KR20130003715A - 상처자극을 이용한 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 배양액의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄기세포에 상처자극을 가하는 단계를 포함하는 줄기세포의 배양액의 제조방법, 상기 방법에 의하여 제조된 줄기세포의 배양액, 상기 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물, 약제학적 조성물 및 상처 치료와 관련된 단백질의 대량 생산 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따라 상처자극을 가하여 제조한 줄기세포의 배양액을 이용하여 세포 성장 및 피부 재생 능력이 보다 우수한 조성물을 제공할 수 있다.

Description

상처자극을 이용한 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 배양액의 제조방법{Method for manufacturing culture solution of fetus-derived mesenchymal stem cells from amniotic fluids using shear stress}

본 발명은 줄기세포에 상처자극을 가하는 단계를 포함하는 줄기세포의 배양액의 제조방법, 상기 방법에 의하여 제조된 줄기세포의 배양액, 상기 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물, 약제학적 조성물 및 상처 치료와 관련된 단백질의 대량 생산 방법에 관한 것이다.

줄기세포는 자가 증식이 가능하고 적합한 환경 및 자극을 통해 다른 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포이다. 줄기세포는 특징적인 현상과 특화된 기능을 가지는 세포로 발달하는 잠재력을 가지고 있다.

지금까지 알려진 바에 의하면, 성체줄기세포는 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진다고 알려져 있다. 성체줄기세포는 골수(bone marrow) (Science 276, 71-74, 1997; Science 284, 143-147, 1999; Science 287, 1442-1446, 2000), 골격근(skeletal muscle) (Proc . Natl Acad . Sci . USA 96, 14482-14486, 1999; Nature 401, 390-394, 1999)과 지방조직(Fat tissue) (Tissue Eng 7, 211-228, 2001; J. Cell . Physiol . 206, 229-237, 2006)에서 분리하였으며, 이들은 각각 유사한 계통으로 분화가 가능하다.

성체 줄기세포의 종류인 골수에서 유래한 중간엽줄기세포는 오래전부터 사용되어 오고 있고 효과도 입증이 된 세포이다. 그러나 분리 및 다량의 세포 획득이 어려워 다른 대체할 수 있는 소스가 시급히 필요하다. 지방조직뿐만 아니라 다른 조직에서 분리한 세포들도 인간 골수 유래 중간엽줄기세포와 비슷한 특성을 가지고 있다는 연구 결과가 나오고 있는 가운데, 최근 태아를 보호하는 양수에서도 줄기세포가 존재한다는 가설이 새롭게 제기되고 있다.

수정란이 수정 후 자궁벽에 착상한 다음 수일이 지나게 되면 배아는 양수로 채워진 양막낭에 둘러싸이게 된다. 양수에는 태아의 몸으로부터 나온 여러 물질들이 섞여 있으므로, 양수를 분석함으로써 태아의 염색체에 이상이 있는지, 세균에 감염되지 않았는지 등을 알 수 있다. 또한 양수는 태아가 자유롭게 움직이게 할 뿐만 아니라, 외부에서 오는 충격과 자극으로부터 태아를 보호하고, 세균 감염을 막으며, 또한 태아의 체온 조절을 도와준다.

태아가 태어나기 전에 양수를 통하여 태아의 건강에 대한 여러 가지 정보를 알아보는 검사를 하는데, 이 때 임신이 시작되는 순간부터 출산 직후까지 모체에 해를 끼치지 않고 양수를 추출할 수 있다. 이렇게 검사에 사용된 세포는 검사 후 폐기하게 되는데 환자의 동의를 얻을 경우 폐기하지 않고 연구용 목적으로 사용할 수 있다. 따라서 양수 세포는 기존에 연구되어 오던 다른 성체줄기세포에 비해 쉽게 다량의 세포를 획득할 수 있다는 장점을 가진다. 그리고 양수세포는 다른 성체줄기세포에 비해 다분화능력(multipotency)이 뛰어난 장점을 가지고 있다.

한편, 줄기세포를 배양하는데 필수적으로 필요한 싸이토카인인 bFGF(basic fibroblast growth factor)는 고가인 관계로, 중간엽줄기세포를 얻기 위해서는 비용이 많이 드는 문제점이 존재하였다. 따라서, 중간엽줄기세포를 얻고 상기 중간엽줄기세포의 배양액을 제조함에 있어서, 보다 효율적으로 제조하는 방법을 개발하는 것이 당업계에서 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 쉽게 분리 가능한 인간의 양수로부터 다분화능을 가지면서 손쉽게 체외 배양이 가능한 중간엽줄기세포를 얻기 위하여 고가의 bFGF 대신에 항산화 효과를 갖는 셀레늄을 함유한 배지로 세포를 배양한 결과, 중간엽줄기세포의 세포 성장이 촉진됨을 확인하고, 상기 방법으로 제조한 중간엽줄기세포의 컨디션드 배지 배양액을 제조하는 과정에서 상처자극을 가하는 경우에 보다 우수한 상처 치유 및 피부 재생 능력이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 줄기세포에 상처자극을 가하는 단계를 포함하는 줄기세포의 배양액의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의하여 제조된 줄기세포의 배양액을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물 및 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상처 치료와 관련된 단백질의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 줄기세포에 상처자극을 가하는 단계; 및 (b) 상기 줄기세포를 무혈청 배지에 1일 내지 10일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 배양액의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 (a) 단계는 줄기세포에 상처자극을 가하는 단계이다.

