KR20120115498A - Method for preparing transformed potato plants having multispecies virus resistance, and potato plants prepared by same - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A manufacturing method of transformed potato plant with multifariousness virus resistance and a transformed potato plant manufactured by using the same are provided to increase potato productivity and to be used as a virus resistance parent. CONSTITUTION: A transformed potato plant is obtained by being transformed into an expression vector pK7GWIWG 2 which includes a gene fusing more than 3 kinds of virus genes selected from potato mop-top virus gene of the sequence number 5, PVY(Potato virus Y) gene of the sequence number 1(SEQ ID NO:1), PLRV(Potato leafroll virus) gene of the sequence number 2,PVA(Potato virus A) gene of the sequence number 3, or TRV(Tobacco rattle virus) gene of the sequence number 4 in sense and anti-sense direction. A manufacturing method of the multifariousness virus resistant transformed potato plant comprises the following steps: transforming Agrobacterium tumefaciens into an expression vector pK7GWIWG 2(I)/ YLRATRPM including YLRATRPM gene of the sequence number 6; and transforming potato cells by cocltivating agrobacterium and potato cells.

Description

다종 바이러스 저항성을 갖는 형질전환 감자 식물체의 제조방법 및 이를 이용하여 제조된 감자 식물체{METHOD FOR PREPARING TRANSFORMED POTATO PLANTS HAVING MULTISPECIES VIRUS RESISTANCE, AND POTATO PLANTS PREPARED BY SAME}METHOD FOR PREPARING TRANSFORMED POTATO PLANTS HAVING MULTISPECIES VIRUS RESISTANCE, AND POTATO PLANTS PREPARED BY SAME}

본 발명은 여러 종류의 바이러스에 대한 저항성을 부여하기 위한 형질전환 감자 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 감자 식물체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Potato virus Y(PVY), Potato leafroll virus(PLRV), Potato virus A(PVA), Tobacco rattle virus(TRV) 및 Potato mop-top virus(PMTV)의 5종의 식물 바이러스 중 일부 또는 모두에 대하여 저항성을 나타내는 형질전환 감자의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 감자에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a transformed potato plant for imparting resistance to various kinds of viruses and to a transformed potato plant produced by the method, more specifically Potato virus Y (PVY), Potato leafroll virus (PLRV), Potato virus A (PVA), Tobacco rattle virus (TRV) and Potato mop-top virus (PMTV) A method for preparing and transforming potatoes that are resistant to some or all of the five plant viruses It relates to a transgenic potato produced by.

농업적으로 중요한 작물의 대부분은 식물 바이러스 또는 바이로이드(viroid) 감염에 의해 수확량이 감소됨은 물론 품질이 저하되어 심각한 경제적 손실을 일으킨다. 식물 바이러스병은 곰팡이병 또는 세균병과는 다르게 농약을 살포하여 예방하거나 치료하는 것이 불가능하여, 바이러스에 대한 저항성을 갖는 품종을 만들고자 하는 노력이 있어왔다. 예를 들면 식물 바이러스 유전자를 식물체 형질전환 기술을 이용하여 식물체에서 발현시킴으로써 바이러스 저항성을 부여하는 방법이 이용되어왔다. 이때, 주로 이용된 바이러스 유전자는 외피단백질이었으며, 복제효소 유전자와 HCPro 유전자가 이용되었다. 그러나 바이러스 특정 유전자 전체를 식물체에서 발현시킴으로써 식물체에 바이러스 저항성을 부여하는 방법은 단일 종류 바이러스 또는 밀접한 연관이 있는 바이러스에 대해서만 저항성을 부여할 수 있다는 문제가 있었다.Most agriculturally important crops are not only reduced in yield by plant viruses or viroid infections, but also deteriorated in quality, causing significant economic losses. Plant viral diseases, unlike fungal or bacterial diseases, it is impossible to prevent or treat by spraying pesticides, and efforts have been made to produce varieties that are resistant to viruses. For example, a method of imparting viral resistance by expressing plant virus genes in plants using plant transformation techniques has been used. At this time, the mainly used viral gene was the envelope protein, and the replication enzyme gene and HCPro gene were used. However, the method of imparting viral resistance to a plant by expressing the entire virus-specific gene in the plant has a problem that resistance can be given only to a single type of virus or a virus closely related thereto.

또한, 여러 종류의 바이러스에 대한 억제효과를 나타내기 위한 방법이 개발되어 있는데 이는 리보솜 불활성화 단백질(ribosomal inactivating protein: RIP)을 식물체에서 발현시키는 것이다. 그러나 이러한 유전자를 발현하는 형질전환 식물체들은 잎에 반점이 생기거나, 발육이 저해되고, 생식능력을 상실하는 등 비정상적인 형질을 나타내는 문제점이 있다.In addition, a method for expressing an inhibitory effect against various types of viruses has been developed, which is to express the ribosomal inactivating protein (RIP) in plants. However, the transgenic plants expressing such genes have a problem of showing abnormal traits such as spots on the leaves, growth inhibition, loss of fertility, and the like.

또한, 동물로부터 유래한 이중가닥 RNA에 의하여 활성화되는 단백질 인산화효소(double strand dependent protein kinase)로 식물체를 형질전환하여 복합저항성을 유도하는 방법도 있으나, 바이러스 감염에 대한 면역반응이 아니라 증상 발현이 늦어지는 정도의 약한 저항성만 보이는 문제점이 있다. 이중가닥 RNA 유전자를 형질전환을 통하여 식물체 게놈에 도입하면 도입유전자가 파괴되면서 20?25 뉴클레오타이드 크기의 siRNA(small interference RNA)가 생성되는데, 이러한 siRNA를 생성하는 형질전환 식물체는 도입된 바이러스 유전자와 염기서열이 동일한 바이러스가 외부에서 침입 시 저항성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이러한 저항성 반응을 PTGS(post-transcriptional gene silencing)라고 한다.There is also a method of inducing complex resistance by transforming a plant with a double strand dependent protein kinase activated by double-stranded RNA derived from an animal. The problem is that only weak resistance is seen. When the double-stranded RNA gene is introduced into the plant genome through transformation, the transgene is destroyed to produce 20-25 nucleotide-sized small interference RNA (siRNA). Viruses with the same sequence are known to be resistant to invasion from the outside. This resistance response is called post-transcriptional gene silencing (PTGS).

또한, 바이러스 일부유전자를 여러개 연결하여 여러 종류의 바이러스에 대한 저항성을 갖게 하고자 하는 연구가 이루어진 바 있는데, 토스포바이러스(Tospovirus) 그룹에 대한 저항성을 갖는 담배를 만들기 위하여 토스포바이러스 그룹에 속하는 WSMoV(Watermelon silver mottle tospovirus), TCSV(tomato chlorotic spot virus), GRSV(Groundnut ringspot virus), TSWV(Tomato spotted wilt tospovirus) 등의 4종 바이러스 각각으로부터 N 유전자 부위 150bp 부분을 선정하여 만들어진 새로운 바이러스 유전자를 이용하여 담배를 형질전환시킴으로써 바이러스 저항성 담배를 제조한 바 있다. 그러나 이들 4개 바이러스는 모두 동일그룹에 속하며 또한 동일한 바이러스 유전자인 N 유전자를 도입한 것이며, 현실적으로 한 식물체가 4종의 토스포바이러스에 감염되지는 않는다.In addition, research has been conducted to connect several virus genes to make them resistant to various types of viruses. To make tobacco resistant to the Tospovirus group, WSMoV ( Using a new virus gene made by selecting 150bp region of N gene from each of four viruses such as watermelon silver mottle tospovirus (TSCV), tomato chlorotic spot virus (TCSV), groundnut ringspot virus (GRSV), and tomato spotted wilt tospovirus (TSWV) Viral-resistant tobacco has been produced by transforming tobacco. However, these four viruses all belong to the same group and have introduced the same viral gene, the N gene, and in reality, one plant is not infected with four tospoviruses.

대한민국 공개특허 제 10-2008-0058751 호에는 두 가지의 비선택성 제초제에 복합 저항성을 가지는 감자 식물체 및 그 제조방법에 대하여 기재하고 있으나, 본 발명에서는 특정 감자 바이러스병에 대하여 동시에 저항성을 나타내는 감자 식물체 및 그 제조 방법에 관한 것에 차이가 있다.Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2008-0058751 discloses a potato plant having a complex resistance to two non-selective herbicides and a method for producing the same, but in the present invention, a potato plant that simultaneously shows resistance to certain potato virus diseases and There is a difference about the manufacturing method.

국내의 중요한 채소작물 중 하나인 감자 바이러스병(바이러스에 의해 일어나는 감자의 병해를 총칭함)은 감자재배 지역에서는 쉽게 발생되며, 소독 및 살균제 살포 등을 이용한 화학적 방제가 불가능하기 때문에 특별한 방제 방법이 필요하다. 바이러스에 감염된 감자를 연속적으로 재배할 경우, 수확량의 20?50％까지 감소할 수 있기 때문에 생산에 막대한 차질이 생긴다.Potato virus disease, one of the important vegetable crops in Korea (generally referred to as virus caused by potato), occurs easily in potato growing areas, and special control methods are needed because chemical control using disinfection and disinfectant spraying is impossible. Do. Continuous cultivation of virus-infected potatoes can reduce production by up to 20-50%, resulting in significant production disruptions.

이들 바이러스에 의한 병징은 단일종의 바이러스에 의해 유발되기보다는, 상이한 그룹에 속하는 다종 바이러스에 의해 유발되는 경우가 많으며, 이들 바이러스 중 특히 PVY, PLRV, PVA, TRV 및 PMTV 등에 대해 동시에 저항성을 갖는 품종 육성이 절실히 요청되고 있는 실정이다.Symptoms caused by these viruses are often caused by multiple viruses belonging to different groups, rather than by a single species of virus, and among them, breeding varieties that are simultaneously resistant to PVY, PLRV, PVA, TRV and PMTV. This situation is urgently requested.

이러한 바이러스에 의한 피해를 감소시키기 위한 다양한 전략들이 시도되고 있으며, 본 발명에서는 유전자 변형에 의한 저항성을 이용하는 방안을 제시한다.Various strategies have been tried to reduce the damage caused by these viruses, and the present invention proposes a method of utilizing resistance by genetic modification.

따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 다종 바이러스, 특히 PVY, PLRV, PVA, TRV 및 PMTV의 5종류 바이러스 또는 PVY, PLRV 및 PVA의 3종류 바이러스에 대하여 동시에 저항성을 갖는 형질전환 감자식물체의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 형질전환 감자식물체를 제공하는 것이다.Therefore, the technical problem to be achieved by the present invention is a method for producing a transgenic potato plant having resistance to multiple viruses, in particular, five types of viruses such as PVY, PLRV, PVA, TRV and PMTV or three types of viruses of PVY, PLRV and PVA. And to provide a transgenic potato plant prepared by the above method.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 6의 YLRATRPM 유전자 또는 서열번호 7의 YLRA 유전자를 포함하고 도 1에 나타낸 개열지도를 가지는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM 또는 도 2(b)의 개열지도를 가지는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRA로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시킨 후, 상기 아그로박테리움과 감자 세포를 공동배양하여 상기 감자 세포를 형질전환시키는 것을 포함하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an expression vector pK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM or a cleavage map of FIG. 2 (b) which includes a YLRATRPM gene of SEQ ID NO: 6 or a YLRA gene of SEQ ID NO: 7 and has a cleavage map shown in FIG. Expression vector pK7GWIWG2 (I) / YLRA having agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium) tumefaciens ), and then co-culturing the Agrobacterium and potato cells to transform the potato cells, to provide a method for producing a multi-virus resistant transgenic potato plant.

상기 서열번호 6의 YLRATRPM 유전자는 서열번호 1의 PVY(Potato virus Y) 유전자, 서열번호 2의 PLRV(Potato leafroll virus) 유전자, 서열번호 3의 PVA(Potato virus A) 유전자, 서열번호 4의 TRV(Tobacco rattle virus) 유전자 및 서열번호 5의 PMTV(Potato mop-top virus) 유전자를 오버랩 PCR을 이용하여 융합시킬 수 있다.The YLRATRPM gene of SEQ ID NO: 6 is a PVY (Potato virus Y) gene of SEQ ID NO: 1, Potato leafroll virus (PLRV) gene of SEQ ID NO: 2, PVA (Potato virus A) gene of SEQ ID NO: 3, TRV of SEQ ID NO: 4 The Tobacco rattle virus gene and the Potato mop-top virus (PMTV) gene of SEQ ID NO: 5 can be fused using overlap PCR.

