KR20120118929A - 화학발광법을 이용하여 전립선특이항원을 초고감도로 검출하는 방법 - Google Patents

화학발광법을 이용하여 전립선특이항원을 초고감도로 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화학발광법을 이용하여 전립선특이항원을 초고감도로 정량할 수 있는 방법에 관한 것으로, 기존에 전립선특이항원을 검출하는 방법들보다 더욱 짧은 시간 내에 매우 적은 양(피코 단위 수준)의 시료로도 간편하게 전립선특이항원을 검출할 수 있다.

Description

화학발광법을 이용하여 전립선특이항원을 초고감도로 검출하는 방법{Detection method for prostate specific antigen using chemiluminescence}
본 발명은 전립선 관련 질환을 진단하기 위한 바이오 마커인 전립선특이항원을 초고감도로 검출하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 감도가 매우 높은 화학발광법을 이용하여 전립선특이항원을 초고감도로 정량할 수 있도록 한 방법에 관한 것이다.
21세기를 살아가는 현대인은 문화생활 및 식생활의 변화로 과거에 볼 수 없었던 여러 가지 질병 및 질환에 상당히 노출되어있다. 이에 따라 현재 의료진단에서 가장 관심을 끌고 있고, 많은 연구가 진행되고 있는 분야는 여러 가지 질병을 조기에 진단하는 것이다.
임상 의료 진단은 크게 두 가지로 나누어 볼 수 있는데, 검체 채취를 필요로 하지 않는 체내 진단(in vivo diagnostics)과 검체 채취를 필요로 하는 체외 진단 (in vitro diagnostics IVD)로 구분할 수 있고, 현재 대부분의 의료 진단시장은 체외진단 시장을 목표로 구성되어 있다.
하지만, 유감스럽게도 현재 국내의 체외진단 의료 기기 생산 업체는 미미한 실정이며, 전량 미국, 일본 등으로부터 수입하고 있는 실정이다. 미국이나 일본 등으로부터 주로 수입하는 생화학 분석 기기는 우리 나라 전체 의료 기기 분야의 40%를 차지하고, 혈액학 분석기기의 수입은 12%를 차지하고 있다. 또한, 소변을 검체로 분석하는 소변 분석기는 전체 수입의 9%를 점유하고 있다. 그 외에 방사선 동위원소를 표지 인자로 사용하는 RIA 검사와 비방사선 동위원소-면역분석기는 각각 3% 및 12%를 점유하고 있는데, 매년 증가하는 추세에 있다.
한편, 국외 체외 진단 시장은 발전 방향이 크게 바뀌었는데, 이를 요약하면 크게 두 가지로 나누어 볼 수 있다.
첫째로는 많은 시간과 비용 및 인력을 필요로 하는 중앙검사실 임상검사가 진료현장, 즉 개별 진료실. 응급실, 병동 등에서 검사 가능하도록 설계된 현장검사용 기기로 전향하는 추세에 있다는 것이다. 2004년까지 전체 진단용 의료기기 시장의 연간 성장률을 10.8%로 전망하는 클리니카 리포레(Clinica Repore)에 의하면, 이 기간 동안 급성심근경색 진단용 기기와 시약의 연간 성장률은 75.4%라는 놀라운 수치를 제시하였다. 이는 전 세계적으로 많은 의료기기 회사들이 앞 다투어 현장측정용 장비 개발에 참여하는 뛰어들고 있는 것을 의미한다.
두 번째로는 의료경비 절감을 요구하는 각국 정부와 시장의 압력에 따라 자동화 추세가 증가하는 추세에 있는 것이다. 단기적으로 가장 중요한 그리고 시장성이 높은 분야는 당뇨병 검사 관련 시장 즉 혈중 내의 글루코스의 농도를 측정하는 혈당측정기라 할 수 있는데, 현재 혈당측정기 한 품목이 260 억불이라는 놀라운 규모의 시장을 형성하고 있으며, 지속적으로 성장이 예상되는 분야이기도 하다.
