KR20120129046A - Ｌｃ8을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 NF-κB 활성을 저해하는 것으로 알려진 다이네인 경사슬 LC8을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물을 이용하면, 유효성분인 LC8에 의하여 파골세포로의 분화에 관여하는 세포내 신호를 사전에 저해할 뿐만 아니라, 파골세포로의 분화가 진행중인 세포내에서 액틴 링의 형성을 억제할 수 있으므로, 보다 효과적인 골다공증의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

ＬＣ8을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학조성물{A Pharmaceutical Composition for Prevention and Treatment of Osteoporosis Comprising LC8 as an Active Ingredient}

본 발명은 LC8을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 NF-κB 활성을 저해하는 것으로 알려진 다이네인 경사슬 LC8을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

뼈의 발생, 성장 및 대사과정에는 뼈의 형성(bone modeling)과 재형성(remodeling) 과정이 중요한 역할을 한다. 뼈의 형성은 태생기부터 시작하여 이후 골격이 성숙되어 성장이 끝나는 청장년기까지 지속되어 20대에서 30대 초반까지 최대 골량을 형성하게 된다. 이후 약 30년 동안은 뼈를 제거하고 다시 이를 보충하는 골재형성 과정을 반복하게 되는데 이때는 골형성과 골흡수가 서로 짝을 이루어 균형을 유지하게 된다. 이 시기가 지난 후에는 골흡수에 따른 골소실을 골형성이 충분히 따라갈 수 없어 결국 연 0.3 ~ 0.5% 정도의 골량 감소를 겪게 되며, 특히 여성의 경우에는 폐경 초기에 연 2 ~ 3%의 상당한 골손실을 겪게 된다.

뼈는 크게 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast), 라이닝세포(lining cell) 및 골세포(osteocyte)의 네 가지 세포로 구성되어 있다. 이때, 골수내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래되는 조골세포는 골기질을 합성하는 분화된 세포로서 골형성을 주도하며, 조혈모세포로부터 유래되는 파골세포는 골흡수를 주도한다.

골다공증(osteoporosis)은 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강(骨髓腔)이 넓어지는 상태로, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골량은 유전적 요인, 영양 섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받으며, 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있다. 한편, 개인차는 있지만 백인보다는 흑인이 골 재흡수 수준(bone resorption level)이 낮아 골량이 더 높으며, 대개 골량은 14 ~ 18세에 가장 높고 노후에는 1년에 약 1%씩 감소한다. 특히, 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다. 즉, 폐경기에 이르면 에스트로젠 농도가 급속히 감소하는데, 이때, IL-7(interleukin-7)에 의한 것처럼 B-임파구(B-lymphocyte)가 다량 생성되어 골수(bone marrow)에 B 세포 전구체(pre-B cell)가 축적되고, 이로 인해 IL-6의 양이 증가하여 파골세포의 활성을 증가시키므로 결국 골량이 감소하게 된다.

이와 같이, 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가하고 있다. 또한, 전 세계적으로 골질환 치료와 관련되어 약 1300억 달러의 시장이 형성되어 있는 것으로 알려져 있으며, 앞으로 더 증가할 것으로 예상되기 때문에 세계적인 각 연구 기관과 제약회사에서는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있다. 국내에서도 근래에 평균수명이 80세에 육박하면서 골다공증 유병률이 급격하게 증가하고 있는데, 최근 지역 주민을 대상으로 실시된 연구에 의하면 전국 인구로 표준화하였을 경우 남성의 4.5%, 여성의 19.8%가 골다공증을 갖고 있다고 보고된 바 있다. 이는 골다공증이 당뇨병이나 심혈관계 질환보다 더 흔한 질환이며, 골절로 인해 받는 환자들의 고통이나 치료를 위해 들어가는 비용을 추정할 때 골다공증은 매우 중요한 보건 문제임을 시사한다.

지금까지 여러 물질이 골다공증 치료제로 개발되었다. 그 중 골다공증 치료제로 가장 많이 사용되는 에스트로겐은 그 실제적인 효능이 아직 검증되지 않은 상태이며 생애 동안 계속 복용해야하는 단점이 있으며, 장기간 투여하는 경우 유방암이나 자궁암이 증가하는 부작용이 있다. 알렌드로네이트(alrendronate)도 그 효능이 명확하지 않고 소화관에서의 흡수가 더디며 위장과 식도점막에 염증을 유발하는 문제가 있다. 칼슘제제는 부작용이 적으면서도 효과가 우수한 것으로 알려져 있지만 치료제라기보다는 예방제에 해당한다. 그 외에 칼시토닌과 같은 비타민 D 제제가 알려져 있으나 아직 효능 및 부작용에 대한 연구가 충분히 되어있지 않은 상태이다. 이에, 부작용이 적고 효과가 우수한 새로운 대사성 골 질환 치료제가 요구되는 실정이다.

