KR20120139581A - 신규한 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 골다공증 완화, 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기의 [화학식 I]의 신규한 화합물, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 수화물 또는 용매화물, 이의 제조방법 및 이를 유효량 함유하는 골다공증 완화, 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
[화학식 I]
Figure pat00030

Description

신규한 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 골다공증 완화, 예방 또는 치료용 약학조성물{New compounds, the preparation thereof and pharmaceutical composition comprising the same for alleviation, prevention or treatment of osteoporosis}
본 발명은 신규한 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 골다공증의 완화, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
골다공증은 매우 빈번한 질병 중 하나로 전세계적으로 약 2억 명의 사람들이 골질량 (bone mass)이 낮거나 골다공증을 앓고 있으며, 뼈의 미세구조가 붕괴되고 골질량이 감소하는 증상을 나타낸다. 이로 인해 뼈의 강도가 감소하고 골절의 위험, 특히 척추, 엉덩이, 손목, 상완골, 골반 골절의 위험이 증가한다.
A. 뼈
뼈는 조골세포 (osteoblast), 골세포 (osteocyte), 파골세포 (osteoclast) 세 가지 주요한 세포로 구성되어 있다. 조골세포는 동화 (anabolic) 작용을 하며, 뼈의 유기적인 구성성분 (유골, osteoid)을 생성한 후 골화 (mineralization)함으로써 새로운 뼈의 생성을 촉진한다. 조골세포는 골수 줄기 세포에서 유래하며 유골의 형성은 상대적으로 빠르게 6~12시간 안에 끝나지만 그 다음 골화의 과정은 훨씬 길게 1~2개월이 걸린다. 뼈 형성이 끝나면 조골세포는 새로운 골기질 (bone matrix)에 둘러싸여 파골세포로 분화된다.
파골세포는 뼈에서 가장 많은 세포로, bone multicellular unit가 국소의 필요에 따라 뼈의 구성성분을 조정할 수 있도록 local strain information을 전달하는 'mechanostat' 기능을 한다고 여겨지고 있으며, 커다란 다핵세포로, 골수에서 유래한 단핵 대식세포의 융합으로 형성된다. 파골세포는 특정 부위에서 lysosomal enzyme 작용을 통해 뼈의 구성성분을 파괴하는 이화 (catabolic) 작용을 하며, 파골세포의 분화와 기능에는 receptor activation of nuclear factor κ B ligand (RANKL)와 관련된 경로가 중요한 조절인자로 작용한다.
또한, RANKL/RANK/OPG system은 현재 뼈의 재흡수 조절에서 가장 중요한 경로로 알려져 있다. RANKL은 tumor necrosis factor (TNF) family에 속하는 cytokine으로 조골세포에 의해 발현되며, 파골세포의 membrane bound receptor RANK에 결합하여 골수세포가 파골세포로 분화하는 것을 촉진하고, RANKL의 발현 촉진은 Parathyroid hormone (PTH), calcitriol, prostaglandin과 같은 호르몬들에 의한 조골세포에 의해 이루어진다. 한편, 조골세포는 osteoprotegrin (OPG)이라는 soluble receptor도 분비하는데 이는 RANKL에 결합하여 이를 불활성화시킬 수 있어 파골세포 형성의 강력한 antagonist로써 뼈의 재흡수에서 중요한 조절인자이며, OPG는 estrogen에 의해 촉진된다.
B. 골다공증 유발 원인
골다골증은 골밀도 (bone mineral density)가 2.5 이하이거나 T score (T-score는 젊은 성인의 평균골질량과의 표준편차)가 -2 .5 이하인 경우를 가리킨다. 연령에 따른 뼈의 감소는 40대나 50대에 시작하며, 이때 파골세포 (osteoclast)에 의한 뼈의 파괴가 증가하고 조골세포 (osteoblast)에 의한 뼈의 형성은 감소해서 골다공증이 발생하며, 여성의 경우, 뼈의 감소가 폐경에 의해 가속화된다.
최대골량 (peak bone mass)은 30대에 도달하는데 최대골량은 그 후의 골질량에 중요한 결정요인이 된다. 최대골량은 유전적 요인에 크게 영향을 받고 그 외에도 영양, 특히 칼슘과 비타민 D 섭취와 호르몬 상태, 신체 활동, 흡연, 낮은 체질량, 사춘기 시기 등의 영향을 받는다.
Estrogen 부족은 골다공증의 결정적인 원인으로 여겨지는데 이는 estrogen level이 자연적으로 줄어드는 폐경기 여성이 골다공증 유발 위험이 가장 높은 데서 기인한다. 폐경기 때 estrogen 부족은 뼈의 재흡수 증가를 야기하여 빠르고 지속적인 뼈의 감소를 유발한다. Estrogen은 여성뿐 만 아니라 남성의 뼈 재흡수에도 큰 역할을 하고 최대골량 도달에도 중요한 역할을 한다. 뿐만 아니라 노인층 남성의 골다공증은 낮은 androgen level보다 낮은 estrogen level에 훨씬 밀접한 관련이 있다.
칼슘 부족은 골다공증의 원인으로 처음부터 지목됐다(특히 노인층). 칼슘 흡수 저하나 칼슘 손실 증가 (hypercalcuria)에 의한 칼슘 부족은 PTH 분비와 뼈 재흡수를 증가시킨다. PTH(Parathyroid hormone)은 84개의 아미노산으로 구성된 peptide로 칼슘 항상성 조절에 필수적이며, 칼슘의 농도와 역-상관관계를 가지는데, 칼슘은 부갑상선 세포의 calcium-sensing receptor에 결합하여 PTH 분비에 영향을 주게 된다. PTH는 신장의 칼슘 재흡수와 장의 칼슘 흡수, 뼈의 remodeling을 증가시킨다. 비타민 D 부족과 이차성 부갑상선 항진증 (hyperparathyroidism)은 노인층에서 일반적으로 발생하는데 이 역시 골다공증에 기여할 수 있다. 이차성 부갑상선 항진증은 비타민 D가 상대적으로 부족하여 circulating form인 25-hydroxy vitamin D의 농도가 30ng/mL 이하로 떨어졌을 때 발생하고 그러므로 비타민 D 보급은 이 농도나 그 이상으로 되어야 한다. 활성형 호르몬인 1,25-dihydroxy vitamin D(calcitriol)는 장에서의 칼슘과 인의 흡수에 필수적이고 PTH 생성에 대한 tonic inhibitory effect도 있어서 양쪽 모두 이차성 부갑상선 항진증 유발의 원인이 될 수 있다. 비타민 D 부족과 이차성 부갑상선 항진증은 뼈 감소 가속화, 골절 증가, 신경근육 장애를 통한 넘어질 위험 증가를 유발한다.
C. 새로운 골다공증 치료제의 디자인
현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 화합물로는 비스포스포네이트 제제(알렌드로네이트, 에티드로네이트), 호르몬 제제(랄록시펜), 비타민 D 제제, 칼시토닌 제제, 칼슘 제제 등이 있다. 일반적으로 골다공증 치료제에 대해서 환자의 순응도가 낮고 지속적인 복용이 잘 이뤄지지 않는다. 경구용 bisphosphonates는 상부 위장의 부작용이 있을 수 있으며, 물 한잔과 공복에 먹어야 하고 똑바로 앉거나 서서 30~60분 동안 음식물이나 음료를 섭취하면 안 되는 등 복용 시 주의 할 점이 많다. 또한 오랫동안 사용하면 뼈의 remodeling을 과도하게 억제하고 골절과 미세 손상을 회복하지 못하게 되어 지나친 골화와 미소 균열 증가를 유발한다는 우려도 있다. 호르몬 대체요법의 경우 치료 효과만큼 그에 따른 부작용이 크다는 문제점이 있으며, PTH는 매일 피하 주사해야 되는 불편함과 비싼 가격의 문제점이 있다. 또한, 칼슘과 비타민 D 보급만으로는 치료효과가 불충분하다. 더욱이, 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없으며 약물의 장기 투여가 필수적이므로, 약물을 장기 투여할 때에 상기와 같은 부작용이 없고 우수한 약효를 갖는 새로운 화합물의 필요성이 요구되고 있다.
이에 따라, 본 발명자들은 골다공증에 대한 효과적인 치료제를 찾고자 새로운 골다공증 치료제를 디자인하여 합성하고, 이들 화합물이 파골세포로의 분화(파골세포의 형성)를 억제해 골흡수를 효과적으로 억제함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 골다공증 완화, 예방 또는 치료에 유용한 신규한 화합물과, 이의 제조방법, 이를 함유하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 하기 [화학식 I]로 표시되는 신규한 화합물, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 수화물 또는 용매화물을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pat00001
상기 [화학식 I]에서,
R1 또는 R2는 독립적으로 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 시아노, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C2-C4 알켄일 또는 N`-히드록시카르밤이미도일이며, 여기서, 알킬, 알콕시, 알켄일은 치환되지 않거나, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도 또는 시아노 중에서 선택된 1종 이상으로 치환된 것일 수 있고, R1 또는 R2는 페닐기에 오르소(ortho)-, 메타(meta)-, 또는 파라(para )-위치에 위치한다.
