KR20120105116A

KR20120105116A - 폐질환 치료용 다공성 미립자 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20120105116A
Application number: KR1020110022705A
Authority: KR
Inventors: 이은성; 유나영
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2011-03-15
Filing date: 2011-03-15
Publication date: 2012-09-25
Also published as: KR101738691B1

Abstract

본 발명은 폐질환 치료용 다공성 미립자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 자세하게는 생분해성 고분자, 항산화제, 점성질 물질 및 다공유도 물질을 포함하는 폐질환 치료용 다공성 미립자 및 (a) 다공유도 물질 및 점성질 물질을 포함하는 증류수에 항산화제를 용해하여 내부 수상(W₁)을 제조하는 단계; (b) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 유기상(O)을 제조하는 단계; (c) 상기에서 제조된 내부 수상(W₁) 및 유기상(O)을 혼합하여 1차 에멀젼(W₁/O)을 형성하는 단계; 및 (d) 상기 형성된 1차 에멀젼을 외부 수상(W₂)에 분산시키는 단계를 포함하는 폐질환 치료용 다공성 미립자의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 폐질환 치료용 다공성 미립자는 매우 작은 입경을 가지므로 폐로 흡입되는 경우 폐 심부 상피세포에 신속히 이동하여 효과적으로 폐포에 침적될 수 있으며, 동시에 대식세포에 의한 파괴를 줄일 수 있고 봉입된 항산화제의 안정성 및 손실을 최대한 줄일 수 있어 치료 효과를 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라 점성을 가지는 물질을 포함하고 있어 장기간 지속적인 항산화제의 방출이 가능하므로 폐질환을 효과적으로 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

폐질환 치료용 다공성 미립자 및 이의 제조방법{Porous microparticles for prevention or treatment of pulmonary disease and method thereof}

본 발명은 약물의 안정성 유지가 우수하고 지속 방출이 가능하여 치료 효과를 증진시킬 수 있는 신규한 폐질환 치료용 다공성 미립자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)은 유해한 입자나 가스의 흡입에 의해 폐에 비정상적인 염증 반응이 일어나면서 이로 인해 점차 기류 제한이 진행되어 폐 기능이 저하되고 호흡곤란을 유발하게 되는 호흡기 질환으로, 만성 기관지염(chronic bronchitis) 또는 폐포 구조의 손상을 보이는 폐기종(emphysema), 또는 두 질환이 혼합되는 형태로 나타나는 특징을 가진다.

증상으로는 장기간 객담을 동반하는 기침이 계속되고, 기도폐쇄증상으로 기류의 속도가 감소하여 호흡이 곤란하며, 감기와 같은 호흡기 감염이 빈발한다. 이 질환은 세계 사망원인 6위, 미국의 사망원인 4위이며, 한국도 흡연, 대기오염 등으로 급격히 환자의 수가 늘고 있는 추세이다.

만성폐쇄성폐질환의 원인은 독성 분자나 가스에 대한 폐의 비정상적 만성 염증 반응으로, 흡연, 도시화와 공해, 호흡기 감염증 등의 여러 가지 인자들이 복합적으로 관여하며, 이 중 흡연이 만성폐쇄성폐질환의 발생에서 가장 중요한 위험인자로 인식되고 있다.

흡연 시 발생되는 담배 연기에는 과도한 활성산소(reactive oxygen species: ROS)가 존재하며, 이러한 활성산소는 공기의 흐름을 저해시키고 기도에 염증을 유발하게 되는데, 수년간의 흡연으로 인해 과도한 활성산소에 노출되는 경우 상피조직 세포의 파괴와 기관지의 염증 증가의 결과로 만성폐쇄성폐질환이 진행되는 원인이 된다.

이러한 활성산소로 인해 유도된 염증을 치료하기 위해 항산화제를 사용하여 활성산소를 제거하는 연구가 현재 활발히 연구되고 있다.

한편 약물전달시스템(Drug Delivery System, DDS)이란 약리학적 활성을 갖는 물질을 다양한 물리화학적 기술을 이용하여 최적의 효력을 발휘하도록 세포, 조직, 장기 및 기관으로의 전달 및 방출을 제어하는 일련의 기술을 총칭하며, 기존 의약품의 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화시키며 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 제형을 설계하여 약물치료를 최적화 하는 기술을 말한다.

약물전달시스템은 투여경로, 전달기술의 형태 및 약물의 종류에 따라 분류할 수 있다. 투여 경로에 따른 분류로는 일반적으로 경구형, 주사형, 폐흡입형, 경피형, 삽입형 등으로 분류되며, 전달기술의 형태에 따른 분류로는 흡수촉진형, 약효지속형, 표적부위집중형, Intelligent DDS 등으로 분류할 수 있다.

상기와 같은 약물전달시스템에서 약물을 전달하기 위한 전달체로는 미립자(microparticles) 또는 미립구(microsphere) 등이 사용될 수 있으며, 이러한 약물 전달체는 치료부위에 질병 치료용 약물을 효율적으로 전달함으로써 약물의 부작용을 줄이고 약물에 대한 환자의 순응도를 높이며 약물의 효능 및 효과를 극대화할 수 있도록 제형을 설계하는 것이 중요하다.

특히 생분해성 고분자를 이용한 약물전달용 미립자는 지용성 또는 수용성의 생리활성물질을 미립자에 쉽게 함유시킬 수 있어야 하고, 인체 내에서 약물을 포함하고 일정기간 유지할 수 있는 물성과 인체에 무해한 물질로 분해되는 안전성 및 인체에 투입된 초기에는 약물을 방출하지 않다가 목표지점에 도달한 이후에 원하는 기간 동안 충분히 약물을 방출할 수 있는 지속성을 가지고 있어야 한다.

현재 널리 사용되고 있는 생분해성 고분자로는 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산([0003] PLA), 폴리락타이드글리콜라이드(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 락트산-ε-카프로락톤 공중합체(PLCL), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리트라이메틸렌카보네이트(PTMC), 폴리아미노산(poly(amino acid)), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리오르쏘에스테르(polyorthoester) 및 이들의 공중합체 등이 있다. 그러나 현재까지는 PGA, PLA, PLGA 등만이 미국 식품의약청(FDA)으로부터 인체에 사용가능한 생분해성 고분자로 승인되어 약물전달용 미립자 및 인체 조직의 체내 재생을 위한 다공성 고분자 지지체(scaffold) 재료로 사용되고 있다.