한편, 뼈의 재생(bone remodeling)은 뼈를 형성하는(bone forming) 조골세포(osteoblasts)와 뼈를 흡수하는(bone resorbing) 파골세포(osteoclast, OC)의 상대적인 작용을 통하여 이루어진다고 알려져 있다. 다중 핵(multinuclear) 파골세포는 다중 핵화된 거대 세포(multi-nucleated giant cell)를 형성하기 위한 세포 부착(cell adhesion), 증식(proliferation), 운동성(motility), 세포간 연접(cell-cell contact) 및 말단 융합(terminal fusion)의 다단계 과정을 통한 조혈전구세포(hematopoietic progenitor cell)의 단핵구 대식세포 계통(monocyte macrophage lineage)으로부터 분화된다. 이 과정은 NF-κB의 수용체 활성인자(receptor activator of nuclear factor-κB)라 불리는 RANK와 NF-κB의 수용체 활성인자 리간드(receptor activator of NF-κB ligand)라 불리는 RANKL이 결합하면서 시작되고, 이어서, 몇 가지 신호전달계(signaling cascade)의 활성화에 의해 전달된다. 활성화된 신호전달경로(signaling pathway)는 TNF 수용체 연관성인자 6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6, TRAF6)를 통한 NF-κB, 세포외 신호조절 키나제(extracellular signal-regulated kinase, ERK), c-Jun N-말단 키나제(N-terminal kinase, JNK) 및 p38 MAP 키나제(p38 mitogen-activated protein kinase)를 포함한다. 이러한 신호전달 현상은 파골세포의 분화 및 작용의 조절에 직접적인 영향을 미친다(Boyle, W.J., et al., Nature, 423:337-342, 2003).

이처럼, NF-κB의 활성이 파골세포의 분화를 유발시키는 원인이 되는 것으로 알려져 있기 때문에, 상기 NF-κB의 활성을 억제할 경우 이에 의하여 파골세포의 분화가 제한됨으로써, 골다공증의 유발 및 진행을 방지할 수 있을 것으로 예상되고 있어, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, WO 2009/032994에는 NP1을 포함하는 실리카-기반 나노입자가 NF-κB의 활성을 억제하여 파골세포의 분화를 저해하는 방식으로 골다공증을 예방 또는 치료할 수 있음이 개시되어 있고, 네일 알레스 등(Neil Alles st al.)은 S1627이라는 NF-κB 저해제를 이용하여 파골세포에 의한 골의 재흡수를 감소시킬 수 있음을 보고하였으며(Endocrinology, 151(10):4626-4634, 2010), 치-신 탕 등(Chih-Hsin Tang et al.)은 이소플라본 유도체를 이용하여 RANKL의 활성을 억제함으로써 파골세포의 분화를 억제할 수 있음을 보고하였고(Eur. J. Pharm., 648:59-66, 2010), 사이몬 라우터 등(Simone Reuter et al.)은 엠벨린(Embelin, 2,5-dihydroxy-3-undecyl-1,4- benzoquinone)이 RANKL이 유도하는 단핵세포의 파골세로로의 분화를 억제함을 규명하였다(Mol. Cancer Res., 8:1425-1436, 2010).

그러나, 상기 연구에 의해 규명된 물질들은 파골세포로의 분화에 관여하는 세포내 신호를 사전에 저해하는 방식으로 파골세포의 분화를 억제할 수 있을 뿐, 파골세포로의 분화가 개시된 후에는 이를 저해할 수 없다는 단점이 있어, 골다공증을 예방하고, 이미 발병한 골다공증의 증상이 악화되는 것을 방지할 수 있을 뿐, 발병된 골다공증을 개선하거나 치료하는 효과는 거의 나타내지 못한다는 한계가 있었다. 만일, 파골세포로의 분화에 관여하는 세포내 신호를 사전에 저해하면서도 파골세포로의 분화가 진행중인 세포의 분화를 억제할 수 있다면, 보다 효과적으로 골다공증을 예방 및 치료할 수 있을 것으로 예상되고 있다.

이에, 본 발명자들은 NF-κB 활성을 저해하는 것으로 알려진 다이네인 경사슬 LC8을 사용할 경우, NF-κB 활성을 저해하여 파골세포로의 분화에 관여하는 세포내 신호를 사전에 저해할 뿐만 아니라, 파골세포로의 분화가 진행중인 세포내에서 액틴 링의 형성을 억제함으로써, 파골세포로의 분화를 억제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 다이네인 경사슬 LC8을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시양태에 의하면, 본 발명의 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물은 다이네인 경사슬 LC8 또는 이를 발현할 수 있는 유전자 단위를 유효성분으로 포함하고 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명에서 용어 "골다공증"은 남아 있는 뼈에는 구조상으로 아무런 이상이 없으면서 뼈를 형성하는 무기질과 기질의 양이 과도하게 감소되어 뼈에 스펀지 처럼 작은 구멍이 많이 나서 무르고 쉽게 부러지는 상태를 일컫으며, 골조소증 또는 골소공증이라고도 한다.