상기 N`-히드록시카르밤이미도일은 N`-히드록시아미디노일 수 있으며, 이는 (E)-N`-히드록시아미디노 또는 (Z)-N`-히드록시아미디노를 포함하며, 바람직하게는 (E)-N`-히드록시아미디노일 수 있다.
본 발명에서, 상기 [화학식 I]의 화합물, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 수화물 또는 용매화물은 하기 [화학식 I-1]로 표시되는 5-(4-(N`-히드록시카르밤이미도일-펜옥시)-N-(2-(4-에틸페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드, 하기 [화학식 I-2]로 표시되는 5-((E)-4-N`-히드록시아미디노펜옥시)-N-(2-(페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드 또는 하기 [화학식 I-3]으로 표시되는 5-((E)-4-N`-히드록시아미디노펜옥시)-N-(2-(4-메톡시페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 수화물 또는 용매화물일 수 있다.
[화학식 I-1]
Figure pat00002
[화학식 I-2]
Figure pat00003
[화학식 I-3]
Figure pat00004
본 발명에서, 약제학적으로 허용 가능한 염은 통상적으로 약제조업자가 의약품을 제조하는데 사용하는 무기산 및 유기산염을 의미하며, 예를 들어, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등이 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 푸 마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플루오로아세트산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 말레인산, 벤조산, 글루콘산, 글리콜산, 숙신산, 4-모폴린에탄술폰산, 캠포술폰산, 4-니트로벤젠술폰산, 히드록시-O-술폰산, 4 -톨루엔술폰산, 칼룩투론산, 엠보산, 글루탐산, 아스파르트산 등이 있다.
본 발명은 또한, a)하기 [화학 식 II]의 화합물 및 5-브로모발레르산을 아미드 결합반응시켜 하기 [화학식 III]의 화합물을 제조하는 단계 및 b) [화학식 III]의 화합물과 [화학식 IV]를 염기 존재 하에서 반응시켜 [화학식 I] 화합물을 제조하는 방법을 제공한다:
[화학식 II]
Figure pat00005
[화학식 III]
Figure pat00006
[화학식 IV]
Figure pat00007
[화학식 I]
Figure pat00008
상기 [화학식 I] 내지 [화학식 IV]에서,
R1 또는 R2는 각각 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 시아노, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C2-C4 알켄일 또는 N`-히드록시카르밤이미도일이며, 여기서, 알킬, 알콕시, 알켄일은 치환되지 않거나, 플루오로 , 클로로, 브로모, 요오도 또는 시아노 중에서 선택된 1종 이상으로 치환된 것일 수 있고, R1 또는 R2는 페닐기에 오르소(ortho)-, 메타(meta)-, 또는 파라(para)-위치에 위치한다.
상기 N`-히드록시카르밤이미도일은 N`-히드록시아미디노일 수 있으며, 이는 (E)-N`-히드록시아미디노 또는 (Z)-N`-히드록시아미디노를 포함하며, 바람직하게는 (E)-N`-히드록시아미디노일 수 있다.
본 발명에서, a)단계의 출발물질로 사용되는 [화학식 II] 화합물은 Bioorg. Med. Chem. 18: 7580 -7585 (2010)에 기재된 방법으로 합성하거나 시중에서 구입하여 사용할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서, a) 단계의 아미드 결합반응 조건은 통상의 기술자가 아민기가 있는 화합물과 카르복실산 기가 있는 화합물을 반응시켜 아미드 결합을 형성시킬 때 사용하는 반응 조건을 이용하며, 예를 들어, PyBOP(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate) 또는 PyBROP 및 3차 아민 존재하에서 수행할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서, a) 단계가 PyBROP 및 3차 아민의 존해 하에서 수행되는 경우, 상기 3차아민은 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, N-메틸포르포린, N-메틸피페 리딘, 4-디메틸아미노피리딘, N,N-디메틸아닐린, 2, 6-루티딘 및 피리딘 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, N,N-디이소프로필에틸아민이 보다 더 바람직하다.
본 발명의 제조방법에서, 5-브로모발레르산의 사용량은 a) 단계의 [화학식 II] 화합물의 1 몰(mol) 대비 0.85 내지 1.50몰(mol)이 바람직하며, PyBOP의 사용량은 [화학식 II] 화합물의 1몰 대비 0.95 내지 1.20 몰이 바람직하고 1.00몰이 보다 바람직하다.
본 발명의 제조방법에서, a)단계의 반응용매는 유기화합물 제조에서 아미드 결합반응 수행 시 통상적으로 사용하는 유기용매를 사용할 수 있으며, 예를 들어, DMF(디메틸포름아미드), DMSO(디메틸설폭시드), 아세톤(aceto ne) 등을 사용할 수 있으며, DMF가 보다 바람직하다.
본 발명의 제조방법에서, a)단계의 반응온도는 아미드 결합반응 수행시 통상적으로 사 용하는 반응온도일 수 있으며, 바람직하게는 -5 내지 50℃이며, 실온(15 내지 30℃)이 보다 더 바람직하다.
본 발명의 제조방법에서, b) 단계의 [화학식 IV]는 시중에서 판매되는 화합물을 이용 (Aldrich 사) 한 것일 수 있다.
본 발명의 제조방법에서, b) 단계의 염기는 무기 염기일 수 있으며, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산칼슘 및 인산나트륨에 서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다.
상기 무기 염기의 사용량은 [화학식 IV] 화합물의 1몰 대비 0.95 내지 1 .5몰이 바람직하고, 1몰이 보다 더 바람직하다.
본 발명의 제조방법에서, b)단계의 반응용매는 통상의 유기용매를 사용할 수 있으며, 예를 들어, DMF(디메틸포름아미드), DMSO(디메틸설폭시드), 아세톤 등을 사용 할 수 있고, DMF가 보다 바람직하다.
본 발명의 제조방법에서, b)단계의 반응온도는 실온 내지 70℃이며, 50 내지 60℃가 보다 바람직하다.
본 발명은 또한, 5-(4-시아노펜옥시-N-(2-(4-에틸페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄 아미드와 NH2OHㆍHCl을 3차아민 존재 하에 반응시켜 상기 화학식 I-1로 표시되는 5-(4-(N`-히드록시카르밤이미도일)-펜옥시-N-(2-(4-에틸페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드를 제조하는 방법을 제공한다.
여기서, 3차 아민은 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, N-메틸포르포린, N-메틸피페리딘, 4-디메틸아미노 피리딘, N,N-디메틸아닐린, 2, 6-루티딘 및 피리딘 중에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하며, 트리에틸아민이 보다 더 바람직하며, 3차아민의 사용 몰량은 NH2OHㆍHCl의 사용 몰량과 동일한 것이 바람직하다. 또한 본 반응에서, NH2OHㆍHCl의 사용량은 5-(4-시아노펜옥시-N-(2-(4-에틸페 닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드의 1몰 대비 1.1 내지 3몰이 바람직하며 2몰이 보다 더 바람직하다. 반응온도는 가열환류가 바람직하다.
본 발명은, 5-(4-시아노펜옥시-N-(2-(4-페닐아미노)벤조 [d]옥사졸-5-일)펜탄 아미드와 NH2OH를 포함하는 수용액(40 내지 60 중량%)을 반응시켜 상기 화학식 I-2로 표시되는 5-((E)-4-N`-히드록시아미디노펜옥시)-N-(2-(페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드를 제조하는 방법을 제공한다.
여기서, 상기 반응의 반응 용매는 C1-C4의 알콜일 수 있으며, 바람직하게는 메탄올일 수 있다. 상기 NH2OH의 사용량은 5-(4-시아노펜옥시-N-(2-(4-페닐아미노)벤조 [d]옥사졸-5-일)펜탄 아미드 1 몰 대지 1.1 내지 3몰이 바람직하며, 반응 온도는 약 30 내지 50℃, 바람직하게는 40℃일 수 있다.
