KR20120136730A

KR20120136730A - 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산의 제조방법

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Publication number: KR20120136730A
Application number: KR1020110055842A
Authority: KR
Inventors: 권동건; 박남우; 이길용; 박상후; 임승택; 이주헌
Original assignee: 코오롱생명과학 주식회사
Priority date: 2011-06-10
Filing date: 2011-06-10
Publication date: 2012-12-20

Abstract

본 발명은 히알루론산을 염화칼슘(CaCl₂)과 반응시켜 변성 히알루론산을 제조하는 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 히알루론산 용액에 염화칼슘(CaCl₂)을 첨가하고 반응시키는 단계를 포함하는 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 히알루론산을 염화칼슘(CaCl₂)과 반응시켜 히알루론산 가교물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법은 기존 화학적 가교제를 이용한 것과 같이 효과적인 분자량 증가를 통해 점탄성 등의 물성이 증대되면서도, 화학적 가교제의 독성 또는 반응 조건 등과 관련된 안전성이 문제되어 사용이 제한되고, 선호도가 저하된다는 종래 기술의 문제점을 해결하여, 고점도나 고기능성이 요구되는 목적에 사용되는 히알루론산의 제조에 널리 사용할 수 있다.

Description

생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산의 제조방법{A METHOD FOR PREPARING MODIFIED HYALURONIC ACID HAVING HIGH BIOCOMPATIBILITY}

본 발명은 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산의 제조방법에 관한 것이다.

히알루론산(Hyaluronic acid, HA)은 분자량이 1,000 Da 내지 13,000,000 Da, 보통 50,000 Da 내지 10,000,000 Da에 이르는 고분자로, 생체 내 존재하는 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan)의 일종이며, 수용성이고, 무색의 고점도인 직쇄의 다당류이다. 상기 히알루로산의 구조는 반복단위인 글루쿠론산(D-glucuronic acid)과 N-아세틸글루코스아민(N-acetylglucosamine)의 동일 반복 분자구조 즉, 글루쿠론산과 N-아세틸글루코스아민이 β-1,3 결합과 β-1,4 결합이 번갈아가면서 반복적으로 연결된 구조를 갖는다.

히알루론산은 보습효과, 물리적 마찰에 대한 윤활효과 및 세균 등의 침입에 대한 보호 효과 등의 다양한 효능과 우수한 물성을 가지고 있어서, 화장품 첨가제, 관절염치료제, 안과수술용 수술보조제 및 외과수술후의 유착저해제 등 화장품, 의약품 및 의약부외품의 소재와 식품 등에 광범위하게 사용된다.

보다 구체적으로, 상기 히알루론산은 몸의 움직임을 원활하게 하는 윤활효과를 갖고, 생리 활성 물질들의 이동을 주관하며 세포와의 특이한 작용에 의해 세포의 분화 및 성장을 유도하는 중개자 역할 및 세포외 기질에서는 콜라겐, 엘라스틴, 황산콘드로이틴 등의 조직을 지탱하게 하는 단백질과 당 단백질들의 지지체 역할과 관련된 효능이 있으며, 수분함유능력이 뛰어나고 점성과 탄성이 우수한 것으로 알려져 있다.

따라서 이러한 특성들로 인해, 히알루론산은 노령화에 따른 퇴행성 관절염의 치료 및 통증완화 치료제로서 사용되고, 안과 수술시 수술 보조재 및 안구 건조증 약물의 주성분으로 사용되기도 하며, 또한 주름 및 함몰된 피부조직의 보완에도 사용되는 등 성형보조재료로서도 각광을 받고 있고, 화장품의 첨가제나 식품의 첨가제로도 사용되고 있다.

상기 히알루론산의 생리 활성 또는 기능성과 관련하여, 상기 히알루론산의 분자량에 따라 서로 구분되는 생리활성을 가지는 것으로 보고되어 있다.