본 발명에서 용어, "줄기세포"는 자가 증식이 가능하고 적합한 환경 및 자극을 통해 다른 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포로서, 특징적인 현상과 특화된 기능을 가지는 세포로 발달하는 잠재력을 가진 세포이다. 상기 줄기세포는 바람직하게는 중간엽줄기세포, 보다 바람직하게는 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포일 수 있다.

본 발명에서 용어, "중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)"는 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등에도 존재하며, 이들로부터 수득할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 중간엽줄기세포는 바람직하게는 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포일 수 있다.

산모로부터 얻은 양수에는 태아의 몸으로부터 나온 여러 가지 화학물질들이 포함되어 인체에 있는 대부분의 세포를 생성할 수 있고 채취가 쉬운 편이다. 또한, 양수에는 이종(heterogenous) 모양의 세포들이 존재하는데, 본 발명자들은 그 중에서 중간엽줄기세포의 특징인 섬유아세포와 같은 모양을 가지는 동종(homogenous) 의 중간엽줄기세포가 존재한다는 것을 확인하였다.

본 발명에서 상기 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포는 바람직하게는 양수 유래 세포를 FBS 및 셀레늄 함유 배지에서 계대배양하여 수득할 수 있으며, 보다 바람직하게는 bFGF를 추가로 함유하는 배지에서 계대배양하여 수득할 수 있다.

상기 양수 유래 세포는 산모로부터 얻은 양수를 배양하고 배양 용기의 바닥에 붙은 세포를 제외한 나머지를 제거한 후 바닥에 붙은 세포를 트립신을 이용하여 분리하고 원심분리를 통하여 얻을 수 있다.

본 발명에서 용어, "배지(culture media)"는 인 비트로(in vitro)에서 양수 내 태아 유래 세포들의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 양수 내 태아 유래 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함하며, 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이러한 세포 배양 최소 배지는 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium) 및 IMEM( Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등이 있으나, 이로 제한되지는 않는다. 또한, 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.

본 발명의 배지는 FBS와 함께 셀레늄을 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일실시예에서는 배지에 bFGF의 첨가와 셀레늄의 첨가시에 장기간의 세포 성장이 가능함을 확인함으로써, 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 제조시 bFGF 대신 셀레늄이 첨가된 배지에서 배양이 가능함을 확인하였다. 본 발명의 배지에서 상기 FBS의 함량은 바람직하게는 2 내지 15%일 수 있으며, 보다 바람직하게는 5 내지 10%일 수 있고, 보다 더 바람직하게는 10%일 수 있으며, 상기 셀레늄의 함량은 바람직하게는 1 내지 20ng/ml일 수 있고, 보다 바람직하게는 2.5 내지 10ng/ml일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 5ng/ml일 수 있다.

상기 배지는 FBS, 셀레늄의 함유와 함께 추가적으로 bFGF를 함유하는 것일 수 있다. 상기 배지 내에 셀레늄과 bFGF의 공동 첨가를 통하여 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 제조시 더욱 우수한 효과를 나타낼 수 있다. 상기 bFGF의 함량은 바람직하게는 1 내지 20ng/ml일 수 있고, 보다 바람직하게는 2 내지 10ng/ml일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 4ng/ml일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 10% FBS, 4ng/ml bFGF 및 5ng/ml 셀레늄이 함유된 배지에서 세포 성장이 가장 잘 일어남을 확인하였다(도 3).

또한, 상기 배지는 바람직하게는 로우 글루코즈 DMEM 배지를 사용할 수 있으며, 추가적으로 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "상처자극(shear stress)"은 줄기세포에 가하는 인체에 가해지는 상처와 유사한 상처를 통한 인위적인 자극으로서, 상기 상처자극을 통하여 상처치유와 관련된 성장인자들이나 유효성분들을 이끌어낼 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 줄기세포에 상처자극을 가함으로써, 상처자극을 가하지 않은 그룹에 비하여 세포성장 및 상처 치유 능력이 향상됨을 관찰하였다(도 7 및 9).

상기 상처자극은 인체에 가해지는 상처와 유사한 상처를 가할 수 있는 물리적인 자극을 포함하면 제한없이 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 다중 피펫(multi pipette), 마이크로 피펫(micro pipette), 스크랩퍼(scraper) 등을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 다중 피펫을 사용할 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 상기 다중 피펫으로 스크래치하여 가하는 것일 수 있다. 상기 상처자극은 바람직하게는 1 내지 7회, 보다 바람직하게는 3 내지 5회 가하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 7개의 팁(tip)을 꽂은 다중 피펫을 이용하여 상처자극을 가한 경우, 상처자극을 가하지 않은 경우에 비하여 우수한 세포성장이 일어남을 확인하였으며, 4회의 상처자극을 가한 경우 가장 우수한 세포성장이 일어남을 확인하였다(도 6).