상기 서열번호 7의 YLRA 유전자는 서열번호 1의 PVY(Potato virus Y) 유전자, 서열번호 2의 PLRV(Potato leafroll virus) 유전자 및 서열번호 3의 PVA(Potato virus A) 유전자를 오버랩 PCR을 이용하여 융합시킬 수 있다.The YLRA gene of SEQ ID NO: 7 is a fusion of PVY (Potato virus Y) gene of SEQ ID NO: 1, Potato leafroll virus (PLRV) gene of SEQ ID NO: 2 and PVA (Potato virus A) gene of SEQ ID NO: 3 using overlap PCR You can.

또한, 본 발명은 상기 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법에 의해 제조되는 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체를 제공한다.In addition, the present invention provides a multi-virus resistant transgenic potato plant produced by the method for producing a multi-virus resistant transgenic potato plant.

본 발명의 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법으로 제조된 감자식물체는, 감자를 감염시키는 5종의 주요 바이러스인 PVY, PLRV, PVA, TRV 및 PMTV에 대하여 다종의 저항성을 나타내므로 감자 생산성을 증가시키고, 바이러스 저항성 교배 모본으로 이용이 가능하다.Potato plants prepared by the method for producing a multi-virus resistant transgenic potato plant of the present invention exhibit a variety of resistance to PVY, PLRV, PVA, TRV, and PMTV, five major viruses that infect potatoes, resulting in increased potato productivity. Increasingly, it can be used as a virus resistant hybrid model.

도 1은 YLRATRPM 유전자를 pK7GWIWG2(I) 발현벡터에 삽입하여 제작한 재조합 벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-OUT의 구조를 나타낸 사진이다.
도 2은 YLRATRPM 유전자 또는 YLRATRPM 유전자를 pK7GWIWG2(I) 발현벡터에 삽입하여 제작한 재조합 벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-OUT, pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-IN, pK7GWIWG2(I)/YLRA-OUT 및 pK7GWIWG2(I)/YLRA-IN의 구조를 나타낸 사진이다.
도 3는 pK7GWIWG2(I)에 도입된 융합유전자 YLRA와 YLRATRPM 클론에 대한 HindIII 제한효소 처리에 의하여 확인한 결과 사진이다. 1: pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-IN(867, 976, 1597 bp) ; 2-3: pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-OUT(667, 776, 1797 bp); 4-5: pK7GWIWG2(I)/YLRA-IN(467, 576, 1597 bp); 6-7: pK7GWIWG2(I)/YLRA-OUT(667, 776, 1397 bp).
도 4는 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자로 형질전환된 감자의 서던블럿 분석 결과를 나타낸 사진이다. M은 DNA 사이즈 마커 레인(lane)이며, NC는 음성대조로서 형질전환하지 않은 감자(Vales Sovereign 품종)의 DNA 레인이다. 레인 1 내지 7은 형질전환 감자 계통이다(1: 1000-101-OUT16 계통; 2: 1000-101-OUT28 계통; 3: 1000-101-OUT54 계통, 4: 1000-4-11-OUT19계통, 5 : 600-102-6-IN34 계통, 6 : 600-102-6-IN38 계통, 7 : 600-102-6-IN39 계통).
도 5은 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자로 형질전환된 감자의 노던블럿 분석 결과를 나타낸 사진이다. 프로브(Probe)는 각 블럿별 하이브리다이제이션(hybridization)에 이용된 도입 바이러스 유전자 특이 프로브를 나타내며, PC는 양성대조로서 각 바이러스에 감염된 식물체로부터 추출한 RNA 레인을 나타내고, NC는 음성대조로서 형질전환하지 않은 감자(품종: Vales Sovereign)로부터 추출한 RNA 레인을 나타낸다.
도 6는 실시예 4에 의한 감자 식물체(품종:Vales Sovereign)의 PVY, PLRV, PVA 다종바이러스 저항성 조사에 대한 결과 사진이다.1 is a photograph showing the structure of the recombinant vector pK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM-OUT prepared by inserting the YLRATRPM gene into the pK7GWIWG2 (I) expression vector.
2 is a recombinant vector pK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM-OUT, pK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM-IN, pK7GWIWG2 (I) / YLRA-W and pK7GWI prepared by inserting the YLRATRPM gene or YLRATRPM gene into the pK7GWIWG2 (I) expression vector. It is a photograph showing the structure of (I) / YLRA-IN.
Figure 3 is a photograph confirmed by the HindIII restriction enzyme treatment for the fusion genes YLRA and YLRATRPM clone introduced into pK7GWIWG2 (I). 1: pK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM-IN (867, 976, 1597 bp); 2-3: pK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM-OUT (667, 776, 1797 bp); 4-5: pK7GWIWG2 (I) / YLRA-IN (467, 576, 1597 bp); 6-7: pK7GWIWG2 (I) / YLRA-OUT (667, 776, 1397 bp).
Figure 4 is a photograph showing the results of Southern blot analysis of potato transformed with YLRATRPM gene or YLRA gene. M is the DNA size marker lane, NC is the negative control DNA lane of the non-transformed potato (Vales Sovereign variety). Lanes 1 to 7 are transgenic potato strains (1: 1000-101-OUT16 strain; 2: 1000-101-OUT28 strain; 3: 1000-101-OUT54 strain, 4: 1000-4-11-OUT19 strain, 5 : 600-102-6-IN34 strain, 6: 600-102-6-IN38 strain, 7: 600-102-6-IN39 strain).
5 is a photograph showing the results of Northern blot analysis of potato transformed with YLRATRPM gene or YLRA gene. Probe represents the introduced viral gene specific probe used for hybridization for each blot, PC represents the RNA lane extracted from the plant infected with each virus as a positive control, and NC is not transformed as a negative control. RNA lanes extracted from uncooked potatoes (variety: Vales Sovereign).
Figure 6 is a photograph of the results of the PVY, PLRV, PVA multi-virus resistance investigation of potato plants (variety: Valley Sovereign) according to Example 4.

[발명의 실시를 위한 최선의 형태]Best Mode for Carrying Out the Invention [

이하에서는 본 발명에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 다종 바이러스에 대한 저항성을 부여하기 위한 형질전환 감자 식물체로서, 서열번호 1의 PVY(Potato virus Y) 유전자, 서열번호 2의 PLRV(Potato leafroll virus) 유전자, 서열번호 3의 PVA(Potato virus A) 유전자, 서열번호 4의 TRV(Tobacco rattle virus) 유전자 및 서열번호 5의 PMTV(Potato mop-top virus) 유전자로부터 선택된 3종이상의 바이러스 유전자를 융합한 유전자를 센스 및 안티센스 방향으로 포함하는 발현벡터로 형질전환 된, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체를 제공한다.The present invention is a transgenic potato plant for imparting resistance to a variety of viruses, Potato virus Y (PVY) gene of SEQ ID NO: 1, Potato leafroll virus (PLRV) gene of SEQ ID NO: 2, PVA (Potato virus of SEQ ID NO: 3) A) An expression vector comprising, in the sense and antisense direction, a gene in which three or more viral genes selected from the gene, the Tobacco rattle virus (TRV) gene of SEQ ID NO: 4 and the Potato mop-top virus (PMTV) gene of SEQ ID NO: 5 are fused To provide a transformed, multi-virus resistant transgenic potato plants.

상기 발현벡터는 pK7GWIWG2(I)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.The expression vector is preferably pK7GWIWG2 (I), but is not limited thereto.

본 발명은 다종 바이러스에 대한 저항성을 부여하기 위한 형질전환 감자 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 감자 식물체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 Potato virus Y(PVY), Potato leafroll virus(PLRV), Potato virus A(PVA), Tobacco rattle virus(TRV) 및 Potato mop-top virus(PMTV)의 5가지 종류의 식물 바이러스 모두 또는 이로부터 선택된 Potato virus Y(PVY), Potato leafroll virus(PLRV), Potato virus A(PVA)의 3가지 종류에 식물 바이러스 모두에 대하여 저항성을 나타내는 형질전환 감자의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 감자에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a transformed potato plant for imparting resistance to multiple viruses and to a transformed potato plant produced by the method, more specifically Potato virus Y (PVY), Potato leafroll virus (PLRV). ), Potato virus A (PVA), Tobacco rattle virus (TRV), Potato mop-top virus (PMTV), or all five plant viruses selected from or selected from Potato virus Y (PVY), Potato leafroll virus (PLRV), The present invention relates to a method for producing a transformed potato exhibiting resistance to all plant viruses to three types of Potato virus A (PVA) and to a transformed potato produced by the method.

본 발명의 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법은, PVY 유전자, PLRV 유전자, PVA 유전자, TRV 유전자 및 PMTV 유전자를 융합시킨 바이러스 융합유전자(이후, 'YLRATRPM 유전자'로도 칭함) 를 보유한 식물체 형질전환용 재조합 발현벡터로 감자를 형질전환 시키는 것을 포함하는 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 PVY 유전자, 서열번호 2의 PLRV 유전자, 서열번호 3의 PVA 유전자, 서열번호 4의 TRV 유전자 및 서열번호 5의 PMTV 유전자를 오버랩 PCR을 이용하여 융합시킨 서열번호 6의 YLRATRPM 유전자를 포함하고 도 1에 나타낸 개열지도를 갖는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM으로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시킨 후, 상기 아그로박테리움과 감자 세포를 공동배양하여 상기 감자 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다. 상기 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)는 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 이용할 수 있다.Method for producing a multi-virus resistant transgenic potato plant of the present invention, a plant transformation having a virus fusion gene (hereinafter referred to as 'YLRATRPM gene') fused with PVY gene, PLRV gene, PVA gene, TRV gene and PMTV gene Potato transformed with a recombinant expression vector for the gene, more specifically, the PVY gene of SEQ ID NO: 1, the PLRV gene of SEQ ID NO: 2, the PVA gene of SEQ ID NO: 3, the TRV gene of SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5 of transformed Agrobacterium Tome Pacific Enschede (Agrobacterium tumefaciens) into an expression vector pK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM having a cleavage map shown in Fig. 1 comprises a YLRATRPM gene of which SEQ ID NO: 6 fused using a PCR overlap PMTV gene And then co-culturing the Agrobacterium and potato cells to transform the potato cells. The Agrobacterium Tome Pacific Enschede (Agrobacterium tumefaciens), for example, Agrobacterium Tome Pacific Enschede (Agrobacterium tumefaciens ) LBA4404 is available.

또는, 본 발명의 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법은, PVY 유전자, PLRV 유전자 및 PVA 유전자를 융합시킨 바이러스 융합유전자(이후, 'YLRA 유전자'로도 칭함)를 보유한 식물체 형질전환용 재조합 발현벡터로 감자를 형질전환 시키는 것을 포함하는 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 PVY 유전자, 서열번호 2의 PLRV 유전자 및 서열번호 3의 PVA 유전자를 오버랩 PCR을 이용하여 융합시킨 서열번호 7의 YLRA 유전자를 포함하는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRA로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시킨 후, 상기 아그로박테리움과 감자 세포를 공동배양하여 상기 감자 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다. 상기 아그로박테리움 투메파시엔스는 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 이용할 수 있다.Alternatively, the method for producing a multi-virus resistant transgenic potato plant of the present invention is a recombinant expression vector for plant transformation having a viral fusion gene (hereinafter also referred to as 'YLRA gene') in which a PVY gene, a PLRV gene, and a PVA gene are fused. The YLRA gene of SEQ ID NO: 7, which comprises transforming a potato into the potato, is more specifically fused to the PVY gene of SEQ ID NO: 1, the PLRV gene of SEQ ID NO: 2, and the PVA gene of SEQ ID NO: 3 using overlap PCR. Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium ) containing expression vector pK7GWIWG2 (I) / YLRA tumefaciens ), and then co-culturing the Agrobacterium and potato cells to transform the potato cells. The Agrobacterium tumefaciens, for example, Agrobacterium tumefaciens tumefaciens ) LBA4404 is available.