한편 최근 연구가 활발히 진행 중인 폐흡입형 약물전달은 전달기관인 폐의 표면적이 넓고 흡수 장벽이 얇아 약제의 흡수 전달이 빠르고, 폐 점막이 고분자 물질에 대해서도 상당히 높은 투과성을 나타내며, 흡수된 약제가 간을 통과하지 않고 바로 전신 순환됨으로써 속방형 약제의 투여경로로 적합하다는 점에서 주목을 받고 있다.

이와 관련된 최근 연구로는 다공성 미립자를 폐로 전달하기 위하여 약물을 봉입하지 않고 소수성 흡착 성질을 이용하여 미립자 표면에 엑센딘-4를 부착 하여 당뇨병을 치료하는 연구가 있으며 (문헌[H. W. Kim , H. I. Park, J. H. Lee, T. H. Kim, E. S. Lee, K. T. Oh, K. C. Lee, Y. S. Youn, Biomaterials. 2011, 32, 1685-93.]), 약 18시간정도 동안 면역글로불린이 방출할 수 있는 지질을 기반으로 한 속이 빈 다공성 미립자(문헌[A. I. Bot, T. E. Tarara, D. J. Smith, S. R. Bot, C. M. Woods, J. G. Weers, Pharm. Res. 2000, 17, 275-283.]), 재조합된 인간 성장 호르몬을 하루 동안 지속적으로 방출하는 다공성 미립자에 대한 연구가 발표되었다(문헌[Kim, H. K, Chung, H. J, Park, T. G, J. Control. Release. 2006, 112, 167-174.]).

그러나 상기와 같은 연구에도 불구하고, 만성폐쇄성폐질환과 같은 폐질환에서 산화적 스트레스를 장시간 지속적으로 완화시키는 과정을 통하여, 폐질환 치료의 효과를 나타낼 정도의 충분한 지속성을 가진 약물전달용 미립자에 대한 연구는 전무한 상태이다.

이에 본 발명자들은 생분해성 고분자로 이루어진 몸체에 항산화제 및 점성질 물질을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 폐질환 치료용 다공성 미립자가 폐에 존재하는 대식세포의 식작용을 피할 수 있는 충분한 입경 크기를 가지며, 또한 점성을 가지는 물질을 유효성분으로 포함하여 장기간(5일 정도) 지속 방출이 가능하게 함으로써 만성적인 폐질환을 보다 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 흡입을 통해 폐로 침착된 다공성 미립자가 장기간 항산화제의 방출을 통해 만성적인 폐질환을 효과적으로 치료할 수 있는 폐질환 치료용 다공성 미립자 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 생분해성 고분자, 항산화제, 점성질 물질 및 다공유도 물질을 포함하는 폐질환 치료용 다공성 미립자를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락타이드글리콜라이드(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 이들의 유도체 및 이들의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항산화제는 안토시아닌, 제니스테인, 퀴세틴, 리코펜, 루테인, 레스베라스톨, 피크노게놀, 알리신, 유비키논 및 카테킨으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 점성질 물질은 전분일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미립자는 5 내지 100μm의 입경을 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폐질환은 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미립자는 폐 대식세포의 식작용을 피할 수 있으며, 점성질 물질로 인해 항산화제가 지속적으로 방출할 수 있는 효과를 가질 수 있다.

또한, 본 발명은,

(a) 다공유도 물질 및 점성질 물질을 포함하는 증류수에 항산화제를 용해하여 내부 수상(W₁)을 제조하는 단계;

(b) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 유기상(O)을 제조하는 단계;

(c) 상기에서 제조된 내부 수상(W₁) 및 유기상(O)을 혼합하여 1차 에멀젼(W₁/O)을 형성하는 단계; 및

(d) 상기 형성된 1차 에멀젼을 외부 수상(W₂)에 분산시키는 단계를 포함하는 폐질환 치료용 다공성 미립자의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 및 (b) 단계는 비순차적인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 다공유도 물질은 암모늄 바이카보네이트이고, 상기 점성질 물질은 전분이고, 상기 항산화제는 안토시아닌일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 생분해성 고분자는 폴리락타이드글리콜라이드(PLGA)이며, 유기용매는 디클로로메탄(DCM) 또는 에틸 아세테이트일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c) 단계에서 내부 수상(W₁) 대 유기상(O)의 혼합비는 1 : 2 내지 1 : 10일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (d) 단계에서 외부 수상(W₂)은 폴리비닐알코올 및 염화나트륨이 용해된 수용액일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미립자는 생분해성 고분자에 항산화제, 점성질 물질 및 다공유도 물질이 봉입된 흡입형 제제로 제조되는 것일 수 있다.

본 발명의 폐질환 치료용 다공성 미립자는 5 내지 100 ㎛의 입경을 가지므로, 폐로 흡입되는 경우 폐 심부 상피세포에 신속히 이동하여 효과적으로 폐포에 침적(deposition)될 수 있으며, 동시에 대식세포에 의한 파괴를 줄일 수 있으므로 봉입된 항산화제의 안정성 및 손실을 최대한 줄일 수 있는 이점이 있다. 또한 본 발명의 폐질환 치료용 다공성 미립자는 점성을 가지는 유효성분을 포함하여 장기간 지속적인 생리활성약제(항산화제)의 방출이 가능하므로, 지속적인 항산화제의 활성산소 소거능(reactive oxygen species eliminating activity)으로 인해 폐질환을 효과적으로 치료하는데 유용하다.

도 1은 본 발명의 다공성 미립자들(ATH-S-PM1, ATH-S-PM2, ATH-S-PM3)의 형태를 FE-SEM 이미지로 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 다공성 미립자(ATH-S-PM3)를 단면화하여 내부 기공 형태를 FE-SEM 이미지로 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 다공성 미립자(ATH-S-PM3)에 FITC-라벨링된 안토시아닌이 분산된 이미지를 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명의 다공성 미립자들(ATH-S-PM1, ATH-S-PM2, ATH-S-PM3)의 가공밀도(Tap-density)를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 다공성 미립자들(ATH-S-PM1, ATH-S-PM2, ATH-S-PM3)이 시간에 따라 방출되는 안토시아닌의 누적 %를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 다공성 미립자인 ATH-S-PM3의 활성산소 라디칼의 소거활성 정도를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(대조군으로 ATH-PM 사용).
도 7a는 본 발명의 다공성 미립자를 마우스의 기도를 통해 흡입시킨 후 30분이 경과한 다음 폐에서 안토시아닌(FITC-라벨링됨)의 잔류량을 이미지화하여 나타낸 사진이다(대조군으로 ATH-PM 사용).
도 7b는 본 발명의 다공성 미립자를 마우스의 기도를 통해 흡입시킨 후 시간 경과(1일, 3일, 5일, 10일, 20일)에 따른 안토시아닌(FITC-라벨링됨)의 잔류량을 이미지화하여 나타낸 사진이다(대조군으로 ATH-PM 사용).
도 8은 본 발명의 다공성 미립자를 폐 조직에 적용하여 10일이 경과한 후 세포 내에 반응을 살핀 사진이다.
도 9는 본 발명의 다공성 미립자가 담배연기의 독성으로부터 폐 상피세포를 보호하는 효과를 확인하기 위해, 담배연기 추출물 수용액을 포함하는 배지에서 배양시킨 세포에 본 발명의 다공성 미립자를 적용한 후 세포의 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다(대조군 1: 무첨가 군, 대조군 2: 안토시아닌 투입 군).
도 10은 본 발명의 다공성 미립자가 신체 내 산화적 스트레스를 억제하는 과정을 개략적으로 나타낸 그림이다.