구체적으로, 고분자의 히알루론산은 인체 충진제(space-filler)로 사용되고, 혈관생성 억제(anti-angiogenic) 활성, 면역 억제(Immunosuppressive) 활성 등의 기능성을 가지며, 중분자의 히알루론산은 면역 촉진(Immunostimulatory) 활성을 보이며, 저분자의 히알루론산은 세포사멸과 단백질 유도 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.

한편, 히알루론산은 큰 분자량과 구조적 성질로 인해 외부 스트레스와 같은 물리적인 힘에 의해 쉽게 분해되어 물성이 저하되는 것으로 알려져 있다. 이러한 히알루론산의 물성의 저하는 전형적인 고분자 용액의 특성과 관련된 것으로 파악되고 있다. 일반적으로, 높은 농도에서 형성된 고분자 네크워크는 non-newtonian flow의 성질을 띠게 되며, 상기 히알루론산이 외부의 물리적인 힘에 의해 쉽게 분해되고 물성이 저하되는 현상도 상기 non-newtonian flow의 성질과 부합되는 것으로 평가된다. 이러한 이유로, 상기 히알루론산은 온도와 pH에 변화에 의해 분자의 분해와 응집 현상을 나타내며, 염이나 금속이온의 첨가에 의해서도 물성의 변화가 발생되기도 한다.

히알루론산은 상기와 같은 뛰어난 생리 활성 또는 기능성을 가지고 있음에도 불구하고, 상기와 같이 외부 스트레스나 환경 변화에 따른 급격한 물성 저하가 나타나는 문제점들로 인해 임상적인 응용에 많은 제약이 있는 실정이다.

상기 기능성이 우수한 히알루론산의 문제점 즉, 외부 스트레스나 환경 변화에 따른 급격한 물성 저하라는 문제점을 보완하기 위해, 히알루론산의 안정성을 향상시키고자 하는 요구가 증대되고 있다.

이러한 요구와 관련하여, 여러 가지 화학적인 가교 반응에 의해 히알루론산의 가교 결합을 형성시키거나 히알루론산이 소수성을 띠게 하는 변성 반응 등을 이용해, 물리적 또는 화학적으로 안정적이고 탄탄한 구조의 겔을 형성하거나 상기 히알루론산의 불용적인 특성을 향상시켜 상기 히알루론산의 안전성을 향상시키고자 하는 다양한 연구가 보고되고 있다.

특히, 히알루론산의 가교 결합 형성과 관련하여, 화학적 반응을 통해 변성된 히알루론산을 생산하는 방법이 산업적으로 주로 사용되고 있다. 보다 구체적으로, 상기 화학적 반응을 통한 히알루론산의 변성은 상기 히알루론산의 카복실기와 수산화기를 변성의 주된 작용기로 이용하여, 에스테르화 반응에 의해 변성된 히알루론산을 생산하는 방법이 산업적으로 개발되어 있다.

이와 관련하여, 가교 결합(cross-linking)을 통해 분해 안정성 및 저항성을 향상시키고, 점도를 상승시키고자 하는 연구가 꾸준히 진행되고 있으며, 상기 가교 결합을 형성시키기 위하여, 에틸렌글리콜 디글리시딜 에테르(ethylene glycol diglycidyl eter, EGDGE), 부탄디올 디글리시딜 에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE), 글리시딜 에테르(glycidyl ether), 비스에폭사이드(bis(epoxides))등과 같은 에폭시계 가교제, 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 포름알데하이드(formaldehyde), 카르보디이미드(carbodiimides) 등의 다양한 가교제(cross-linkers)들이 제시되고 있다.