상기 서열번호 7의 YLRA 유전자를 포함하는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRA는 보다 상세하게는 서열번호 7의 YLRA 유전자를 포함하고, 도 2(b)에 나타낸 개열지도를 갖는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRA를 말한다.The expression vector pK7GWIWG2 (I) / YLRA comprising the YLRA gene of SEQ ID NO: 7 more specifically includes the expression vector pK7GWIWG2 (I) having the cleavage map shown in FIG. Say / YLRA

여기서, 상기 형질전환된 감자 세포를 조직배양 방법으로 재분화시키는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 외래 유전자가 도입된 아그로박테리움, 바람직하게는 아그로박테리움 튜메파시엔스 LB와 감자의 세포 조직을 공존 배양하여 재분화 감자를 유도할 수 있다.Here, the transformed potato cells may further comprise the re-differentiation by a tissue culture method, Agrobacterium, preferably Agrobacterium tumefaciens LB and the cell tissue of the potato introduced foreign gene of the present invention Co-culture can be used to induce regenerated potatoes.

이때, 상기 감자 세포 조직은 줄기 또는 잎의 조직을 이용하는 것이 바람직하다.At this time, it is preferable that the potato cell tissue uses a stem or leaf tissue.

상기 공존 배양시간은 15 내지 30℃에서 10 내지 40분인 것이 바람직하다.The coexistence incubation time is preferably 10 to 40 minutes at 15 to 30 ℃.

또한, 상기 재분화는 조직배양으로 캘러스(callus)를 형성시킨 후 기관을 유도하는 방법을 통하여 이루어질 수 있다.In addition, the re-differentiation can be made through the method of inducing organ after forming callus (callus) in tissue culture.

본 발명에서 용어 "다종 바이러스 저항성"이란, 동일하거나 상이한 그룹에 포함되는 여러 종류의 바이러스에 대한 저항성, 특히 PVY, PLRV, PVA, TRV 및 PMTV 바이러스에 대한 저항성을 의미한다.The term "multiple virus resistance" in the present invention means resistance to various kinds of viruses included in the same or different groups, in particular resistance to PVY, PLRV, PVA, TRV and PMTV viruses.

용어 "재조합"이란, 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.The term "recombinant" refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid. The recombinant cell can express a gene or a gene fragment that is not found in the natural form of the cell in one of the sense or antisense form. Recombinant cells can also express genes found in natural cells, but the genes have been modified and reintroduced into cells by artificial means.

용어 "발현 벡터"란, 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.The term “expression vector” refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and an appropriate nucleic acid sequence essential for expressing a coding sequence operably linked in a particular host organism. Promoters, enhancers, termination signals and polyadenylation signals available in eukaryotic cells are known.

여기서, 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens FA et al., Nature296,72-74,1982;NegrutiuIetal.,PlantMol.Biol.8,363-373,1987),원형질체의 전기천공법(Shillito RD et al., Bio / Technol.3,1099-1102,1985),식물 요소로의 현미주사법(Crossway A et al., Mol . Gen . Genet.202,179-185,1986),각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein TM et al., Nature327,70,1987),식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0,301,316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터(binary vector) 기술을 이용하는 것이다.Here, the transformation of a plant means any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily have a period of regeneration and / or tissue culture. Transformation of plant species is now common for plant species, including both dicotyledonous plants as well as monocotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce hybrid DNA according to the invention into suitable progenitor cells. Method calcium / polyethylene glycol method for protoplasts (Krens FA et al, Nature 296,72-74,1982 ;.. NegrutiuIetal, PlantMol.Biol .8,363-373,1987), electroporation of protoplasts (Shillito RD et al ., Bio / Technol. 3,1099-1102,1985), microscopic injection into plant elements (Crossway A et al., Mol . Gen. Genet . 202,179-185,1986), (DNA or RNA- Coated) particle bombardment (Klein TM et al., Nature 327,70,1987), (incomplete) virus in Agrobacterium tumerfaciens mediated gene transfer by plant infiltration or transformation of mature pollen or vesicles By infection (EP 0,301,316) and the like. Preferred methods according to the invention include Agrobacterium mediated DNA delivery. Especially preferred is the use of the so-called binary vector technology as described in EP A 120 516 and US Pat. No. 4,940,838.

본 발명의 바이러스 저항성 감자 품종은 Vales Sovereign 인 것이 바람직하며, 형질전환 감자 계통명은 예를 들어 1000-101-OUT16(YLRATRPM-101-OUT16), 1000-101-OUT28(YLRATRPM-101-OUT28), 1000-101-OUT54(YLRATRPM-101-OUT54), 1000-4-11-IN19(1000-4-11-IN19), 600-102-6-IN34(YLRA-102-6-IN34), 600-102-6-IN38(YLRA-102-6-IN38) 및 600-102-6-IN39(YLRA-102-6-IN39)이다.The virus resistant potato variety of the present invention is preferably Vales Sovereign, and the transgenic potato strains are, for example, 1000-101-OUT16 (YLRATRPM-101-OUT16), 1000-101-OUT28 (YLRATRPM-101-OUT28), 1000 -101-OUT54 (YLRATRPM-101-OUT54), 1000-4-11-IN19 (1000-4-11-IN19), 600-102-6-IN34 (YLRA-102-6-IN34), 600-102- 6-IN38 (YLRA-102-6-IN38) and 600-102-6-IN39 (YLRA-102-6-IN39).

또한, 형질전환 감자의 게놈에 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자가 삽입되었는지 확인하기 위하여 서던브롯(Southern blot) 분석을 이용하였다.In addition, Southern blot analysis was used to determine whether the YLRATRPM gene or the YLRA gene was inserted into the genome of the transgenic potato.

상기 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자가 도입된 감자의 바이러스 감염에 대한 저항성은 각각의 형질전환 식물체로부터 도입 바이러스 특이 siRNA 생산 여부를 분석하는 노던블롯(Northern blot) 분석과, PVY-O, PVY-N, PLRV, PVA를 형질전환 감자에 인공접종과 진딧물 전염 방법을 통하여 전염시킨 후 형질전환 감자 식물체가 저항성을 발현하는 것을 확인하였다.Resistance of the YLRATRPM gene or potato to which the YLRA gene is introduced is resistant to viral infection by Northern blot analysis, which analyzes whether the virus-specific siRNA is produced from each transgenic plant, and PVY-O, PVY-N, and PLRV. , PVA was transmitted to the transgenic potato through artificial inoculation and aphid transmission method, and the transgenic potato plants were confirmed to express resistance.

보다 구체적으로, 본 발명은 형질전환 감자로부터 DNA를 추출하여 서던블롯(Southern blot)으로 목적유전자의 삽입 여부를 확인하였으며, RNA를 추출하여 노던 블롯 분석으로 PVY, PLRV, PVA, TRV, PMTV 각각의 바이러스 유전자의 특이 프로브(probe)를 이용하여 siRNA를 검출함으로써, 형질전환 감자에 도입된 바이러스 유전자 발현에 의한 전사후유전자침묵현상(Post transcriptional gene silencing)으로 도입 바이러스 5종 또는 3종에 대하여 저항성을 확인할 수 있다.More specifically, the present invention extracted DNA from the transgenic potato to confirm whether the target gene is inserted into the Southern blot (Southern blot), RNA extraction by Northern blot analysis of PVY, PLRV, PVA, TRV, PMTV each By detecting siRNA using a specific probe of a viral gene, resistance to 5 or 3 viruses introduced by post transcriptional gene silencing by viral gene expression introduced into transgenic potatoes. You can check it.

또한, 본 발명의 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법에 의해 제조된 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체를 제공할 수 있다.In addition, it is possible to provide a multi-virus resistant transgenic potato plant produced by the method for producing a multi-virus resistant transgenic potato plant of the present invention.

상기 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체는 감자를 감염시키는 주요 5종의 바이러스인 PVY, PLRV, PVA, TRV, PMTV 또는 이 중 선택되는 3종 바이러스인 PVY, PLRV, PVA에 대하여 저항성을 나타내며, 그에 따라 감자의 생산성 향상 효과를 가진다.The multi-virus resistant transgenic potato plant exhibits resistance against PVY, PLRV, PVA, TRV, PMTV or three selected viruses among the five major viruses infecting potatoes, PVY, PLRV, and PVA. It has the effect of improving the productivity of potatoes.

또한, 본 발명은 YLRATRPM 유전자를 선정한 각각의 바이러스 유전자 부위 및 염기서열을 제공한다.In addition, the present invention provides each viral gene region and sequence selected from the YLRATRPM gene.

PVY(Potato virus Y), PLRV(Potato leafroll virus), PVA(Potato virus A), TRV(Tobacco rattle virus) 및 PMTV(Potato mop-top virus) 각각으로부터 일부 유전자를 선정하여 융합하였으며, 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5에 나타내었다.Some genes were selected and fused from PVY (Potato virus Y), PLRV (Potato leafroll virus), PVA (Potato virus A), TRV (Tobacco rattle virus) and PMTV (Potato mop-top virus), respectively. , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 is shown.

또한, 본 발명은 YLRA 유전자는 서열번호 7에 나타냈으며, YLRA 유전자를 선정한 각각의 바이러스 유전자 부위 및 염기서열을 제공한다.In addition, the present invention provides the YLRA gene shown in SEQ ID NO: 7, and provides the respective viral gene region and base sequence for selecting the YLRA gene.

PVY(Potato virus Y), PLRV(Potato leafroll virus) 및 PVA(Potato virus A) 각각으로부터 일부 유전자를 선정하여 융합하였으며, 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3에 나타내었다.Some genes were selected and fused from PVY (Potato virus Y), PLRV (Potato leafroll virus) and PVA (Potato virus A), respectively, and are shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3, respectively.

이하에서, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하지만, 이러한 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다. 하기의 실시예는 본 발명의 범위 내에서 당업자에 의해 적절히 수정, 변경될 수 있다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but these Examples are intended to illustrate the present invention in more detail, whereby the scope of the present invention is not limited. The following examples can be appropriately modified and changed by those skilled in the art within the scope of the present invention.

[발명의 실시를 위한 형태][Mode for Carrying Out the Invention]

실시예Example 1: 융합유전자  1: fusion gene YLRATRPMYLRATRPM 및  And YLRAYLRA 의 of 클로닝Cloning

실시예Example 1-1 : 융합유전자  1-1: Fusion gene YLRATRPMYLRATRPM 의 of 클로닝Cloning

PVY 전장, PLRV 전장, PVA 전장, TRV RNA1및 PMTV RNA1 유전자가 각각 클로닝 된 클로닝 벡터의 플라스미드 DNA를 융합유전자 제작을 위한 주형으로 이용하였다 (참조: PVY (strain O, SCRI-O isolate; Barker et al., 2009), PLRV (Canadian isolate; Nurkiyanova et al., 2000), PVA (strain U; Paalme et al., 2004), PMTV (Swedish isolate; Savenkov et al., 2003) 및 TRV (isolate PpK20; Liu et al., 2002.)). 이로부터 PVY 외피단백질 200bp(8894-9093, GenBank accession no. NC_001616;서열번호 1), PLRV 외피단백질 200bp(3831-4030, GenBank accession no. AF453394;서열번호 2), PVA 원통형봉입체 200bp(4472-4671, GenBank accession no. Z21670;서열번호 3), TRV 복제효소 200bp(3427-3626, GenBank accession no. NC_003805; 서열번호 4), PMTV 복제효소 200bp(3411-3610, GenBank accession no. NC_003723; 서열번호 5)를 오버랩(overlap) PCR에 의해 융합하여 하나의 새로운 바이러스 유전자 YLRATRPM(1000bp)를 만들었다. 이때, 상기 오버랩 PCR에 이용한 프라이머(primer)를 표 1에 나타내었다. 상기 오버랩 PCR은 클로닝 벡터에 도입된 각 바이러스 플라스미드 DNA를 100ng을 주형으로 이용하였고, 5㎕의 10×PCR 완충액, 2㎕의 50 mM MgSO4,4㎕의 10 mM dNTP, 0.5㎕의 Taq DNA polymerase(Invitrogen, USA, Platinum Taq DNA polymerase high fidelity), 서열번호 8 내지 18의 프라이머를 각각 10uM로 이용하여,총 50㎕의 반응액에서 이루어졌다.The plasmid DNA of the cloning vector cloned with the full-length PVY, full-length PLRV, full-length PVA, TRV RNA1 and PMTV RNA1 genes was used as a template for constructing the fusion gene (see PVY (strain O, SCRI-O isolate; Barker et al.). , 2009), PLRV (Canadian isolate; Nurkiyanova et al., 2000), PVA (strain U; Paalme et al., 2004), PMTV (Swedish isolate; Savenkov et al., 2003) and TRV (isolate PpK20; Liu et al., 2002.)). From this PVY envelope protein 200bp (8894-9093, GenBank accession no.NC_001616; SEQ ID NO: 1), PLRV envelope protein 200bp (3831-4030, GenBank accession no. AF453394; SEQ ID NO: 2), PVA cylindrical inclusion 200bp (4472-4671 , GenBank accession no.Z21670; SEQ ID NO: 3), TRV transcriptase 200 bp (3427-3626, GenBank accession no.NC_003805; SEQ ID NO: 4), PMTV transcriptase 200 bp (3411-3610, GenBank accession no. NC_003723; SEQ ID NO: 5 ) Was fused by overlap PCR to make one new viral gene YLRATRPM (1000 bp). In this case, the primers used for the overlap PCR are shown in Table 1. In the overlap PCR, 100 ng of each virus plasmid DNA introduced into the cloning vector was used as a template, 5 μl of 10 × PCR buffer, 2 μl of 50 mM MgSO 4 , 4 μl of 10 mM dNTP, and 0.5 μl of Taq DNA polymerase. (Invitrogen, USA, Platinum Taq DNA polymerase high fidelity), using primers of SEQ ID NO: 8 to 18 in 10uM, respectively, was made in a total of 50μl reaction solution.