본 발명에서 용어 "LC8"은 마이크로튜불-기반 다이네인 모터의 핵심적인 구성성분인 8kDa 크기를 가지는 다이네인 경사슬을 의미하는데, 상기 LC8은 유사분열 및 소포형 운반와 같은 세포 내 이동 절차에서 핵심적인 역할을 하고(J. Biol. Chem., 271:19358-19366, 1996; Mol. Cell Biol., 16:1966-1977, 1996; Development, 122:2955-2963, 1996), NF-κB의 저해제인 IκBα를 포함하는 다수의 단백질에 결합하여 그들의 활성을 조절하며(J. Mol. Biol., 306:97-108, 2001; Mol. Cell Biol., 17:7375-7385, 1997; Science, 274:774-777, 1996; Mol. Cell, 3:287-296, 1999; Science, 293:1829-1832, 2001; Biochem. Biophys. Res. Commun., 331:153-158, 2005; Cancer Cell., 5:575-585, 2004; J. Biol. Chem., 280:8172-8179, 2005), IκBα 인산화 억제를 통해 TNFα-유도 NF-κB 활성화를 저해하는 다이설피드 리덕타제인 TRP14의 기질로서 이용될 수 있어, 상기 다이설피드 리덕타제 활성을 NF-κB 조절에 연결시키는 분자 매개자로서 작용하고(J. Biol. Chem., 279:3151-3159, 2004), IκBα와 산화환원-의존 상호작용을 수행하여, IKK에 의한 IκBα의 인산화를 저해하며(J. Biol. Chem., 283:23863-23871, 2008; Free Radic. Biol. Med., 47:1294-1303, 2009), 종양 괴사인자 α, 지질다당체 및 인터루킨 1-β를 포함하는 강력한 NF-κB 자극인자에 의한 NF-κB 활성화를 저해하는 것으로 알려져 있다(J. Biol. Chem., 283:23863-23871, 2008).

본 발명의 "발현단위"는 프로모터와 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 단편을 의미하며, 이에 3'-UTL, 5'-UTL, poly A tail 등이 추가로 포함될 수도 있다.

본 발명의 LC8은 이들만으로 또는 이하에서 설명하는 것과 같은 적당한 부형제와 함께 공지의 방법으로 제제화 할 수 있다. 이와 같은 제형의 구체예로서는, 연질캡슐제, 경질캡슐제, 정제, 시럽제 등의 경구제, 주사제 또는 외용제를 들 수 있다. 상세하게는, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다.

이러한 부형제로서 약제학적으로 허용되는 담체에는 멸균용액, 정제, 코팅정 및 캡슐과 같은 공지된 제형들에 사용되는 표준의 제약학적 담체 중 어느 것이든 포함된다. 전형적으로 이러한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐피롤리돈, 덱스트린, 밀크, 특정 종류의 클레이, 스테아린산, 탈크, 식물성 기름(예를 들면 식용유, 면실유, 코코넛유, 아몬드유, 낙화생유), 중성지방산 글리세라이드 등의 유상 에스테르, 광물유, 바세린, 동물유지, 셀룰로오스 유도체(예를 들면 결정셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스), 등의 부형제, 또는 기타 다른 공지의 부형제를 포함한다. 이러한 담체에는 또한 산화방지제, 습윤제, 점도안정제, 풍미제, 색소 첨가제 및 다른 성분들이 포함될 수 있다. 이러한 담체를 함유하는 조성물은 주지된 방법에 의해 제형화 할 수 있다.

본 발명의 골다공증의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 골다공증의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

다른 또 하나의 양태로서 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 골다공증 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다. 구체적인 일 실시양태에서, 본 발명의 골다공증 예방 및 치료하는 방법은 다이네인 경사슬 LC8 또는 이를 발현할 수 있는 유전자 단위를 유효성분으로 포함하고 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 본 발명의 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하여 골다공증의 치료 효과를 향상시키는 단계를 포함한다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 골다공증 예방 및 치료용 조성물의 투여 경로는 목적조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강내 투여, 경막내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따른 골다공증 예방 및 치료용 조성물은 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효성분이 각각 단제인 경우의 투여횟수는 같은 횟수여도 좋고, 다른 횟수로 해도 된다.

골다공증의 종류나 투여 형태, 그리고 치료 효과 등을 고려하여 당업자에게 통상적으로 알려진 다양한 방법에 따라 본 발명에 따른 골다공증 예방 및 치료용 조성물을 적절히 투여할 수 있을 것이다.

