많은 인슐린이 분비되어 여러 가지 문제를 일으키는 것을 말한다.
WW-도메인 함유 옥시도리덕타제 (WW-domain-containing oxidoreductase: WWOX) 유전자는 16번 염색체의 장암 23 (q23)에 위치하며 1.1Mb의 큰 사이즈로 2개의 WW 도메인과 단쇄-데히드로게나제/리덕타제 도메인 (SRD)를 갖는다 (J cell Biochem 108:737-745, 2008). WWOX 유전자는 NCBI accession 번호 NM605131의 서열을 갖는 것일 수 있다. WWOX 유전자는 종양억제 유전자로 알려져 있으며 췌장암, 갑상선암, 유방암 등에서 기능소실이 보고되고 있다 (Clin. Cancer Res. 2004:10: 249-2465).
본 발명에서는 한국인 중 정상체중 정상 대사특성을 나타내는 정상 체중군 과 대사증후군을 나타내는 비만인에서 대사증후군 발생과 관련이 있을 것으로 예측되는 WWOX 유전자의 단일 염기 다형성의 빈도를 분석하였다.
일 양상은 비만인 개체의 대사증후군의 발병 위험을 효율적으로 진단하기 위한 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비만인 개체의 대사증후군의 발병 위험을 효율적으로 진단하기 위한 조성물, 마이크로어레이 또는 키트를 제공하는 것이다.
다른 양상은 대사증후군의 변경된 위험도를 갖는 개체를 효율적으로 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 서열번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 선택된 폴리뉴클레오티드의 단일염기다형 (single nucleotide polymorphism: SNP) 위치를 포함하고 상기 선택된 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 10 개 이상의 연속 뉴클레오티드로서, 상기 SNP 위치는 서열번호 1 내지 4의 경우 101번째 염기인 것인 비만인 개체의 대사증후군의 발병 위험을 진단하기 위한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 서열번호 1 내지 4에서 101번 위치의 s, w 및 y는 각각 C 또는 G, A 또는 T 및 C 또는 T를 나타낸다.
서열번호 1 내지 4의 폴리뉴클레오티드는 표 1 및 2에 나타낸 바와 같은 특성을 갖는다. 서열번호 1 내지 4의 폴리뉴클레오티드는 SNP 명칭 rs17572124, rs8050912, rs1566884, 및 rs1397158를 포함하는 인간 게놈 서열이다. 이들 폴리뉴클레오티드는 인간 WWOX 유전자 또는 그의 인트론에 해당하는 서열로서, 표 1 및 2에 나타낸 바와 같은 대립인자 구성, 유전자형 빈도, 소수대립인자 빈도, p 값, OR 및 유전 모델을 갖는다.
WW-도메인 함유 옥시도리덕타제 (WW-domain-containing oxidoreductase: WWOX) 유전자는 16번 염색체의 장암 23 (q23)에 위치하며 1.1Mb의 큰 사이즈로 2개의 WW 도메인과 단쇄-데히드로게나제/리덕타제 도메인 (SRD)를 갖는다 (J cell Biochem 108:737-745, 2008). WWOX 유전자는 NCBI accession 번호 NM605131의 서열을 갖는 것일 수 있다. WWOX 유전자는 종양억제 유전자로 알려져 있으며 췌장암, 갑상선암, 유방암 등에서 기능소실이 보고되고 있다 (Clin Cancer Res 2004:10: 249-2465).
서열
번호		 SNP 명칭 유전자,
위치		 SNP A a 유전자형 빈도수
con_AA con_Aa con_aa cas_AA cas_Aa cas_aa
1 rs17572124 WWOX,
인트론5		 G/C G C 539 110 9 1321 392 23
2 rs8050912 WWOX,
인트론5		 A/T A T 276 301 96 639 871 259
3 rs1566884 WWOX
 C/T C T 335 271 44 801 760 155
4 rs1397158 WWOX,
인트론8		 T/C T C 445 199 29 1082 598 88
서열번호 MAF_con MAF_cas p-값 OR(95% CI) 유전모델
1 0.0973 0.1262 0.002571 1.433(1.134-1.810) 우성
2 0.3663 0.3926 0.01659 1.258(1.043-1.517) 우성
3 0.2762 0.3118 0.01761 1.253(1.040-1.510) 우성
4 0.1909 0.2189 0.02217 1.251(1.033-1.515) 우성
표 1에서 정상체중-정상 대사군 개체와 비만 체중-대사증후군인 개체의 모수는 673명 및 1770명이었으며, 전체 시료 중 95% 이상 데이터가 확인된 경우의 SNP를 이용하였다.