본 발명은 폐질환을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 폐질환 치료용 다공성 미립자를 제공함을 특징으로 하며, 구체적으로는 생분해성 고분자, 항산화제, 점성질 물질 및 다공유도 물질을 포함하는 폐질환 치료용 다공성 미립자 및 상기 미립자의 제조방법을 제공함에 그 특징이 있다.

또한, 본 발명의 다공성 미립자는 약물을 체내로 전달할 수 있는 전달체의 역할을 하며, 다수의 기공이 형성되어 있고, 직경이 μm 단위의 매우 작은 입자로 구성되어 있는 구형의 미립자이다.

또한, 본 발명의 다공성 미립자는 생분해성 고분자에 항산화제, 점성질 물질 및 다공유도 물질이 봉입된 형태를 가지며 약리물질인 상기 항산화제가 장기간 지속방출 가능한 특징을 가지고 있다.

본 발명에 따른 폐질환 치료용 다공성 미립자에 포함되는 상기 생분해성 고분자는 생분해 활성이 있는 고분자라면 특별히 제한하는 것은 아니나, 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락타이드글리콜라이드(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 이들의 유도체 및 공중합체로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 폴리락타이드글라이드(poly(lactic-co-glycolic acid), 이하 간편하게 ‘PLGA’라 함)를 사용하였다.

본 발명에서 상기 "생분해성"은 상기 고분자가 신체 내에서 화학적으로 분해되어서 비독성 화합물을 형성할 수 있음을 의미한다. 이때 분해속도는 약물 방출 속도와 동일 또는 상이하며, 생분해성 고분자의 사용으로 바람직하지 않은 후속효과 없이 인체와 상호작용하는 특성을 가진다.

또한, 본 발명의 다공성 미립자에 포함되는 상기 항산화제는 폐질환 환자에게 적용 시 질환의 예방 또는 치료효과를 유도할 수 있는 약학적 물질을 말한다.

인간을 비롯하여 모든 호기성 생물체는 산소를 이용하여 에너지 대사를 진행하며 생존하고 있는데, 생체 내 산소가 각종 물리적, 화학적, 생물학적인 스트레스를 받으면 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(?O^2-; superoxide anion radical), 과산화수소(H₂O₂), 히드록시 라디칼(?OH; hydroxy radical) 등의 유해한 활성 산소종 (active oxygen species)으로 변화된다. 식균세포(phagocytic cell)가 호흡방출 (respiratory burst)하는 동안 생성되는 수퍼옥사이드 음이온은 외부에서 침입한 박테리아나 바이러스 등을 파괴하는데 중요한 역할을 담당하기도 하지만, 이러한 활성 산소종이 다양한 요인에 의하여 필요 이상으로 생성되면 인체에 치명적인 생리적 장애를 일으키고 심할 경우는 질병을 유발하고 폐질환이 이러한 활성 산소종에 의해 발병되는 질환이기도 하다.

한편, 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 항산화제는 특별히 제한되지는 않으나, 바람직하게는 안토시아닌, 제니스테인, 퀴세틴, 리코펜, 루테인, 레스베라스톨, 피크노게놀, 알리신, 유비키논 및 카테킨으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종을 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 검정콩 유래의 시아니딘-3-글루코시드를 사용하였다.

또한, 본 발명에서 사용된 상기 점성질 물질은 점성을 가지며 체내 유해하지 않는 성분으로 이루어진 것이라면 모두 사용할 수 있으며, 바람직하게는 전분을 사용할 수 있다.

전분은 생분해성 특징을 갖는 천연 고분자로서 식물에서 영양물의 저장물질로서 작용하며, α-D-glucose가 축합하여 생긴 다당류의 일종으로서 D-glucose가 분기 없이, α-1,4 glicoside의 결합을 통해 가지가 없는 형태의 쇄상으로 중합된 나선형의 아밀로오스와, 분자내 1000개 이상의 글루코스로 구성된 가지가 있는 형태의 전분인 아밀로펙틴으로 분류할 수 있다. 또한, 전분은 식물의 종류에 따라 그 모양과 크기가 다르나 모두 거대분자이고, 주로 옥수수, 고구마, 감자, 밀, 쌀 등으로부터 생산되어 가공식품부터 직물용 호료, 제지공업, 제약공업 등 산업전반에 걸쳐 광범위하게 사용되고 있다. 사람이 섭취하는 탄수화물의 반 이상이 전분으로 알려져 있으며, 주로 췌장이나 타액샘에서 분비되는 α-아밀라아제로 빠르게 가수분해 되는 성질이 있다.

한편, 본 발명에서는 이러한 전분을 약물전달체인 폐질환 다공성 미립자의 제조에 사용함으로써 본 발명의 미립자 내에 함유된 약물, 즉 항산화제의 방출이 체내에서 지속적으로 이루어질 수 있도록 하였고, 궁극적으로 폐질환의 치료효과를 보다 향상시킬 수 있도록 하였다.

본 발명에서 사용할 수 있는 상기 전분을 특별히 제한하는 것은 아니나, 일반 옥수수 전분, 고아밀로오스 옥수수 전분, 찰옥수수 전분, 쌀 전분, 찹쌀 전분, 고아밀로오스 쌀 전분, 감자 전분, 찰 감자 전분, 고구마 전분, 보리 전분, 찰 보리 전분, 콩(pea) 전분, 밀 전분, 찰 밀 전분, 사고(sago) 전분, 아마란스 전분, 타피오카 전분, 수수(sorghum) 전분, 찰수수 전분, 바나나 전분, 녹두 전분, 동부 전분, 쿠즈(kuzukiri) 전분, 이들 전분의 유도체 및 이들 전분에서 추출된 아밀로오스로 이루어진 군에서 선택된 전분일 수 있다.