그러나, 상기와 같은 화학 가교제들은 세포 독성을 가지고 있어 가교 반응 시 최소량을 사용하여야 할 뿐만 아니라 반응 완료 후 부산물이나 잔류물들을 제거해야 하는 문제점을 보여, 의약용으로 제한이 따르기도 한다. 또한, 상기 화학 가교제를 사용하여 히알루론산을 변성시키는 경우, 우선 히알루론산을 pH 4.5정도의 산성 영역에서 충분히 용해하여 해리하는 과정이 요구되므로, 상기 pH 4.5 정도의 산성 영역에서 히알루론산을 처리하는 과정에서 상기 히알루론산이 급격하게 분해되는 문제점이 있다. 상기와 같이 히알루론산이 분해되어, 가교제에 의해 히알루론산에 가교가 형성되어도, 상기 가교결합에 의한 분자량 증가가 제한적이며, 상기 분자량 증가에 의해 물성을 향상시키기 위해서는 가교 반응 시 과량의 가교제를 사용할 것이 요구되고, 사용되는 가교제의 양이 증가할 경우 독성 등의 안전성 면에서 선호도가 저하될 수 있다. 또한, 상기 화학적 가교제를 사용하는 경우, 반응 완료 후 정제를 통해 화학적 가교제를 반드시 제거하여야 하는 문제점이 지적되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 개선하기 위하여, 화학적 가교제 없이 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로, 화학적 가교제 없이 히알루론산의 가교 결합을 형성시켜 변성 히알루론산을 제조하는 제조방법에 관한 것이다.

이러한 측면에서 본 발명은 히알루론산 가교물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 발명자들은 화학적 가교제의 사용없이 히알루론산의 가교결합을 형성하여, 생체 적합성이 우수하고 기능성이 향상된 변성 히알루론산을 제조하는 방법을 연구하던 중, 중성 영역의 정제수에 히알루론산을 충분히 해리한 후, 일정양의 CaCl₂를 가하면, 상기 히알루론산 간에 가교결합이 형성되어, 히알루론산의 분자량이 증대되고, 상기 분자량 증대에 의한 히알루론산의 물성이 향상된다는 것을 확인하였고, 상기 CaCl₂를 통해 제조된 변성 히알루론산에 대해 가교제, 일 예로 인체에 무해한 포스페이트나 최소량의 화학적 가교제를 첨가하여 가교반응을 추가로 진행시키는 경우, 2차적으로 가교 결합이 형성되어, 고기능성의 변성 히알루론산을 제조할 수 있다는 것을 확인하고, 이를 기초로 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 히알루론산을 염화칼슘(CaCl₂)과 반응시켜 변성 히알루론산을 제조하는 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 히알루론산 용액에 염화칼슘(CaCl₂)을 첨가하고 반응시키는 단계를 포함하는 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법에 관한 것이다.

상기 히알루론산 용액은 상기 히알루론산의 농도가 0.1%(w/v) 내지 10%(w/v) 또는 0.2%(w/v) 내지 5%(w/v) 또는 0.3%(w/v) 내지 2.5%(w/v) 또는 0.5%(w/v) 내지 2%(w/v)인 것일 수 있다. 상기 히알루론산 용액의 용매는 물 또는 유기용매일 수 있고, 일 예로 물일 수 있다.

이러한 측면에서, 본 발명은 상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시키는 단계 전에 상기 히알루론산의 농도가 0.1%(w/v) 내지 3%(w/v) 또는 0.3%(w/v) 내지 2.5%(w/v) 또는 0.5%(w/v) 내지 2%(w/v)인 히알루론산 용액을 제조하는 단계를 더욱 포함하는 것일 수 있다.

상기 히알루론산 용액을 제조하는 단계는 상기 히알루론산을 용매에 0.1%(w/v) 내지 3%(w/v) 또는 0.3%(w/v) 내지 2.5%(w/v) 또는 0.5%(w/v) 내지 2%(w/v)의 농도로 첨가하고, 10℃ 내지 90℃ 또는 30℃ 내지 85℃ 또는 50℃ 내지 80℃ 또는 50℃ 내지 70℃에서 1시간 내지 48시간 또는 4시간 내지 40시간 또는 8시간 내지 36시간 또는 12시간 내지 30시간 또는 18시간 내지 30시간 동안 용해시키는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 용매는 물, 유기용매 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 물일 수 있다. 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 5로 이루어진 알코올 또는 아세톤일 수 있고, 구체적으로 에탄올, 메탄올 또는 프로판올일 수 있다. 상기 물의 경우 pH가 pH 6.0 내지 pH 7.5, 또는 pH 6.0 내지 pH 7.0 또는 pH 6.5 내지 pH 7.0일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 히알루론산은 히알루론산, 히알루론산 염 또는 히알루론산과 히알루론산 염의 혼합물일 수 있다. 상기 히알루론산 염은 히알루론산의 무기염 및 히알루론산의 유기염을 모두 포함하는 개념이며, 구체적으로 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알룬론산 코발트 등의 무기염 또는 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염일 수 있다.