본 발명은 5-(4-시아노펜옥시)-N-(2-(4-메톡시페닐아미노)벤조 [d]옥사졸 5-일)펜탄아미드와 NH2OH를 포함하는 수용액(40 내지 60 중량%)을 반응시켜 상기 화학식 I-3으로 표시되는 5-((E)-4-N`-히드록시아미디노펜옥시)-N-(2-(4-메톡시페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드를 합성하는 방법을 제공한다. 여기서, 상기 반응의 반응 용매는 C1-C4의 알콜일 수 있으며, 바람직하게는 메탄올일 수 있다. 상기 NH2OH의 사용량은 5-(4-시아노펜옥시-N-(2-(4-페닐아미노)벤조 [d]옥사졸-5-일)펜탄 아미드 1 몰에 대하여 1.1 내지 3몰이 바람직하며, 반응 온도는 약 30 내지 50℃, 바람직하게는 40℃일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 [화학식 I], 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 수화물 또는 용매화물을 유효량 함유하는 골다공증의 완화, 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pat00009
상기 [화학식 I]에서,
R1 또는 R2는 각각 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 시아노, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C2-C4 알켄일 또는 N`-히드록시카르밤이미도일이며, 여기서, 알킬, 알콕시, 알켄일은 치환되지 않거나, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도 또는 시아노 중에서 선택된 1종 이상으로 치환된 것일 수 있고, R1 또는 R2는 페닐기에 오르소(ortho)-, 메타(meta)-, 또는 파라(para )-위치에 위치한다.
상기 N`-히드록시카르밤이미도일은 N`-히드록시아미디노일 수 있으며, 이는 (E)-N`-히드록시아미디노 또는 (Z)-N`-히드록시아미디노를 포함하며, 바람직하게는 (E)-N`-히드록시아미디노일 수 있다.
본 발명의 조성물에서, [화학식 I]의 신규한 화합물, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 수화물 또는 용매화물은 하기 [화학식 I-1]로 표시되는 5-(4-(N`-히드록시카르밤이미도일-펜옥시)-N-(2-(4-에틸페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드, 하기 [화학식 I-2]로 표시되는 5-((E)-4-N`-히드록시 아미디노펜옥시)-N-(2-(페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드 또는 하기 [화학식 I-3]으로 표시되는 5-((E)-4-N`-히드록시 아미디노펜옥시)-N-(2-(4-메톡시페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 수화물 또는 용매화물일 수 있다.
[화학식 I-1]
Figure pat00010
[화학식 I-2]
Figure pat00011
[화학식 I-3]
Figure pat00012
또한, 본 발명은 앞서 언급한 상기 [화학식 I]의 신규한 화합물, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 수화물 또는 용매화물의 유효량을 골다공증 예방 또는 치료를 요하는 인간을 포함하는 포유류에게 투여함으로서 골다공증을 완화 또는 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 골다공증 예방 또는 치료위한 약제학적 제제를 제조하는데 앞서 언급한 상기 [화학식 I]의 신규한 화합물, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 수화물 또는 용매화물을 사용하는 용도를 제 공한다.
본 발명에서 용어 "골다공증"은 남아 있는 뼈에는 구조상으로 아무런 이상이 없으면서 뼈를 형 성하는 무기질과 기질의 양이 과도하게 감소되어 뼈에 스펀지처럼 작은 구멍이 많이 나서 무르고 쉽게 부러 지는 상태를 일컬으며, 골소송증이라고도 한다.
본 발명의 조성물은 상기 [화학식 I]의 신규한 화합물, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 수화물 또는 용매화물에 추가하여 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기한 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수 , 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제 형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 패치제, 액제, 환약, 캡 슐, 과립, 정제,좌제 등일 수 있다. 이들 제제는 당 분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 Remingt on's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법으로 제조 될 수 있으며 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 다양한 제제로 제제화 될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 화학식 1의 유도체 화합물의 일일 투여량은 약 10 내지 1 ,000㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 50 내지 500㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물은 골다공증의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명 [화학식 I]의 신규한 화합물, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 수화물 또는 용매화물은 파골세포의 형성을 억제해 골 흡수를 억제시킨다. 따라서 본 발명의 [화학식 I] 화합물, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 수화물 또는 용매화물은 골다공증의 완화제, 예방제 또는 치료제로 사용가능하다.
도1 및 도 2는 본원발명의 화합물의 처리에 따른 파골세포 분화의 억제정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3 및 도 4는 본원발명의 화합물의 처리에 따른 세포 생존률을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 K7 화합물의 칼시토닌 리셉터, 카셉신 K, αv-인테그린, β3-인테크린, ATP6v0d2, DC-STAMP에서 나타내는 효과를 관찰한 도이다.
도 6은 K7 화합물의 NFAT, ERK, p38 또는 IκB에서 나타내는 효과를 관찰한 도이다.
도 7은 K7 화합물을 마우스 두개관 골손실 모델에 처리한 결과 리포폴리사카라이드에 의한 파골세포 증가를 억제하는 정도를 TRAP 염색 면적으로 나타낸 그래프이다.
도 8은 K7 화합물을 마우스 골손실 모델에 처리한 결과 리포폴리사카라이드에 의한 골손실 증가를 억제하는 정도를 BMD (Bone Mineral Density)로 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
또한, 이하에서 언급된 시약 및 용매는 특별한 언급이 없는 한 Aldrich 사로부터 구입한 것이며, 1H-NMR 데이터는 400 MHz Varian FT-NMR spectrometer 기계로 측정한 값이며 , Mass 데이터는 JMS-700 (Jeol, Japan) 기계로 측정한 값이다. 또한, 실시예에서, "에테르"라고 표기된 것 은 별다른 언급이 없는 한 "디에틸에테르"를 의미하며, "헥산"(hexane)이라고 표기된 것은 별다른 언급이 없는 한 "n-헥산"을 의미한다.
< 실시예 1> 5-(4-(N'-히드록시 카르밤이미도일)-페녹시)-N -(2-(4-에틸페닐아미노)벤조[d] 옥사졸-5-일)펜탄아미드( K7 )의 합성
화합물 K7의 합성은 하기 [반응식 1]에 나타낸 바와 같이, 화합물 1c로부터 화합물 2c를 제조하고, 화합물 2c를 5% Pd/C존재하에 수소와 반응시켜 화합물2d를 제조하고 (88% 수득률), 이에 PyBOP(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate)을 이용하여 5-브로모발레르산(5-bromovaleric acid)과 커플링시켜 화합물 3을 제조하며(46% 수득률). K2CO3 존재 하에 60℃에서 4-시아노페놀(4-cyanophenol)과 반응하여 화합물K6를 얻은 후 (52% 수득률), 마지막으로 NH2OHㆍHCl과 reflux하여 화합물 K7(36% 수득률)를 제조하였다.
[반응식 1]
Figure pat00013
1-A. 1-(4-에틸페닐)-3-(2-히드록시-5-니트로페닐)치오우레아 (1c) 합성
메탄올10mL에 녹인 2-아미노-4-니트로페놀(2-amino-4-nitrophenol,0.5 g, 3.24 mmol)과 4-에틸 페닐 이소티오시아네이트(4-ethylphenyl isothiocyanate,0.530 g, 3.24 mmol)를 넣고 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 후, 용매를 회전 증류(rotary evaporation)로 제거한 후 침전물을 n-hexane으로 감압 여과하여 화합물 1c (0.809 g, 79%)를 얻었다.
Yellow-green powder, mp 137~138 ℃; 1 H NMR (400MHz, Acetone-d 6 ) δ 9.475 (s, 1H), 9.351 (s, 1H), 8,755 (s, 1H), 7.968 (d, J=9.8, 1H), 7.464 (d, J=8.0, 2H), 7.282 (d, J=8.8, 2H), 7.089 (d, J= 9.2, 1H), 2.658 (q, J=7.6, 2H), 1.225 (t, J=7.6, 3H).
1-B. N -(4-에틸페닐) -5-니트로벤조 [ d ]옥사졸 2-아민 (2c) 합성
KO2 (0.9 06 g, 12.75 mmol)가 현탁된 아세토니트릴 10 mL에 화합물 1c (0.809 g, 2.55 mmol)가 용해된 아세토니트릴 50mL를 질소가스 치환하의 얼음조(ice bath)에서 교반하면서 가하였다. 실온에서 16시간 동안 반응시킨 후 얼음물에 부어 희석시켰다. 이 용액을 디클로로메탄으로 추출하고 포화 NaCl 수용액으로 씻고 MgSO4로 건조시킨 후 용 매를 감압 농축시켜 화합물 2c (0.568 g, 88%)를 얻었다.
Yellow powder, mp 172~173 ℃; 1H NMR (400MHz, Acetone-d 6 ) δ 9.805 (s, 1H), 8.229 (s, 1H), 8.109 (d, J=8.8, 1H), 7.764 (d, J=8.4, 2H), 7.615 (d, J=9.2, 1H), 7.278 (d, J=8.8, 2H ), 2.651 (q, J=7.6, 2H), 1.230 (t, J=7.6, 3H).