본 발명에서 상기 (b) 단계는 상기 줄기세포를 무혈청 배지에 1일 내지 10일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계이다.

본 발명에서 용어, "컨디션드 배지(conditioned medium)"는 세포를 액체현탁배양하여 세포분열 최성기인 대수성장기에 도달했을 때 분열세포를 원심분리 또는 여과하여 제거하고 배양액만 채취하여 이를 배양기질에 혼합한 배지를 말한다. 이는 분열중인 세포로부터 배지 내에서 추출되어 나오는 미지의 성장요소(growth factor)를 이용하는 것으로서, 저밀도의 세포 플레이팅이나 원형질체 배양에 많이 이용된다.

본 발명의 목적상, 본 발명의 컨디션드 배지 조성물이란 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 배양한 배지에서 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 제거한 용액을 포함하는 조성물로서, 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포에서 유래한 성장인자 등의 물질이 풍부하게 함유되어 있는 조성물을 말하며, 바람직하게는 Apo-1/Fas, 표피세포 성장인자(EGF), IP-10(Interferon-γ inducible protein-10), 렙틴(Leptin), MIP4, MMP3, 란테스(Rantes), 인터페론-감마(IFNγ), 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β), 종양괴사인자-알파(TNFα), 종양괴사인자 수용체 Ⅰ(TNFRⅠ), 종양괴사인자 수용체 Ⅱ(TNFRⅡ), 세포부착인자-1(ICAM-1), 혈관세포 부착인자-1(VCAM-1), 맥관내피세포 성장인자(VEGF), 인터루킨-1 베타(IL-1β), 인터루킨-1 수용체 알파(IL-1Rα), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-7, IL-8, IL-12 및 IL-15을 포함할 수 있다. 또한, 상처 치료 관련 유전자인 collagen type Ⅲ, MMP1, fibronectin, vitronectin, syndecan 2, syndecan 4, SPP1, elastin가 다량으로 발현될 수 있다.

본 발명에서는 태아 유래 중간엽줄기세포의 컨디션드 배지를 얻기 위하여, 양수에서 분리하여 수득한 중간엽줄기세포를 아미노산 또는 그 유사체와 비타민 또는 그 유사체를 포함하는 Ham's F-12 영양소 혼합액을 함유하는 무혈청 배양배지를 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 Ham's F-12 영양소 혼합액을 함유하는 무혈청 배지는 페놀 레드 등의 pH 지시약이 첨가되지 않은 DMEM을 기본으로 하고 Ham's F-12 영양소 혼합액을 대략 1: 0.5 ~ 2의 비율로 첨가한다. 이 때, L-글루타민 등의 산화영양원, 소디움 피루베이트 등 에너지 대사물질, 소디움 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가하는 것이 가능하다. 본 혼합액은 세포의 성장과 항상성 유지를 돕고 중간엽줄기세포의 초기배양 후 계대배양에 있어 세포의 안정성과 유지력 증진에 관여되는 여러 가지의 무기질과 아미노산들, 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포에서 분비되는 성장인자의 더 높은 생산을 촉진할 수 있는 비타민 계열의 영양소들과 다른 인자들이 일정한 비율로 혼합하여 형성된다.

본 발명에서는 상기 컨디션드 배지 배양액을 수거하는 단계를 포함할 수 있으며, 이에 따라 최종적으로 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 배양액을 제조할 수 있다. 상기 컨디션드 배지 배양액의 수거는 당업계에 공지된 방법에 의하여 수행할 수 있으며, 예컨대 원심분리 또는 여과하여 수거할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 줄기세포의 배양액을 제공한다.

상기 배양액은 상기에서 설명한 바와 같이 제조될 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 상처자극을 가하여 제조한 컨디션드 배지 배양액이 우수한 세포성장 및 상처 치유 효과가 있음을 확인하였으며, 추가적으로 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 제조시 셀레늄 및 bFGF를 함유하는 배지에서 배양할 경우, 더욱 우수한 세포성장 및 상처 치유 효과가 있음을 확인하였다(도 7, 9 및 11).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 피부 상태는 미백, 주름, 자외선에 의한 피부 손상, 피부 탄력, 모공 확장, 피부 상처 또는 피부 흉터일 수 있다.

본 발명의 조성물은 피부 상태를 개선하는 용도로 이용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 셀레늄 및 bFGF를 함유하는 배지에서 배양하여 제조한 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포에서 얻은 컨디션드 배지의 상처 치유 효과가 탁월함을 확인하였고, 상처자극을 가하여 제조한 컨디션드 배지(CM2)가 대조군 및 상처자극을 가하지 않은 경우보다 우수한 효과를 보임을 확인하였다(도 9 및 11).