보다 구체적으로, 오버랩 PCR 방법은 PVY와 PLRV 주형을 넣은 후 서열번호 8과 서열번호 11 프라이머를 넣어 PCR 을 한 후 PVY와 PLRV이 합성된 PCR 산물을 Sepharose 컬럼(Sigma-Aldrich)를 이용하여 정제한다. PVY와 PLRV이 합성된 정제된 PCR 산물을 주형으로 서열번호 8과 서열번호 13을 넣어 PCR을 하여 PVY, PLRV와 PVA 가 합성된 PCR 산물을 얻는다. 한편 TRV와 PMTV 주형을 넣은 후 서열번호 15와 서열번호 18의 프라이머를 넣어 PCR 한 후 TRV와 PMTV가 합성된 PCR 산물을 Sepharose 컬럼(Sigma-Aldrich)를 이용하여 정제한다. PVY, PLRV와 PVA 가 합성된 PCR 산물과 TRV와 PMTV이 합성된 PCR 산물을 주형으로 서열번호 8과 서열번호 18의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 PVY, PLRV, PVA, TRV와 PMTV 가 합성된 융합유전자 YLRATRPM을 얻는다.More specifically, in the overlap PCR method, PCR is performed after putting the primers of SEQ ID NO. 8 and SEQ ID NO. . The PCR product synthesized with PVY, PLRV, and PVA was prepared by PCR using the purified PCR product synthesized with PVY and PLRV as a template. Meanwhile, after inserting the TRV and PMTV template, PCR was performed by adding primers of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 18, and the PCR product synthesized with TRV and PMTV was purified using Sepharose column (Sigma-Aldrich). PCR was carried out using primers of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 18 using a PCR product synthesized with PVY, PLRV and PVA and a PCR product synthesized with TRV and PMTV to synthesize PVY, PLRV, PVA, TRV and PMTV. Obtain the fusion gene YLRATRPM.

PCR 반응 조건은 92℃에서 2분 변성(denaturation) 반응후, 92℃에서 30초 변성(denaturation), 55℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 2분 연장(extention) 반응을 25회 반응시킨 후, 72℃에서 10분 반응시켰다.PCR reaction conditions were 2 minutes denaturation reaction at 92 ° C., 30 seconds denaturation at 92 ° C., 30 seconds annealing at 55 ° C., and 2 minutes extension reaction at 72 ° C. for 25 times. After making it react, it was made to react at 72 degreeC for 10 minutes.

상기 YLRATRPM 유전자의 DNA 서열은 본 출원과 동시에 제출하는 서열목록의 서열번호 6과 같다.The DNA sequence of the YLRATRPM gene is the same as SEQ ID NO: 6 in the sequence listing filed simultaneously with the present application.

Figure pct00001
Figure pct00001

상기 YLRATRPM 유전자를 발현벡터인 pK7GWIWG2(I) 벡터(Plant systems biology, 벨기에)에 삽입하였다. 상기 벡터 pK7GWIWG2(I)는 T-DNA의 오른쪽 경계(RB: right border)와 왼쪽 경계(LB: left border) 사이에 위치한 CaMV 35S 프로모터(promoter)와 CaMV 35S 터미네이터 사이에 인트론(intron)을 포함하고 있으며, 선발표지 유전자로 카나마이신 저항성 유전자를 가지고 있다. 또한 상기 벡터는 게이트웨이 클로닝(Gateway recombination cloning)이 가능하도록 인트론의 전과 후에 attR1과 attR2 카세트를 갖고 있다. 따라서 게이트웨이 시스템(Invitrogen사)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 본 발명의 YLRATRPM 유전자를 상기 벡터에 삽입하였으며(pK7GWIWG2(I))/YLRATRPM), 이때 벡터에 클로닝 가능 부위(CmR-ccdB)가 두 군데 존재하므로 YLRATRPM 유전자가 반대방향으로 반복 삽입됨으로써 RNA 전사 후 헤어핀구조(이중가닥 RNA 형태)가 되도록 하였다. 이때, 상기 벡터에 YLRATRPM 유전자 클로닝시 인트론을 중심으로 YLRATRPM 유전자를 antisense-intron-sense 방향으로 재조합 백터를 제작한 경우 OUT으로 명명하였으며, sense-intron-antisense 방향으로 재조합 백터를 제작한 경우 IN으로 명명하였다. 도 2의 (a)는 YLRATRPM 유전자를 pK7GWIWG2(I) 발현백터에 삽입하여 제작한 재조합 백터 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-OUT 및 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-IN의 구조를 나타낸 사진이다.The YLRATRPM gene was inserted into an expression vector pK7GWIWG2 (I) vector (Plant systems biology, Belgium). The vector pK7GWIWG2 (I) includes an intron between a CaMV 35S promoter and a CaMV 35S terminator located between a right border (RB) and a left border (LB) of the T-DNA. It has a kanamycin resistance gene as a selection marker gene. The vector also has attR1 and attR2 cassettes before and after the intron to allow gateway recombination cloning. Therefore, the YLRATRPM gene of the present invention was inserted into the vector using a gateway system (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol (pK7GWIWG2 (I)) / YLRATRPM). Since it is present, the YLRATRPM gene is repeatedly inserted in the opposite direction so that the hairpin structure (double stranded RNA form) after RNA transcription is obtained. At this time, when cloning the YLRATRPM gene in the vector, the YLRATRPM gene was named OUT when the recombinant vector was produced in the antisense-intron-sense direction, and IN when the recombinant vector was produced in the sense-intron-antisense direction. It was. Figure 2 (a) is a photograph showing the structure of the recombinant vector pK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM-OUT and pK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM-IN produced by inserting the YLRATRPM gene into the pK7GWIWG2 (I) expression vector.

실시예Example 1-2 : 융합유전자  1-2: fusion gene YLRAYLRA 의 of 클로닝Cloning

PVY 전장, PLRV 전장 및 PVA 전장 유전자가 각각 클로닝 된 클로닝 벡터의 플라스미드 DNA를 융합유전자 제작을 위한 주형으로 이용하였다. 이로부터 PVY 외피단백질200bp(8894-9093, GenBank accession no. NC_001616;서열번호 1), PLRV 외피단백질 200bp(3831-4030, GenBank accession no. AF453394;서열번호 2) 및 PVA 원통형봉입체 200bp(4472-4671, GenBank accession no. Z21670;서열번호 3)를 증폭하도록 제작한 프라이머를 이용하여 오버랩(overlap) PCR에 의해 융합하여 하나의 새로운 바이러스 유전자 YLRA(600bp)를 만들었다. 이때, 상기 오버랩 PCR에 이용한 프라이머(primer)를 표 1에 서열목록 8 내지 14로 나타내었다. 보다 구체적으로, 상기오버랩 PCR 방법은 PVY와 PLRV 주형을 넣은 후 서열번호 8과 서열번호 11 프라이머를 넣어 PCR을 한 후 PVY와 PLRV이 합성된 PCR 산물을 Sepharose 컬럼(Sigma-Aldrich)를 이용하여 정제한다. PVY와 PLRV이 합성된 정제된 PCR 산물을 주형으로 서열번호 8과 서열번호 13을 넣어 PCR을 하여 PVY, PLRV와 PVA 가 합성된 융합유전자 YLRA을 얻는다.The plasmid DNA of the cloning vector cloned with the full-length PVY, full-length PLRV and full-length PVA genes was used as a template for the production of the fusion gene. From this PVY envelope protein 200bp (8894-9093, GenBank accession no.NC_001616; SEQ ID NO: 1), PLRV envelope protein 200bp (3831-4030, GenBank accession no. AF453394; SEQ ID NO: 2) and PVA cylindrical inclusion 200bp (4472-4671 , GenBank accession no.Z21670; SEQ ID NO: 3) using a primer prepared to amplify by overlap (overlap) PCR to create a new viral gene YLRA (600bp). In this case, primers used for the overlap PCR are shown in Table 1 as SEQ ID NOS: 8 to 14. More specifically, in the overlap PCR method, the PCR product after the addition of the primers SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 11 after the PVY and PLRV template was purified using a Sepharose column (Sigma-Aldrich) synthesized PVY and PLRV do. The purified PCR product synthesized with PVY and PLRV was put into SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 13 as a template to obtain a fusion gene YLRA synthesized with PVY, PLRV and PVA.

PCR 반응 조건은 92℃에서 2분 변성(denaturation) 반응후, 92℃에서 30초 변성(denaturation), 55℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 2분 연장(extention) 반응을 25회 반응시킨 후, 72℃에서 10분 반응시켰다.PCR reaction conditions were 2 minutes denaturation reaction at 92 ° C., 30 seconds denaturation at 92 ° C., 30 seconds annealing at 55 ° C., and 2 minutes extension reaction at 72 ° C. for 25 times. After making it react, it was made to react at 72 degreeC for 10 minutes.

상기 YLRA 유전자의 DNA 서열은 본 출원과 동시에 제출하는 서열목록의 서열번호 7과 같다.The DNA sequence of the YLRA gene is the same as SEQ ID No. 7 in the sequence listing filed simultaneously with the present application.

상기 YLRA 유전자를 발현벡터인 pK7GWIWG2(I) 벡터(Plant systems biology, 벨기에)에 삽입하였다. 상기 벡터 pK7GWIWG2(I)는 T-DNA의 오른쪽 경계(RB: right border)와 왼쪽 경계(LB: left border) 사이에 위치한 CaMV 35S 프로모터(promoter)와 CaMV 35S 터미네이터 사이에 인트론(intron)을 포함하고 있으며, 선발표지 유전자로 카나마이신 저항성 유전자를 가지고 있다. 또한 상기 벡터는 게이트웨이 클로닝(Gateway recombination cloning)이 가능하도록 인트론의 전과 후에 attR1과 attR2 카세트를 갖고 있다. 따라서 게이트웨이 시스템(Invitrogen사)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 본 발명의 YLRA 유전자를 상기 벡터에 삽입하였으며(pK7GWIWG2(I))/YLRA), 이때 벡터에 클로닝 가능 부위(CmR-ccdB)가 두 군데 존재하므로 YLRA 유전자가 반대방향으로 반복 삽입됨으로써 RNA 전사 후 헤어핀구조(이중가닥 RNA 형태)가 되도록 하였다. 이때, 상기 벡터에 YLRATRPM 유전자 클로닝시 인트론을 중심으로 YLRA 유전자를 antisense-intron-sense 방향으로 재조합 백터를 제작한 경우 OUT으로 명명하였으며, sense-intron-antisense 방향으로 재조합 백터를 제작한 경우 IN으로 명명하였다.The YLRA gene was inserted into the expression vector pK7GWIWG2 (I) vector (Plant systems biology, Belgium). The vector pK7GWIWG2 (I) includes an intron between a CaMV 35S promoter and a CaMV 35S terminator located between a right border (RB) and a left border (LB) of the T-DNA. It has a kanamycin resistance gene as a selection marker gene. The vector also has attR1 and attR2 cassettes before and after the intron to allow gateway recombination cloning. Therefore, the YLRA gene of the present invention was inserted into the vector using a gateway system (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol (pK7GWIWG2 (I)) / YLRA), wherein the vector has a cloning site (CmR-ccdB). Since the YLRA gene is repeatedly inserted in the opposite direction, the YLRA gene is present in the hairpin structure (double stranded RNA form) after RNA transcription. In this case, when the recombinant vector was produced in the antisense-intron-sense direction of the YLRA gene centered on the intron during cloning of the YLRATRPM gene, the vector was named OUT. In the case of producing the recombinant vector in the sense-intron-antisense direction, it was named IN. It was.