상기 히알루론산의 분자량은 50,000 Da 내지 10,000,000 Da일 수 있으나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시키는 단계는 상기 히알루론산 용액에 염화칼슘(CaCl₂)을 0.01 M 내지 5 M, 또는 0.05 M 내지 4 M 또는 0.1 M 내지 3 M 또는 0.5 M 내지 2 M 의 농도로 첨가하는 반응시키는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 히알루론산과 염화칼슘의 반응은 10℃ 내지 90℃ 또는 30℃ 내지 85℃ 또는 50℃ 내지 80℃ 또는 60℃ 내지 75℃ 또는 50℃ 내지 70℃에서 수행할 수 있다.

상기 히알루론산과 염화칼슘의 반응은 1시간 내지 96시간 또는 4시간 내지 72시간 또는 8시간 내지 48시간 또는 12시간 내지 36시간 또는 18시간 내지 30시간 동안 수행할 수 있으며, 상기 히알루론산과 염화칼슘이 충분히 접촉하여 상기 히알루론산의 분자량이 목적하는 분자량 이상으로 증가될 정도로 가교화될 수 있는 충분한 시간일 수 있으며, 특별히 제한되는 것은 아니다. 이러한 측면에서 상기 반응시간은 목적하고자 하는 히알루론산의 가교화 정도 즉, 상기 히알라론산의 분자량을 고려하여 조절될 수 있다.

또한, 본 발명은 사용하고자 하는 목적 및 용도에 따라서, 히알루론산의 가교화 정도 즉, 상기 히알루론산의 분자량을 높이기 위해 가교화반응을 추가로 수행할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시키는 단계를 수행한 후에, 상기 반응물 즉, 가교화된 히알루론산에 가교제를 첨가하고 반응시키는 단계를 더욱 포함할 수 있다.

상기 반응을 위하여 상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시킨 반응물 또는 결과물인 가교화된 히알루론산을 분리 또는 정제하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.

상기 가교화된 히알루론산을 분리 또는 정제하는 단계는 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 통상의 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 가교화된 히알루론산을 분리 또는 정제하는 단계는 상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시킨 반응물을 증류, 재결정, 컬럼 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 상 분리, 용매 추출 또는 투석 등의 방법으로 수행할 수 있다. 상기 가교화된 히알루론산을 분리 또는 정제하는 단계는 상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시킨 반응물 유기용매 또는 유기용매 수용액에 침전시켜 회수하는 과정을 더욱 포함할 수 있다.

상기 가교제는 화학적 가교제 또는 식품용 가교제일 수 있다. 상기 식품용 가교제는 식품용 점증제로 가교반응을 수행시키는 것일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 화학적 가교제는 글리시딜 에테르(glycidyl ether), 에폭시계 가교제, 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 포름알데하이드(formaldehyde) 및 카르보디이미드(carbodiimides)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 글리시딜 에테르(glycidyl ether)는 에틸렌글리콜 디글리시딜 에테르(ethylene glycol diglycidyl eter, EGDGE), 부탄디올 디글리시딜 에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether, BDDE) 등일 수 있다. 상기 에폭시계 가교제는 비스에폭사이드(bis(epoxides)) 등일 수 있다. 상기 카르보디이미드(carbodiimides)는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) 등일 수 있다.

상기 식품용 가교제는 식품용 가교제 또는 히알루론산의 가교결합을 수행할 수 있는 식품용 점증제일 수 있으며, 일 예로 구아과 검(guar gum), 잔탄 검, 아라비아검, 슈가 검 또는 포스페이트 계열의 가교제 등일 수 있다.