본 발명의 화장료 조성물은 상기 배양액 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있으며, 그 효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수촉진 물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 배양액을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부 손상, 주름, 피부 상처 또는 피부 흉터의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여 중 경피투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은, 경구형 제형인 경우 성인 기준으로 0.1-100 ㎎/kg 의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1일당 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상처 치료와 관련된 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다. 구체적으로, (a) 양수 유래 세포를 FBS 및 셀레늄 함유 배지에서 계대배양하여 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포에 상처자극을 가하는 단계; 및 (c) 상기 줄기세포를 무혈청 배지에 1일 내지 10일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계를 포함하는, 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포로부터 collagen type Ⅲ, MMP1, fibronectin, vitronectin, syndecan 2, syndecan 4, SPP1 및 elastin으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 (a) 단계는 양수 유래 세포를 FBS 및 셀레늄 함유 배지에서 계대배양하여 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 수득하는 단계로서, 이는 상기에서 설명한 바와 같으며, 상기 배지는 bFGF를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명에서 상기 (b) 단계는 상기 수득한 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포에 상처자극을 가하는 단계로서, 상기 상처자극에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 일실시예에서는 상처자극을 가하여 제조한 컨디션드 배지(CM2)에서 컨디션드 배지가 아닌 DMEM/F12 무혈청 배지 및 상처 자극을 가하지 않고 제조한 컨디션드 배지(CM1)와 비교하여, 상처 치료와 관련된 유전자들인 collagen type Ⅲ, vitronectin, syndecan 2, syndecan 4, fibronectin, MMP1, SPP1, elastin의 발현량이 높음을 확인하였다(도 10).

본 발명에 따라 상처자극을 가하여 제조한 줄기세포의 배양액을 이용하여 세포 성장 및 피부 재생 능력이 보다 우수한 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 bFGF 및/또는 셀레늄이 첨가된 배지에서 양수 내 태아 유래 세포주를 배양시 다양한 모양(heterogenous population: 왼쪽)의 형태가 나타났으나, 3번의 계대배양(sub-culture)을 통하여 동일한 모양(homogenous enrichment: 오른쪽: 4 passage)의 중간엽줄기세포로 바뀌는 것을 나타낸다.
도 2는 산모에서 분리한 양수 내 태아 유래 세포의 핵형 분석(karyotype)의 결과로서, 성염색체가 XY로 나와 산모가 아닌 양수 내 태아에게서 유래된 것임을 보여주며, bFGF 단독첨가, 셀레늄 단독첨가 또는 bFGF 및 셀레늄 동시첨가 그룹에서 모두 정상의 핵형 분석이 나왔음을 나타낸다.
도 3은 셀레늄의 적정농도를 결정하기 위한 실험결과로서, 5ng/ml일 때 가장 좋은 결과의 세포성장을 보여주고 있음을 나타낸다. 아래 그림은 3T3 assay를 통하여 장기간의 배양에서도 정상적인 세포성장을 보여주고 있으며, 26 passage에서도 셀레늄 단독과 동시첨가에서 모두 정상적인 세포성장이 일어남을 보여 주고 있고, 40 passage에 이르렀을 때 beta-gal staining을 통하여 세포성장이 멈춰짐을 나타낸다(+/-: bFGF 첨가/셀레늄 미첨가, -/+: bFGF 미첨가/셀레늄 첨가, +/+: bFGF 첨가/셀레늄 첨가, 이하 동일).
도 4는 세포의 면역학적 표현형을 유세포 분석기를 통해 분석하여, 그 결과 세 그룹에서 모두 중간엽줄기세포와 비슷한 특징을 가지고 있음을 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 양수 내 태아 유래 세포가 다분화능을 가진 골수 유래 중간엽줄기세포와 비슷한 분화능을 가지고 있음을, 지방(A), 뼈(B), 연골(C)로의 분화를 통해서 확인한 결과를 보여주며, 각각의 분화마커를 통하여 mRNA 수준에서도 분화가 이루어짐을 나타낸다.
도 6은 양수 내 태아 유래 세포주를 bFGF 및/또는 셀레늄이 첨가된 배지에서 배양한 세포를 이용하여 제조한 컨디션드 배지(CM1)와 추가적으로 상처자극을 가하여 제조한 컨디션드 배지(CM2)와의 세포성장 비교실험(a), CM2를 생산하기 위한 세포 분주수 결정실험(b) 및 상처자극 횟수의 최적조건을 확인하기 위한 실험(c)의 결과를 나타낸다.
도 7은 상처자극을 가하여 제조한 컨디션드 배지에 존재하는 다량의 성장인자들이 섬유아세포의 성장에 미치는 효과를 상처자극을 가하지 않은 그룹 및 대조군 그룹과 비교한 결과를 나타낸다.
도 8은 BrdU assay를 이용한 세포 주기 분석 및 세포의 증식과 관계된 cyclin A와 E의 유전자를 real-time PCR 분석을 통하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 양수 내 태아유래 중간엽줄기세포를 이용하여 제조한 컨디션드 배지(CM1 및 CM2)의 in vitro 상에서 피부 섬유아세포의 상처 치유의 효과를 비교한 결과를 나타낸다.
도 10은 양수 내 태아유래 중간엽줄기세포를 이용하여 제조한 컨디션드 배지(CM1 및 CM2)의 in vitro 상에서 상처 치유와 관련된 유전자들의 정량분석 결과를 나타낸다.
도 11은 마우스 피부에 상처를 준 후, 대조군, CM1 및 CM2 컨디션드 배지를 피부에 도포한 결과, 상처 재생능력에 차이가 있음을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 산모로부터 얻은 양수 내 태아 유래 세포주의 배양을 통한 동종의 중간엽줄기세포 모양 확인