도 2의 (b)는 YLRA 유전자를 pK7GWIWG2(I) 발현백터에 삽입하여 제작한 재조합 백터 pK7GWIWG2(I)/YLRAM-OUT 및 pK7GWIWG2(I)/YLRA-IN의 구조를 나타낸 사진이다.Figure 2 (b) is a photograph showing the structure of the recombinant vector pK7GWIWG2 (I) / YLRAM-OUT and pK7GWIWG2 (I) / YLRA-IN prepared by inserting the YLRA gene into the pK7GWIWG2 (I) expression vector.

상기 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자를 발현벡터인 pK7GWIWG2(I) 벡터에 삽입한 것을 확인하기 위하여 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-IN, pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-OUT, pK7GWIWG2(I)/YLRA-IN과 pK7GWIWG2(I)/YLRA-OUT 클론을 HindIII 제한효소로 처리한 후, 전기영동하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. (레인1: pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-IN(867, 976, 1597 bp의 절단 패턴); 레인2-3: pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-OUT(667, 776, 1797 bp의 절단 패턴); 레인 4-5: pK7GWIWG2(I)/YLRA-IN(467, 576, 1597 bp의 절단 패턴); 레인 6-7: pK7GWIWG2(I)/YLRA-OUT(667, 776, 1397 bp의 절단 패턴)).PK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM-IN, pK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM-OUT, pK7GWIWG2 (I) / YLRA-IN and pK7GWIWG (I) / YLRA-OUT clones were treated with HindIII restriction enzymes, followed by electrophoresis, and the results are shown in FIG. 3. (Lane 1: pK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM-IN (867, 976, 1597 bp cleavage pattern); lanes 2-3: pK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM-OUT (667, 776, 1797 bp cleavage pattern); 4-5: pK7GWIWG2 (I) / YLRA-IN (cleavage pattern of 467, 576, 1597 bp); lanes 6-7: pK7GWIWG2 (I) / YLRA-OUT (cleavage pattern of 667, 776, 1397 bp)).

실시예Example 2:  2: YLRATRPMYLRATRPM 유전자 또는  Gene or YLRAYLRA 유전자가 삽입된 아그로박테리움(Agrobacterium containing the gene ( AgrobacteriumAgrobacterium )과 감자 조직의 ) And potato tissue 공존배양Coexistence Culture 및 형질전환체의 유기 And organic of the transformant

상기 실시예 1에서 제작된 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM벡터 또는 pK7GWIWG2(I)/YLRA벡터를 각각 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404에 도입한 다음 줄기 절편 형질전환법을 이용하여 감자(품종: Vales Sovereign)를 형질전환시켰다(Joung et al., 1996). 상기 아그로박테리움을 접종하기 전, 감자 줄기는 NAA(naphthalene acetic acid) 10mg/L, BA 10mg/L CaCl21 47mg/L, NH4NO3 80mg/L를 포함한 MS 배지(Murasighe ＆ Skoong medium)에 24시간 동안 전처리 한 다음 아그로박테리움균 현탁액에 20분간 침지하였다. 아그로박테리움균이 접종된 줄기는 2.4-D(2.4-dichloro phenoxy acetic acid)가 2 mg/L 첨가된 MS 배지에서 48시간 동안 암상태에서 배양하였다. 암배양이 끝난 후 캘러스 유도를 위하여 선발 항생제(카나마이신)가 포함되지 않은 MS배지(NAA 0.1mg/L, Zeatin 2.0mg/L, GA 0.01 mg/L, 세포탁심 250 mg/L)에서 2주 동안 배양하여 캘러스가 유도되면 카나마이신 40 ㎍/ml을 포함한 MS 배지에 옮겨서 감자를 재분화시켰다. 재분화 식물체가 1.5cm 정도 자라면 분리하여 생육시켰다. 형질전환 감자를 배양하는 조직배양실 광조건은 16시간이었으며 온도는 25℃를 유지하였다. 형질전환 감자는 온실에서 성장시킨 다음, 형질전환된 유전자의 삽입여부와 바이러스 저항성 유무를 분석하였다.The pK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM vector or pK7GWIWG2 (I) / YLRA vector prepared in Example 1 was introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404, and then potato (cultivar varieties) using stem fragment transformation method. : Vales Sovereign) was transformed (Joung et al., 1996). Before inoculating the Agrobacterium, potato stems were prepared with MS medium (Murasighe & Skoong medium) including 10 mg / L of naphthalene acetic acid (NAA), 10 mg / L of CaCl 2 1 47 mg / L, and NH 4 NO 3 80 mg / L. It was pretreated for 24 hours and then immersed in Agrobacterium suspension for 20 minutes. Agrobacterium-inoculated stems were incubated for 48 hours in MS medium containing 2.4 mg (2 mg / L) of 2.4-D (2.4-dichloro phenoxy acetic acid). 2 weeks in MS medium (NAA 0.1mg / L, Zeatin 2.0mg / L, GA 0.01mg / L, Cytotaxime 250mg / L) without selection antibiotics (Kanamycin) for induction of callus after cancer culture When the callus was induced by culturing, the potato was re-differentiated by transferring to MS medium containing 40 µg / ml of kanamycin. When the regenerated plants grew about 1.5 cm, they were grown separately. Tissue culture room for culturing transgenic potatoes was 16 hours and the temperature was maintained at 25 ℃. Transgenic potatoes were grown in greenhouses, and then analyzed for insertion of transformed genes and virus resistance.

실시예Example 3: 형질전환체의 확인 3: identification of transformants

3-1. 3-1. 서던블롯Southern Blot 분석( analysis( SouthernSouthern blottingblotting ))

먼저 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자가 감자식물체의 게놈에 삽입되었는지 확인하기 위하여 DNeasy kit(Qiagen사)를 이용하여 실시예 2의 형질전환 감자로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 얻어진 게놈 DNA 25 ㎍를 제한효소 EcoRI으로 처리하여 절단한 후, 1％ 아가로즈 겔에서 25V로 17시간 동안 전기영동하였다 (0.5X TBE 버퍼 사용). 상기 겔 상의 게놈 DNA를 나일론 멤브레인(nylon Hybond™-N+membrane, AmershamLifescience사)에 모세관 전이 방법으로 블롯팅한 후, 상기 멤브레인 상에 블롯팅된 DNA 단편에, PVY, PLRV 및 PVA 유전자가 각각 200bp 씩 연결된 600bp 유전자(YLRA)를 RedyprimeII™RandomPrimedlabelingSystem (AmershamLifescience사)을 사용하여 표지(labeling)한 유전자 단편을 프로브로 이용하여 혼성화(hybridization)를 수행하였다. 상기 혼성화 및 멤브레인 세척은 공지된 표준 방법에 따라 수행하였으며, BAS-1800II Bio-Imaging analyzer(Fujifilm)을 사용하여 프로브 인식을 수행하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.First, genomic DNA was extracted from the transgenic potato of Example 2 using DNeasy kit (Qiagen) to confirm whether the YLRATRPM gene or YLRA gene was inserted into the genome of the potato plant. Restriction enzyme with 25 µg of the obtained genomic DNA After digestion with Eco RI, digestion was carried out on 1% agarose gel at 25 V for 17 hours (using 0.5X TBE buffer). The genomic DNA on the gel was blotted to a nylon membrane (nylon Hybond ™ -N + membrane, Amersham Lifescience Co., Ltd.) by capillary transfer method, and the DNA fragments blotted onto the membrane were each 200bp of PVY, PLRV and PVA genes. Hybridization was carried out using a gene fragment labeled with a 600 bp gene (YLRA) that had been linked with a Redyprime II ™ Random Primed labeling System (Amersham Lifescience, Inc.) as a probe. The hybridization and membrane washing were performed according to a known standard method, and probe recognition was performed using a BAS-1800II Bio-Imaging analyzer (Fujifilm), and the results are shown in FIG. 4.

도 4에 나타난 바와 같이, 형질전환 감자식물체 1 내지 7(각각 1 : 1000-101-OUT16 계통, 2 : 1000-101-OUT28 계통, 3: 1000-101-OUT54 계통, 4 : 1000-4-11-OUT19계통, 5 : 600-102-6-IN34 계통, 6 : 600-102-6-IN38 계통, 7 : 600-102-6-IN39 계통)은 모두 상기 600 bp 프로브로 인식되었으므로, 상기 형질전환 감자식물체 1 내지 7의 게놈에는 본 발명의 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자가 삽입되었음을 알 수 있다.As shown in Figure 4, transgenic potato plants 1 to 7 (1: 1000-101-OUT16 strain, 2: 1000-101-OUT28 strain, 3: 1000-101-OUT54 strain, 4: 1000-4-11, respectively) -OUT19 line, 5: 600-102-6-IN34 line, 6: 600-102-6-IN38 line, 7: 600-102-6-IN39 line) are all recognized as the 600 bp probe, so the transformation It can be seen that the YLRATRPM gene or YLRA gene of the present invention is inserted into the genomes of potato plants 1 to 7.

3-2. 3-2. 노던블롯Northern Blot 분석( analysis( NorthernNorthern blottingblotting ))

pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM-OUT 벡터 또는 pK7GWIWG2(I)/YLRA-IN 벡터로 형질전환시킨 형질전환 감자식물체에서 YLRATRPM 유전자 또는 YLRA 유전자의 전사도(transcription level)를 알아보고자 하였다.The transcription level of YLRATRPM gene or YLRA gene in transgenic potato plants transformed with pK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM-OUT vector or pK7GWIWG2 (I) / YLRA-IN vector was investigated.

실시예 2의 조건으로 배양한 감자식물체의 잎 0.5g을 액체질소를 이용하여 마쇄한 후 Trizol(Invitrogen사)을 이용하여 전체 RNA를 추출분리하고, 42％ urea를 포함한 12％ PAGE 겔(arylamide:bis=19:1)에서 0.5× TBE 완충액을 이용하여 100 V로 2시간 동안 전기영동을 수행하였으며, 상기 겔 상의 RNA를 Hybond N+ 멤브레인에 전이시켰다 (250 mA, 1시간 가량).0.5 g of the leaves of potato plants incubated under the conditions of Example 2 were crushed with liquid nitrogen, followed by extraction and separation of total RNA using Trizol (Invitrogen), and a 12% PAGE gel containing 42% urea (arylamide: Electrophoresis was performed for 2 hours at 100 V using 0.5 × TBE buffer in bis = 19: 1) and RNA on the gel was transferred to Hybond N + membrane (250 mA, about 1 hour).

혼성화를 위한 프로브의 제조에 있어, PVY및 TRV 각각에 대한 프로브의 제조에서는 pGEMT-easy 벡터(Promega사)에 클로닝된 PVY 200bp및 TRV 200bp 유전자를 SalI 제한효소로 선형화시킨 DNA를 주형으로 SP6 RNA polymerase를 첨가하고; 또한 PLRV, PVA및 PMTV각각에 대한 프로브의 제조에서는 pGEMT-easy 벡터에 클로닝된 PLRV 200bp, PVA 200bp및 PMTV 200bp 유전자를 NcoI 제한효소로 선형화시킨 DNA를 주형으로 T7 RNA polymerase를 첨가하였으며; 이들 모두 DIG-표지된 dNPT mixture(digozigenin-labeled dNTP mixture, Roche)와 반응시켜 제조사의 프로토콜에 따라 제조하였다.In the preparation of the probe for hybridization, in the preparation of the probes for PVY and TRV, respectively, the SP6 RNA was used as a template of DNA obtained by linearizing the PVY 200bp and TRV 200bp genes cloned into pGEMT-easy vector (Promega) with Sal I restriction enzyme. adding polymerase; In addition, in the preparation of probes for PLRV, PVA and PMTV, T7 RNA polymerase was added as a template of DNA linearized with Nco I restriction enzyme, which was cloned into PGEV-easy vector, PLRV 200bp, PVA 200bp and PMTV 200bp genes; All of them were reacted with a DIG-labeled dNPT mixture (digozigenin-labeled dNTP mixture, Roche) and prepared according to the manufacturer's protocol.