또한 본 발명 상기 다공유도 물질은 미립자가 다수의 기공을 가질 수 있도록 하는 물질을 말하며, 지금까지 연구된 바에 의하면 약물전달체로서 다공성 미립구가 비다공성 미립구에 비해 약물 전달 효과가 더 우수하다고 밝혀진 바 있다(D.A. Edwards et. al., Science 276:1868-1871, 1997). 이는 다공성 구조를 갖는 미립구는 실제 크기에 비해 공기 역학적 크기(aerodynamic diameter)가 작기 때문에, 폐를 통한 약물 전달 측면에 대식세포에 의한 식세포 작용을 최소화시키고, 우수한 폐포로의 침적 효율을 극대화하는데 효과적이기 때문이다.

이러한 다공유도 물질로 사용할 수 있는 물질로는 암모늄 바이카보네이트를 사용할 수 있다.

나아가 본 발명은 폐질환용 다공성 미립자를 제조하는 방법을 제공함에 그 특징이 있는데, 상기 제조방법은 이중에멀션 유기용매 증발법(W₁/O/W₂ double emulsion)을 통해 제조할 수 있다.

보다 바람직하게 상기 미립자의 제조방법은, (a) 다공유도 물질 및 점성질 물질을 포함하는 증류수에 항산화제를 용해하여 내부 수상(W₁)을 제조하는 단계; (b) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 유기상(O)을 제조하는 단계; (c) 상기에서 제조된 내부 수상(W₁) 및 유기상(O)을 혼합하여 1차 에멀젼(W₁/O)을 형성하는 단계; 및 (d) 상기 형성된 1차 에멀젼을 외부 수상(W₂)에 분산시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 "이중에멀션 유기용매 증발법"이란 약물을 함유한 수용액을 고분자가 함유되어 있는 유기용매에 분산시켜서 1차 에멀젼을 형성 (W₁/O)한 다음, 이를 2차 수상(W₂)에 분산시킨 후 유기용매를 증발시켜 입자를 제조하는 방법이다. 이 방법은 유기용매상의 고분자가 수상에 분산된 이후 유기용매가 추출 또는 증발 등의 과정을 통해 고분자의 용해도가 감소됨에 따라 고형화되어 입자가 형성되는 원리이다.

본 발명에 따른 미립자의 제조방법에서, 상기 (a) 단계는 내부 수상(W₁)을 제조하는 단계로, 다공유도 물질(polymeric pore generator) 및 점성질 물질을 포함하는 증류수에 항산화제를 용해시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 상기 (a) 단계에서 다공유도 물질은 기공을 유도할 수 있는 중합체로, 바람직하게는 암모늄 바이카보네이트를 사용할 수 있고, 상기 점성질 물질은 점성을 나타내는 물질로, 바람직하게는 전분을 사용할 수 있으며, 상기 항산화제로는 항산화효과를 나타내는 물질을 사용할 수 있는데, 바람직하게는 안토시아닌을 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 (a) 단계에서 증류수에 포함되는 점성질 물질은 첨가되는 항산화제 대비 1 : 1 내지 1 : 10의 질량비로 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 1 : 2 내지 1 : 5 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 : 1 내지 1: 2일 수 있다.

본 발명의 상기 (b) 단계는 유기상을 제조하는 단계로 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 상기 (b) 단계에서 사용할 수 있는 생분해성 고분자는 이에 제한되지는 않으나, 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락타이드글리콜라이드(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 이들의 유도체 및 이들의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 (b) 단계에서 사용할 수 있는 유기용매는 생분해성 고분자를 균일하게 용해시킬 수 있는 용매라면 특별히 그 종류를 제한하지는 않으나, 바람직하게는 수상과 섞이지 않는 소수성 및 휘발성이 강한 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 디메틸포름아마이드, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, 디메틸설폭사이드 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게 생분해성 고분자로 PLGA를 사용하는 경우 유기용매로 디클로로메탄 또는 에틸 아세테이트를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 (a) 단계 및 상기 (b) 단계는 순차적이지 않으며, 어느 것을 먼저 제조하여도 무방하다.

본 발명의 상기 (c) 단계는 상기(a) 단계 및 (b) 단계에서 제조된 각각의 용액을 혼합하여 1차 에멀젼(W₁/O)을 형성하는 단계로서, 혼합되는 내부 수상(W1) 대 유기상(O)의 부피비는 1: 2 내지 1 :10 일 수 있으며, 바람직하게는 1 : 2 내지 1 : 5일 수 있다.

상기 (c) 단계의 1차 에멀젼은 강렬한 교반을 통하여 유화될 수 있는데, 예를 들어 초음파파쇄기, 호모믹서, 교반기 등과 같은 기구를 이용하여 에멀젼을 제조할 수 있다.

이후 상기 형성된 1차 에멀젼은 외부 수상(W₂)에 분산시키는 단계를 포함할 수 있으며, 추가로 외부 수상에 분산시킨 후 유기용매를 증발시키는 단계를 더 수행할 수 있다.

상기 외부 수상은 폴리비닐알코올 및 염화나트륨이 용해된 수용액이 바람직하다. 이렇게 1차 에멀젼을 외부 수상에 분산시키는 경우, 결과적으로 이중에멀젼(W₁/O/W₂ emulsion)이 형성될 수 있으며, 이중에멀젼에서 유기용매를 분산시킴으로써 본 발명의 다공성 미립자를 제조할 수 있다.

한편, 상기와 같은 제조방법으로 제조된 본 발명의 다공성 미립자는 5 내지 100 ㎛의 입경을 가지는 것을 특징으로 하는데, 이러한 미세한 입자크기로 인해 본 발명의 미립자가 폐로 흡입되는 경우 폐 심부 상피세포에 신속히 이동하여 효과적으로 폐포에 침적될 수 있으며, 동시에 대식세포에 의한 파괴를 줄일 수 있으므로 봉입된 항산화제의 안정성을 유지할 수 있을 뿐만 아니라 약물의 손실을 최대한 줄일 수 있는 이점이 있다.

또한 본 발명의 폐질환 치료용 다공성 미립자는 점성을 가지는 물질을 유효성분으로 포함하여 장기간 지속적인 생리활성약제(항산화제)의 방출이 가능하므로, 지속적인 항산화제의 활성산소 소거능으로 인해 폐질환을 효과적으로 치료하는데 유용하다.