본 발명의 약학 조성물을 이용하면, 유효성분인 LC8에 의하여 파골세포로의 분화에 관여하는 세포내 신호를 사전에 저해할 뿐만 아니라, 파골세포로의 분화가 진행중인 세포내에서 액틴 링의 형성을 억제할 수 있으므로, 보다 효과적인 골다공증의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 LC8 과잉발현에 의한 RAW 264.7의 RANKL-유도 파골세포 분화의 저해를 나타내는 사진 및 그래프이다. (A) 빈벡터(Mock) 또는 HA-LC8 발현 벡터로 형질전환된 RAW 264.7 세포의 용해물(20㎍)이 LC8 및 β-액틴에 특이한 항체를 사용하여 면역블롯팅 분석되었다. (B 및 C) RAW264.7 세포는 표기된 시간 동안 RANKL(100ng/ml)의 존재하에서 배양되었다. 세포는 고정 및 TRAP 착색되어 광학 현미경하에서 관찰되었다: 스케일 바, 200㎛. (B). TRAP-양성 다핵세포(TRAP+ MNCs)의 수가 계수되었다(C). 모든 값은 평균값 ± 표준편차로 표시되었다. *P<0.005; **P<0.0005; ***P<0.0001.
도 2는 LC8 형질 전환 마우스의 생산방법을 나타내는 모식도 및 전기영동 사진이다. (A) LC8 형질 전환 마우스 생산하는데 사용된 컨스트럭트의 모식도. 318bp의 HA 태깅된 LC8 cDNA가 닭의 β-액틴(CBA) 프로모터의 하류의 EcoRI 및 KpnI 부위에 클로닝되었다. 토끼의 β-글로빈(RBG) 유전자 하류의 540bp 영역은 폴리아데닐화 신호를 포함한다. Tg 마우스 스크리닝을 위한 PCR 분석에 사용된 프라이머는 작은 화살로 표시되었다. (B) PCR분석은 Tg 마우스를 확인하기 위한 목적으로 수행되었다. (C) 야생형(-) 및 Tg(+) (83 라인) 마우스로부터 준비된 조직 용해물의 면역 블롯팅 분석결과를 나타내는 사진으로서, 각 조직 용해물(20㎍)은 LC8 및 튜블린에 특이한 항체를 사용하여 면역 블롯팅 방법으로 분석되었다.
도 3은 LC8 과잉발현에 의한 BMM의 RANKL-유도 파골세포 분화의 저해를 나타내는 사진 및 그래프이다. (A 및 D) 야생형(WT) 또는 Tg 마우스로부터 얻은 BMM의 세포 용해물(20㎍)은 LC8 및 β-액틴에 특이적인 항체를 사용한 면역블로팅 방법으로 분석되었다. (B 및 E) BMM은 표기된 시간 동안 M-CSF(20 ng/ml) 및 RANKL(100 ng/ml)와 같이 배양되었다. 세포는 고정 및 TRAP 착색되어 광학 현미경하에서 관찰되었다: 스케일 바, 200㎛. (C 및 F) B 및 E에서 생성된 TRAP-양성 다핵세포(TRAP+ MNCs)의 수가 계수되었다. Tg 마우스 2개의 라인이 사용되었다: A-C, 18라인 ; D-F, 83라인. 모든 값은 평균값 ± 표준편차로 표시되었다. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.005.
도 4는 LC8 과잉발현에 의한 RANKL-유도 NF-κB 활성화의 저해를 나타내는 전기영동 사진 및 그래프이다. BMMs는 표기된 시간 동안 M-CSF(20 ng/ml)의 존재 하에서 RANKL(100 ng/ml)에 노출되었다. 세포 용해물은 p-IκBα, IκBα, LC8, 또는 β-액틴에 대한 항체를 사용하여 면역블로팅 방법으로 분석되었다(A). p-IκBα 및 IκBα에 대한 화학발광 신호는 정량화되고 β-액틴의 신호에 의해 노멀라이즈되었다(B). 세포 용해물에서의 COX-2, LC8, 및 β-액틴의 양은 그들의 특이적 항체를 사용하여 면역 블롯팅 분석으로 결정되었다.
도 5는 LC8 과잉발현에 의한 RANKL-유도 MAPK 활성화의 저해를 나타내는 전기영동사진 및 그래프이다. BMMs는 표기된 시간 동안 M-CSF(20 ng/ml) 및 RANKL(100 ng/ml)과 항온처리 된 후, 세포 용해물이 phospho-JNK 및 JNK1, phospho-ERK 및 ERK2 또는 phospho-p38 및 p38에 대한 항체를 이용한 면역블롯팅 방법으로 분석되었다(사진 각 쌍의 위 및 아래)(A). phospho-JNK, phospho-ERK 및 phospho-p38에 대한 화학발광 신호는 정량화되고 JNK1, ERK2 및 p38의 신호에 의하여 노멀라이즈되었다(B).
도 6은 LC8 과잉발현에 의한 c-Fos 및 NFATc-1의 RANKL-유도 발현의 억제를 나타내는 전기영동 사진 및 그래프이다. BMMs는 표기된 시간 동안 M-CSF(20 ng/ml) 및 RANKL(100 ng/ml)과 항온처리 되었다. 세포 용해물의 c-Fos (A) 및 NFATc-1 (B)의 양은 그들의 특이적 항체를 사용한 면역블롯팅 분석방법으로 결정되고, 또한 TRAP의 특이적 활성도가 결정되었다(C). 모든 값은 평균값 ± 표준편차로 표시되었다. *P < 0.05; **P < 0.005.
도 7은 LC8 과잉발현에 의한 RANKL-유도 액틴 링 형성 및 골 재흡수의 저해를 나타내는 사진 및 그래프이다. (A) M-CSF(20 ng/ml) 존재 하에서 5일 동안 BMMs를 RANKL(100 ng/ml)과 항온처리한 후, 상기 세포는 PBS에서 3.7% 포름알데히드 용액으로 고정되고, 0.1% 트리톤 X-100로 투과도를 향상시켰으며, 20분간 Alexa Fluor 488-팔로이딘으로 항온처리 되었다. PBS로 세척 후, 상기 세포는 4′,6-다이아미디노-2-페닐린도레 (DAPI)와 2분간 항온처리 되었다. 공초점 현미경을 이용하여 촬영하였다. 스케일 바, 50㎛. (B) 덴틴 디스크상의 BMM 세포를 7일간 M-CSF(20 ng/ml) 및 RANKL(100 ng/ml)와 항온처리한 후, 세포가 덴틴 디스크로부터 제거되어 재흡수 피트가 헤마토자일린과의 착색을 통하여 가시화되었다. 스케일 바, 200㎛(왼쪽). 재흡수 피트의 면적은 Image-Pro Plus 4.5 (Media Cybernetics)를 이용하여 측정하였다. 데이터는 평균값 ± 표준편차로 표시되었다. *P < 0.05(오른쪽).
도 8은 LC8 과잉발현에 의한 LPS- 또는 RANKL-유도 파골세포 형성 및 골 파괴의 저해를 나타내는 사진 및 그래프이다. LPS(15 mg/kg 몸무게), 또는 PBS를 피하조직과 두개골 골막사이의 공간에 각 40㎕ 부피로 주사하였다. (A) 주사 후 7일째에 두개관 뼈를 고정, 석회질을 제거하고, 파라핀에 담구어 TRAP으로 착색하였다. 스케일 바, 100㎛. (B) 골 강(왼쪽)의 차이 및 TRAP+파골세포(오른쪽)의 수가 분석되었다. 데이터는 평균값 ± 표준편차로 표시되었다. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.005.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: LC8 발현 벡터의 구축