표 1에서 A는 다수 대립인자, a는 소수 대립인자를 나타내고, con_AA, con_Aa 및 con_aa는 대조군 즉, 정상체중이고 정상 대사군인 개체에서의 유전자형 빈도를 나타내고, cas_AA, cas_Aa 및 cas_aa는 환자군 즉, 비만 체중이고 대사증후군인 개체에서의 유전자형 빈도를 나타내는 것이다. 표 2에서 MAF_con 및 MAF_cas는 대조군과 환자군에서의 소수 대립인자의 빈도를 나타낸다.
표 1에서, rs 번호는 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov, National Center for Biotechnology Information) 젠 뱅크에 등록된 SNP의 번호로서, 상기 서열번호에 나타낸 서열은 SNP를 포함하는 이들 서열의 일부를 나타낸 것이다. 당업자라면, rs 번호를 참조하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있다.
표 2에서 칼럼 'p-값'은 상기 SNP의 유전자형의 분포가 정상인과 환자군에서 주어진 모형에서 유의하게 차이가 나는지에 대한 검증의 결과인 p-값 (p-value)를 의미한다.
표 2에서 칼럼 'OR (95% CI)'은 유전자형을 기준으로 정상인군 중에서 해당 SNP를 가질 확률에 대한 환자군 중에서 해당 SNP를 가질 확률인 오즈비 (odds ratio)를 나타내는 것으로, 괄호 안은 해당 오즈비에 대한 상하 5% 에러 범위를 고려한 95% 신뢰구간의 하한 및 상한을 의미한다. 각 오즈비가 1 보다 큰 경우에는 해당 SNP의 소수 대립인자와 대사증후군의 연관성이 발병 위험을 증가시키는 효과를 나타내는 것이다.
표 2에서 유전모델은 각 SNP의 소수 대립인자가 대사증후군 발병과의 연관성을 나타내는 유전 모델로 우성 모델 (dominant)은 AA 유전자형을 가지는 사람에 비해, Aa 또는 aa 유전형을 가지는 경우 대사증후군의 발병 위험이 증가 또는 감소할 수 있는 경우를 나타내는 것이다. 즉 소수 대립인자가 하나 또는 두 개 존재할 때 소수 대립인자가 하나도 없는 경우보다 대사증후군의 발병 위험이 증가 또는 감소할 수 있다.
본 발명에 있어서, 위험 대립인자 (risk allele)는 기준 대립인자를 소수대립인자 a로 하여 대사증후군의 a의 빈도가 정상 대사군에서의 a의 발현 빈도 보다 큰 경우에는 a를 위험 대립인자로 하고, 그 반대의 경우에는 A를 위험 대립인자로 하였다. 위험 대립인자를 많이 가질수록 대사증후군 발병 가능성이 높음을 의미한다. 예를 들면, 서열번호 1 내지 4에서 소수 대립인자 a가 존재하는 경우, 상기 대상을 대사증후군 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정할 수 있다. 대립인자 A 및 a에 대하여는 표 1에 나타낸 바와 같다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1 내지 4에 대하여, MAF-cas가 MAF-con 보다 크므로, 위험 대립인자는 각각 모두 a 대립인자, 즉 C, T, T 또는 C이다.