혼성화는, 상기 멤브레인을 43℃에서 2시간 동안 ULTRAhyb 용액(Ambion사)을 이용하여 전혼성화(prehybridization) 후 특이 프로브를 첨가한 후 하룻밤동안 수행하였다. 상기 멤브레인의 세척은, 45℃에서 2％ SDS를 포함한 2 ×SSC 버퍼로 15분간 2회 세척 후, 0.1X SSC 버퍼에서 15분간 2회 세척하였으며, 상온에서 0.3％의 Tween20과 0.15M NaCl을 포함한 0.1M 말레산(Maleic acid, pH7.5) 버퍼를 이용하여 15분간 2회 세척하였다. 프로브 인식을 위하여 1X 블로킹(blocking) 버퍼(Roche)를 이용하여 1시간 동안 처리 후 동일 용액에 4 ㎕의 Anti-Digoxigenin-AP Fab fragment(Roche)를 첨가하여 2시간 처리하고, 그 후 0.3％의 Tween20과 0.15M NaCl이 첨가된 0.1M 말레산(pH 7.5) 버퍼를 이용하여 20분간 2회 세척한 뒤 필름(Fujifilm사)에 노출시켰다.Hybridization was performed overnight at 43 ° C. after the addition of specific probes after prehybridization with ULTRAhyb solution (Ambion) for 2 hours. The membrane was washed twice for 15 minutes with 2 × SSC buffer containing 2% SDS at 45 ° C., and then washed twice for 15 minutes in 0.1 × SSC buffer, containing 0.3% Tween20 and 0.15M NaCl at room temperature. Washing was performed twice for 15 minutes using 0.1 M maleic acid (pH 7.5) buffer. After probe treatment for 1 hour using a 1X blocking buffer (Roche) for the probe recognition, 4 μl of Anti-Digoxigenin-AP Fab fragment (Roche) was added to the same solution for 2 hours, followed by 0.3% Tween20 and 0.15 maleic acid (pH 7.5) to which 0.15M NaCl was added were washed twice for 20 minutes and then exposed to a film (Fujifilm).

도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 형질전환 감자식물체 1, 2, 3 및 4(각각 1 : 1000-101-OUT16 계통, 2 : 1000-101-OUT28 계통, 3: 1000-101-OUT54 계통 및 4 : 1000-4-11-OUT19계통)은 모두 상기 프로브들로 인식되었으므로, 상기 형질전환 감자식물체 1, 2, 3 및 4 모두에서 PVY, PLRV, PVA, TRV 및 PMTV 유전자가 모두 전사되었음을 알 수 있며, 본 발명의 형질전환 감자식물체 5, 6 및 7(5 : 600-102-6-IN34 계통, 6 : 600-102-6-IN38 계통, 7 : 600-102-6-IN39 계통)는 PVY, PLRV, PVA 프로브들로 인식되었으므로, 형질전환 감자식물체 5, 6 및 7에서 PVY, PLRV 및 PVA 유전자가 전사되었음을 알 수 있었다.As shown in Figure 5, transgenic potato plants 1, 2, 3 and 4 of the present invention (1: 1000-101-OUT16 strain, 2: 1000-101-OUT28 strain, 3: 1000-101-OUT54 strain and 4: 1000-4-11-OUT19 line) were all recognized as the probes, it can be seen that all the PVY, PLRV, PVA, TRV and PMTV genes were transcribed in all of the transgenic potato plants 1, 2, 3 and 4 In the transformed potato plants 5, 6 and 7 of the present invention (5: 600-102-6-IN34 strain, 6: 600-102-6-IN38 strain, 7: 600-102-6-IN39 strain) are PVY Since it was recognized as PLRV, PVA probes, it was found that the PVY, PLRV and PVA genes were transcribed in transgenic potato plants 5, 6 and 7.

3-3. 3-3. 웨스턴블롯Western Blot 분석( analysis( WesternWestern blottingblotting ))

상기 실시예 2의 조건으로 형질전환된 감자 식물체의 바이러스 저항성 검정을 위하여, 웨스턴블롯 분석을 이용하였다. 분리젤(separating gel)은 0.1％ SDS를 포함하는 0.375M Tris-HCl, pH 8.8를 넣어 12.5％ 아크릴아마이드(arylamide:bis=29:1) 농도로 만들었으며, 스태킹 젤(stacking 젤)은 0.1％ SDS을 포함하는 0.125 M Tris-HCl, pH 6.8을 이용하여 5％ acrylamide(arylamide:bis=29.1) 농도로 SDS-PAGE 겔을 제조하였다.Western blot analysis was used for the virus resistance assay of potato plants transformed under the conditions of Example 2. Separating gel was prepared by adding 0.375M Tris-HCl containing 0.1% SDS, pH 8.8 to 12.5% acrylamide (arylamide: bis = 29: 1) concentration, and stacking gel 0.1%. SDS-PAGE gels were prepared at 5% acrylamide (arylamide: bis = 29.1) concentration using 0.125 M Tris-HCl, pH 6.8 with SDS.

실시예 2로부터 제조된 형질전환된 감자 식물체의 잎 0.3g을 300㎕의 1× PBS 완충액을 이용하여 마쇄한 후, 상층액을 5× sample 완충액(60 mM Tris-HCl pH 6.8, 25％ glycerol, 2％ SDS, 14.4 mM 2-mercaptoethanl and 0.1％ bromophenol blue)과 혼합하여 5분 동안 끊인 후, 상기 준비한 SDS-PAGE 젤에 로딩하여, running 완충액(25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine, 0.1％ SDS)으로 100 볼트에서 1시간 30분 동안 전개하였다. 전개된 단백질은 250 mM에서 1 시간 동안 SDS가 포함되지 않은 running 완충액을 이용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전이하였다.0.3 g of the leaves of the transformed potato plants prepared in Example 2 were ground using 300 μl of 1 × PBS buffer, and then the supernatant was washed with 5 × sample buffer (60 mM Tris-HCl pH 6.8, 25% glycerol, 2% SDS, 14.4 mM 2-mercaptoethanl and 0.1% bromophenol blue) was mixed for 5 minutes, loaded onto the prepared SDS-PAGE gel, and loaded with running buffer (25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine, 0.1% SDS). ) Was developed at 100 volts for 1 hour 30 minutes. The developed protein was transferred to the nitrocellulose membrane using SDS-free running buffer at 250 mM for 1 hour.

PVY, PLRV, PVA와 TRV 특이항체는 각각 PVGB(SWU, Korea), ATCC PVAS-649, PVAS-266T와 ATCC PVAS-820로부터 구입하여 이용하였다, 2차 항체는 다클론 특이 항체를 이용한 경우에는 Anti-rabbit IgG(H＆L) AP conjugate, 단클론 특이 항체를 이용한 경우에는 anti-Mouse IgG (H＆L) AP conjugate(Promega, USA)를 이용하였다. 발색을 위해서는 NBT/BCIP(Sigma)를 이용하였다.PVY, PLRV, PVA and TRV specific antibodies were purchased from PVGB (SWU, Korea), ATCC PVAS-649, PVAS-266T and ATCC PVAS-820, respectively. In the case of -rabbit IgG (H & L) AP conjugate and monoclonal specific antibody, anti-Mouse IgG (H & L) AP conjugate (Promega, USA) was used. NBT / BCIP (Sigma) was used for color development.

실시예Example 4: 형질전환된  4: transformed 감자식물체의Potato plant 바이러스 저항성 조사 Virus resistance investigation

바이러스 저항성 정도를 확인하기 위하여, 상기 식물체의 7계통(각각 1000-101-OUT16 계통, 1000-101-OUT28 계통, 1000-101-OUT54 계통, 1004-4-11-OUT19계통, 600-102-6-IN34 계통, 600-102-6-IN38 계통 및 600-102-6-IN39 계통) 및 음성대조군으로 형질전환시키지 않은 감자 Vales Sovereign 품종에 진딧물을 이용한 바이러스 전염을 시켰다. 진딧물 전염 방법은 PVY-O, PVY-N와 PVA의 경우 복숭아혹진딧물 2령충을 3시간 동안 굶긴 후 각각의 바이러스를 증식시킨 감자 잎에 올려 놓아서 5분 동안 바이러스를 취득하게 하고, 바이러스를 취득한 진딧물을 검정하고자 하는 감자 한그루 당 10마리씩 옮겨서 바이러스를 전염시켰다. PVY-O+PVA 접종은 PVY-O와 PVA에 중복감염된 감자에 진딧물을 옮겨 놓아서 바이러스를 취득하도록 하였다. PLRV 진딧물 전염 방법은 PLRV에 감염된 땅꽈리에 복숭아혹진딧물을 3일동안 올려놓아서 바이러스를 취득하게 한 후, 바이러스를 취득한 진딧물을 감자 한 그루당 10마리씩 옮겨 놓는 방법으로 바이러스를 전염시켰다. 다음 1달 경과 후의 감염 정도(RT-PCR 이용) 및 저항성을 조사하여 하기 표 3 및 도 6에 나타내었다.In order to check the degree of virus resistance, the seven strains of the plant (1000-101-OUT16 strain, 1000-101-OUT28 strain, 1000-101-OUT54 strain, 1004-4-11-OUT19 strain, 600-102-6, respectively) -IN34 strains, 600-102-6-IN38 strains and 600-102-6-IN39 strains) and potato Vales not transformed with the negative control Sovereign varieties were infected with aphid virus. Aphid transmission methods are PVY-O, PVY-N, and PVA in which 2 worms of peach or aphids are starved for 3 hours and placed on a leaf of potato that has grown each virus to acquire the virus for 5 minutes. The virus was transferred by transferring 10 eggs per potato to be tested. Inoculation of PVY-O + PVA was performed by transferring aphids to potatoes infected with PVY-O and PVA. The PLRV aphid transmission method spreads the virus by placing peach hump aphids on PLRV infected groundworms for 3 days to acquire the virus, and then transferring the virus aphids every 10 potatoes. The infection degree (using RT-PCR) and resistance after 1 month elapsed were examined and shown in Table 3 and FIG. 6.

이때, 바이러스 접종 후 감염 여부를 확인하기 위한 수단으로 PVY의 경우 웨스턴 블롯분석을 이용하였으며, PLRV와 PVA의 경우 RT-PCR을 이용하였다. 상기 RT-PCR에 이용한 프라이머를 표 2에 나타내었다. 역전사반응은 1㎕의 10 uM 리버스 primer와 1 ㎕의 RNA를 넣고 멸균수를 넣어 총 부피 10㎕의 반응액을 70℃에서 10 분간 반응시킨 후 2㎕의 10× PCR 버퍼, 2㎕ 의 25 mM MgCl2,2㎕ 의 2.5 mM dNTPs and 1㎕ of ImProm-II reverse transcriptase(Promega, USA)를 넣은 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PCR 반응은 20㎕의 RT 반응액, 5㎕의 10× PCR 완충액, 2㎕의 50 mM MgSO4,4㎕의 10 mM dNTP, 0.5㎕의 Taq DNA polymerase(Invitrogen, USA, Platinum Taq DNA polymerase high fidelity), 프라이머로는 각각 서열번호 21의 포워드 프라이머 및 서열번호 22의 리버스 프라이머를 이용하거나, 서열번호 23의 포워드 프라이머 및 서열번호 24의 리버스 프라이머를 이용하며, 각각 10uM 프라이머 1㎕, 0.5 ㎕의 Taq DNA polymerase(Roche, USA)를 총 50㎕의 반응액에서 이루어졌다. PCR 반응은 92℃ 변성(denaturation)단계 2분 후, 92℃ 30초, 52℃ 어닐링(annealing)단계 30초, 72℃ 연장(elongation)단계 1분 반응을 30회 시킨 후 마지막으로 72℃ 10분 반응시켰다.At this time, Western blot analysis was used for PVY, and RT-PCR was used for PLRV and PVA as a means for checking the infection after virus inoculation. The primers used for the RT-PCR are shown in Table 2. Reverse transcription reaction was performed by adding 1 µl of 10 uM reverse primer and 1 µl of RNA and adding sterile water to react 10 µl of the total volume of the reaction solution at 70 ° C. for 10 minutes, followed by 2 µl of 10 × PCR buffer and 2 µl of 25 mM. MgCl 2 , 2 μl of 2.5 mM dNTPs and 1 μl of ImProm-II reverse transcriptase (Promega, USA) were added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. PCR reactions were 20 μl RT reaction solution, 5 μl 10 × PCR buffer, 2 μl 50 mM MgSO 4 , 4 μl 10 mM dNTP, 0.5 μl Taq DNA polymerase (Invitrogen, USA, Platinum Taq DNA polymerase high fidelity) For primers, a forward primer of SEQ ID NO: 21 and a reverse primer of SEQ ID NO: 22 are used, or a forward primer of SEQ ID NO: 23 and a reverse primer of SEQ ID NO: 24, respectively, 1 μl of 10 uM primer and 0.5 μl of Taq, respectively. DNA polymerase (Roche, USA) was made in a total of 50ul reaction solution. PCR reaction was performed after 2 minutes of 92 ° C denaturation step, 92 ° C 30 seconds, 52 ° C annealing step 30 seconds, 72 ° C elongation step 1 minute, 30 times and finally 72 ° C 10 minutes Reacted.