pCGN-LC8 벡터를 주형으로 사용하고, EcoRI 절단부위 및 개시코돈을 포함하는 하나의 정방향 프라이머(5'-CG GAA TTC ATG GCT TCT AGC TAT CCT TAT GAC-3', 서열번호 1), XhoI 절단부위 및 종료코돈을 포함하는 하나의 역방향 프라이머(5'-GC CTC GAG TTA ACC AGA TTT GAA CAG AAG AAT GG-3', 서열번호 2) 및 KpnI 절단부위 및 종료코돈을 포함하는 또 다른 역방향 프라이머(5'-GG GGT ACC TTA ACC AGA TTT GAA CAG AAG AAT G-3', 서열번호 3)를 사용한 PCR을 수행하여, HA-태깅된 LC8를 코딩하는 각 DNA서열을 증폭시켜 PCR 산물을 수득하였다.

상기 각 PCR 산물을 EcoRI/XhoI 또는 EcoRI/KpnI로 절단하고, 절단된 절편을 pcDNA3.1 또는 pCBA-M에 클로닝하여, 발현벡터 pcDNA-HA-LC8 또는 pCBA-HA-LC8을 수득하였다. 상기 각 발현벡터는 LC8을 안정하게 발현하는 세포를 확립 또는 LC8으로 형질전환된 마우스를 생성하기 위해 사용되었다.

실시예 2: LC8 과잉발현 RAW264.7 세포에서 RANKL-유도 파골세포분화 분석

설치류 대식세포 RAW264.7 세포는 10% FBS가 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)에서 유지하였고 37℃, 5% CO2에서 항온처리 되었다. RAW264.7은 제조자 매뉴얼에 따라 Amaxa transfection kit (reagent V)를 사용하여 pcDNA-HA-LC8 또는 pcDNA3.1 vector (mock)로 감염시켰다. 48시간 후, 상기 세포를 1 mg/ml G418가 포함된 배지에서 항온처리한 후 G418-저항 클론을 분리하여 LC8이 적절하게 발현되는 몇몇 세포주를 확보하였다(도 1의 A).

파골 세포 분화에 있어서 LC8의 역할을 평가하고자, RAW264.7 대식세포를 10% FBS 및 20 ng/ml MCSF가 첨가된 α-MEM에서 3~5일 동안 100 ng/ml RANKL로 처리하고 아래와 같이 파골세포 분화 정도를 탈트레이트-저항 산 포스퍼타제(TRAP) 염색을 하여 분석하였다. 파골세포 분화 후, 48웰의 세포를 1X PBS로 2번 세척하고 4% 파라포름알데히드로 10분간 고정하고 제조사의 지시에 따라 leukocyte acid phosphatase cytochemistry kit를 사용하여 염색하였다(Sigma-Aldrich). 3개 또는 그 이상의 핵을 포함하는 TRAP-양성 다핵 세포(TRAP+MNCs)를 광학 현미경으로 관찰하여 파골세포로 카운트하였다. LC8을 과잉 발현하는 세포는 빈 벡터로 형질전환된 세포와 비교하여 RANKL에 의한 TRAP-양성 다핵 세포의 형성에서 현저한 감소를 나타내었다(도 1의 B 및 C).

실시예 3: LC8 형질전환 마우스의 제조

프라이머리 세포뿐만 아니라 생물체에서 RANKL-유도 파골세포 분화에 대한 LC8의 역할을 조사하기 위해서 아래와 같이 LC8 형질 전환 마우스를 제조하였다.