본 발명에 있어서, 상기 개체는 사람일 수 있다. 상기 사람은 예를 들면, 한국인일 수 있다. 또한, 상기 개체는 비만인 사람일 수 있다. 상기 개체는 예를 들면, 비만인 한국인일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 정상 체중이고 정상 대사군에 대한 비만 체중인 개체의 대사증후군 발명의 위험을 진단하기 위한 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "비만 (obesity)"은 체중 (kg)을 미터 단위로 나타낸 신장의 제곱 값으로 나누어 계산되는 체질량지수 (body mass index: BMI, kg/m2) 값에 기반하여, 2000년 WHO 아시아 태평양 지역인에 대한 체질량지수와 체중 분류에 관한 기준에 따라 정의하였다. 구체적으로, 체질량지수가 18.5 내지 22.9인 경우 정상 체중군으로 분류하고, 체질량지수가 25 이상인 경우 비만 체중군으로 분류하였다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어 "대사증후군 (metabolic syndrome)"은 미국 국가 콜레스테롤 교육 프로그램 성인 치료 패널 III (National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel III: NCEP ATPIII) (JAMA 2001:285:2486-97)의 정의에 따라 복부 비만을 나타내는 허리둘레, 혈중 HDL 콜레스테롤 (HDL cholesterol) 농도, 혈중 중성지방 (triglyceride) 농도, 혈압 및 공복 혈당 (fasting glucose) 농도의 5가지 항목에서 아래 표의 기준에 대하여, 3개 이상을 만족하는 경우로 정의될 수 있다. 허리둘레와 공복 혈당 농도는 2005년 대한 당뇨학회의 기준을 따랐다 (Yonsei Med. J. 2005;46:198-205). 정상 체중의 정상 대사군은 대사증후군을 평가하는 5개 기준을 하나도 만족하지 않은 것으로 정의될 수 있다.
대사증후군 기준 남 여
허리둘레(cm) >90 >85
HDL 콜레스테롤농도(mg/dl) <40 <50
중성지방농도(mg/dl) ≥150
혈압(mmHg) 수축기혈압≥130
또는 이완기혈압≥85
공복 혈당농도(mg/dl) >100
본 발명의 일 구체예는 "비만인 개체의 대사증후군 발병 위험을 진단하기 위한 것"일 수 있다. 즉, 대사증후군 발병의 상대적인 위험을 진단하기 위한 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 위험은 정상체중 군에 비하여 증가되어 있는지, 또는 감소되어 있는지를 진단하기 위한 것일 수 있다. 또한, 상기 위험은 다른 특정 대립인자 또는 유전자형에 대한 특정 대립인자 또는 유전자형을 갖는 개체에서의 위험일 수 있다. 진단의 대상은 한국인일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "뉴클레오티드 (nucleotide)"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 나타내며, 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체 및 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체를 포함할 수 있다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 용어 "폴리뉴클레오티드 (polynucleotide) 또는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)"는 상기 뉴클레오티드들의 중합체를 의미하는 것으로 단일가닥 또는 이중가닥 형태를 포함할 수 있다.
한편, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에서 101 번째 뉴클레오티드 즉 대립인자의 다형에 관한 것이나, 이러한 대립형 뉴클레오티드가 이중가닥의 게놈 DNA (genomic DNA)에서 발견되는 경우, 상기한 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 예컨대, 대립인자가 "T"인 경우 그의 상보적인 뉴클레오티드 서열에서 SNP는 "A"가 된다. 이러한 측면에서, 본 명세서의 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, 게놈 DNA에서 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 길이가 10 내지 100, 예를 들면, 10 내지 90, 10 내지 80, 10 내지 70, 10 내지 60, 10 내지 50, 10 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 25, 20 내지 100, 30 내지 90, 40 내지 80, 50 내지 70, 20 내지 60, 20 내지 50, 30 내지 40, 20 내지 30 또는 20 내지 25 뉴클레오티드인 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 분석의 대상으로서 사용될 수도 있다.