산모로부터 얻은 양수 내에는 많은 부유물들이 있다. 그것을 분리하기 위하여 양수를 T-플라스크에 담고 37℃에서 배양을 하였다. 다음날 바닥에 붙은 세포만 제외하고 나머지는 제거를 하였다. 바닥에 붙은 세포를 트립신을 이용하여 바닥에서 분리를 시키고 원심분리를 하여 모은 후, 로우 글루코즈 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 10% FBS(fetal bovine serum), 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 및 5ng/ml 셀레늄(selenium) 또는 4ng/ml bFGF로 구성된 기본 배지에 재부유시켜 100mm 세포 배양 접시에 세포를 시딩(seeding)하였다. 12~24시간 후 새 배지로 바꿔 주었다. 양수 내 태아 유래 세포주는 다양한 형태의 모양(heterogenous population)을 가지나, 3~4번의 계대 배양 후에는 한 가지의 섬유아세포 모양(homogenous population)만을 가지게 됨을 확인할 수 있었다(도 1). 배지는 2~3일에 한 번씩 바꿔주었으며 세포 밀도가 80~90%정도 일 때 계대배양을 하였다.

실시예 2: 핵형 분석을 통한 양수 내 태아 유래 세포 여부 확인

상기 실시예 1에서 배양한 세포가 양수 내 태아 유래 세포인지 알아보기 위해 핵형 검사를 하였다.

염색체의 수, 크기, 모양 등을 핵형이라고 하며 핵형 분석을 통해 태아의 염색체를 검사하여 염색체 돌연변이, 성별을 알 수 있다. 핵형 분석을 하기 위해서 1~2시간 동안 콜세미드(Colcemid)로 세포 분열을 중기에 중지시키고 지 밴딩 염색법(G-banding staining)으로 관찰하여 염색체를 분석하였다. 이러한 핵형 분석을 통해 알아본 결과, bFGF 및 셀레늄을 함유한 배지를 통한 세포배양에서 양수 내 태아 유래 세포는 정상염색체를 가지고 있고 성염색체가 XY로 나타나는 것으로 보아 산모가 아닌 태아에게서 유래된 세포임이 확인되었으며, bFGF 단독첨가, 셀레늄 단독첨가 그리고 bFGF와 셀레늄의 동시첨가를 통한 세포배양에서도 모두 정상적인 핵형의 결과를 나타내었다(도 2).

실시예 3: 셀레늄의 적정농도 확립, 세포배양에 있어서의 bFGF 의 셀레늄으로의 대체가능성 및 bFGF 와 셀레늄의 공동 첨가를 통한 상승효과 확인

셀레늄의 적정농도를 결정하기 위하여 2% 및 10%의 FBS 혈청 조건하에서, 4ng/ml bFGF의 첨가 유무에 따라 배양 조건을 달리하고, 첨가되는 셀레늄의 농도를 0ng/ml, 2.5ng/ml, 5ng/ml 및 10ng/ml로 나누어 세포성장을 비교하였다. 그 결과, 혈청은 2% FBS를 첨가했을 때보다 10% FBS를 첨가했을 때 세포성장이 높았고, 셀레늄은 bFGF의 첨가 여부와 상관없이 세포의 성장을 촉진시켰으며, 5ng/ml 첨가시 세포성장 효과가 가장 높았다. 또한, bFGF 및 셀레늄을 동시에 첨가한 배지에서 세포배양시 세포성장 효과가 bFGF 또는 셀레늄의 단독 첨가시보다 월등히 높았으며, 4ng/ml bFGF 및 5ng/ml 셀레늄을 첨가한 경우에 세포성장이 가장 활발하였다(도 3). 이로부터 양수 내 태아 유래 세포 배양시 기존에 사용되던 bFGF를 대체하여 셀레늄을 사용할 수 있으며, bFGF 및 셀레늄을 공동 첨가할 경우에 월등한 세포성장이 가능함을 확인할 수 있었다.