플라스미드 pCBA-HA-LC8를 PvuI, SalI 및 PstI으로 절단하고, 치킨 β-액틴 프로모터 및 CMV 인핸서 조절 하에 있는 LC8 유전자를 포함하는 2.6 kb DNA 절편(도 2의 A)을 아가로스 겔로부터 정제하였다. 상기 선형 DNA 절편을 C57BL/6 마우스의 수정란의 전핵기에 주사하고, 주사된 배아를 가임신 C57BL/6의 자궁에 이식하였다. 생후 2 내지 3주령된 마우스로부터 수득한 꼬리를 용해 완충용액(100 mM Tris pH 8.0, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 100 μg/ml proteinase K)에서 55℃ 하룻밤 동안 용해시키고, 상온에서 12000 rpm으로 5 분간 원심분리하였다. 그런 다음, 상등액을 새로운 1.5-ml 튜브에 옮겨 DNA침전을 위해 1 부피의 이소프로판올을 첨가하였다. DNA 펠릿(pellet)을 70%로 세척하고 공기 중에서 건조하여 50 μl 증류수에 용해시켰다. LC8 형질전환 마우스는 꼬리 DNA (500 ng) 및 다음 프라이머 쌍: 5'-CCT ACA GCT CCT GGG CAA CG-3'(서열번호 4) 및 5'-GAG CCA GGG CAT TGG CCA CA-3'(서열번호 5)을 사용하여 PCR분석에 의해 결정하였다. PCR은 94℃에서 30 sec, 62℃에서 30 sec, 72℃ 에서 30 sec 동안 전체 32 사이클로 수행하였고, 1.5% 아가로스 전기영동에서 455-bp DNA를 확인하였다. 대리모로부터 얻어진 자손의 유전자 타이핑 분석에 의해 3마리의 LC8 형질전환 마우스가 확인되었다(도 2의 B). 또한, HA-태깅된 LC8은 형질전환 마우스의 검사된 모든 조직에서 발현되었다(도 2의 C).

실시예 4: LC8 형질전환 마우스 골수-유래 대식세포(BMMs)에서 RANKL-유도 파골세포분화 분석

프라리머리 세포에서 LC8에 의한 파골세포분화 억제를 조사하기 위하여 파골세포 전구체 세포인 골수-유래 대식세포(BMMs)를 4 내지 8주령 된 C57BL/6 수컷 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 아래와 같이 준비하였다. 골수강으로부터 10% FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 포함하는 α-minimal essential medium (α-MEM)을 가지고 제거된 골수세포는 실온에서 1000rpm으로 수확하였고 세포 펠릿을 같은 배지에 다시 현탁하였다. 하루간의 항온처리 후, 비부착성 세포를 수확하였고 적혈구 세포를 제거하고자 10분간 Gey 용액에서 항온처리하였다. 원심분리 후, 상기 세포는 10% FBS, 100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 20 ng/ml 재조합 인간 MCSF를 포함하는 α-MEM에서 배양하였다. 3일 후, 부착성 세포를 파골세포 전구체 세포로 사용하였다.

LC8 형질전환 마우스(18 라인)의 골수로부터 얻어진 프라이머리 대식세포에서, HA-LC8은 내재적인 LC8과 비교하여 상당히 높게 발현되었다(도 3의 A). 골수-유래 대식세포가 M-CSF의 존재하에서 RANKL에 의해 파골세포로 분화될 때, LC8-과잉발현 BMMs는 야생형 BMMs와 비교하여 TRAP-양성 다핵 세포의 형성에서 현저한 감소를 나타내었다(도 3의 B 및 C). 게다가 다른 형질전환 마우스(83 라인)에서도 일치하는 결과를 얻었다(도 3의 D 내지 F). 이들 결과는 LC8이 프라이머리 대식세포에서 RANKL-유도 파골세포 분화를 저해한다는 것을 시사한다.

실시예 5: 골수-유래 대식세포(BMMs)에서 LC8의 RANKL-유도 NF-κB 활성화에 대한 효과 분석

LC8이 파골세포분화를 NF-κB 활성 억제를 통해 저해하는지를 알아보기 위해, 본 발명자는 BMM 세포에서 RANKL-유도 NF-κB 활성화에 대한 LC8 과잉발현의 효과를 조사하였다. TNFα와 같은 NF-κB 활성자에 반응하여, IκBα는 잔기 Ser32 및 Ser36에서 IKK에 의해 인산화 된 후 유비퀴틴-프로티솜 시스템에 의해 분해된다. 이전의 연구는 LC8이 TNFα-처리된 세포에서 IKK에 의한 IκBα 인산화를 차단한다는 것을 제시하였으므로, 본 발명자는 RANKL로 자극된 BMMs에서 IκBα 인산화 및 분해에 대한 LC8의 효과를 조사하였다.

LC8을 과잉발현하는 BMMs는 야생형 BMMs와 비교하여 IκBα의 세린 인산화의 양을 현저하게 감소시켰고, 이러한 효과는 IκBα 분해속도에서의 감소와 동반되었다(도 4의 A 및 B). 본 발명자는 또한 NF-κB 타켓 유전자의 하나인 사이클로옥시진나제-2(COX-2)의 유도에 대한 LC8의 효과를 결정하였다. 일관성 있게 LC8 과잉발현은 RANKL-자극 BMMs에서 COX-2의 유도를 현저하게 감소시켰다(도 4의 C). 이들 데이터는 LC8이 TNF-α 신호경로에서처럼 IKK에의한 IκBα 인산화를 차단하여 RANKL-유도 NF-κB 활성화를 저해한다는 것을 암시한다.