Figure pct00002
Figure pct00002

표 3에서 PVY-O, PVY-N는 각각 바이러스 분리주를 나타낸다.In Table 3, PVY-O and PVY-N represent virus isolates, respectively.

표 3 및 도 5에 나타난 바와 같이, 모든 접종 바이러스에서, 형질전환된 식물체의 저항성(저항성={(검정된 식물의 수-감염된 식물의 수)/검정된 식물의 수})이 형질전환되지 않은 식물체(대조군)에 비해 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.As shown in Table 3 and FIG. 5, in all inoculated viruses, the resistance of the transformed plant (resistance = {(number of infected plants-number of infected plants) / number of tested plants}) was not transformed. It was confirmed that the increase significantly compared to the plant (control).

따라서, 저항성을 나타내는 형질전환된 감자식물체는 음성 대조군에 비해 상기 바이러스들에 대해 큰 저항성을 나타내었다. 또한 PLRV를 접종한 형질전환 감자식물체의 경우, 계통에 따라 감염 정도 및 저항성에서 차이를 나타내었다.Thus, the transformed potato plants exhibiting resistance showed greater resistance to the viruses than the negative control. In addition, the transgenic potato plants inoculated with PLRV showed a difference in the degree of infection and resistance according to the strain.

Figure pct00003
Figure pct00003

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> METHOD FOR GENERATING TRANSGENIC POTATO PLANT HAVING MULTI-VIRUS RESISTANCE AND TRANSGENIC POTATO PLANT DEVELOPED BY USING THE METHOD <130> FC11046PCK <150> KR10-2010-0067991 <151> 2010-07-14 <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 200 <212> DNA <213> Potato virus Y <400> 1 atgccaactg tgatgaatgg gcttatggtt tggtgcattg aaaatggaac ctcgccaaat 60 gtcaacggag tttgggttat gatggatggg aatgaacaag ttgagtaccc gttgaaacca 120 atcgttgaga atgcaaaacc aacccttagg caaatcatgg cacatttctc agatgttgca 180 gaagcgtata tagaaatgcg 200 <210> 2 <211> 200 <212> DNA <213> Potato leaf roll virus <400> 2 tcaccttcgg gccgagtcta tcagactgtc cggcattcaa ggatggaata ctcaaggcct 60 accatgagta taagatcaca agcatcttac ttcagttcgt cagcgaggcc tcttccacct 120 cctccggttc catcgcttat gagttggacc cccattgcaa agtatcatcc ctccagtcct 180 acgtcaacaa gttccaaatt 200 <210> 3 <211> 200 <212> DNA <213> Potato virus A <400> 3 gaagcttgga caagttgaga tcatcaccaa gggcagtgct aacaaaaagc acttcattgt 60 cgccaccaat ataatagaga atggagttac actggacatt gatgcagtca tagactttgg 120 gatgaaagtg gtgccattct tagactctga taatcgcatg atatcataca acaaggtgag 180 tattagctat ggcgagagaa 200 <210> 4 <211> 200 <212> DNA <213> Tobacco rattle virus <400> 4 ggtttctttg aagcctggtg ctcagtacat aactttcctt cagtctgaga agaaggagtt 60 ggtaaatttg ttggcattga ggaaagtggc agctaaagtg agtacagtac acgagtcgca 120 aggagagaca ttcaaagatg tagtcctagt caggacgaaa cctacggatg actcaatcgc 180 tagaggtcgg gagtacttaa 200 <210> 5 <211> 200 <212> DNA <213> Potato mop-top virus <400> 5 ggatgatttg tctgcaagaa gtgtgatatg tcaaggtgac tctcagcaga tcccgtttat 60 taatagagtg gagtctatta cgcttcgata ctccaagttg gaaattgata atgttgtgga 120 aaaaagactg acttatagat cgcctttgga tgtggcatcg tacctgacta agaaaaattt 180 ttatggtaca tccgtggtga 200 <210> 6 <211> 1000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YLRATRPM gene <400> 6 atgccaactg tgatgaatgg gcttatggtt tggtgcattg aaaatggaac ctcgccaaat 60 gtcaacggag tttgggttat gatggatggg aatgaacaag ttgagtaccc gttgaaacca 120 atcgttgaga atgcaaaacc aacccttagg caaatcatgg cacatttctc agatgttgca 180 gaagcgtata tagaaatgcg tcaccttcgg gccgagtcta tcagactgtc cggcattcaa 240 ggatggaata ctcaaggcct accatgagta taagatcaca agcatcttac ttcagttcgt 300 cagcgaggcc tcttccacct cctccggttc catcgcttat gagttggacc cccattgcaa 360 agtatcatcc ctccagtcct acgtcaacaa gttccaaatt gaagcttgga caagttgaga 420 tcatcaccaa gggcagtgct aacaaaaagc acttcattgt cgccaccaat ataatagaga 480 atggagttac actggacatt gatgcagtca tagactttgg gatgaaagtg gtgccattct 540 tagactctga taatcgcatg atatcataca acaaggtgag tattagctat ggcgagagaa 600 ggtttctttg aagcctggtg ctcagtacat aactttcctt cagtctgaga agaaggagtt 660 ggtaaatttg ttggcattga ggaaagtggc agctaaagtg agtacagtac acgagtcgca 720 aggagagaca ttcaaagatg tagtcctagt caggacgaaa cctacggatg actcaatcgc 780 tagaggtcgg gagtacttaa ggatgatttg tctgcaagaa gtgtgatatg tcaaggtgac 840 tctcagcaga tcccgtttat taatagagtg gagtctatta cgcttcgata ctccaagttg 900 gaaattgata atgttgtgga aaaaagactg acttatagat cgcctttgga tgtggcatcg 960 tacctgacta agaaaaattt ttatggtaca tccgtggtga 1000 <210> 7 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YLRA gene <400> 7 atgccaactg tgatgaatgg gcttatggtt tggtgcattg aaaatggaac ctcgccaaat 60 gtcaacggag tttgggttat gatggatggg aatgaacaag ttgagtaccc gttgaaacca 120 atcgttgaga atgcaaaacc aacccttagg caaatcatgg cacatttctc agatgttgca 180 gaagcgtata tagaaatgcg tcaccttcgg gccgagtcta tcagactgtc cggcattcaa 240 ggatggaata ctcaaggcct accatgagta taagatcaca agcatcttac ttcagttcgt 300 cagcgaggcc tcttccacct cctccggttc catcgcttat gagttggacc cccattgcaa 360 agtatcatcc ctccagtcct acgtcaacaa gttccaaatt gaagcttgga caagttgaga 420 tcatcaccaa gggcagtgct aacaaaaagc acttcattgt cgccaccaat ataatagaga 480 atggagttac actggacatt gatgcagtca tagactttgg gatgaaagtg gtgccattct 540 tagactctga taatcgcatg atatcataca acaaggtgag tattagctat ggcgagagaa 600 600 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVY CP Forward Primer(PVY CP-F) <400> 8 atgccaactg tgatgaat 18 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLRV CP+PVY CP Reverse Primer <400> 9 actcggcccg aaggtgacgc atttctatat acgctt 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVY CP+PLRV CP Forward Primer <400> 10 aagcgtatat agaaatgcgt caccttcggg ccgagt 36 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVA CI+PLRV CP Reverse Primer <400> 11 tctcaacttg tccaagcttc aatttggaac ttgttgacgt 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLRV CP+PVA CI Forward Primer <400> 12 acgtcaacaa gttccaaatt gaagcttgga caagttgaga 40 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVA CI Reverse Primer <400> 13 ttctctcgaa atagctaata ct 22 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRV REP+PVA CI Reverse Primer <400> 14 agcaccaggc ttcaaagaaa ccttctctcg ccatagctaa 40 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVA CI+TRV REP Forward Primer <400> 15 agctatggcg agagaaggtt tctttgaagc ctggtgct 38 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMTV REP+TRV REP Reverse Primer <400> 16 tcttgcagac aaatcatcct taagtactcc cgacctct 38 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRV REP+PMTV REP Forward Primer <400> 17 agaggtcggg agtacttaag gatgatttgt ctgcaaga 38 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMTV REP Reverse Primer <400> 18 tcaccacgga tgtaccata 19 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVY-NC_001616 9382-9373 nt-Sense-Forward Primer <400> 19 catgaacttg actccaagta ga 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVY-NC_001616_8573-8592 nt-Antisense-Reverse Primer <400> 20 gcaaatgaca caattgatgc 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLRV-NC_001747_3844-3867 nt-Sense-Forward Primer <400> 21 gagtctatca gactgtccgg catt 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLRV-NC_001747_4401-4424 nt-Antisense-Reverse Primer <400> 22 attgagagta atactgagag ctaa 24 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVA-NC_004039_8532-8555 nt-Sense-Forward Primer <400> 23 ccgaaactct tgatgcaagc gaa 23 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVA-NC_004039_9315-9338 nt-Antisense-Reverse Primer <400> 24 cacccccttc acgcctaaaa ggtg 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRV-NC_003805 3191-3214 nt-Sense-Forward Primer <400> 25 cgatgtatct gtcaaggaga tcag 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRV_NC_003805_3603-3626 nt-Antisense-Reverse Primer <400> 26 ttaagtactc ccgacctcta gcga 24 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMTV-NC_003723 3067-3088 nt-Sense-Forward Primer <400> 27 atgaatgaaa ttccgatttt ga 22 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMTV-NC_003723_3643-3662 nt-Antisense-Reverse Primer <400> 28 accatctctg ggtccaacgg t 21 <110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> METHOD FOR GENERATING TRANSGENIC POTATO PLANT HAVING MULTI-VIRUS          RESISTANCE AND TRANSGENIC POTATO PLANT DEVELOPED BY USING THE          METHOD <130> FC11046PCK <150> KR10-2010-0067991 <151> 2010-07-14 <160> 28 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 200 <212> DNA <213> Potato virus Y <400> 1 atgccaactg tgatgaatgg gcttatggtt tggtgcattg aaaatggaac ctcgccaaat 60 gtcaacggag tttgggttat gatggatggg aatgaacaag ttgagtaccc gttgaaacca 120 atcgttgaga atgcaaaacc aacccttagg caaatcatgg cacatttctc agatgttgca 180 gaagcgtata tagaaatgcg 200 <210> 2 <211> 200 <212> DNA <213> Potato leaf roll virus <400> 2 tcaccttcgg gccgagtcta tcagactgtc cggcattcaa ggatggaata ctcaaggcct 60 accatgagta taagatcaca agcatcttac ttcagttcgt cagcgaggcc tcttccacct 120 cctccggttc catcgcttat gagttggacc cccattgcaa agtatcatcc ctccagtcct 180 acgtcaacaa gttccaaatt 200 <210> 3 <211> 200 <212> DNA <213> Potato virus A <400> 3 gaagcttgga caagttgaga tcatcaccaa gggcagtgct aacaaaaagc acttcattgt 60 cgccaccaat ataatagaga atggagttac actggacatt gatgcagtca tagactttgg 120 gatgaaagtg gtgccattct tagactctga taatcgcatg atatcataca acaaggtgag 180 tattagctat ggcgagagaa 200 <210> 4 <211> 200 <212> DNA <213> Tobacco rattle virus <400> 4 ggtttctttg aagcctggtg ctcagtacat aactttcctt cagtctgaga agaaggagtt 60 ggtaaatttg ttggcattga ggaaagtggc agctaaagtg agtacagtac acgagtcgca 120 aggagagaca ttcaaagatg tagtcctagt caggacgaaa cctacggatg actcaatcgc 180 tagaggtcgg gagtacttaa 200 <210> 5 <211> 200 <212> DNA <213> Potato mop-top virus <400> 5 ggatgatttg tctgcaagaa gtgtgatatg tcaaggtgac tctcagcaga tcccgtttat 60 taatagagtg gagtctatta cgcttcgata ctccaagttg gaaattgata atgttgtgga 120 aaaaagactg acttatagat cgcctttgga tgtggcatcg tacctgacta agaaaaattt 180 ttatggtaca tccgtggtga 200 <210> 6 <211> 1000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YLRATRPM gene <400> 6 atgccaactg tgatgaatgg gcttatggtt tggtgcattg aaaatggaac ctcgccaaat 60 gtcaacggag tttgggttat gatggatggg aatgaacaag ttgagtaccc gttgaaacca 120 atcgttgaga atgcaaaacc aacccttagg caaatcatgg cacatttctc agatgttgca 180 gaagcgtata tagaaatgcg tcaccttcgg gccgagtcta tcagactgtc cggcattcaa 240 ggatggaata ctcaaggcct accatgagta taagatcaca agcatcttac ttcagttcgt 300 cagcgaggcc tcttccacct cctccggttc catcgcttat gagttggacc cccattgcaa 360 agtatcatcc ctccagtcct acgtcaacaa gttccaaatt gaagcttgga caagttgaga 420 tcatcaccaa gggcagtgct aacaaaaagc acttcattgt cgccaccaat ataatagaga 480 atggagttac actggacatt gatgcagtca tagactttgg gatgaaagtg gtgccattct 540 tagactctga taatcgcatg atatcataca acaaggtgag tattagctat ggcgagagaa 600 ggtttctttg aagcctggtg ctcagtacat aactttcctt cagtctgaga agaaggagtt 660 ggtaaatttg ttggcattga ggaaagtggc agctaaagtg agtacagtac acgagtcgca 720 aggagagaca ttcaaagatg tagtcctagt caggacgaaa cctacggatg actcaatcgc 780 tagaggtcgg gagtacttaa ggatgatttg tctgcaagaa gtgtgatatg tcaaggtgac 840 tctcagcaga tcccgtttat taatagagtg gagtctatta cgcttcgata ctccaagttg 900 gaaattgata atgttgtgga aaaaagactg acttatagat cgcctttgga tgtggcatcg 960 tacctgacta agaaaaattt ttatggtaca tccgtggtga 1000 <210> 7 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YLRA gene <400> 7 atgccaactg tgatgaatgg gcttatggtt tggtgcattg aaaatggaac ctcgccaaat 60 gtcaacggag tttgggttat gatggatggg aatgaacaag ttgagtaccc gttgaaacca 120 atcgttgaga atgcaaaacc aacccttagg caaatcatgg cacatttctc agatgttgca 180 gaagcgtata tagaaatgcg tcaccttcgg gccgagtcta tcagactgtc cggcattcaa 240 ggatggaata ctcaaggcct accatgagta taagatcaca agcatcttac ttcagttcgt 300 cagcgaggcc tcttccacct cctccggttc catcgcttat gagttggacc cccattgcaa 360 agtatcatcc ctccagtcct acgtcaacaa gttccaaatt gaagcttgga caagttgaga 420 tcatcaccaa gggcagtgct aacaaaaagc acttcattgt cgccaccaat ataatagaga 480 atggagttac actggacatt gatgcagtca tagactttgg gatgaaagtg gtgccattct 540 tagactctga taatcgcatg atatcataca acaaggtgag tattagctat ggcgagagaa 600                                                                          600 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVY CP Forward Primer (PVY CP-F) <400> 8 atgccaactg tgatgaat 18 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLRV CP + PVY CP Reverse Primer <400> 9 actcggcccg aaggtgacgc atttctatat acgctt 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVY CP + PLRV CP Forward Primer <400> 10 aagcgtatat agaaatgcgt caccttcggg ccgagt 36 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVA CI + PLRV CP Reverse Primer <400> 11 tctcaacttg tccaagcttc aatttggaac ttgttgacgt 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLRV CP + PVA CI Forward Primer <400> 12 acgtcaacaa gttccaaatt gaagcttgga caagttgaga 40 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVA CI Reverse Primer <400> 13 ttctctcgaa atagctaata ct 22 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRV REP + PVA CI Reverse Primer <400> 14 agcaccaggc ttcaaagaaa ccttctctcg ccatagctaa 40 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVA CI + TRV REP Forward Primer <400> 15 agctatggcg agagaaggtt tctttgaagc ctggtgct 38 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMTV REP + TRV REP Reverse Primer <400> 16 tcttgcagac aaatcatcct taagtactcc cgacctct 38 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRV REP + PMTV REP Forward Primer <400> 17 agaggtcggg agtacttaag gatgatttgt ctgcaaga 38 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMTV REP Reverse Primer <400> 18 tcaccacgga tgtaccata 19 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVY-NC_001616 9382-9373 nt-Sense-Forward Primer <400> 19 catgaacttg actccaagta ga 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVY-NC_001616_8573-8592 nt-Antisense-Reverse Primer <400> 20 gcaaatgaca caattgatgc 20 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLRV-NC_001747_3844-3867 nt-Sense-Forward Primer <400> 21 gagtctatca gactgtccgg catt 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLRV-NC_001747_4401-4424 nt-Antisense-Reverse Primer <400> 22 attgagagta atactgagag ctaa 24 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVA-NC_004039_8532-8555 nt-Sense-Forward Primer <400> 23 ccgaaactct tgatgcaagc gaa 23 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVA-NC_004039_9315-9338 nt-Antisense-Reverse Primer <400> 24 cacccccttc acgcctaaaa ggtg 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRV-NC_003805 3191-3214 nt-Sense-Forward Primer <400> 25 cgatgtatct gtcaaggaga tcag 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRV_NC_003805_3603-3626 nt-Antisense-Reverse Primer <400> 26 ttaagtactc ccgacctcta gcga 24 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMTV-NC_003723 3067-3088 nt-Sense-Forward Primer <400> 27 atgaatgaaa ttccgatttt ga 22 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMTV-NC_003723_3643-3662 nt-Antisense-Reverse Primer <400> 28 accatctctg ggtccaacgg t 21