1-C . N 2 -(4-에틸페닐)벤조 [ d ]옥사졸 -2,5-디아민 (2d)의 합성
상기 실시예 1-B에서 제조한 화합물2c (0.1 g, 0.35 mmol)를 메탄올 10ml에 녹이고, 이에 5% Pd/C를 적가하고, 수소를 충전시킨 후 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응액을 셀라이트(celite)로 여과한 후 여액의 용매를 감압하에서 제거하여 표제의 화합물2d (0.079 g, 88%)를 얻었다.
Grey solid, mp 143~145 ℃; 1H NMR (400MHz, Acetone-d 6 ) δ 9.170 (s, 1H), 7.737 (d, J=8.4, 2H), 7.205 (d, J=8.4 , 2H), 7.036 (d, J=8.8, 2H), 6.752 (s, 1H), 6.439 (d, J=8.4, 1H), 4.443 (d, J=1 0.4, 1H), 2.615 (q, J=7.6, 2H), 1.210 (t, J=7.6, 3H); HR-FABMS Calcd for C15 H16N3O (M++H): 254.1293, Found: 254.1292.
1-D. N -(2-(4-에틸페닐아미노)벤조 [ d ]옥사졸 -5-일)-5-브로모펜탄아미드 (3 = K25)의 합성
화합물 2d (0.079 g, 0.31 mmol), 5-브로모발레르산(5-bromovaleric acid, 0.051 g, 0.28 mmol), PyBOP (benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate, 0.163 g, 0.31 mmol)에 DMF(d imethylformamide) 8 mL를 얼음조(ice bath)에서 넣어 녹였다. 여기에 디이소프로필에틸아민(diisopropyl e thylamine, 0.073 g, 0.57 mmol)을 가하고 16시간 동안 실온에서 반응시켰다. 에틸아세테이트(EtOAc, 8 mL) 를 넣어 희석시키고 10% HCl 수용액으로 3회, 포화 NaHCO3 수용액으로 2회, 포화 NaCl 수용액으로 1회 씻었다. MgSO4로 건조시킨 후 용매를 감압 농축시키고 이를 컬럼크로마토그래 피(EtOAc/hexane= 2:1(v/v))를 이용하여 표제의 화합물 3 (화합물 K25)(0.054 g, 46%)을 얻었다.
Pale brown powder, mp 196~198 ℃; 1H NMR (400MHz, Acetone-d 6 ) δ 9.360 (s, 1H), 9.152 (s, 1H), 7.871 (s, 1H), 7.755 (d, J=8.4, 2H), 7.343 (d, J=8. 8, 1H), 7.266 (d, J=8.4, 1H), 7.230 (d, J=8.8, 2H), 3.546 (t, J=6.6, 2H), 2.628 (q, J=7.6, 2H), 2.428 (t, J=7.2, 2H), 1.989~1.919 (m, 2H), 1.899~1.803 (m, 2H), 1.218 (t, J=7.6, 3H); HR-FABMS Calcd for C20H23BrN3O2 (M++H): 416.0974, Found: 416.0969.
1-E. 5-(4-시아노펜옥시- N -(2-(4-에틸페닐아미노)벤조[ d ]옥사졸 -5-일)펜탄아미드(k6)의 합성
DMF 3 mL에 녹인 4-시아노페놀(4-cyanophenol, 0.024 g, 0.20 mmol)에 K2CO3 (0.032 g, 0.23 mmol)를 가한 후 50~55℃에서 30분간 교반하였다. 여기에 DMF 4 mL에 녹인 화합물 K25 (0.064 g, 0.15 mmol)을 넣고 60℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 실온으로 냉각시킨 후 EtOAc 7 mL를 가해 희석시키고 증류수와 포화 NaCl 수용액으로 씻었다. MgSO4로 건조시킨 후 용매를 감압 농축시키고 이를 디에틸에테르로 씻으면서 감압 여과하여 표제의 화합물 K6 (0.036 g, 52%)를 얻었다.
Pale yellow powder, mp 2 00~203 ℃; 1H NMR (400MHz, Acetone-d 6 ) δ 9.358 (s, 1H), 9.151 (s, 1H), 7.874 (s, 1H), 7.755 (d, J=8.4, 2H), 7.691 (d, J=8.8, 2H), 7.339 (d, J=8.6 , 1H), 7.264 (d, J=8.4, 1H), 7.231 (d, J=8.4, 2H), 7.122 (d, J=9.2, 2H), 4.167 (t, J=6.0, 2H), 2.627 (q, J=7.6, 2H), 2.473 (t, J=7.0, 2H), 1.907~1.876 (m, 4H) , 1.218 (t, J=7.6, 3H); HR-FABMS Calcd for C27H27N4O 3 (M++H): 455.2083, Found: 455.2080.
1-F. 5-(4-( N ' -히드록시 카르밤이미도일 )- 페녹시 )- N -(2-(4- 에틸페닐아미노 )벤조 [ d ] 옥사졸 -5-일) 펜탄아미드 ( k7 )의 합성
화합물K6 (0.031 g, 0.07 mmol)에 에탄올 5 mL를 가하고 교반하면서 트리에틸아민(0.014 g, 0.14 mmol)을 넣었다. 여기에 NH2OHㆍHCl(0.010 g, 0.14 mmol)을 넣고 밤새 환류하였다. 반응액의 온도를 40℃로 냉각시키고 증류수를 서서히 가해서 결정으로 만들었다. 이 결정을 증류수와 디에틸 에테르로 씻어 표제의 화합물K7 (0.012 g, 36%)를 얻었다.
White powder, mp 191~196 ℃; 1H NMR (400MHz, Acetone-d6) δ9.364 (s, 1H), 9.162 (s, 1H), 8.693 (s, 1H), 7.881 (s, 1H), 7.753 (d, J=8.8, 2H), 7.643 (d, J=9.2, 2H), 7.349 (d, J=8.0, 1H) , 7.263 (d, J=8.4, 1H), 7.229 (d, J=8.8, 2H), 6.929 (d, J=9.2, 2H), 5.371 (s, 2 H), 4.070 (t, J=6.0, 2H), 2.627 (q, J=7.6, 2H), 2.467 (t, J=7.2, 2H), 1.893~1.8 72 (m, 4H), 1.218 (t, J=7.6, 3H); HR-FABMS Calcd for C27H30N5 O4 (M++H): 488.2298, Found: 488.2299.
<실시예 2> 5-((E)-4-N`-히드록시아미디노펜옥시)-N-(2-(페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드 (D2F)의 합성
화합물 D 2F는 하기의 [반응식 2]에 나타낸 바와 같은 방법으로 합성하였다.
[반응식 2]
Figure pat00014
(c) 5% Pd/C, H2, CH3OH, rt, 24 hr; (d) 5-Bromovaleric acid, PyBOP, iPr 2NEt, DMF, rt, 16 hr; (e) 4-Cyanophenol, K2CO3, 60 ℃, 5 hr; (f) 50 % NH2OH in water, CH3OH, 40 ℃, 16hr.
2-A. 1-(2-히드록시-5-니트로페닐 )-3-페닐티오우레아[1-(2-hydroxy-5-nitrophenyl)-3-phenylthiourea] (D2-1)의 제조
메탄올10 mL에 녹인 2-아미노-4-니트로페놀(2-amino-4-nitrophenol, 0.5 g, 3.24 mmol, 1eq.)에 페닐 이소티오시아네이트(phenyl isothiocyanate, 0.439 g, 3.24 mmol)를 넣고 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 회전증류(rotary evaporation)으로 제거한 후 침전을 디에틸에테르, n-헥산으로 세척하고 감압 여과하여 화합물 D2 -1 (0.850 g, 91%)을 얻었다.
Yellow powder, mp 145-148 ℃; 1H NMR (400MHz, Ace tone-d 6 ) δ 9.327 (d, J=2.8 Hz, 1H), 7.977 (dd, J=8.8, 2.8 Hz, 1H), 7.596 (d, J=6.4 Hz, 2H), 7.427 (t, J=8.0 Hz, 2H), 7.256 (t, J=7.4 Hz, 1H), 7.10 4 (d, J=8.8 Hz, 1H)
2-B. 5-니트로 N-페닐벤조 [d]옥사졸 -2-아민(D2)의 합성
KO2 (1.044 g, 14.69 mmol)가 현탁된 아세토니트릴10 mL에 화합물 D2-1 (0.850 g, 2.94 mmol)가 용해된 아세토니트릴 15 mL를 질소가스 치환 하의 ice bath에서 교반하면서 가하였다. 실온에서 16시간 동안 반응 시킨 후 얼음물에 부어 희석시켰다.
디클로로메탄으로 3회 추출하고 포화 NaCl 수용액으로 씻고 MgSO 4로 건조시킨 후 용매를 감압 농축시켜 표제의 화합물D2 (0.450 g, 92%)를 얻었다.