이와 같은 효과는 하기 실시예에서 증명하였는데, 즉 점성질 물질의 첨가 없이 항산화제로 안토시아닌만을 봉입한 다공성 미립자가 폐로 흡수된 경우, 안토시아닌의 방출 지속 시간이 2시간인 반면, 본 발명의 다공성 미립자의 경우 안토시아닌의 방출 지속력이 최대 5일간 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명의 다공성 미립자는 활성산소로 인해 유도되는 산화적 스트레스를 완화시킬 수 있으므로, 이러한 본 발명의 다공성 미립자는 폐질환 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 뿐만 아니라 상기 미립자는 생분해성 고분자에 항산화제, 점성질 물질 및 다공유도 물질이 봉입된 흡입형 제제로 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 다공성 미립자가 치료효과를 가지는 폐질환으로는 활성산소로 인해 유도되는 산화적 스트레스와 관련된 폐질환이라면 특별히 한정하지는 않으나, 바람직하게는 만성폐쇄성폐질환일 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

먼저 하기 실시예에서 수행하는 시약 및 이들의 구입처는 다음과 같다. 안토시아닌(시아니딘-3-글루코시드, 검은콩으로부터 추출)은 Rural Development Administration, Republic of Korea에서 구입하였으며; 전분(soluble, ACS reagent), 소듐 아자이드(sodium azide), 포르말린(formalin), 디클로로메탄(dichloromethane: DCM), 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide:　DMSO), 4-디메틸아미노피리딘(４-dimethylaminopyridine: DMAP), N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimde: DCC), 트리에틸아민(triethylamine: TEA), 소듐 클로라이드(NaCl), 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate), 플루오레세인 아이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate: FITC), 2,2-디페닐-1-피크릴-히드라질(2,2-diphenyl-1-pikryl-hydrazyl: DPPH), 인산(phosphoric acid) 및 폴리비닐 알콜(PVA: MW 12,000-23,000 달톤)은 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하였으며; 폴리락타이드글리콜라이드(RG504; lactide:glycolide=50:50, MW 48,000 달톤)는 Boehringer-Ingelheim(USA)에서 구입하였으며; Dulbeco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 0.25%(wt./vol.), 트립신/0.03%(wt./vol.) EDTA, fetal bovine serum(FBS), 및 페니실린-스트렙토마이신은 Welgene, Inc.(korea)에서 구입하였다.

< 실시예 1>

다공성 미립자의 제조

본 발명의 다공성 미립자들은 전통적인 W₁/O/W₂ 이중 에멀젼 공법에 의해 제작되었다.

20mg의 안토시아닌(시아니딘-3-글루코시드, Rural Development Administration, Republic of Korea)을 암모늄 바이카보네이트 및 전분을 포함하는 1.0mL의 희석된 물에 용해하여 내부 수상(W₁)을 제조하였다. 또한 100mg의 PLGA를 3mL의 디클로로메탄에 용해하여 유기 상을 준비하였다. 각각의 용액은 혼합한 후 30초 동안 강하게 교반하였다. 이렇게 교반하여 유화된 W1/O 에멀젼(1: 5)을 1.0중량% 폴리비닐알코올 및 0.9중량% 염화나트륨을 포함하는 수용액(외부 수상, W₂) 200ml에 투입한 후 호모 믹서(Primix Corp, Japan)를 이용하여 3000rpm에서 5분 동안 교반하여 W₁/O/W₂의 이중 에멀젼을 제조하였다.

상기 W₁/O/W₂의 이중 에멀젼 혼합물은 50℃에서 1시간 동안 약하게 교반하여, 유기용매를 증발시킨 후, 3000rpm에서 2분 동안 원심분리함으로써 다공성 미립자를 수득하였다. 상기 수득된 입자들은 0.9중량% 염화나트륨 수용액으로 3번 세척한 다음 3일 동안 동결건조하였다.

본 발명의 다공성 미립자에서 안토시아닌 로딩 효율은 추출법에 의해 측정되었다. 상기에서 제조된 10mg의 다공성 미립자를 2ml의 인산 및 4ml의 디클로로메탄과 같은 비혼합(immisible) 용매에 용해하였다. 인산에 용해된 안토시아닌은 519nm 파장에서 UV/visible 분광광도계로 측정되었다. 추가로 519nm에서 흡수는 안토시아닌 농도에 비례한다. 그 결과 안토시아닌 로딩 효율은 60 내지 70중량%를 나타내었다.

< 실시예 2>

본 발명의 다공성 미립자의 형태 분석

본 발명의 다공성 미립자의 형태학적 분석을 위해, 하기 표 1에서 나타낸 조성별로 상기 실시예 1의 W₁/O/W₂ 이중 에멀젼 방법을 이용하여 각각의 다공성 미립자를 제조하였으며, 이들을 전계방사 주사전자현미경(Field Emission Scanning Electron Microscope, Hitachj S-4800, USA)을 통해 확인하였다.

이하에서는 설명의 편의를 위하여 하기 표 1의 조성으로 제조된 각각의 다공성 미립자들을 Non-PM, ATH-PM, ATH-S-PM1, ATH-S-PM2, ATH-S-PM3 이라고 표시한다. 상기에서 Non-PM은 암모늄 바이카보네이트가 첨가되지 않고 제조된 미립자이며, ATH-PM는 암모늄 바이카보네이트는 첨가되나 전분이 첨가되지 않고 제조된 다공성 미립자를 나타낸다. 또한 ATH-S-PM1, ATH-S-PM2, ATH-S-PM3은 첨가된 전분의 질량에 따라 순번을 매긴 것이다.

제조된 각각의 다공성 미립자 시료(Non-PM, ATH-PM, ATH-S-PM1, ATH-S-PM2, ATH-S-PM3)는 분석 전에, 카본으로 진공 코팅되었다. 단면의 형태학적 관찰을 위해, 다공성 미립자들은 젤라틴/글리세린 젤 안에 침투시킨 후 초박편 제작기로 단면화하였다. 미립자 안에 안토시아닌의 분산을 가시화하기 위하여, 50mM 안토시아닌은 10ml의 디메틸설폭사이드에서 N,N'-디사이틀로헥실카보디이미드, 4-디메틸아미노피리딘 및 트리에틸아민을 이용하여 4시간 동안 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC)로 라벨링되고, 한외여과(막 분자량 cut-off, 500 달톤)를 이용하여 응축하였다. 2일 동안 동결건조된 FITC-라벨링된 안토시아닌은 다공성 마이크로 입자 안에 봉입되었다. 단면화된 미립자 안에 안토시아닌 분산은 형광현미경(E-SCOPE 1500F, Korea)을 이용하여 확인하였다.