수많은 시장 분석가들이 공통적으로 지적하는 미래 진단기기의 모델은 탈중앙화 테스트(Decentralized test), 즉 현장 검사용 시스템과 분자생물학적 검사법이 수행 가능한 모델이다. 진단기기 분야의 유명한 분석그룹인 미국 아시아틱 리서치(Asiatic research)에 따르면 향후 5년간 현장검사용 기기는 지속적으로 소형화될 것으로 전망하였다. 또한, 분자생물학적 검사 기기는 보다 자동화로 가게 될 것이라고 전망하였다.
한편, 항원-항체 반응을 응용한 검사장비로서 암검사, 호르몬 검사, 골다공증 등을 검사하는데 사용하는 기기들은 과거에 방사선 면역 측정법 (radioimmuniassay : RIA)을 주로 사용하였으나, 현재에는 미세입자 효소 면역 분석법 (micropaticle enzyme immunoassay : MEIA)과 혈광 편광 면역 분석법 (fluorescence polarization immunoassay : FPIA) 등을 주로 사용하고 있다. 하지만, 최근에는 감도가 더욱 우수한 화학 발광 면역 분석법(chemiluminescence immunoassay : CLIA)으로 대체되는 경향으로 발전하고 있다. 그러나, 아직 선진국에서도 화학 발광 면역 분석법을 스트립상에서 구현하는데 많은 기술적인 애로점을 가지고 있는 실정이다.,
한편, 전립선 관련 질환은 최근 60대 이상 중년 남성에게 급격하게 증가하여 발병하고 있다. 현재까지 전립선암이 의심되는 환자의 전립선특이항원 수치는 4.0 ng/mL인데, 이때 전립선암 조기 검진 확률은 67.5~80%로 알려져 있다. 하지만, 그 기준을 4.0 ng/mL 이상으로 하였을 경우, 조기 검진 확률은 60~70%로 상당부분 낮아진다.
스로더(Schroder) 등은 유러피언 랜더마이즈드 스터디 오브 스크리닝 포 프로스테이드 캔서(European Randomized study of Screening for Prostate Cancer)에 직장수지 검사를 고려하지 않고, 전립선특이항원 수치의 기준을 3.0 ng/mL로 정하였을 때 발견되는 전립선암과 PSA의 농도 4.0 ng/mL 이상이거나 직장수지검사 결과 전립선암으로 판단되는 경우를 조직 검사하여 발견되는 전립선암의 빈도를 비교하여 보고 하였다. 그 결과 전립선암으로 판단하는 전립선특이항원의 농도를 3.0 ng/mL로 낮춘다면 전립선특이항원의 전립선암에 대한 예측률은 18%에서 24%로 무려 6%나 증가함을 확인할 수 있었다. 이러한 사례는 카타로나(Catalona) 등의 보고에 의해서도 확인되었다. 전립선특이항원의 기준치를 2.6~4.0 ng/mL로 낮추었을 때 전립선암의 진단을 81%까지 증가시킬 수 있었다.
이와 같은 결과들은 전립선암을 진단함에 있어, 전립선특이항원의 기준치를 더욱 낮게 하향조정하는 것이 유리함을 의미한다.
이에 본 발명은 전립선특이항원(PSA)을 스트립 상에서 초고감도로 검출하는 방법을 개발하여 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 니트로셀룰로스 멤브레인에 전립선특이항원(prostate specific antigen: PSA)을 포함하는 시료를 0.2 μL 분주하고, 25 ℃로 조절된 인큐베이터에서 20 분간 건조하여 전립선특이항원을 고정화하는 단계 (a); 상기 단계 (a)의 과정을 5 회 반복하여 분주한 시료의 양이 1 μL가 되도록 하는 단계 (b); 상기 시료가 분주된 위치에 화학발광 기질용액과 반응하여 신호를 낼 수 있는 효소가 부착된 전립선특이항원에 대한 항체를 0.2 μL 분주하고, 25 ℃로 조절된 인큐베이터에서 20 분간 건조하는 단계 (c); 상기 단계 (c)의 과정을 5 회 반복하여 분주한 항체의 양이 1 μL가 되도록 하는 단계 (d); 및 상기 항체가 분주된 위치에 루미놀과 과산화수소가 혼합된 화학발광 기질용액을 첨가하는 단계 (e);를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선특이항원의 검출 방법을 제공한다.