Yell ow powder, mp 209-210 ℃; 1H NMR (400MHz, Acetone-d 6 ) δ 9.298 (br s, 1H), 7.841 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.356 (t, J=8.0 Hz, 2H), 7.064~7.005 (m, 2H), 6.775 ( d, J=4.8 Hz, 1H), 6.458 (dd, J=8.6, 2.2 Hz, 1H)
2-C. N2-페닐벤조[d]옥사졸-2,5-디아민 (D2R)
화합물 D2 (0.450 g, 1.76 mmol)를 4개의 둥근플라스크에 약 110 mg씩 나눠서 반응하였다. 각 둥근플라스크에 메탄올10 mL를 화합물 D2 (0.110 g, 0.43 mmol)와 5% Pd/C (0.9 g)에 적가한 후 수소를 충전시켜 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 각 둥근 플라스크의 반응액을 셀라이트(celi te)로 여과한 후 여액의 용매를 감압 하에서 제거하여 목적 화합물 D2R (0.361 g, 91%)를 얻었다.
Brown powder, mp 161-163 ℃; 1H NMR (400MHz, Acetone-d 6 ) δ 9.271 (brs, 1H), 7.841 (d, J=7.6 Hz, 2H), 7.357 (t, J=7.6 Hz, 2H), 7.064~7.006 (m, 2H), 7.77 0 (d, J=0.8 Hz, 1H), 6.456 (dd, J=8.6, 2.2 Hz, 1H)
2-D. 5-브로모-N-(2-(페닐아미노 )벤조 [d]옥사졸 5-일)펜탄아미드(D2RC)의 제조
화합물 D2R (0.361 g, 1.60 mmol), 5-브로모 발레르산(5-bromovaleric acid, 0.029 g, 1.60 mmol), PyBOP (0.918g, 1.76 mmol)에 DMF 15 mL를 넣어 녹였다. 여기에 디이소프로필 에틸아민(0.168 ㎕, 0.96 mmol)을 가하고 16시간 동안 실온에서 반응시켰다. EtOAc 30 mL를 넣어 희석시키고 10% HCl 수용액으로 3회, 포화 NaHCO3 수용액으로 2회, 포 화 NaCl 수용액으로 1회 씻었다. MgSO4로 건조시킨 후 용매를 감압 농축하여 화합물 D2RC (0.385 g, 62%)를 얻었다.
White powder, mp 166-168 ℃; 1H NMR (400MHz, Acetone- d 6 ) δ 9.464 (brs, 1H), 9.165 (brs, 1H), 7.891~7.846 (m, 3H), 7.405~7.346 (m, 3H), 7 .282 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.061 (t, J=7.4 Hz, 1H) , 3.547 (t, J=6.6, 2H), 2.430 ( t, J=7.4, 2H), 1.974~1.920 (m, 2H), 1.879~1.822 (m, 2H)
2-E. 5-(4-시아노펜옥시)-N-(2-(페닐아미노)벤조 [d]옥사졸-5-일 펜탄아미드 (D2RCP)의 합성
DMF 10 mL에 녹인 4-시아노페놀(4-cyanop henol, 0.150 g, 1.26 mmol)에 K2CO3 (0.201 g, 1.46 mmol)를 가한 후 50~55 ℃ 에서 30분간 교반하였다. 여기에 DMF 5 mL에 녹인 화합물 D2RC (0.377 g, 0.97 mmol)를 넣고 60 ℃에 서 5시간 동안 반응시켰다. 실온으로 냉각시킨 후 EtOAc 7 mL를 가해 희석시키고 증류수와 포화 NaCl 수용액 으로 씻었다. MgSO4로 건조시킨 후 용매를 감압 농축시키고 이를 ether로 씻으면서 감압 여과 하여 표제의 화합물 D2RCP (0.259 g, 63%)를 얻었다.
White powder, mp 181-182 ℃; 1 H NMR (400MHz, Acetone-d 6 ) δ 9.464 (brs, 1H), 9.167 (brs, 1H), 7.893 (d, J =2 Hz, 1H) 7.872~7.847 (m, 2H), 7.692 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.405~7.343 (m, 3H), 7.281 (d, J =8.8, 1H), 7.122 (d, J=8.8, 2H), 7.061 (t, J=7.4 Hz, 1H), 4.168 (t, J=6 Hz, 2H) , 2.476 (t, J=6.8 Hz, 2H), 1.909~1.892 (m, 4H)
2-F. 5-((E)-4-아미디노펜옥시)-N-(2-(페닐 아미노)벤조 [d]옥사졸 -5-일)펜탄아미드 (D2F)의 합성
화합물 D2RCP (0.259 g, 0.607 mmol)에 메탄올 20 mL를 가하고 환류하여 완전히 녹였다. 실온으로 식힌 후 NH2OH 50% in water (1 .85 mL, 1.215 mmol, 2 eq.)를 가하였다. 반응액의 온도를 40 ℃로 높이고 16시간 동안 교반하였다. 감압 농축하여 용매를 제거하고 증류수를 가하여 결정을 만든 후 감압여과 하였다. 얻어진 고체를 컬럼크로마토그래피(EtOAc/MeOH=10:1(v/v))로 정제하여 표제의 화합물 D2F (0.50 g, 18%)를 얻었다.
White powder, mp 202-203 ℃; 1H NMR (400MHz, Acetone-d 6 ) δ 9.467 (brs, 1H), 9.178 (brs, 1H), 8.695 (brs, 1H), 7.901 (d, J=2 Hz, 1H), 7.859 (d, J=7.6, 2H), 7.643 ( d, J=8.8 Hz, 2H), 7.404~7.353 (m, 3H), 7.280 (d, J=8.8, 1H), 7.061 (tt, J=7.4, 0.8 Hz, 1H), 6.930 (d, J=9.2 Hz, 2H), 5.373 (brs, 1H), 4.070 (t, J=5.6 Hz, 2H), 2.470 (t, J=7 Hz, 2H), 1.894~1.872 (m, 4H), HR-FABMS Calcd for C25H25N 5O4 (M++H): 460.1985, Found: 460.1988.
<실시예 3> 5-((E)-4-N`-히드록시아미디노펜옥시)-N-(2-(4-메톡시페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드(D5F)의 합성
화합물 D5F를 하기의 [반응식 3]에 나타낸 바와 같은 방법으로 합성하였다.
[반응식 3]
Figure pat00015
(c) 5% Pd/C, H2, CH3 OH, rt, 24 hr; (d) 5-Bromovaleric acid, PyBOP, iPr2NEt, DMF, rt, 16 hr; (e) 4-Cyanophen ol, K2CO3, 60 ℃, 5 hr; (f) 50% NH2OH in water, CH3 OH, 40 ℃, 18hr.
3-A. 1-(2-히드록시-5-니트로페닐)-3-(4-메톡시페닐)티오우레아(D5-1)의 합성
메탄올10 mL에 녹인 2-아미노-4-니트로페놀 (0.5 g, 3.24 mmol, 1eq.)에 4-메톡시페닐 이소티오시아네이트 (4-methoxyphenyl isothiocyanate, 448 ㎕, 3.24 mmol)를 넣고 24시간 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 rotary evaporation으로 제거한 후 침전을 디에틸에테르, n-헥산으로 세척하고 감압 여과하여 표제의 화합물 D5-1 (0.810 g, 78%)을 얻었다.
Yellow powder, mp 135-136 ℃; 1H NMR (400MHz, A cetone-d 6 ) δ 9.372~9.335 (m, 1H), 8.656 (brs, 1H), 7.961 (dd, J=9, 2.6 Hz , 1H), 7.437 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.079 (d, J=9.2 Hz, 1H), 6.999 (d, J=8.8 Hz, 2H ), 3.827 (s, 3H)
3-B. N-(4-메톡시페닐)-5-니트로벤조 [d]옥사졸 -2-아민(D5)의 합성
KO2 (0.902 g, 12.68 mmol)가 현탁된 아세토 니트릴 10 mL에 화합물 D5-1 (0.810 g, 2.54 mmol)가 용해된 아세토니트릴 15 mL를 질소가스 치환하의 ice bath에서 교반하면서 가하였다. 실온에서 16시간 동안 반응 시킨 후 얼음물에 부어 희석시켰다.
디클로로메탄으로 3회 추출하고 포화 NaCl 수용액으로 씻고 MgSO 4로 건조시킨 후 용매를 감압 농축시켜 화합물 D5 (0.545 g, 75%)를 얻었다.