안토시아닌이 봉입된 다공성 미립자의 제작을 위하여 사용된 시료의 조성

시료	PLGA (mg)	기공유도중합체 (mg)	Internal Water Phase (W1, DW)(ml)/ 안토시아닌(mg)/ 전분(mg)	DCM (ml)	PVA(%)/ NaCl(%) (W2)	혼합 속도 (rpm)	Hardeming Temp&Time
Non-PM	RG504 (100)	-	1/20/0	3	1/0.9	3,000	50℃, 1시간
ATH-PM		암모늄 바이카보네이트 (40)	1/20/0
ATH-S-PM1		암모늄 바이카보네이트 (40)	1/20/8
ATH-S-PM2		암모늄 바이카보네이트 (40)	1/20/16
ATH-S-PM3		암모늄 바이카보네이트 (40)	1/20/32

그 결과 다공성을 위한 전처리과정 동안(50℃에서 1시간 동안), 가스 형성을 유도하는 기공유도중합체인 암모늄 바이카보네이트의 증기는 많은 외부 및 내부의 기공을 발생시켰다. 첨가제로 전분이 없는 다공성 미립자들(ATH-PM)은 전분을 가지는 다공성 미립자들(ATH-S-PM1, ATH-S-PM2, ATH-S-PM3)의 표면 보다 더 깔끔한 기공을 보였으며, 전분을 포함하는 다공성 미립자들(ATH-S-PM1, ATH-S-PM2, ATH-S-PM3)의 평균 크기는 FE-SEM 이미지에서 5 내지 100μm로 나타났다(도 1 참조). 또한 단면화된 다공성 미립자들(ATH-S-PM3)의 FE-SEM 이미지를 통해 미립자들의 내부에 기공 구조가 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

본 발명의 다공성 미립자(ATH-S-PM3) 내부에 항산화제인 안토시아닌이 분산된 정도를 평가하기 위하여, 형광염료(FITC)를 안토시아닌에 부착시켰으며 단면화된 미립자들은 형광현미경을 이용하여 관찰하였다.

그 결과 도 3에서 보이는 바와 같이, 안토시아닌은 다공성 미립자들 내부에 널리 분산된 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3>

본 발명의 다공성 미립자의 가공밀도( tap - density ) 측정

200mg의 본 발명의 다공성 미립자들(ATH-S-PM1, ATH-S-PM2, ATH-S-PM3)을 5ml 메스실린더에 이동시킨 후, 처음 볼륨을 측정하였다. 상기 미립자들의 가공밀도(ρ)는 100 태핑 후 차지하게 되는 미립자들의 볼륨(ml)을 미립자들의 무게(g)로 나누어 계산하였다.

그 결과는 도 4에서 나타낸 바와 같이 다공성 구조로 본 발명의 미립자들은 낮은 질량밀도를 나타내었다. 모든 다공성 미립자들은 0.12g/cm³ 미만의 낮은 질량밀도를 나타냈다. 이러한 특징은 폐 상피세포 안에 침적되기 위한 이점으로 작용할 수 있다. 본 발명의 다공성 미립자들(ATH-S-PM1, ATH-S-PM2, ATH-S-PM3)은 첨가되는 전분의 농도에 비례하여 미립자들의 질량밀도가 증대되었다.

< 실시예 4>

본 발명의 다공성 미립자로부터 안토시아닌의 방출 측정

시간의 경과에 따라 본 발명의 다공성 미립자들로부터 안토시아닌 방출을 인 비트로 상에서 확인하기 위하여, 다공성 미립자 각각(ATH-PM, ATH-S-PM1, ATH-S-PM2, ATH-S-PM3)을 PBS 안에서 모니터링하였다.

상기 각각의 미립자들 10mg씩을 투석 막 튜브(spectra/por, MWCO 15,000 달톤)에 첨가한 후, 37℃에서 신선한 PBS pH7.4(10ml, ionic strength: 0.15; 0.01% 소듐 아지드)를 포함하는 바이알에 침전시켰다. 상기 투석 백의 바깥 상은 정해진 시간 간격에서 신선한 버퍼 용액으로 교체되었다. 각각 용액의 안토시아닌 농도는 UV/visible 분광광도계를 이용하여 519nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 전분을 포함하지 않은 ATH-PM은 안토시아닌 방출이 2시간 안에 100중량% 에 이르렀으며, 이는 다수 형성된 기공으로부터 안토시아닌의 빠른 방출 및 다공성으로 인한 넓은 표면적에서 기인한 것으로 추정되었다. 그러나 점착성 전분을 첨가하여 제조된 본 발명의 ATH-S-PM1은 20시간 이전에 안토시아닌 양의 65중량%가 방출되었으나, 48시간 동안 안토시아닌의 방출이 지속되는 것으로 나타났으며, 첨가되는 전분의 농도가 증가할수록 안토시아닌이 방출되는 기간이 최대 120시간까지 길어지는 것을 알 수 있었다. 첨가되는 전분 농도가 가장 높은 ATM-S-PM3은 안토시아닌 방출이 120시간 지속되는 것으로 나타났으며, 20시간 이전에 방출되는 안토시아닌 양이 10중량% 보다 적은 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5>

본 발명의 다공성 미립자의 DPPH 라디칼 소거활성 측정

안토시아닌을 봉입하고 있는 본 발명의 다공성 미립자의 항산화활성을 평가하기 위하여 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였다.

상기에서 제조된 본 발명의 다공성 미립자 시료(ATH-S-PM3, 표 1참조)를 PBS pH7.4 버퍼에 부유시켜 현탁액 0.2ml를 형성한 후, 이 현탁액에 4×10^-4M DPPH 용액 1.8ml를 혼합한 후 실온에서 30분 동안 반응시켰다. DPPH 자유 라디칼과 안토시아닌의 반응에 의해 야기되는 DPPH의 색상 변화는 UV/visible 분광광도계(varian CARY 1E, USA)를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 전분을 첨가하지 않고 제조한 다공성 미립자 시료(ATM-PM)를 대조군으로 비교하였다.

안토시아닌이 봉입된 미립자들의 라디칼 소거 활성(%)은 하기의 관계에 따라 517nm에서 DPPH 흡광도 측정을 통해 이루어졌다.

라디칼 소거 활성(%) = [1 - (A_DPPH + A_ATH - A_DPPH _- _ATH)/A_DPPH]×100

상기에서 A_DPPH는 개시 DPPH, A_ATH는 개시 ATH, A_DPPH _- _ATH는 DPPH/ATH 혼합물의 흡광도를 나타낸다.