또한, bFGF 대신 셀레늄을 첨가하거나, bFGF 및 셀레늄을 공동 첨가할 경우 장기간의 세포배양에서의 결과를 확인하여 단기간이 아닌 장기간의 세포배양에서도 대체 첨가와 공동 첨가의 가능성을 확인하였다. 산모에게서 얻은 양수 내 태아 유래 줄기세포를 처음부터 로우 글루코즈 DMEM에 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가하고, 4ng/ml bFGF 단독첨가, 5ng/ml 셀레늄 단독 첨가 및 공동 첨가로 구성된 기본 배지에서 3T3의 배양방법을 통하여 장기간의 세포성장에서도 무리 없이 세포성장이 가능한지 확인하였다. 그 결과, 2일 혹은 3일에 한번씩 계대배양을 통하여 40 passage까지도 정상적인 세포성장이 가능하였으며, 이는 셀레늄의 단독첨가와 bFGF 단독첨가에서 유사한 결과를 나타내어 대체가능성을 확인하였으며, bFGF 및 셀레늄의 공동 첨가가 가장 우수한 세포성장 능력을 보여주었다(도 3).

실시예 4: 양수 내 태아 유래 세포의 중간엽줄기세포와의 유사성 확인

양수 내 태아유래 세포가 다분화성의 중간엽줄기세포의 특성을 가지고 있는지를 확인하였다.

먼저, 유세포 분석기를 통해서 면역학적 표현형을 분석하였다. 양수 내 태아 유래 세포를 사람 골수 유래 중간엽줄기세포와 같이 비교하였을 때 골수 유래 중간엽줄기세포와 유사하게 CD13, CD29, CD44가 발현되는 것을 확인하였다(도 4). 그리고 이런 표면의 발현은 중간엽줄기세포에 특이적인 마커이긴 하지만 세포들마다 다른 특성들이 존재할 수도 있기 때문에 중간엽줄기세포의 성격을 나타내는 대표적인 특성인 뼈, 지방, 연골세포로의 분화능을 살펴보았다.

양수 내 태아 유래 세포는 인간 골수 유래 중간엽줄기세포와 마찬가지로 분화를 시킨 후, 뼈는 골이 형성이 되면서 특이적으로 발현되는 유전자인 오스테오폰틴(osteopontin)과 오스테오칼신(osteocalcin)으로, 지방은 지방 형성에 관련된 유전자인 리포단백질 리파아제(lipoprotein lipase; LPL), 지방산 결합 단백질 2(fatty acid binding protein; aP2)와 페록시좀 프로리퍼레이터 활성화 수용체 감마(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ; PPAR)로, 연골은 연골이 형성되면서 대표적인 유전자 타입 2 콜라겐(Type II collagen), 타입 1 콜라겐(Type I collagen)과 어그리칸(aggrecan)으로 분화가 되었다는 것을 역전사 연쇄반응(RT-PCR)으로 확인하였다. 뼈로 분화를 시키면 칼슘염의 생성되는 것을 확인하기 위해서 알리자린 레드 에스 염색법(Alizarin red S staining)으로, 지방으로 분화를 시키면 지방액포(Lipid droplet)가 생기고 이것을 염색하기 위해서 오일 레드 오 염색법(Oil red O staining)과 연골로 분화를 시키면 연골 특이적으로 분비하는 기질을 염색하기 위해서 알시안 블루 염색법(Alcian blue staining)을 이용하여 각 분화별 특이적인 염색법으로 확인하였다(도 5). 그 결과, 본 발명의 양수 내 태아 유래 세포는 골수 유래 중간엽줄기세포와 유사한 특성을 가지는 세포임을 확인하였다.

실시예 5: 양수 내 태아 유래 세포주를 이용한 컨디션드 배지 제조

양수 내 태아 유래 세포주를 이용하여 컨디션드 배지를 제조하였다. bFGF 단독, 셀레늄 단독 또는 bFGF 및 셀레늄을 공동 첨가한 배지에서 배양하여 제조된 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포로부터 컨디션드 배지의 생산 조건을 확립하였다.

먼저, 세 가지 조건에 의해 확립된 중간엽줄기세포를 100mm 세포 배양 접시에서 트립신 처리를 하여 바닥에서 분리하였다. 떨어진 세포를 모아서 15ml 튜브에 담고 원심분리를 하여 모아진 세포를 5~10ml 배지에 풀어준 다음 잘 섞어 주었다. 상기 세포를 로우 글루코즈 DMEM에 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가하고, 4ng/ml bFGF 단독, 5ng/ml 단독 및 공동 첨가로 구성된 세 가지 조건의 기본 배지에 재부유시켜 100mm 세포 배양 접시에 시딩하였다. 12시간 후, 컨디션드 배지인 DMEM/F12 무혈청 배지로 바꿔주고 72시간 동안 배양하였다. 72시간 후, 각 조건의 배양액을 튜브에 옮겨 담은 후 원심분리를 하고 0.20㎛ 시린지 필터(syringe filter)를 하여 컨디션드 배지를 생산하였다.