Yellow pow der, mp 196-197 ℃; 1H NMR (400MHz, Acetone-d 6 ) δ 9.689 (brs, 1H) , 8.200 (dd, J=2.4, 0.4 Hz, 1H), 8.095 (dd, J=8.8, 2.4 Hz, 1H), 7.761 (d, J=9.2 Hz, 2H), 7.597 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.007 (d, J=8.8 Hz, 2H) 3.820 (s, 3H)
3-C. N-2-(4- 메톡시페닐 ) 벤조 [d] 옥사졸 -2,5- 디아민 ( D5R )의 합성
둥근 플라스크에 메탄올 10 mL를 화합물 D5 (0.135 g, 0.47 mmol)와 5% Pd/C (0.2 g)에 적가한 후 수소를 충전시켜 24시간 동안 실온에서 교반하 였다. 반응액을 셀라이트(celite)로 여과한 후 여액의 용매를 감압 하에서 제거하여 화합물 D5R (0 .067 g, 14%)를 얻었다.
Brown powder, mp 156-158 ℃; 1H NMR (400MHz, Acetone-d 6 ) δ 9.060 (brs, 1H), 7.737 (d, J=9.2 Hz, 2H), 7.021 (d, J=8.4 Hz, 1H), 6.9 42 (d, J=9.2 Hz, 2H), 6.732 (d, J=2 Hz, 1H), 6.418 (dd, J=8.4, 2.4 Hz, 1H), 3.7 89 (s, 3H)
3-D. N-(2-(4-메톡시페닐아미노)벤조 [d]옥사졸 -5-일)-5-브로모펜탄아미드 (D5RC)의 합성
화합물 D5R (0.067 g, 0.26 mmol), 5-브로모발레르산(5-bromovaleric acid, 0.043 g, 0.24 mmol), PyBOP (0.135 g, 0.26 mmol)에 DMF 8 mL를 넣어 녹였다. 여기에 디이소프로필에틸아민(33㎕, 0.19 mmol)을 가하고 16시간 동안 실온에서 반응시켰다. EtOAc 8 mL를 넣어 희석시키고 10% HCl 수용액으로 3회, 포화 NaHC O3 수용액으로 2회, 포화 NaCl 수용액으로 1회 씻었다. MgSO4로 건조시킨 후 용매를 감압 농축하여 화합물 D5RC (0.055 g, 55%)를 얻었다.
White powder, mp 179-180 ℃; 1H NMR (400MHz, Acetone-d 6 ) δ 9.266 (brs, 1H), 9.145 (brs, 1H), 7 .844 (d, J=1.6 Hz, 1H), 7.755 (d, J=9.2 Hz, 2H), 7.330 (dd, J=8.4, 2.5 Hz, 1H), 7.250 (d, J=8.4 Hz, 1H), 6.965 (d, J=9.2 Hz, 2H), 3.800 (s, 3H), 3.545 (t, J=6. 4 Hz, 2H), 2.425 (t, J=7.2 Hz, 2H), 1.972~1.918 (m, 2H), 1.875~1.819 (m, 2H)
3-E. 5-(4- 시아노펜옥시)-N-(2-(4-메톡시페닐아미노)벤조 [d]옥사졸 5-일)펜탄아미드 (D5RCP)의 합성
DMF 3 mL 에 녹인 4-시아노페놀(0.020 g, 0.17 mmol)에 K2CO3 (0.036 g, 0.26 mmol)를 가한 후 50~55 ℃에서 30분간 교반하였다. 여기에 DMF 4 mL에 녹인 화합물 D5RC (0.055 g, 0.13 mmol) 를 넣고 60 ℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 실온으로 냉각시킨 후 EtOAc 7 mL를 가해 희석시키고 증류수와 포화 NaCl 수용액으로 씻었다.
MgSO4로 건조시킨 후 용매를 감압 농축시키고 이를 에테르 로 씻으면서 감압 여과하여 화합물 D5RCP (0.029 g, 48%)를 얻었다.
White powder, mp 213-215 ℃; 1H NMR (400MHz, Acetone-d 6 ) δ 9.263 (brs, 1H), 9.146 (brs, 1H ), 7.849 (s, 1H), 7.755 (d, J=9.2 Hz, 2H), 7.691 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.329 (d, J =8.4 Hz, 1H), 7.248 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.122 (d, J=9.2 Hz, 2H), 6.965 (d, J=8.8 Hz, 2H), 4.167 (t, J=6.2 Hz, 2H), 3.800 (s, 3H), 2.470 (t, J=7 Hz, 2H), 1.905~1.874 (m , 4H)
3-F. 5-((E)-4-아미디노펜옥시)-N-(2-(4-메톡시페닐아미노)벤조[d]옥사졸 -5-일)펜탄아미드 (D 5F)의 합성
화합물 D5RCP (0.025 g, 0.055 mmol)에 메탄올10 mL를 가하고 환류하여 완전히 녹였다. 실온으로 식힌 후 NH2OH 50% in water (0.167 mL, 0.110 mmol, 2eq.)를 넣었다. 반응액의 온도를 40℃로 높이고 16시간 동안 교반한다. 감압 농축하여 용매를 제거하고 증류수를 가하여 결정을 만들고 감압여과 후 메탄올로 재결정하여 화합물 D5F (0.008 g, 30%)을 얻었다.
White powder, mp 200-202 ℃; 1H NMR (400MHz, Acetone-d 6 ) δ 9.259 (s, 1H), 9.148 (s, 1H), 8.686 (s, 1H), 7.856 (s, 1H), 7.754 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.642 (d, J=8.8 Hz, 2H ), 7.337 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.247 (d, J=8.8 Hz, 1H), 6.965 (d, J=9.2 Hz, 2H), 6 .929 (d, J=9.2 Hz, 2H), 5.362 (brs, 2H), 4.070 (t, J=6.2 Hz, 2H), 3.800 (s, 3H), 2.463 (t, J=7.2 Hz, 2H), 1.905~1.870 (m, 4H). HR-FABMS Calcd for C26H27N 5O5 (M++H): 490.2090, Found: 490.2095.
<실험예 1>
1) 마우스 골수세포의 배양
ICR mouse (6-9주, 수컷)를 경추 탈골한 후 70 % 에탄올로 소독하였다. 경골 부분의 피부를 절개하여 부착 근육을 떼어냈다. 경골 원심부를 절단하고 슬개골을 탈골시켜 경골을 적출하였다. 뼈 양끝을 조금 잘라 한 쪽 끝에 25G의 주사바늘을 꽂고 α-MEM (Minimum Essential Medium)을 흘 려보내 골수세포를 시험관에 모았다.
원심 분리한 후 a-MEM에 현탁하고 2배의 Gey's solution을 가해 적혈구를 제거했다. 원심 분리한 후 10 % FBS(fetal bovine serum)가 함유된 a-MEM으로 재현탁했다.
2) 파골 세포의 분화유도
초기 배양한 골수세포를 M-CSF(Macrophage colony-stimulating factor) 10 ng/ml로 하룻밤 배양한 후 부유세포를 M-CSF 30 ng/ml로 3일간 추가 배양했다. 접착 세포 (BMM) 회수 후 1 x 105 cells/well을 RANKL 50ng/ml 및 M-CSF 30ng/ml에서 또는 RANKL 50ng/ml 및 M-CSF 30ng/ml에 본원발명의 실시예 1(K7 ), 실시예 2(D2F) 또는 실시예 3(D5F) 화합물의 농도를 변화시키며 첨가하여 배양하였다.　실시예 1(K7) 화합물의 경우 1, 3, 10μM 농도로 각각 첨가하면서 배양하였고, 실시예 2(D2F) 또는 실시예 3(D5F) 화합물는 1, 2, 3μM 농도로 첨가하면서 배양하였다.
배양이 끝난 세포는 10 % formalin으로 10분간 고정한 후 에탄올l-아세톤(1:1(v/v)) 로 1분간 재고정하여 TRAP (tartrate-resistant acid phosp hatase) 을 염색하였다. 현미경 하에서 관찰하여 3개 이상의 핵을 가진 TRAP+ 세포를 다핵 파골세포로 판정하였으며, 상기 실시예 1(K7), 실시예 2(D2F) 또는 실시예 3(D5F) 화합물의 파골세포 분화에 관한 IC50 값을 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure pat00016
또한, 실시예 1(K7), 실시예 2(D2F) 또는 실시예 3(D5F) 화합물의 농도에 따른 파골세포의 분화 정도는 도 1 및 도 2와 같다. 도1 및 도 2에서, 가로축은 실시예 1(K7), 실시예 2(D2F) 또는 실시예 3(D5F) 화합물의 사용농도를 의미하며, 도 1의 가로축에서 왼쪽에서 오른쪽으로 K7의 농도는 0(Veh), 1, 3, 10μM이며, 도 2의 가로축에서 왼쪽에서 오른쪽으로 D2F와 D5F는 0, 1, 2, 3μM이며, 도 1 및 도 2에서 세로축은 TRAP+ 다핵 파골세포 수를 의미한다(*: p<0.05 compared to 0μM).