Claims (11)

서열번호 1의 PVY(Potato virus Y) 유전자, 서열번호 2의 PLRV(Potato leafroll virus) 유전자, 서열번호 3의 PVA(Potato virus A) 유전자, 서열번호 4의 TRV(Tobacco rattle virus) 유전자 및 서열번호 5의 PMTV(Potato mop-top virus) 유전자로부터 선택된 3종이상의 바이러스 유전자를 융합한 유전자를 센스 및 안티센스 방향으로 포함하는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)로 형질전환된, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체.Potato virus Y (PVY) gene of SEQ ID NO: 1, Potato leafroll virus (PLRV) gene of SEQ ID NO: 2, Potato virus A (PVA) gene of SEQ ID NO: 3, Tobacco rattle virus (TRV) gene of SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: A multi-virus resistant transgenic potato plant transformed with an expression vector pK7GWIWG2 (I) comprising a gene in which three or more viral genes selected from the PMTV (Potato mop-top virus) gene in the sense and antisense directions are fused. 서열번호 6의 YLRATRPM 유전자를 포함하고 도 1에 나타낸 개열지도를 갖는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRATRPM로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시킨 후, 상기 아그로박테리움과 감자 세포를 공동배양하여 상기 감자 세포를 형질전환시키는 것을 포함하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법. Agrobacterium tumefaciens was transformed with the expression vector pK7GWIWG2 (I) / YLRATRPM containing the YLRATRPM gene of SEQ ID NO: 6 and having the cleavage map shown in FIG. 1, and then the Agrobacterium and potato cells were transformed. A method of producing a multi-viral resistant transgenic potato plant, comprising co-culturing the transformed potato cells. 청구항 2에 있어서, 상기 서열번호 6의 YLRATRPM 유전자는 서열번호 1의 PVY(Potato virus Y) 유전자, 서열번호 2의 PLRV(Potato leafroll virus) 유전자, 서열번호 3의 PVA(Potato virus A) 유전자, 서열번호 4의 TRV(Tobacco rattle virus) 유전자 및 서열번호 5의 PMTV(Potato mop-top virus) 유전자를 오버랩 PCR을 이용하여 융합시켜 제조한 것을 특징으로 하는 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.The method according to claim 2, wherein the YLRATRPM gene of SEQ ID NO: 6 is Potato virus Y (PVY) gene of SEQ ID NO: 1, Potato leafroll virus (PLRV) gene of SEQ ID NO: 2, Potato virus A (PVA) gene of SEQ ID NO: 3, sequence A method for producing a multi-virus resistant transgenic potato plant, characterized in that it is produced by fusion of a Tobacco rattle virus (TRV) gene of No. 4 and a Potato mop-top virus (PMTV) gene of SEQ ID NO: 5 using overlap PCR. 서열번호 7의 YLRA 유전자를 포함하는 발현벡터 pK7GWIWG2(I)/YLRA로 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 형질전환시킨 후, 상기 아그로박테리움과 감자 세포를 공동배양하여 상기 감자 세포를 형질전환시키는 것을 포함하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.After transforming Agrobacterium tumefaciens with the expression vector pK7GWIWG2 (I) / YLRA containing the YLRA gene of SEQ ID NO: 7, co-cultured the Agrobacterium tumefaciens with the potato cells to transform the potato cells. A method of producing a multi-viral resistant transgenic potato plant, comprising the conversion. 청구항 4에 있어서, 상기 서열번호 7의 YLRA 유전자는 서열번호 1의 PVY(Potato virus Y) 유전자, 서열번호 2의 PLRV(Potato leafroll virus) 유전자 및 서열번호 3의 PVA(Potato virus A) 유전자를 오버랩 PCR을 이용하여 융합시켜 제조한 것을 특징으로 하는 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.The YLRA gene of SEQ ID NO: 7 overlaps the Potato virus Y (PVY) gene of SEQ ID NO: 1, the Potato leafroll virus (PLRV) gene of SEQ ID NO: 2, and the PVA (Potato virus A) gene of SEQ ID NO: 3 A method for producing a multi-viral resistant transgenic potato plant, which is prepared by fusing using PCR. 청구항 2 또는 청구항 4에 있어서, 상기 형질전환된 감자 세포를 조직배양 방법으로 재분화시키는 것을 추가로 포함하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.The method of claim 2 or 4, further comprising re-differentiating the transformed potato cells by a tissue culture method. 청구항 6에 있어서, 상기 재분화는 조직배양으로 캘러스를 형성시킨 후 기관을 유도하는 방법을 통하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.The method of claim 6, wherein the re-differentiation is through a method of inducing organs after forming callus as a tissue culture. 청구항 2에 있어서, 상기 다종바이러스 저항성 감자식물체가 PVY(Potato virus Y), PLRV(Potato leafroll virus), PVA(Potato virus A), TRV(Tobacco rattle virus) 및 PMTV(Potato mop-top virus) 모두에 대해 저항성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.The method of claim 2, wherein the multi-virus-resistant potato plant is found in all of Potato virus Y (PVY), Potato leafroll virus (PLRV), Potato virus A (PVA), Tobacco rattle virus (TRV) and Potato mop-top virus (PMTV). A method of producing a multi-viral resistant transgenic potato plant, characterized by exhibiting resistance to. 청구항 4에 있어서, 상기 다종바이러스 저항성 감자식물체가 PVY(Potato virus Y), PLRV(Potato leafroll virus) 및 PVA(Potato virus A) 모두에 대해 저항성을 나타내는 것을 특징으로 하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.5. The multi-virus resistant transgenic potato plant of claim 4, wherein the multi-virus resistant potato plant exhibits resistance to all of Potato virus Y (PVY), Potato leafroll virus (PLRV), and Potato virus A (PVA). Method of preparation. 청구항 2 또는 청구항 4에 있어서, 상기 감자가 Vales Sovereign 품종의 감자인 것을 특징으로 하는, 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체의 제조 방법.The method according to claim 2 or 4, characterized in that the potato is a potato of the Vales Sovereign variety. 청구항 2 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 다종 바이러스 저항성 형질전환 감자식물체.A multi-virus resistant transgenic potato plant produced by the method according to any one of claims 2 to 10.
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