전립선특이항원(prostate specific antigen: PSA)은 임상적으로 전립선암에 사용되는 가장 유용한 종양 표지자이며, 국소적 전립선암의 진단율을 향상시켰는데, 1960 년대 들어서면서부터 일부 학자들에 의해 존재가 알려지기 시작하였다. 그 후 1971 년에 하라(Hara) 등이 정장액(seminal plasma)에서 단백을 추출하여 이를 γ-세미노프로테인(seminoprotein)이라고 명명하였으며, 리(Li)와 벨링(Beling) 등도 인간의 정장액에서 한 항원을 분리하여 이를 E1 항원(Antigen) 이라고 하였다. 하지만, 그 당시에는 이 항원들이 전립선에서 나온 것으로는 생각하지는 않았다. 그러다가 1978 년에 이르러, 센사바우흐(Sensabaugh) 등이 법의학에 사용하기 위해 에시드 포스파타아제(acid phosphatase)보다 특이도가 높은 표지자를 찾고자 노력하였고, 그 결과 인간의 정액에 그러한 항원이 있음을 알아내고, 이를 분리하여 p30 (분자량이 대략 30kd)이라고 명명하였는데, 확인결과 이 물질은 전립선에서 유래하는 것으로 판명되었으며, 그레이브스(Graves) 등은 이 물질을 이용하여 강간 사건을 조사하기도 하였다. 왕(Wang) 등은 1979 년에 전립선 조직에서 항원을 정제하여 이를 종양 표지자로 사용하였는데, 이 항원에 대한 항혈청을 가지고 조사한 바에 의하면, 이 전립선 항원은 전립선 이외의 조직과는 반응하지 않는 것으로 나타나, 전립선에 특이한 항원임을 밝혀내고, 그 후에 전립선특이항원(Prostate Specific Antigen: 이하 PSA)으로 명명하였다.
PSA는 관 상피(ductal epithelium)와 전립선 소포(prostatic acini)에서 만들어지며, 전립선 세포 내의 세포질 내 과립(cytoplasmic granules)과 베시클(vesicles), 조면 소포체(rough endoplasmic reticulum), 베큘(vacules)과 분비 과립(secretory granules) 및 리소좀 덴스 바디(lysosomal dense bodies)에 분포되어 있다.
한편, 본 발명에서는 시료 또는 화학발광 기질용액과 반응하여 신호를 낼 수 있는 효소가 부착된 전립선특이항원에 대한 항체(항체-효소 결합체)를 한꺼번에 1 μL를 전부 분주하지 않고, 0.2 μL씩 나누어 여러 번 분주하는데, 그 이유는 검출하고자 하는 전립선특이항원의 농도가 pg/mL 단위로서 매우 낮은 농도이므로 확산 현상에 의해 시료에 포함된 전립선특이항원의 손실을 막기 위함이다. 다시 말해, 멤브레인에 점적된 전립선특이항원은 농도가 묽을 때는 점적한 곳을 중심으로 퍼지나, 0.2 μL씩 여러 번 점적하면 니트로셀룰로스 매질에 농축되기 때문이다.
한편, 본 발명에서 사용한 '화학발광'이라는 용어는 전립선특이항원의 항체-효소 결합체 중 효소에 의해 발광하는 빛을 가리킨다.
한편, 본 발명에서 사용한 '시료'라는 용어는 분석 대상 화합물인 전립선특이항원 또는 그것이 포함된 조성물을 가리킨다. 본 발명에서 사용될 수 있는 시료는 전립선특이항원을 함유하는 것이라면 어느 유래의 것으로부터 선택되어 사용될 수 있으며, 예로는 전립선 질환이 의심되는 환자의 혈액, 뇨 등이 있다.