실시예 6: 골수-유래 대식세포(BMMs)에서 LC8의 RANKL-유도 MAPKs 활성화에 대한 효과 분석

RANKL은 골 파괴과정-연관 유전자 발현에서 중요한 역할을 하는 JNK, p38 및 ERK를 포함하는 미토겐 활성 단백질 키나제(mitogen activating protein kinases (MAPKs))를 활성화시킨다. 따라서 이들 MAPKs의 RANKL-유도 활성이 LC8 과잉 발현에 의해 영향 받는지를 조사하였다.

MAPKs는 TXY 모티프 안에서 트레오닌 및 타이로신 잔기(JNK에 대해서는 Thr183 및 Tyr185; p38에 대해서는 Thr180 및 Tyr182; ERK에 대해서는 Thr202 및 Tyr204)의 2중 인산화에 의해 활성화된다. 이처럼 2중으로 인산화된 단백질에 대해 특이한 항체를 가지고 면역블로팅을 하면 RANKL-유도 JNK and ERK 인산화의 양이 야생형 BMMs와 비교하여 LC8-과잉발현된 BMMs에서 현저하게 감소되었다(도 5의 A 및 B). 그러나 p38 인산화의 양은 LC8 과잉 발현에 의해 영향을 받지 않았다.

실시예 7: 골수-유래 대식세포(BMMs)에서 LC8의 RANKL-유도 c-Fos와 NFATc1의 발현 및 TRAP 활성에 대한 효과 분석

파골세포분화 과정에서 주로 c-Jun과 c-Fos의 heterodimer로 이루어진 전사인자 AP-1의 활성화도 매우 중요하다. RANKL은 부분적으로 파골세포분화의 주요인자인 c-Fos의 발현유도를 통해서 전사인자 AP-1을 활성화시킨다. 본 발명자는 RANKL에 의해 자극된 BMMs에서 c-Fos 발현유도에 대한 LC8 과잉발현의 효과를 조사하였다. RANKL에 의한 c-Fos 유도는 야생형 BMMs에서 8시간 후 최대치에 도달했으며 24시간까지 유지되었으나, LC8-과잉발현 BMMs에서는 현저하게 감소되었다(도 6의 A).

RANKL은 또한 파골세포 분화의 마스터 조절자인 NFATc1 발현을 유도하는데, 이 발현유도는 NF-κB와 c-Fos 경로에 의존적이다. NFATc1은 자신의 프로모터를 활성화시켜 RANKL-유도 파골세포분화 과정 동안 강력한 NFAFc1 발현이 유도된다. LC8이 RANKL-유도 파골세포분화 과정에서 NF-κB 활성 및 c-Fos 발현을 저해하므로, LC8이 RANKL-유도 NFATc1 발현을 억제할 것으로 예상된다. 예상대로 야생형 BMMs에서는 RANKL 처리에 의해 방대한 양의 NFATc1이 발현되었으나, LC8-과잉발현 BMMs에서는 NFATc1이 거의 발현되지 않았다(도 6의 B).

NFATc1은 AP1, PU.1, MITF 및 CREB를 포함하는 다른 전사 인자와 더불어 탈트레이트-저항 산 포스퍼타제(TRAP), 카셉신 K, 칼시토닌 수용체, 파골세포-연관 수용체(OSCAR) 및 β-인테그린과 같은 다수의 파골세포-특이적 유전자를 조절한다. TRAP 활성도 검사에서 알 수 있듯이 NFATc1 타켓 유전자 중 하나인 TRAP의 발현은 야생형 BMMs와 비교하여 LC8-과잉발현 BMMs에서 현저하게 감소되었다(도 6의 C).

구체적으로, 12-웰 플레이트의 세포는 10 mM 소듐 탈트레이트, 1% 트리톤 X-100, 아프로티닌 (10 μg/ml) 및 류펩틴 (10 μg/ml)을 포함하는 100 mM 소디엄 아세테이트 완충용액 (pH 5.2)에서 용해하였다. 원심분리 후, 상등액의 단백질 농도를 Bradford 시약을 사용하여 결정하였고 파라니트로페닐 포스페이트(pNPP)를 기질로 사용하는 표준 방법에 따라 TRAP 활성도를 검사하였다. 100 mM 소듐 아세테이트 (pH 5.2), 10 mM 소듐 탈트레이트, 1 mg/ml of pNPP 및 전체 단백질 2 μg을 포함하는 120-ul 반응 혼합물을 2시간 동안 37 °C에서 항온처리하고 반응을 1N NaOH 80μl를 첨가하여 종료하였다. 유리된 파라-니트로페놀은 96웰에서 405nm상의 흡광도를 측정하여 결정하였다. TRAP 활성도는 특이적 활성도로 표현하였다(A₄₀₅/min/mg protein).

실시예 8: 골수-유래 대식세포(BMMs)의 RANKL-유도 액틴 링 형성 및 골 재흡수에 대한 LC8의 효과 조사

성숙한 파골세포는 골 재흡수에 필요하고 분명한 가장자리를 갖는 실모양의 액틴으로 이루어진 실링 존(sealing zone)을 가지고 있으므로, 본 발명자는 LC8이액틴 링 형성 및 골 재흡수를 감소시키는 지를 조사하였다.