그 결과는 도 6에서 나타내었으며, 도 6에서 나타난 바와 같이 상기 실시예 4의 결과와 유사하게 본 발명의 다공성 미립자(ATH-S-PM3)는 DPPH 라디칼 소거활성이 120시간까지 지속되는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 안토시아닌의 지속적인 방출에 기인하는 것으로 판단되었다. 특히 본 발명의 다공성 미립자의 DPPH 라디칼 소거활성의 지속시간은 대조군인 ATM-PM의 라디칼 소거활성이 2시간 내에 완료된 것과 비교되는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 다공성 미립자들이 폐로 흡입될 경우, 폐로의 항산화제의 지속적인 전달에 유용할 수 있음을 추측할 수 있었다.

< 실시예 6>

in vivo 상에서 본 발명의 다공성 미립자의 폐에 침적( deposition ) 효과 확인

in vivo 상에서 본 발명의 다공성 미립자의 폐에 침적여부를 확인하기 위하여 4-6 주 암컷 BALB/c 마우스들(institute if medical sciencem japan)을 이용하여 폐 침적 테스트를 하였다.

안토시아닌(FITC로 라벨링됨)이 봉입된 본 발명의 건조된 다공성 미립자들(ATH-S-PM3, 400μg/mouse)은 insufflator device(DP-4M) 및 air pump(AP-1; Penn-Century Inc., USA)를 이용하여 마우스들의 기도를 통해 흡입되었다. 기도 열림 및 미립자 흡입은 마우스 speculum에 부착되는 오토스콥 세트(Heine Mini3000, Germany)로 확인하였다. 이렇게 본 발명의 다공성 미립자를 흡입한 마우스들은 정해진 시간 간격으로(30분, 1일, 3일, 5일, 10일, 20일)에 희생되었다. 마우스들의 폐엽은 기도와 함께 적출되었으며, 이미지 스테이션 4000MM(Kodak, USA)를 이용하여 가시화하였다. 추가로, 폐 적출물은 10% 포르말린으로 고정되었으며 파라핀에 침투되었다. 크로스 슬라이드된 폐 절편은 헤마토실린 및 에오신으로 염색되었으며, 광학현미경을 이용하여 관찰하였다. 이 때 전분을 첨가하지 않고 제조한 다공성 미립자 시료(ATM-PM)를 대조군으로 비교하였다.

그 결과는 도 7에서 나타내었다. 도 7a는 본 발명의 다공성 미립자들이 폐에 흡입된 후 30분이 경과한 다음, 미립자들의 폐에 침적된 정도를 나타낸 사진이며, 도 7b는 본 발명의 다공성 미립자들이 폐에 흡입된 후 1일, 3일, 5일, 10일 및 20일 후, 미립자들의 폐에 침적정도를 나타낸 것이다. 폐의 상피세포 내로의 안토시아닌의 분산은 RGB 스펙트라로 측정되었다. 본 발명의 다공성 마이크로입자(ATH-S-PM3)는 폐에 효율적으로 침적되었으며(도 7a 참조), 전체 폐 로브속으로 분산되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

또한 도 7b에서 보이는 바와 같이, 시간의 경과에 따른 폐 상피세포 상에 잔류하는 안토시아닌의 양을 확인할 수 있었다. 이를 자세히 살펴보면 대조군인 ATM-PM의 경우, 안토시아닌 방출이 단시간 내에 급격히 이루어져 3일 이후에는 안토시아닌의 잔류량이 매우 적은 것을 확인할 수 있었으며, 이에 반해 본 발명의 다공성 미립자인 ATM-S-PM3은 5일까지 매우 높은 비율로 안토시아닌이 잔류하는 것으로 나타나 5일까지 방출이 지속되는 것을 알 수 있었고, 게다가 안토시아닌이 폐 안에서 유지되는 기간도 20일 동안 지속되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 7>

본 발명의 다공성 미립자들의 적용에 따른 폐 세포의 조직학적 평가

본 발명의 다공성 미립자를 폐 세포에 적용하는 경우 폐 조직에 미치는 영향을 확인하기 위한 것으로, 본 발명의 다공성 미립자인 ATH-S-PM3를 BALB/c 마우스들의 폐에 적용하여 폐 조직의 면역반응이 일어나는지 실험하였다.

본 발명의 다공성 미립자인 ATH-S-PM3를 BALB/c 마우스들의 폐에 적용하여 10일이 경과한 후, 폐 조직의 조직학적 온전함은 H&E 염색을 이용하여 조사되었다.

그 결과 도 8에서 나타난 바와 같이, ATH-S-PM3로 처리된 폐 조직 시료가 무처리군의 폐 조직과 비교하여 호중구(백혈구) 침투 및 외래 바디 반응의 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 다공성 미립자들의 폐로의 흡입(도입)이 신체 내에서 면역반응을 일으키지 않고 안정성을 나타낸다는 것을 증명할 수 있었다.

< 실시예 8>

본 발명의 다공성 미립자가 담배연기의 독성으로부터 폐 상피세포를 보호하는 효과 확인

담배연기 추출물에 대한 본 발명의 다공성 미립자의 항산화 활성을 평가하기 위하여, in vitro 상에서 alveolar-type-Ⅱ-like A549 세포들을 담배연기 추출물이 포함된 배지에 배양한 후 본 발명의 다공성 미립자를 적용하여 세포 생존률(cell viability, %)을 측정하였다.

alveolar-type-Ⅱ-like A549 상피세포(the korean cell line bank)는 humidified incubator 안에 37℃, 5% CO₂에서 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신과 함께 공급되는 DMEM 배지에서 배양되었다. 테스트 전에, 단일층으로 성장한 세포(1×10⁶ cells/ml)는 0.25%(wt./vol.) 트립신/0.03%(wt./vol.) EDTA 용액을 이용하여 트립신처리법에 의해 수득하였다. DMEM 배지 10ml에 현탁된 A549 세포는 96-well 플레이트에 분주하고 세포 테스트 전에 24시간 동안 배양되었다.

세포 테스트 전에, 담배연기 추출물 수용액은 표준 흡연법에 따라 25mg 타르, 2.5mg 니코틴을 생산하는 여과되지 않은 담배(plain-tipped cigrettes; Davidoff 1000; Davidoff and Cie, Switzerland)로 준비된다. 하나의 담배로부터 발생되는 연기는 DMSO 안에 즉시 용해된다 (이는 하나의 포트를 통하여 DMSO 2ml를 포함하는 앰플과 연결되고 스탑코크를 가지는 20ml 실린지 안에 drawing consecutive puff에 의하여 용해된다). 3초 동안의 20ml 퍼프 드로운은 5초 동안 DMSO 안에서 거품이 만들어진다. 하나의 담배당 50 퍼프의 평균은 이러한 과정으로 수집된다. DMSO 안에서 담배연기 추출물은 사용되기 전에 배양 배지로 희석되었다.