상기 화학적 가교제를 이용하여 추가 반응을 수행하는 경우, 상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시켜 제조한 반응물, 구체적으로 가교화된 히알루론산을 pH 3 내지 pH 5 또는 pH 3.5 내지 pH 5 또는 pH 4 내지 pH 5의 산성 용액에 첨가하고 용해시킨 후에, 상기 화학적 가교제를 첨가하여 반응시키는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 산성 용액은 강산 또는 약산을 첨가하여 제조될 수 있다. 상기 강산은 산으로서의 pH가 3 이하의 산을 의미하고, 일 예로 염화수소, 황산, 질산, 과염소산, 개미산, 옥살산 또는 피크린산일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약산은 산으로서의 pH가 3 이상의 산을 의미하고, 일 예로 젖산, 아세트산, 인산 또는 시안화수소일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 첨가되는 산은 약산, 구체적으로 젖산(lactic acid)일 수 있다.

또한, 상기 식품용 가교제를 이용하여 추가 반응을 수행하는 경우, 상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시켜 제조한 반응물, 구체적으로 가교화된 히알루론산에 상기 식품용 가교제를 첨가하여 반응시키는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 가교제를 첨가하여 추가반응을 수행한 후에, 가교제와 반응한 반응물 또는 결과물인 추가적으로 가교화된 히알루론산을 분리 또는 정제하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.

상기 추가적으로 가교화된 히알루론산을 분리 또는 정제하는 단계는 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 통상의 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 추가적으로 가교화된 히알루론산을 분리 또는 정제하는 단계는 상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시킨 반응물을 증류, 재결정, 컬럼 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 상 분리, 용매 추출 또는 투석 등의 방법으로 수행할 수 있다. 상기 가교화된 히알루론산을 분리 또는 정제하는 단계는 상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시킨 반응물 유기용매 또는 유기용매 수용액에 침전시켜 회수하는 과정을 더욱 포함할 수 있다.

상기 추가적으로 가교화된 히알루론산을 분리 또는 정제하는 단계 전에 상기 가교제, 구체적으로 화학적 가교제 또는 식품용 가교제를 제거하는 과정이 더욱 포함될 수 있다. 상기 가교제를 제거하는 방법은 상기 가교제와 반응한 반응물을 물, 구체적으로 증류수나 산성 용액 또는 염이 첨가된 수용액으로 수회 세척하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 분리 또는 정제하여 수득된 가교화된 히알루론산 또는 히알루론산 가교물은 가열, 질소 공급, 공기 감압 또는 동결 건조 등의 방법을 이용하여 건조시킬 수 있다.

상기 염화칼슘의 첨가에 의해 히알루론산은 가교결합을 형성하여 히알루론산 가교물이 제조되며, 이러한 측면에서 본 발명은 히알루론산을 염화칼슘(CaCl₂)과 반응시켜 히알루론산 가교물을 제조하는 방법일 수 있다.