한편, 본 발명에서 발광을 일으키는 원리는 하기와 같은데, 먼저 알칼리 조건에서 루미놀이 두 개의 수소를 잃고, 두 개의 산소원자가 6각형 고리의 중간에 다리형으로 결합(산화)한다. 이 산화된 상태는 불안정하므로 질소가 곧바로 기체로 되어 떨어져 나간다. 질소가 떨어져 나가 생긴 중간체는 높은 에너지 상태로 불안정한데, 곧바로 내부의 에너지를 빛에너지의 형태로 내어 놓고 안정한 저에너지 상태로 이동한다. 이때, 발광 현상이 나타나는데, 이를 화학발광이라고 한다.
한편, 본 발명에서 신호를 낼 수 있는 효소는 바람직하게 HRP(horse radish peroxidase)인 것이 좋은데, 이때 HRP와 전립선특이항원에 대한 항체는 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에 의해 가교결합된 것일 수 있다.
한편, 본 발명에서 있어서, 발광을 일으키는 루미놀과 증진제인 과산화수소는 1:1의 비율로 혼합된 것을 사용하는 것이 좋다.
본 발명에 의할 경우, 기존의 전립선특이항원을 검출하는 방법들보다 더욱 짧은 시간 내에 매우 적은 양(피코 단위 수준)의 시료로, 매우 간편하게 전립선특이항원을 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 제작한 전립선특이항원 검출 스트립의 개략 단면도이다.
도 2는 본 발명에서 제작한 전립선특이항원 검출 스트립의 실제 사진이다.
도 3은 5~100 pg/mL 범위의 화학발광 값을 그래프로 나타내어 검량선을 작성한 것인데, R2 값이 0.988인 직선성을 나타내었다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
제조예 1: 전립선특이항원 스트립의 제작
전립선특이항원 검출을 위해 스폿 타입(spot type)의 스트립을 제작하였다. 스폿 타입(spot type) 스트립은 화학발광이 일어나는 니트로셀룰로스 멤브레인이 포함된 화학발광 매질과 플라스틱 하우징으로 구성되어 있다. 먼저 얇은 플라스틱 필름에 니트로셀룰로스 멤브레인을 부착하여 화학발광 매질을 제작한다. 도 1과 같이 니트로셀룰로스 멤브레인이 플라스틱 필름 위에 부착되어 있는데, 니트로셀룰로스 멤브레인은 항원과 항체-효소 결합체가 고정화되어 화학발광 반응이 실제적으로 일어나는 곳으로서, 시료를 분주하는 위치는 니트로셀룰로스 왼쪽 말단으로부터 10 mm되는 지점으로 정하였다.
이렇게 시료를 분주하는 점을 정하게 된 이유는 검출하고자 하는 전립선특이항원의 농도가 pg/mL 단위로 매우 낮기 때문에 시료를 고정화하는 지점이 조금만 달라지더라도 검출되는 전립선특이항원의 농도에 심각한 오차를 초래하기 때문이다.
상기와 같이 검출에 이용되는 모든 시료 및 화학발광 기질들을 분주하는 위치를 통일함으로써 검출 오차를 최소화하고자 하였다.
제조예 2: 전립선특이항원 항체-효소 결합체의 제조
효소-항체 결합체를 제작하는 과정은 다음과 같았다.
전립선특이항원에 대한 마우스 단일클론 항체에 HRP(horse radish peroxidase)를 반응시켜 제작하였는데, 전립선특이항원에 대한 항체의 농도는 1.081 mg/ml로 하였으며 효소와의 반응을 용이하게 하기 위하여 완충용액(0.1 M PBS, pH 7.2)하에서 보관하여 두었다가 분말 형태로 된 HRP(sigma, St. Louis, MO)을 첨가하여 빛이 없는 곳에서 천천히 섞어 준 후 항체와 효소간 결합이 이루어지도록 가교 역할을 하는 1% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 첨가하였다.
그 후, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션(incubation)하여 항체와 효소가 결합하도록 유도한 후, 항체에 너무 많은 양의 효소가 부착되는 것을 막기 위해 정지 용액(stop solution)으로서 1 M Tris(pH 7.2) 용액 108 μL 넣어준 후 4 ℃ 냉장고에서 1~2시간 동안 교반하여 항체-효소결합체의 반응을 종결하였다.