본 명세서에서 용어 "프라이머 (primer)"는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오티드일 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머 세트는 주형인 서열번호 1 내지 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 상보성을 가지면 충분하다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 DNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 갖는 것이다. 이러한 프라이머의 디자인은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램 (예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다. 상기 프라이머는 임의의 증폭 방법 예를 들면, PCR, 또는 등온증폭방법의 프라이머일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "프로브 (probe)"는 특정 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형된 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프로브는 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드를 포함하고 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 또한, 상기 프로브는 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 (naturally occurring) dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오티드도 포함할 수 있다. 프로브는 예를 들면, 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이며, 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에 이용되는 프로브는 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 혼성화 특이성의 개선이 손상되지 않는 범위 내에서, 본 발명의 프로브를 변형할 수 있다. 이들 변형, 즉 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단 (예컨대, 플루오레세인 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine) 및 Cy3와 Cy5), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소 (P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼리 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 보조인자, 효소에 대한 기질, 중금속 (예컨대, 금), 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디그옥시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지화는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다. 상기 프로브는 고체 지지체에 고정화되어 있거나 유리 형태로 존재할 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브를 사용하여 SNP 부위에 특정한 대립인자를 가진 뉴클레오티드 서열을 증폭하거나 그 존재를 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대사증후군의 발병 위험을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드를 용해시키기 위한 매질, 예를 들면 물 또는 버퍼를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기한 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대사증후군의 발병 위험을 진단하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.
용어 "마이크로어레이 (microarray)"는 당업계에 알려진 의미로 사용된다. 마이크로어레이는 예를 들면, 기판 상의 복수 개의 구분된 영역에 프로브 또는 프로브의 집단이 고정화되어 있는 것일 수 있다. 상기 기판은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 상기한 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대사증후군의 발병 위험을 진단하기 위한 키트를 제공한다.
용어 "키트 (kit)"는 당업계에 알려진 의미로 사용된다. 상기 키트는 예를 들면, 상기한 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 그의 특정 용도에 필요한 항목들을 포함하는 것일 수 있다. 상기한 바와 같은 폴리뉴클레오티드와 함께 그의 사용 방법에 필요한 시약을 포함하는 것일 수 있다. 상기 시약은 증폭 반응에 필요한 시약일 수 있다. 증폭 반응에 필요한 시약은 dNTP, 폴리머라제 및 ATP를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 키트는 핵산의 혼성화 및 그 결과를 검출하는데 필요한 모든 시약을 포함하는 것일 수 있다.
상기 키트는 비만인의 대사증후군 진단용 키트일 수 있다. 진단은 혼성화 (hybridization)에 기초하여 이루어질 수 있다. 이 경우, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용될 수 있다. 서열번호 1 내지 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 함으로써 대사증후군 여부를 판단할 수 있다. 프로브의 표지 물질 및 표지 방법은 상술한 바와 같다. 상기 인간은 한국인일 수 있다.
또한, 본 발명의 진단용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 개체로부터 분리된 핵산 시료를 제공하는 단계; 및
서열번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정하는 단계로서, 상기 SNP 위치는 서열번호 1 내지 4의 경우 101번째 뉴클레오티드인 것인 단계를 포함하는, 대사증후군의 변경된 위험도를 갖는 개체를 확인하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 개체로부터 분리된 핵산 시료를 제공하는 단계를 포함한다. 개체로부터 핵산을 분리하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 분리하거나 PCR과 같은 핵산 증폭 방법에 의하여 특정한 영역을 증폭함으로써 분리될 수 있다. 상기 분리된 핵산 시료에는 순수하게 분리된 핵산뿐만 아니라 조 분리된 핵산, 예를 들면, 핵산을 포함하는 세포 파쇄물도 포함한다. 상기 핵산 증폭 방법에는 PCR, 리가제 연쇄반응 (LCR), 전사증폭 (transcription amplification), 자기 유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)가 포함된다. 상기 개체는 비만인 개체일 수 있다. 예를 들면, 비만인 한국인일 수 있다.
상기 방법은 서열번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정하는 단계를 포함한다.
SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정하는 것은 알려져 있다. 예를 들면, 디데옥시법에 의하여 직접적으로 핵산의 뉴클레오티드 서열을 결정하거나, SNP 위치의 서열을 포함하는 프로브를 대상 폴리뉴클레오티드와 혼성화시키고, 혼성화 결과를 분석함으로써, SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정할 수 있다. 혼성화 정도는 예를 들면, 검출가능한 표지를 대상 핵산에 표지하고, 혼성화된 대상 핵산을 검출함으로써 확인되거나, 전기적 방법 등에 의하여 확인될 수 있다. 또한, 단일염기 연장 (single base primer extension: SBE) 법이 이용될수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 SNP 부위의 폴리뉴클레오티드를 결정하는 단계는 상기 폴리뉴클레오티드가 고정화되어 있는 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계; 및 상기 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 방법은, 상기 SNP 부위의 뉴클레오티드를 결정한 결과 위험 대립인자가 존재하는 경우, 상기 개체를 대사증후군 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 변경된 위험도는 증가된 위험도 또는 감소된 위험도인 것일 수 있다.
대사증후군과의 관련성이 매우 큰 SNP를 개발하기 위하여 일련의 선별 과정을 거쳤다. 대사증후군 및 정상인들의 혈액으로부터 DNA를 분리 및 증폭하고, 상기 DNA 중 SNP 부위의 서열을 분석한 다음, 비만인-대사증후군들과 정상체중-정상대사군들 사이에서의 출현 빈도가 현저히 다른 SNP 및 그들의 유전자형을 확인하였다. 본 발명의 실시예에서 확인된 SNP 및 그들의 유전자형을 표 1에 나타내었다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 조성물, 마이크로어레이 및 키트에 의하면, 개체의 대사증후군의 발병 위험을 신속하고, 효율적으로 진단하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 대사증후군발병의 변경된 위험도를 갖는 개체를 확인하는 방법에 따르면, 개체가 대사증후군의 변경된 위험도를 갖는지 여부를 효율적으로 확인할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 : 정상인군과 환자군에서 유전자형의 분석
1. 실험 재료 및 실험 방법
(1) 실험 대상의 HOMA IRHOMA IR분류
본 실시예에서는 총 2443 명, 즉 정상체중-정상대사군 673명 (남성 55.5% 평균나이: 49.7세)과 비만체중-대사증후군 1770 (남성 42.7%, 평균나이 54.2세)을 모집하고, 이들의 게놈 DNA를 분석하였다. 이들의 성별, 나이와 여러 임상 증상은 표 4에 나타내었다.
　 정상체중_정상대사군
(n=673)		 비만체중-대사증후군
(n=1770)
남성:여성 374 : 299 756 : 1014
나이(세) 49.7 ± 8.61 54.2 ± 8.55
BMI(kg/m2) 21.1 ± 1.17 27.9 ± 2.28
허리둘리(cm) 73.2 ± 5.45 91.9 ± 6.23
수축기 혈압(mmHg) 108.2 ± 10.1 132.2 ± 17.7
이완기 혈압(mmHg) 71.8 ± 7.29 86.8 ± 10.5
중성지방(mg/dl) 95.7 ± 25.6 228.0 ± 130.0
HDL 콜레스테롤(mg/dl) 54.4 ± 9.12 39.2 ± 7.09
총 콜레스테롤(mg/dl) 183.9 ± 30.4 200.3 ± 35.8
LDL 콜레스테롤(mg/dl) 110.5 ± 28.6 118.6 ± 32.3
포도당 (mg/dl) 81.2 ± 7.49 95.3 ± 26.2
인슐린(μU/mL) 5.91 ± 2.92 9.44 ± 5.30
HOMA IR 1.18 ± 0.60 2.23 ± 1.43
* HOMA IR는 인슐린 저항성의 항상성 모델 측정 (Homeostasis model assessment of insulin resistance)을 나타낸다.
(2) 편광 검출을 통한 유전자형 분석
게놈 DNA는 DNA 분리 키트 (Gentra Genomic DNA purification kit, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 5 ㎖의 혈액으로부터 추출하였다. 유전자형의 확인은 Affymetrix Human SNP Array 5.0 chip을 분석하여 확보하였다(The American Journal of Human Genetics 87, 545-52, October 8, 2010).