본 발명의 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법은 기존 화학적 가교제를 사용한 경우와 달리, 산성 영역이 아닌 범위에서 반응을 수행할 수 있으므로, 히알루론산의 분자량의 감소 없이 가교화 반응이 진행될 수 있어서, 다량의 가교제를 사용하지 아니하여도 되고, 기존 식품에 포함되거나 첨가될 수 있어서 안전성이 확보된 염화칼슘을 이용하여 중성 영역의 용매 또는 정제수와 같은 안전한 반응 조건에서 반응을 수행할 수 있으며, 기존 화학적 가교제를 이용한 것과 같이 효과적인 분자량 증가를 통해 점탄성 등의 물성이 증대되고, 안전성도 향상될 수 있으므로, 종래의 가교화 방법이 가지는 한계점 즉, 화학적 가교제의 독성 또는 반응 조건 등과 관련된 안전성이 문제되어 사용이 제한되고, 선호도가 저하된다는 문제점을 해결하면서도, 효과적으로 가교화를 통해 분자량을 향상시켜 물성 및 안전성을 개선하였으므로, 고점도나 고기능성이 요구되는 목적에 사용되는 히알루론산의 제조에 널리 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산과 염화칼슘(CaCl₂)을 반응시킨 경우에, 반응물의 분자량을 HPLC를 통하여 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산을 산성 조건에서 가교제(EDC)와 반응시켜 가교화반응을 수행한 경우에, 반응물의 분자량을 HPLC를 통하여 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 또는 히알루론산과 염화칼슘(CaCl₂)을 반응시킨 반응결과물을 산성 조건에서 가교제(EDC)와 반응시켜 가교화반응을 수행한 경우에, 반응물의 분자량을 HPLC를 통하여 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산과 염화칼슘(CaCl₂)을 반응시킨 경우에, 반응물의 점도를 교반 속도를 600 rpm에서 1,000 rpm으로 변화시키면서 전단력을 변화시킨 경우에 측정한 결과로 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 구체적인 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명하기로 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 명확하기 이해시키기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

분자량이 약 1 MDa 정도인 히알루론산(㈜코오롱생명과학, 대한민국)을 pH 6.5의 정제수에 2.0%(w/v)의 농도로 첨가하고 70℃에서 24시간 동안 용해시킨 후, CaCl₂를 0.5M 내지 2.0M의 농도 범위로 첨가하고, 24시간 동안 반응시켜 변성 히알루론산을 제조하였다.

[실시예 2]

상기 분자량이 약 1 MDa 정도인 히알루론산(㈜코오롱생명과학, 대한민국)을 pH 4.5의 정제수에 2.0%(w/v)의 농도로 첨가하고 70℃에서 24시간 동안 용해시킨 후, 0.05M CaCl₂를 첨가하고, 24시간 동안 반응시키고, 추가로 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC)를 5mM 첨가하고, 24시간 동안 반응시켜 변성 히알루론산을 제조하였다.

[비교예 1]

상기 분자량이 약 1 MDa 정도인 히알루론산(㈜코오롱생명과학, 대한민국)을 0.05M의 NaNO₃가 용해된 pH 6.5의 정제수에 2.0%(w/v)의 농도로 용해시켜 히알루론산 용액을 제조하였다..

[비교예 2]

상기 분자량이 약 1 MDa 정도인 히알루론산(㈜코오롱생명과학, 대한민국)을 pH 4.5의 정제수에 2.0%(w/v)의 농도로 첨가하고 70℃에서 24시간 동안 용해시킨 후, EDC 5mM 첨가하고, 24시간 동안 반응시켜 변성 히알루론산을 제조하였다.

실험예 1

분자량 측정

상기 실시예 및 비교예의 분자량 측정은 HPLC(Varian 210)을 사용하여 0.05M CaCl₂를 첨가한 정제수를 이동상으로 사용하여, 분자배제컬럼(TSK 5000, TOSOH)을 이용, 유속 0.4ml/min에서 분석하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 도 1 내지 도 3에 나타내었다.

상기 도 1에 나타낸 바와 같이, CaCl₂를 첨가한 경우, 히알루론산의 분자량이 1.1 MDa에서 2.4 MDa으로 증가함을 알 수 있다. 또한, 상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 비교예 2의 경우, 히알루론산의 분자량이 1.1 MDa에서 0.35 MDa으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에서 히알루론산을 CaCl₂를 이용하여 변성화시킨 후, 추가적으로 pH 4.5에서 EDC에 의해 변성 시킨 경우 분자량이 1.0 MDa에서 2.0 MDa으로 크게 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한, CaCl₂를 이용하여 변성화시킨 히알루론산의 경우, 산성 영역에서도 안정성이 뛰어나 분자량이 거의 감소 되지 않은 상태에서 EDC에 의해 가교 반응됨을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, CaCl₂를 이용하는 경우, 소량의 화학적 가교제, 구체적으로 EDC 또는 식품용 점증제나 가교제를 사용하여도 충분한 가교화가 진행될 수 있어, 효과적으로 안정성 및 물성이 우수한 변성 히알루론산을 제조할 수 있는 것으로 확인되었다.