세포 생존률의 평가를 위하여, A549 세포는 본 발명의 다공성 미립자(100μM) 및 1% 담배연기 추출물 수용액(99%(부피비) DMSO 및 1%(부피비) 담배연기 추출물을 포함) 존재 하에 DMEM 배지 200μL 안에서 배양되었다. 1일간 배양시킨 후, 세포 배양 배지의 부피의 반을 매일 제거한 후 새로운 1% 담배연기 추출물 수용액을 포함하는 DMEM 100μl로 갈아주었다. 그 결과 다공성 마이크로입자로부터 방출되는 안토시아닌 양의 절반이, 매일 세포 배양 배지로부터 제거되었다. 각각의 배양기간(2일, 3일, 5일) 후에 세포들은 새로운 PBS pH7.4 150mM로 세척되고, 10%(vol./vol.) CCK-8 (cell counting kit-8, dojindo molecular technologies inc., japan)을 포함하는 새로운 DMEM 안에서 다시 배양시켰다. 이렇게 배양된 세포들은 2시간 후에 마이크로플레이트 리더(greenmate biotech corp, korea)를 이용하여 450nm에서 광학밀도를 분석을 통해 세포생존률을 측정하였다. 이때 안토시아닌이 처리되지 않은 군(대조군 1)과 안토시아닌이 처리된 군(대조군 2)을 대조군으로 비교하였다(대조군 1은 상기 배지에 아무것도 넣지 않은 무첨가 군이며, 대조군 2는 상기에서 본 발명의 다공성 미립자(100μM) 대신 안토시아닌을 100μM 넣어준 군이다.)

그 결과 도 9에서 나타낸 바와 같이, 안토시아닌이 처리된 군(대조군 2)은, 오직 담배연기 노출의 첫 번째 단계(배양기간 2일)에서 활성산소종을 킬레이트 할 수 있었지만, 시간의 경과에 따라 안토시아닌은 지속성이 없으므로 세포 생존률이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

이에 비해 본 발명의 다공성 미립자인 ATH-S-PM3의 첨가군은 담배연기로부터 유도되는 A549 세포의 사멸이 5일이 경과한 후에도 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 다공성 미립자인 ATH-S-PM3로부터 지속적인 안토시아닌 방출이 활성산소종의 독성으로부터 A549 세포들을 지속적으로 보호하는 놀라운 능력을 증명할 수 있었다.

결론적으로 본 발명의 다공성 미립자는 항산화제인 안토시아닌 및 전분을 함께 첨가하여 제조됨으로써, 안토시아닌의 장기간에 걸친 지속적인 방출이 가능한 특징을 가진다. 이는 상기와 같은 실시예를 통해서도 확인할 수 있는데, 특히 실시예 5에서는 본 발명의 다공성 미립자인 ATH-S-PM3의 DPPH 라디칼 소거활성이 120시간까지 지속되는 것을 확인할 수 있었으며, 실시예 6에서는 본 발명의 다공성 미립자인 ATM-S-PM3은 5일까지 매우 높은 비율로 안토시아닌이 잔류하는 것으로 나타나 5일까지 방출이 지속되는 것을 알 수 있었고, 실시예 8에서는 본 발명의 다공성 미립자가 담배연기의 독성으로부터 폐 상피세포를 보호하여 세포 생존율 감소를 완화시키는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 이러한 본 발명의 다공성 미립자를 흡연자에게 적용하는 경우 흡연으로 인해 발생되는 활성산소종의 독성으로부터 폐 세포를 지속적으로 보호할 수 있으므로 만성폐쇄성폐질환을 갖는 환자에게 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

생분해성 고분자, 항산화제, 점성질 물질 및 다공유도 물질을 포함하는 폐질환 치료용 다공성 미립자.
제1항에 있어서,
상기 생분해성 고분자는 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락타이드글리콜라이드(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 이들의 유도체 및 이들의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 폐질환 치료용 다공성 미립자.
제1항에 있어서,
상기 항산화제는 안토시아닌, 제니스테인, 퀴세틴, 리코펜, 루테인, 레스베라스톨, 피크노게놀, 알리신, 유비키논 및 카테킨으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 폐질환 치료용 다공성 미립자.
제1항에 있어서,
상기 점성질 물질은 전분인 것을 특징으로 하는 폐질환 치료용 다공성 미립자.
제1항에 있어서,
상기 미립자는 5 내지 100μm의 입경을 가지는 것을 특징으로 하는 폐질환 치료용 다공성 미립자.
제1항에 있어서,
상기 폐질환은 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)인 것을 특징으로 하는 폐질환 치료용 다공성 미립자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미립자는 폐 대식세포의 식작용을 피할 수 있으며, 점성질 물질로 인해 항산화제가 지속적으로 방출할 수 있는 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 폐질환 치료용 다공성 미립자.
(a) 다공유도 물질 및 점성질 물질을 포함하는 증류수에 항산화제를 용해하여 내부 수상(W₁)을 제조하는 단계;
(b) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 유기상(O)을 제조하는 단계;
(c) 상기에서 제조된 내부 수상(W₁) 및 유기상(O)을 혼합하여 1차 에멀젼(W₁/O)을 형성하는 단계; 및
(d) 상기 형성된 1차 에멀젼을 외부 수상(W₂)에 분산시키는 단계를 포함하는 폐질환 치료용 다공성 미립자의 제조방법.
제8항에 있어서.
상기 (a) 및 (b) 단계는 비순차적인 것을 특징으로 하는 폐질환 치료용 다공성 미립자의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 상기 다공유도 물질은 암모늄 바이카보네이트이고, 상기 점성질 물질은 전분이고, 상기 항산화제는 안토시아닌인 것을 특징으로 하는 폐질환 치료용 다공성 미립자의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 생분해성 고분자는 폴리락타이드글리콜라이드(PLGA)이며, 유기용매는 디클로로메탄(DCM) 또는 에틸 아세테이트인 것을 특징으로 하는 폐질환 치료용 다공성 미립자의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 내부 수상(W1) 대 유기상(O)의 혼합 부피비는 1 : 2 내지 1 : 10인 것을 특징으로 하는 폐질환 치료용 다공성 미립자의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 (d) 단계에서 외부 수상(W₂)은 폴리비닐알코올 및 염화나트륨이 용해된 수용액인 것을 특징으로 하는 폐질환 치료용 다공성 미립자의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 미립자는 생분해성 고분자에 항산화제, 점성질 물질 및 다공유도 물질이 봉입된 흡입형 제제로 제조되는 것을 특징으로 하는 폐질환 치료용 다공성 미립자의 제조방법.