야생형 파골세포와 LC8-과잉세포 BMMs를 3.7% 포름알데히드를 포함하는 PBS로 고정시키고, 0.1% 트리톤 X-100를 처리하여 막투과도를 증가시켰으며, 20분간 Alexa Fluor 488-팔로이딘 (Invitrogen)으로 항온처리하였다. 이어, 상기 세포를 PBS로 세척하고, 2분간 4′,6-다이아미디노-2-페닐린돌레(DAPI)(Roche)로 항온처리한 다음, 형광 현미경하에서 촬영하였다. 그 결과, 야생형 파골세포는 RANKL 존재하에서 분명한 가장자리를 갖는 액틴 링을 형성하지만, LC8-과잉세포 BMMs에서는 감소하거나 관찰되지 않았다(도 7의 A).

한편, LC8에 의한 액틴 링 형성 저해가 파골세포의 재흡수능력에 영향을 주는지를 조사하기 위해, 야생형 파골세포와 LC8-과잉세포 BMMs를 덴틴 디스크(Immunodiagnostic Systems Ltd.)의 위에 위치시키고, 이중 LC8-과잉세포 BMMs에는 MCSF (20 ng/ml) 및 RANKL (100 ng/ml)의 존재하에 항온처리하여, 파골세포로 분화시켰다.

그런 다음, 목화솜 팁으로 상기 덴틴 디스크의 상부를 마멸하여, 덴틴 디스크로부터 모든 세포를 완전히 제거한 다음, 모든 세포가 제거된 덴틴 디스크를 헤마토자일린 용액으로 염색하고, 상기 염색된 덴틴 디스크의 표면을 광학 현미경(40X)으로 촬영하였다. 덴틴 디스크의 표면으로부터 골분이 흡수된 피트(pit)의 면적은 Image-Pro Plus 4.5 (Media Cybernetics)로 분석하였다(도 7의 B). 그 결과, 도 7의 B에서 보듯이, 액틴 링 형성에 대한 저해 효과와 마찬가지로, 재흡수 피트의 형성은 LC8 과잉발현에 의해 현저하게 감소하였다. 이들 결과는 LC8이 액틴 링 형성 및 골 재흡수를 저해한다는 것을 시사한다.

실시예 9: 두개관 주사 및 조직학적 분석

동물 연구 프로토콜은 이화 연구동물 지노믹 센터의 동물 보호 위원회에 의해 승인받았다. 주사는 두개골 중앙의 점에서 28-G 바늘로 수행하였다. LPS (15 mg/kg body weight) 또는 PBS는 피하조직과 두개골 골막 사이의 공간으로 각각 40-μl의 부피로 전송하였다. 주사 후 7일 후 마우스는 CO₂ 챔버에서 희생되었다. 두개관을 절개하여 실온에서 하룻밤 동안 4% 포름알데히드로 고정하였다. 표본을 PBS로 세척한 후 5일간 0.5M EDTA로 석회질을 제거하였다. 표본을 낮은 온도에서 녹는 파라핀에 포매하여 파라핀 블록을 수득하고, 상기 블록을 4μm의 두께로 잘라내어, 조직박편을 수득하였으며, 상기 수득한 조직박편을 TRAP으로 염색하였다.

LC8-과잉발현 BMM 세포에서 얻어진 결과는 LC8은 NF-κB 활성화 뿐만 아니라 c-Fos 및 NFATc1 유도를 억제함으로써 파골세포 분화 및 골 재흡수를 저해한다는 것을 제시하고 있다. 과도한 파골세포의 활성으로 인한 골 질병을 치료하기 위해 LC8의 사용가능성을 조사하기 위해서, 본 발명자는 LPS를 LC8-과잉 발현 마우스의 두개관에 주사하였고 염증 동안 파골세포의 병리학적 형성 및 골 손실에 대한 LC8의 효과를 조사하였다. 골 부식 및 TRAP+ MNCs 형성의 양은 야생형 마우스와 비교하여 LC8-과잉 발현 마우스에서 현저하게 감소하였다(도 8). 이것은 LC8이 염증-유도 골 파괴 현상을 저해할 수 있다는 것을 제시한다.

<110> Ewha University-Industry Collaboration Foundation <120> A Pharmaceutical Composition for Prevention and Treatment of Osteoporosis Comprising LC8 as an Active Ingredient <130> PA110150/KR <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cggaattcat ggcttctagc tatccttatg ac 32 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcctcgagtt aaccagattt gaacagaaga atgg 34 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggggtacctt aaccagattt gaacagaaga atg 33 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cctacagctc ctgggcaacg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gagccagggc attggccaca 20

Claims (7)

1. 다이네인 경사슬 LC8 또는 이를 발현할 수 있는 유전자 단위를 유효성분으로 포함하고 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   LC8은 파골세포로의 분화에 관여하는 세포내 신호를 사전에 저해하는 것인 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   LC8은 파골세포로의 분화가 진행중인 세포내에서 액틴 링의 형성을 억제하는 것인 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   LC8은 NF-κB 활성화를 억제하여 파골세포 분화 및 골 재흡수를 저해하는 것인 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   LC8은 c-Fos 및 NFATc1 유도를 억제하여 파골세포 분화 및 골 재흡수를 저해하는 것인 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   LC8은 파골세포로의 분화가 진행 중인 세포내에서 액틴 링의 형성을 억제하는 것인 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   LC8은 염증에 의해 유도된 골 파괴 현상을 저해하는 것인 골다공증 예방 및 치료용 약학 조성물.

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