실험예 2

점도 측정

상기 실시예 및 비교예의 점도 측정은 Rapid Viscometric Analyser(RVA, Newport Scientific 3D)를 사용하여 총 45분간 온도를 30℃로 유지하면서 교반 속도를 600 rpm에서 1,000 rpm으로 변화를 주며 측정하였다. 상기 실시예 1에서 2.0% 히알루론산 용액을 이용하여 실험을 수행한 경우의 점도 변화를 측정 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 도 4에 나타낸 바와 같이, CaCl₂의 첨가에 의해 점도 값이 200 cP에서 230 Cp 내지 420 cP로 향상됨을 확인할 수 있었다. 상기 도 2에서 CaCl₂의 첨가량과 점도가 비례하지 않는 것은, CaCl₂를 첨가한 후 오랜 시간이 경과됨에 따라 과량의 CaCl₂가 구조적으로 엉겨 있던 히알루론산의 분자 구조를 해리시켜 점도 값이 저하 되는 것으로 추정된다.

또한 히알루론산의 경우 교반 속도를 600 rpm에서 1,000 rpm으로 증가 시켜 전단력(Shear Stress)를 증가 시킴에 따라 점도 값이 200 cP에서 100 cP로 감소되어 통상의 히알루론산과 같이, 외부 스트레스에 대한 안정성이 떨어짐이 확인되었으나, CaCl₂를 첨가한 경우, 전단력이 크게 증가하더라도(교반 속도 600 rpm에서 1,000 rpm), 점도 감소 폭이 히알루론산에 비해 매우 작거나, 오히려 230 cp에서 270 cP로 증가되어, 외부 스트레스에 대한 안정성이 우수한 것으로 확인되었다.

Claims

히알루론산을 염화칼슘(CaCl₂)과 반응시켜 변성 히알루론산을 제조하는 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 제조방법.
히알루론산 용액에 염화칼슘(CaCl₂)을 첨가하고 반응시키는 단계
를 포함하는 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법.
제2항에 있어서,
상기 히알루론산 용액은 히알루론산의 농도가 0.1%(w/v) 내지 10%(w/v)인 히알루론산 용액인 것을 특징으로 하는 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법.
제2항에 있어서,
상기 히알루론산은 히알루론산, 히알루론산 염 또는 히알루론산과 히알루론산 염의 혼합물인 것을 특징으로 하는 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법.
제2항에 있어서,
상기 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법은 상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시키는 단계 전에 상기 히알루론산을 물에 0.1%(w/v) 내지 10%(w/v)의 농도로 첨가하고 10℃ 내지 90℃에서 1시간 내지 48시간 동안 용해시켜 히알루론산 용액을 제조하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법.
제2항에 있어서,
상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시키는 단계는 상기 염화칼슘을 0.01 M 내지 5 M의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법.
제2항에 있어서,
상기 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법은 상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시키는 단계 후에 상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시켜 제조한 반응물을 pH 4 내지 pH 5의 산성 용액에 용해하고, 화학적 가교제를 첨가하여 반응시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법.
제7항에 있어서,
상기 화학적 가교제는 글리시딜 에테르(glycidyl ether), 에폭시계 가교제, 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 포름알데하이드(formaldehyde) 및 카르보디이미드(carbodiimides)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법.
제2항에 있어서,
상기 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법은 상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시키는 단계 후에 상기 염화칼슘을 첨가하고 반응시켜 제조한 반응물에 식품용 가교제를 첨가하여 반응시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법.
제9항에 있어서,
상기 식품용 가교제는 구아과 검(guar gum) 또는 포스페이트인 것을 특징으로 하는 생체 적합성이 우수한 변성 히알루론산 생산방법.
히알루론산을 염화칼슘(CaCl₂)과 반응시켜 히알루론산 가교물을 제조하는 방법.