실시예 6: 산모로부터 얻은 양수 내 태아 유래 세포주를 이용한 컨디션드 배지 제조시 적절한 세포 수와 상처자극의 횟수의 결정

실시예 1의 컨디션드 배지를 제조하는 과정에서 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포에 인체에 가해지는 상처와 유사한 상처를 인위적인 자극으로 가함으로써 상처 재생이나 상처 치유 관련된 성장인자들이나 유효성분들을 이끌어낼 수 있는지 확인하였다. 100 mm 배양접시에 각각 25만 개의 줄기세포를 배양접시에 깔고, bFGF 단독, 셀레늄 단독 또는 bFGF 및 셀레늄을 공동 첨가한 배지에서 배양하여 제조된 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포 세 그룹에 대하여, 상처자극을 가한 경우와 상처자극을 가하지 않은 경우로 구분하여 제조한 컨디션드 배지에서 세포성장의 결과를 관찰하였다. 상기 상처자극은 7개의 팁(tip)을 꽂은 다중 피펫(multi-pipette)을 이용하여 스크래치(scratch)하여 가하였다. 그 결과, 상처자극을 가한 그룹(CM2)에서 상처자극을 가하지 않은 그룹에 비하여(CM1), bFGF 또는 셀레늄의 첨가와는 독립적으로 우수한 세포성장의 결과를 확인할 수 있었다(도 6의 a).

추가적으로, 세포 분주수의 최적조건을 확립하기 위하여 100 mm 배양접시에 각각 25만, 50만, 75만, 100만 및 125만 개의 줄기세포를 배양접시에 깔고 이를 로우 글루코즈 DMEM에 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 4ng/ml bFGF 및 5ng/ml 셀레늄의 동시첨가로 구성된 배지를 첨가하여 12시간 내지 18시간 동안 배양한 후, 이를 7개의 팁을 꽂은 다중 피펫을 이용한 스크래치를 통하여 인위적인 상처자극을 가하였다. 다시 PBS로 3회 세척해내고 DMEM/F12 무혈청 배지 배양액에 3일동안 배양하고 배양액만을 거두어낸 후, 이를 원심분리시키고 다시 0.22um로 필터하는 과정을 거쳐서 컨디션드 배지를 생산하였다. 그 결과, 75만, 100만 및 125만 개의 줄기세포를 시딩(seeding)한 경우에 비슷하게 우수한 세포성장의 효과를 나타내었다(도 6의 b).

상처자극 횟수의 최적 조건을 확립하기 위하여, 상기 실험에서 우수한 세포성장의 효과를 나타낸 그룹 중에서 세포 분주수가 비교적 적은 75만 개의 줄기세포를 시딩한 경우에 대하여, 각각 2회, 4회 및 6회의 상처자극을 가한 경우의 세포성장을 비교하였다. 그 결과, 다중 피펫으로 4회의 상처자극을 가한 그룹에서 가장 우수한 세포성장의 결과를 나타냄을 확인하였다(도 6의 c).

실시예 7: 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포에서의 컨디션드 배지 제조를 통한 세포 성장의 능력비교

상기 실시예 1에서 제조한 bFGF 단독, 셀레늄 단독 또는 공동첨가의 세 가지 방법을 통해 제조된 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포에 상처자극을 가하여 제조한 컨디션드 배지를 이용하여, 상처자극을 가하지 않은 그룹 및 대조군 그룹으로 항생제만을 첨가한 무혈청 DMEM/F12의 배양액과 섬유아세포(fibroblast cell(BJ cell))의 성장 정도를 비교하였다. 24-웰 배양 접시에 섬유아세포를 30,000개씩 분주하여 3일 동안 비교배양실험을 실시하여 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 염색을 통하여 세포성장을 비교하였다. 그 결과, 상처자극을 가한 그룹에서 대조군보다 세포 성장이 현저히 활발함을 확인하였고, 상처자극을 가하지 않은 그룹보다도 세포 성장이 활발하게 일어남을 확인하였다(도 7).

실시예 8: 상처자극에 의한 줄기세포 배양액의 BrdU assay 와 real - time PCR 을 통한 효능 분석

bFGF 및 셀레늄을 공동 첨가한 배지에서 배양한 중간엽줄기세포를 이용하여제조한 컨디션드 배지와 추가적으로 상처자극을 가하여 제조한 컨디션드 배지와의 섬유아세포 성장을 비교한 결과, 상처자극을 가한 경우에 세포 성장이 더 활발함을 확인하여, 상처자극을 가하여 제조한 컨디션드 배지에 대하여 BrdU assay를 실시하였다. 그 결과, BrdU assay를 이용한 세포 주기 분석을 통하여 셀레늄 단독 첨가와 bFGF 및 셀레늄의 공동 첨가시에 세포배양이 활발히 일어남을 확인하였다(도 8). 또한, 세포 증식과 관련된 cyclin A와 E의 유전자를 real-time PCR 분석기법을 통하여 확인한 결과, 역시 셀레늄의 단독 첨가와 bFGF 및 셀레늄의 공동 첨가시에 세포 증식에 관련된 단백질들의 발현이 증가함을 확인하였다(도 8).