(3) 통계 분석
본 발명자들은 카이제곱검정 (chi-square test)을 사용하여 개별 변이체들이 시료의 각 유전자 자리 (locus)에서 하디-바인베르그 평형 (Hardy-Weinberg equilibrium: HWE) 법칙을 따르는지 여부를 결정하였다. 개별 SNP들에 있어서 대립인자 효과 (부가적인 대립인자 효과) 및 유전자형 효과는 성별 및 나이를 공변량으로 한 로지스틱 회귀 분석 모델을 사용하여 시험하였다. p-값이 0.05 미만인 것을 유의성이 있는 것으로 판단하였다. 오즈비 (odds ratio) 또한 로지스틱 회귀 분석 방법을 통해 측정하였다.
통계 분석은 SAS9.1 (SAS Institute Inc., NC, USA) 및 R 통계 언어 (http://www.r-project.org)를 사용하여 수행하였다.
(4) 분석 결과
분석 결과, 서열번호 1 내지 4의 SNP가 정상군과 환자군에서 유의하게 차이가 나는 것으로 확인되었다.
서열번호 1 내지 4의 분석결과는 표 1 및 2에 나타낸 바와 같으며, 이에 대하여는 과제의 해결 수단에서 설명한 바와 같다.
<110> DNA LINK, INC <120> Polynucleotide for detecting a risk of developing metabolic disorder in a subject with obesity and use thereof <130> PN093868 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tccatataga agtatattaa gaacctatat gtaattacta tgactactaa ttatttcatg 60 ggaaaatgcc ctcctgctga gatgttttag atgctccaaa sttagaagag aaaaaatgaa 120 aacaattaaa acaggataac atggacagta cagaagtaaa ccactgtctt aaaaggccaa 180 tccatttggc ataattaaaa a 201 <210> 2 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ctgttgctcc tgctgctgct gctgctgctg cattgtcaag actacattga tgtcttggaa 60 atatagaaaa aagaggctgc tggactgtgt gcttagaatc wgtgtgctaa ctctgttacc 120 aacaccgtag agaagtggtt ccagaaggaa gagttcaggg tgagaatgaa taacggagtg 180 gctttgcagt gggaacctgg c 201 <210> 3 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aaaatatttg tatctcccca caataaaagt ctgtaccaat taagcagcta ctacccattc 60 ctcttcccta ccattctacc ttctgtctca gtaggtttgc ytatttggga tattttattt 120 aagtgggatc atacaatagc atcatgtgtt caaggttgac ccacattgtg gcatgtatca 180 gtacttcatt cccttttatc a 201 <210> 4 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 aacatggata aactgaactt gatttcctgc attaaaaaaa attaaagaaa tgaaagttct 60 gactgtttta ttgtagctgg ggaattcttt ttgcaggtga ygctcatgtt acggttttga 120 acccaggact ttgcgttgca gttttgttca ggggttgcag aataccgatc tgactttgca 180 ggaatgactg tcttggtgca t 201

Claims (7)

  1. 서열번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 선택된 폴리뉴클레오티드의 단일염기다형 (single nucleotide polymorphism: SNP) 위치를 포함하고 상기 선택된 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 10 개 이상의 연속 뉴클레오티드로서, 상기 SNP 위치는 서열번호 1 내지 4의 경우 101번째 염기인 것인 비만인 개체의 대사증후군의 발병 위험을 진단하기 위한 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대사증후군의 발병 위험을 진단하기 위한 조성물.
  3. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대사증후군의 발병 위험을 진단하기 위한 마이크로어레이.
  4. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 대사증후군의 발병 위험을 진단하기 위한 키트.
  5. 비만인 개체로부터 분리된 핵산 시료를 제공하는 단계; 및
    서열번호 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정하는 단계로서, 상기 SNP 위치는 서열번호 1 내지 4의 경우 101번째 뉴클레오티드인 것인 단계를 포함하는, 대사증후군의 변경된 위험도를 갖는 비만인 개체를 확인하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 SNP 부위의 뉴클레오티드를 결정한 결과 위험 대립인자가 존재하는 경우, 상기 개체를 대사증후군의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 변경된 위험도는 증가된 위험도인 것인 방법.
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