상기 표 1, 도 1 및 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 본원발명의 화합물은 아주 적은 농도로 파골세포의 분화를 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.
3) RNA 분리 및 RT-PCR 분석
Total RNA 추출은 Easy-blue (Intron, Biochemistry. INC.)를 이용하였다.
cDNA 합성은 1 mg의 total RNA를 oligodT primer, 10 mM dNTP, 1 unit RNase inhibitor 그리고 4 unit Scrip reverse transcriptase (Fermentas, Life science)로 42 ℃에서 60분, 70 ℃에서 10분 가열함으 로써 반응을 중지 시켰다. Polymerase chain reaction (PCR)의 조건과 사용한 primer (5'→3')의 서열은 다음과 같다.
4) 측정
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetazolium bromide (MTT) 정량은 Mosmann의 방법을 변형하여 실시하였다. 1x104 cells/well 농도로 96 well plate에 분주한 BMM 세포에 시료(실시예 1(K7), 실시예 2(D2F) 또는 실시예 3(D5F) 화합물)를 처리하고 일정 시간 동안 배양하였다. 배양액을 버리고 PBS로 wash 한 후, MTT 용액 (0.5 mg/ml)을 100 ㎕/well 첨가하여 호일로 싼 상태에서 5시간 동안 배양하고, Solubiliz ation buffer (10 % SDS in 0.01M HCl)를 100 ㎕/well 첨가하고 다시 호일로 쌌다. 16~17시간 동안 배양한 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
파골세포 분화 억제 효과가 단순히 화합물 노출에 의한 세포 수 의 차이가 아님을 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetazolium bromide (MTT) assay로써 확인하였다 (도 3 및 도 4). MTT assay 결과에서 나타나는 흡광도는 세포의 수와 직선적인 상관관계를 나타내게 되는데 도 3 및 도 4에 의하면 시료 처리 후(실시예 1(K7), 실시예 2(D2F) 또는 실시예 3(D5F) 화합물)의 흡광도가 시료 처리 전과 비교하여 유의하게 감소하지 않았다. 이는 시료 처리 후 전체 세포의 수가 감소하지 않았음을 의미하며, 그러므로 위의 실험 결과가 세포사 (cell death)에 의한 파골세포 감소가 아닌 파골세포 분화 억제에 의한 것임을 알 수 있다.
5) Pit 형성 분석
BMM 세포를 상아절편상에서 RANKL 50 ng/ml 및 M-CSF 30 ng/ml 존재하에서 또는 RANKL 50 ng/ml, M-CSF 30 ng/ml 및 실시예 1(K7) 화합물 10μM 존재 하에서 6일간 각각 배양하였다. 상아절편 표면의 세포를 닦아낸 후 toluidin blue (J.T. Baker, UK, 1㎍/ml)로 염색하였다. 상아절편상에서 골흡수로 형성된 pit을 현미경하에서 관찰하여 분석하였다.
그 결과는 도 5와 같다. 도 5에서, veh는 DMSO로 처리한 대조군을 나타내고, RANKL은 50ng/ml RANKL로 처리한 군을 나타내며, K7은 10μM K7 으로 처리한 군을 나타내며, R+K7은 10μM K7로 30분간 전처리후 200ng/ml RANKL로 처리한 군을 나타내고, *은 p<0.05 compared to Veh.을 나타내며, **은 *: p<0.05 compared to RANKL을 나타낸다(N.D.=Not Detectable)
또한, 도 5 A는 K7화합물의 처리에 따른 파골세포 특이적 마커 유전자(칼시토닌 리셉터, 카셉신 K, αv-인테그린, β3-인테크린, ATP6v0d2, DC-STAMP)의 발현량을 측정하기 위하여 역전사-중합효소연쇄반응법(RT-PCR)을 수행한 결과를 분석하여 나타낸 그래프이고, 도 5B는 K7 화합물의 처리에 따른 상아질 절편 상에서 골 흡수로 형성된 피트(pit)의 결과 그림이며, 도 5C는 도 5B에서 수행한 실험결과를 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 5A에서 RANKL 처리에 의해 파골세포 특이적 마커 유전자들의 발현이 증가하는 것을 볼 수 있으며, 이는 R+K7 처리군에서 유의하게 감소하였음이 확인된다.
도 5B 및 도 5C에서 RANKL처리로 상아질 절편상에 형성된 pit 수가 증가하는 것을 볼 수 있으며, 이는 R+K7 처리군에서 유의하게 감소하였음이 확인된다. K7 화합물의 파골세포 분화 억제효과와 일치하는 것으로, K7 화합물은 파골세포 분화를 억제하고 이 에 따라 파골세포의 골흡수 기능도 억제하는 것으로 추정되었다.
6) blot 분석
BMM 세포를 시약 처리하여 일정시간 배양 후, lysate buffer로 용해하고 원심 분리하였다. 단백질 농도는 BSA (bovine serum albumin)을 표준화하여 protein assay kit (Bio-Rad)를 사용하여 정량하였다. 20μg의 단백질을 SDS-PAGE (poly acrylamide gel electrophoresis)로 변성 분리하고, 이를 80v에서 1시간 45분 처리하여 PVDF membrane에 이전시켰다. 이를 5% skim milk가 함유된 PBST (Phosp hate Buffered Saline Tween-20) 용액으로 blocking하고, 1차 항체로서 anti-NFATc1 (Nuclear factor of ac tivated T-cells cytoplasmic 1, 1:200, Santa cruiz), p-ERK (1:1000, Cell signaling), ERK (Extracellul ar Regulated Kinase, 1:1000, Cell signaling), p-p38(1:1000, Cell signaling), p38(1:1000, Cell sign aling), anti-IkB (IkappaB, 1:1000) 또는 β-actin(1:4000, Sigma) 항체와 각각 반응시켰다. (여기서 나타 낸 숫자의 비는 예를 들어 1:4000은 4000배로 희석하여 사용하였다는 뜻이다.) PBST로 5회 세정하고 HRP (Horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반응시킨 후 ECL Advance (Amersham. CO.)로 발색시켜 분석 하였다.
그 결과는 도 6과 같다. 도 6에서, veh는 DMSO로 처리한 대조군을 나타내고, RANKL은 200ng/ml RANKL로 처리한 군을 나타내며, K7은 10μM K7로 처리한 군을 나타내며, R+K7은 10μM K7로 30분간 전처리후 200ng/ml RANKL로 처리한 군을 나타내고, *은 p<0.05 compared to Veh.을 나타내며, **은 *: p<0. 05 compared to RANKL을 나타낸다.
또한, 도 6A는 K7 화합물의 처리에 따른 NFAT(파골세포 분화를 위한 전 사인자)의 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이고, 도 6B는 K7 화합물의 처리에 따른 ERK 인산화 감소를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이며, 도 6C는 K7 화합물의 처리에 따른 p38 인산화 감소를 웨스턴 블랏으로 확인 한 결과이고, 도 6D는 K7 화합물의 처리에 따른 IκB 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 6에서 RANKL을 처리한 군에서는 파골세포 분화에 수반하는 NFATc1의 발현 증가, ERK 및 p38의 인산화 증가, IkB의 분해 증가를 관찰할 수 있으며, 이런 RANKL의 효과는 R+ K7 처리군에서 감소하는 것으로 나타났다. 이는 K7 화합물이 RANKL 자극에 의한 파골세포 분화 신호를 차단함을 시사하는 결과이다.
7) 동물모델 실험 1
실시예 1(K7) 화합물을 DMSO에 용해시킨 것을 corn oil과 섞어 준비하였다(corn oil:DMSO=9:1(v/v)).
ICR 마우스 (11-12주, 수컷)를 각각의 군이 5 마리를 포함하도록 대조군 1, 대조군 2 및 실험군으로 분류하였다. 파골세포 분화에 따른 골손실을 유도하기 위해 실험군 및 대조군 2의 마우스에는 리포폴리사카라이드 (0.5mg)를 실험 시작 1일 뒤 두개관(頭蓋冠)에 피하 주사하였다. 대조군 1에는 동량의 PBS를 주사하였다. 실험군 마우스에 DMSO와 con oil과 혼합된 실시예 1 (K7) 화합물 (5mg/kg)을 실험 시작일부터 5일 뒤까지 매일 총 6회 복강 내 주사하였다. 대조군 1 및 2에는 실험군과 동량의 DMSO와 Corn oil의 혼합물(Corn oil: DMSO=9:1(v/v))의 혼합액을 실험 시작일부터 5일 뒤까지 매일 총 6회 복강 내 주사였다.