실시예 9: 피부 섬유아세포에서 컨디션드 배지의 상처 치유( wound healing ) 효과 확인

양수에서 유래한 줄기세포로부터 제조한 컨디션드 배지를 이용하여, 상처자극을 가하여 제조한 컨디션드 배지가 상처 치유 효과를 향상시키는지 여부를 확인하였다. 피부에서 유래한 섬유아세포에 인위적인 상처를 가한 후, 대조군 그룹으로 항생제만을 첨가한 무혈청 DMEM/F12의 배양액을 사용하고, bFGF 및 셀레늄의 동시첨가 배지를 통해 제조된 줄기세포의 컨디션드 배지(CM1)와 여기에 추가적으로 상처자극을 가하여 제조한 컨디션드 배지(CM2)를 처리한 결과, 13시간이 되었을 때 상처자극을 가하여 제조한 컨디션드 배지를 처리한 세포에서 이동(migration)되는 정도가 거의 완성되었음을 보여주여 가장 완성된 상처 치유 효과를 보였으며, 세 그룹에서의 차이는 15시간일 때 가장 큰 것을 확인하였고, 양수 유래의 줄기세포로부터 상처자극을 가하여 제조한 컨디션드 배지(CM2)의 상처 치유 효과가 가장 탁월한 것을 확인하였다(도 9).

실시예 10: 피부 섬유아세포에서 컨디션드 배지의 상처 치유 효과와 관련된 유전자들의 정량분석

이동율(migration rate)을 측정했던 시기에 상처 치유에 관련된 유전자들의 발현을 Real-time PCR로 확인하였다. 컨디션드 배지가 아닌 DMEM/F12 무혈청 배지 및 상처 자극을 가하지 않고 제조한 컨디션드 배지(CM1)와 비교하여 볼 때, 상처자극을 가하여 제조한 컨디션드 배지(CM2)에서 세포의 이동(migration)에 관여하여 상처 치유를 돕는 유전자들인 collagen type Ⅲ, vitronectin, syndecan 2, syndecan 4, fibronectin, MMP1, SPP1, elastin 등이 정량적으로 가장 높게 발현이 되고 있는 것을 확인하였으며, 이를 통하여 양수 유래의 줄기세포로부터 상처자극을 가하여 제조한 컨디션드 배지에서 상처 치유의 효과가 가장 높음을 확인할 수 있었다(도 10).

실시예 11: 마우스 in vivo 에서 컨디션드 배지의 피부재생 효과

피부에 상처를 준 마우스를 이용한 동물실험을 통해 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 컨디션드 배지가 피부 재생능력에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. 마우스 피부 에 약 50cm²(직경 8cm)의 펀치(punch)를 이용하여 인위적인 상처부위를 낸 후 일반 DMEM/F12 무혈청 배지와 상기에서 제조한 상처자극을 가하지 않은 컨디션드 배지(CM1) 및 상처자극을 가하여 제조한 컨디션드 배지(CM2)를 각각 상처부위에 발라 주어 그 상처부위의 상처 봉합(wound closure) 정도를 측정하였다. 9일째 세 그룹의 차이가 가장 잘 비교되며, 일반 DMEM/F12 무혈청 배지는 상처부위에서 더딘 피부재생을 보여주었으나, CM1이 일반 DMEM/F12 무혈청 배지보다 높은 상처 봉합을 보여주고 있으며, CM2에서는 가장 완성된 상처 봉합을 보여 주었다(도 11).

Claims (11)

1. (a) 줄기세포에 상처자극을 가하는 단계; 및
   (b) 상기 줄기세포를 무혈청 배지에 1일 내지 10일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 배양액의 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포인 것인 방법.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포는 양수 유래 세포를 FBS 및 셀레늄 함유 배지에서 계대배양하여 수득한 것인 방법.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 배지는 bFGF를 추가로 함유하는 것인 방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 상처자극은 다중 피펫(multi pipette)으로 스크래치(scratch)하여 가하는 것인 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 스크래치를 3 내지 5회 가하는 것인 방법.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 줄기세포의 배양액.
   
8. 제2항의 방법으로 제조된 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물로서, 상기 피부 상태는 미백, 주름, 자외선에 의한 피부 손상, 피부 탄력, 모공 확장, 피부 상처 또는 피부 흉터인 것인 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
   
9. 제2항의 방법으로 제조된 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부 손상, 주름, 피부 상처 또는 피부 흉터의 치료용 약제학적 조성물.
   
10. (a) 양수 유래 세포를 FBS 및 셀레늄 함유 배지에서 계대배양하여 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득한 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포에 상처자극을 가하는 단계; 및
    (c) 상기 줄기세포를 무혈청 배지에 1일 내지 10일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계를 포함하는, 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포로부터 collagen type Ⅲ, MMP1, fibronectin, vitronectin, syndecan 2, syndecan 4, SPP1 및 elastin으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질을 대량으로 생산하는 방법.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 (a) 단계의 배지는 bFGF를 추가로 함유하는 것인 방법.
    

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