반응이 종결된 후에는 세파덱스(Sephadex) G-25로 충진한 분배 컬럼을 사용하여 단백질-효소 결합체로 결합하지 않고 남아있는 여분의 효소물질과 단백질을 제거하였으며, 정제 완충용액은 0.1 M 중탄산나트륨(pH 8.5)를 사용하였다.
정제된 단백질(항체)-효소 결합체는 사용하기 전까지 냉장 또는 -20 ℃ 이하 냉동고에 보관하였다.
실시예 1: 본 발명의 방법에 의한 전립선특이항원의 검출
니트로셀룰로스 멤브레인에 전립선특이항원을 PBS로 희석하여 0.2 μL를 분주하고 25℃로 조절된 인큐베이터(incubator)에서 20 분간 건조하여 멤브레인에 전립선특이항원을 고정화하는 과정을 거쳤다. 이 과정을 5 회 반복하여 분주한 항원 또는 항체의 양이 1 μL가 되도록 하였다.
그 후, 상기의 분주된 항원에 화학발광 기질 용액과 반응하여 신호를 낼 수 있는 효소가 부착된 전립선특이항원에 대한 항체를 분주하였다. 이때도 0.2 μL를 분주하고, 25℃로 조절된 인큐베이터에서 20 분간 건조하는 과정을 거쳤다. 이 과정을 5 회 반복하여 분주한 항원 또는 항체의 양이 1 μL가 되도록 하였다.
이처럼 한꺼번에 1 μL의 시료 혹은 항체-효소 결합체를 분주하지 않고, 0.2 μL씩 나누어 여러 번 분주하는 이유는 검출하고자 하는 전립선특이항원의 농도가 pg/mL 단위로서 매우 낮은 농도이므로 확산 현상에 의해 시료에 포함된 전립선특이항원의 손실을 막기 위함이다. 다시 말해, 멤브레인에 점적된 전립선특이항원은 농도가 묽을 때는 점적한 곳을 중심으로 퍼지나, 0.2 μL씩 여러 번 점적하면, 니트로셀룰로스매질에 농축되기 때문이다.
전립선특이항원의 검출을 위한 준비가 끝나면 절단기를 사용하여 4 mm 폭으로 잘라 플라스틱 하우징에 담았다. 스트립의 크기는 4 mm × 60 mm이 되도록 하였다. 도 2는 전립선특이항원 검출 스트립의 실제 사진이다.
스트립 제작이 끝나면 전립선특이항원-항체-효소 결합체의 반응이 일어난 지점에 화학발광기질 용액을 가하였다. 화학발광 기질 용액은 루미놀과 과산화수소가 혼합된 용액을 사용하였다.
이렇게 농축된 전립선특이항원을 효소가 부착된 항체와 반응시킨 후 루미놀:과산화수소가 1:1로 혼합된 기질을 가하면, 화학발광 시그날을 얻을 수 있다. 그러면 항원과 반응하게 된 항체에 부착된 효소가 화학발광 기질 용액과 반응하여 빛을 발생시키게 된다. 이때, 발생하는 빛의 세기는 전립선특이항원의 농도에 의존하게 된다. 따라서, 빛의 세기의 차이를 이용하여 시료 중에 전립선특이항원의 농도를 최종적으로 결정할 수 있게 된다.
표 1에 상기와 같이 전립선특이항원의 표준시료를 측정해 본 결과를 기재하였다.
전립선특이항원의 농도(pg/mL) 화학발광 세기 평균 표준편차 상대표준
편차
(%)
1 2 3
2.5 124 290 322 282 0.045ⅹ103 16
5 1928 1976 2163 2022 0. 124ⅹ103 6
25 2041 2268 2255 2188 0.127ⅹ103 6
50 2479 2435 2363 2426 0.058ⅹ103 2
100 3015 3024 3252 3097 0.134ⅹ103 4
250 2186 1979 2241 2135 0.138ⅹ103 6
표 1에서 전립선특이항원의 농도가 2.5 pg/mL일 때는 상대 표준편차가 매우 높고, 5 pg/mL일 때와 화학발광 세기를 비교해 보았을 때도 현저히 작은 화학발광 세기를 나타내기 때문에, 2.5 pg/mL를 검출하는데는 무리가 있다고 할 수 있었다.