6일 뒤 마우스를 희생시켜 두개관(頭蓋冠)을 채취한 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 고정하여 TRAP 염색하여 파골세포의 생성 정도를 현미경 하에서 관찰하였으며, 염색된 영역의 비율은 염색된 부위를 Image J 프로그램 (version 1.40. National Institutes of Health web site에서 제공받음)을 사용하여 측정한 후, %로 환산하였다.
상기 실험의 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 리포폴리사카라이드를 마우스 두개관(頭蓋冠)에 피하 주사한 대조군 2(LPS)는 TRAP+인 파골세포수가 증가한 반면, 실험군(LPS+K7)에서는 리포폴리사카라이드에 의한 파골세포의 수를 유의하게 감소시키는 것으로 나타났다(도 7 참조). 이를 통해 실시예 1(K7) 화합물이 파골세포 분화를 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.
8) 동물모델 실험 2
실시예 1(K7) 화합물을 DMSO에 용해시킨 것을 corn oil과 섞어 준비하였다(corn oil:DMSO=9:1(v/v)). ICR 마우스 (11-12주, 수컷)를 각각의 군이 8 마리를 포함하도록 대조군 1, 대조군 2 및 실험군으로 분류하였다.
대조군 2 및 실험군에는 골손실을 유도하기 위해 lipopolysaccharide (LPS, 5mg/kg)를 실험 시작 1일 뒤와 5일 뒤에 복강 내 주사하였으며, 대조군 1(Veh)에는 동량의 PBS(phosphate buffered saline)를 주사하였다.
실험군에는 실험 시작일부터 7일까지 실시예 1(K7) 화합물(5mg/kg)을 매일 총 8회 복강내 주사하였다. 대조군 1(Veh) 및 대조군 2(LPS)에는 corn oil:DMSO=9:1(v/v)을 주사하였다. 8일 뒤 마우스를 희생시켜 장골을 채취한 후 DXA (Dual-energy X-ray Absor ptiometry)로 분석하여 골밀도(BMD, Bone Mineral Density)를 측정하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서, *은 p<0.05 compared to Veh을 나타내며, **은 *: p<0.05 compared to LPS을 나타낸다.
도 8에서 대조군 2(LPS)는 대조군 1(Veh)에 비해 골밀도 (BMD, Bone Mineral Density)가 유의하게 감소하였으며, 이는 실험군(LPS+K7) 회복되는 것으로 나타났다.
이로부터 실시예 1(K7) 화합물은 파골세포 분화 저해를 통해 체내 골손실을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
9) 통계처리
실험결과는 평균+표준편차로 표기하였고, Student's t-test로 분석하여 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

Claims (12)

  1. 하기의 [화학식 I]의 신규한 화합물, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 수화물 또는 용매화물:
    [화학식 I]
    Figure pat00018

    상기 [화학식 1]에서,
    R1 또는 R2는 독립적으로 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 시아노, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C2-C4 알켄일 또는 N`-히드록시카르밤이미도일이며, 여기서, 알킬, 알콕시, 알켄일은 치환되지 않거나, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도 또는 시아노중에서 선택된 1종이상으로 치환된 것일 수 있고, R1 또는 R2는 페닐기에 오르소(ortho)-, 메타(meta)-, 또는 파라(para)-위치에 위치한다.
  2. 제1항에 있어서, [화학식 I]의 화합물은
    하기 [화학식 I-1]로 표시되는 5-(4-(N'-히드록시 카르밤이미도일)-페녹시)-N -(2-(4-에틸페닐아미노)벤조[d] 옥사졸-5-일)펜탄아미드;
    하기 [화학식 I-2]로 표시되는 5-((E)-4-N'-히드록시 아미디노펜옥시)-N-(2-(페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드; 또는
    하기 [화학식 I-3]으로 표시되는 5-((E)-4-N'-히드록시 아미디노펜옥시)-N-(2-(4-메톡시페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드인 것인 [화학식 I]의 화합물 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 이들의 수화물 또는 이들의 용매화물:
    [화학식 I-1]
    Figure pat00019

    [화학식 I-2]
    Figure pat00020

    [화학식 I-3]
    Figure pat00021
  3. a) 하기 [화학식 II]의 화합물 및 5-브로모발레르산을 아미드 결합 반응시켜 하기 [화학식 III]의 화합물을 제조하는 단계 및 b) [화학식 III]의 화합물과 [화학식 IV]를 염기 존재 하에 반응시켜 [화학식 I] 화합물을 제조하는 방법.
    [화학식 II]
    Figure pat00022

    [화학 식 II]
    Figure pat00023

    [화학식 IV]
    Figure pat00024

    [화학식 I]
    Figure pat00025

    상기 식에서,
    R1 또는 R2는 각각 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 시아노 , C1-4 알킬, C1-4 알콕시, C2-4 알켄일 또는 N`-히드록시카르밤이미도일이며, 여기서, 알킬, 알콕시, 알켄일은 치환되지 않거나, 플루오 로, 클로로, 브로모, 요오도 또는 시아노 중에서 선택된 1종이상으로 치환된 것일 수 있고, R1 또는 R2는 페닐기에 오르소(ortho)-, 메타(meta)-, 또는 파라(para)-위치에 위치한다.
  4. 제3항에 있어서, a) 단계의 아미드 결합반응은 PyBOP(benzotriazo l-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate) 및 3차 아민 존재하에서 수행되는 것인 [화학식 I] 화합물의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 3차 아민은 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, N-메틸포르포린, N-메틸피페리딘, 4-디메틸아미노피리 딘, N,N-디메틸아닐린, 2, 6-루티딘 및 피리딘 중에서 선택된 1종 이상인[화학식 I] 화합물의 제조방법.
  6. 제3항에 있어서, b) 단계의 염기는 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산칼 슘 및 인산나트륨에서 선택된 1종 이상인 [화학식 I] 화합물의 제조방법.
  7. 5-(4-시아노펜옥시-N-(2-(4-에틸페닐아미노)벤조[d] 옥사졸-5-일)펜탄아미드와 NH2OHㆍHCl을 3차아민 존재하에 반응시켜 5-(4-(N'-히드록시카르밤 이미도일)-펜옥시-N-(2-(4-에틸페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드를 제조하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 3차아민은 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에 틸아민, N-메틸포르포린, N-메틸피페리딘, 4-디메틸아미노피리딘, N,N-디메틸아닐린, 2, 6-루티딘 및 피리딘 중에서 선택된 1종 이상인 5-(4-(N'-히드록시카르밤이미도일)-펜옥시-N-(2-(4-에틸페닐아미노)벤조[ d]옥사졸-5-일)펜탄아미드를 제조하는 방법.
  9. 5-(4-시아노펜옥시-N-(2-(4-페닐아미노)벤조 [d]옥사졸-5-일)펜탄 아미드와 NH2OH를 반응시켜 5-((E)-4-N'-히드록시아미디노펜옥시)-N-(2-(4-페닐아미노)벤조 [d]옥사졸-5-일)펜탄아미드를 제조하는 방법.
  10. 5-(4-시아노펜옥시)-N-(2-(4-메톡시페닐아미노)벤조 [d]옥사졸 5-일)펜탄아미드와 NH2OH를 반응시켜 5-((E)-4-N'-히드록시아미디노펜옥시)-N-(2-(4-메톡시페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드를 제조하는 방법.
  11. 하기의 [화학식 I]의 신규한 화합물, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 수화물 또는 용매화물을 유효량 함유하는 골다공증의 완화, 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 I]
    Figure pat00026

    상기 [화학식 I]에서,
    R1 또는 R2는 각각 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도, 시아노, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시, C2-C4 알켄일 또는 N'-히드록시카르밤이미도일이며, 여기서, 알킬, 알콕시, 알켄일은 치환되지 않거나, 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도 또는 시아노 중에서 선택된 1종이상으로 치환된 것일 수 있고, R1 또는 R2는 페닐기에 오르소(ortho)-, 메타(meta)-, 또는 파라(para)-위치에 위치한다.
  12. 제11항에 있어서 , 상기 [화학식 I]의 화합물은
    하기 [화학식 I-1]로 표시되는 5-(4-(N'-히드록시 카르밤이미도일)-페녹시)-N-(2-(4-에틸페닐아미노)벤조[d] 옥사졸-5-일)펜탄아미드;
    하기 [화학식 I-2]로 표시되는 5-((E)-4-N'-히드록시 아미디노펜옥시)-N-(2-(페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드; 또는
    하기 [화학식 I-3]으로 표시되는 5-((E)-4-N'-히드록시 아미디노펜옥시)-N-(2-(4-메톡시페닐아미노)벤조[d]옥사졸-5-일)펜탄아미드인 골다공증의 완화, 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 I-1]
    Figure pat00027

    [화학식 I-2]
    Figure pat00028

    [화학식 I-3]
    Figure pat00029
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