그러나, 5 pg/mL부터 100 pg/mL 까지는 전립선특이항원의 농도와 비교하여 화학발광의 세기가 정량적으로 증가하고 있음을 볼 수 있었다. 하지만, 전립선특이항원의 농도가 250 pg/mL일 때는 상대표준편차는 6% 정도로 화학발광 시그날이 안정적이지만, 100 pg/mL의 전립선특이항원을 통해 얻은 빛의 세기와 비교하였을 때 오히려 작은 값으로 검출되었기 때문에 250 pg/mL는 정량 범위에서 제외하였다.
결국, 본 발명의 스폿 타입(spot type) 스트립으로 제작된 전립선암 진단 스트립의 정량 범위는 전립선특이항원의 농도를 기준으로 할 때 5 pg/mL에서 100 pg/mL가 적정함을 확인할 수 있었다.
가장 낮은 측정 농도가 5 pg/mL인 본 발명의 방법은 무엇보다도 초고감도로 전립선특이항원을 측정할 수 있음을 의미한다.
도 3에서는 5~100 pg/mL 범위의 화학발광 값만을 그래프로 나타내고, 농도에 따른 화학발광 세기의 상관성을 알아보기 위해 일차 다항식에 의한 최소자승법을 이용하여 검량선을 작성하였다. 그 결과, R2 값 이 0.988로써 농도의 증가에 따른 화학발광 세기의 증가가 상관성 있는 결과를 보여줌을 확인할 수 있었다.
정량 가능한 범위로 설정된 5~100 pg/mL 농도의 전립선특이항원은 전립선 관련 질환이라고 판단하는 한계 농도인 4 ng/mL는 물론, 더 낮은 농도 범위의 전립선특이항원을 검출할 수 있는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명의 방법은 전립선 관련 질환의 조기 진단에의 활용은 물론 전립선 관련 질환 환자들의 치료 후 관리 시 전립선특이항원 농도의 미묘한 면화를 정확하게 측정하는데도 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims (4)

  1. 니트로셀룰로스 멤브레인에 전립선특이항원(prostate specific antigen: PSA)을 포함하는 시료를 0.2 μL 분주하고, 25 ℃로 조절된 인큐베이터에서 20 분간 건조하여 전립선특이항원을 고정화하는 단계 (a);
    상기 단계 (a)의 과정을 5 회 반복하여 분주한 시료의 양이 1 μL가 되도록 하는 단계 (b);
    상기 시료가 분주된 위치에 화학발광 기질용액과 반응하여 신호를 낼 수 있는 효소가 부착된 전립선특이항원에 대한 항체를 0.2 μL 분주하고, 25 ℃로 조절된 인큐베이터에서 20 분간 건조하는 단계 (c);
    상기 단계 (c)의 과정을 5 회 반복하여 분주한 항체의 양이 1 μL가 되도록 하는 단계 (d); 및,
    상기 항체가 분주된 위치에 루미놀과 과산화수소가 혼합된 화학발광 기질용액을 첨가하는 단계 (e);를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선특이항원의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    신호를 낼 수 있는 효소는,
    HRP(horse radish peroxidase)인 것을 특징으로 하는 전립선특이항원의 검출 방법
  3. 제2항에 있어서,
    HRP(horse radish peroxidase)가 부착된 전립선특이항원에 대한 항체는,
    HRP와 전립선특이항원에 대한 항체가 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에 의해 가교결합한 것을 특징으로 하는 전립선특이항원의 검출방법
  4. 제1항에 있어서,
    루미놀과 과산화수소는,
    1:1의 비율로 혼합된 것을 특징으로 하는 전립선특이항원의 검출 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102070931B1 (ko) * 2018-08-16 2020-01-29 (주)옵토레인 면역진단 카트리지

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