KR20120103725A - 표적 탐색 리간드를 포함하는 접합체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 작용제가 캡슐화 재료로 캡슐화된 작용제 복합체 및 프로스타시클린 유사체인 적어도 하나의 표적 탐색 리간드를 포함하는 접합체, 및 또한 그의 용도에 관한 것이다.

Description

표적 탐색 리간드를 포함하는 접합체 및 그의 용도{CONJUGATE WITH TARGET-FINDING LIGAND AND USE THEROF}
본 발명은 표적 탐색 구조체로서 프로스타시클린 유사체를 포함하는 작용제 (agent)를 포함하는 접합체, 및 기관지 및 폐포 상피 세포에 있어서 유전자 요법 및/또는 유전자 전달에 있어서의 그러한 접합체의 용도에 관한 것이다.
첫째, 폐는 그 기능이 필수적인 기관이며, 둘째, 폐는 그의 큰 표면적 및 접근성 때문에 활성 물질 또는 활성제를 체내로 도입하는 데 있어서 매력적인 기관이다.
활성제를 국소적 활성 및 전신적 활성 둘 모두를 위하여 에어로졸, 분무기, 흡입기 또는 펌프 스프레이를 통하여 폐 내로 도입하는 것이 오랫동안 공지되어 있었다. 또한, 유전자 요법 목적을 위하여 폐를 통하여 바이러스 또는 비바이러스 유전자 전달제 (gene transfer agent)를 투여하는 것이 공지되어 있다. 바이러스성 및 비바러스성 부형제 둘 모두를 사용하는 것은 흔히 부작용을 초래한다. 이는 특히 용량이 상대적으로 높아야 한다는 사실로 인한 것이며, 그 이유는 유전자 전달, 즉, 요망되는 유전자를 세포 내로 도입하는 것이 흔히 충분하게 효과적이지 않기 때문이다. 따라서 연구자들은 유전자 전달 능률을 개선시키는 작용제를 오랫동안 찾아 왔다. 이와 관련하여, 유전자를 양이온성 지질로 캡슐화하는 것이 이미 제안되었으며, 그 이유는 양이온성 입자가 더욱 용이하게 식작용을 받기 때문이다. 이와 관련하여 제안된 그리고 이미 임상 실험의 대상인 [7] 작용제로는 겐자임 (Genzyme) 지질 67이 있다. 핵산의 캡슐화를 위하여 폴리에틸렌이민 중합체 (PEI)를 사용하는 것이 또한 공지되어 있다 [8]. PEI는 DNA를 보호할 수 있지만, 이것은 유전자 전달 능률이 불량하다는 약점을 가지며, 또한 불량한 트랜스펙션 능률로 인하여 요구되는 PEI의 높은 용량은 염증을 야기함이 또한 밝혀졌다.
따라서 연구자들은 또한 양이온성 중합체 캡슐화된 입자를 세포 내로 도입하고자 의도된 리간드를 이용하여 상기 입자를 제공하려고 오랫동안 시도하였다. 트랜스페린 [10], 폴산 [11], 락토페린 [12], 클렌부테롤 [13] 및 성장 인자, 예컨대 EGF [14]를 이용하는 것이 이미 시도되었다. 이들 리간드를 이용하여 PEI 매개 유전자 전달을 개선하는 것이 가능하였지만, 활성제를 표적화된 방식으로 그리고 고효율로 폐에 전달하는 것에 대한 요구가 여전히 있다.
더욱이, 만성 폐 질환의 신규한 치유적 치료 경로를 찾으려는 시도가 진행 중인데, 유전자 전달은 상기 만성 폐 질환에 있어서 전도유망한 접근법이다. 유전적이거나 또는 후천적인 단백질 및/또는 유전자 결함으로 인한 것인 폐 질환은 그 상실된 또는 손상된 단백질 또는 유전자 생성물을 제공함으로써 개선되거나, 완화되거나 또는 실제로 치유될 수 있다. 그러나, 그러한 목적을 위한 투여는 규칙적이어야 한다. 따라서, 요망되지 않는 부작용과 요망되는 치료 효과 사이에 균형을 찾아야 한다. 또 다른 중요한 측면은 장기간 요법에 요구되는 투약 빈도이다.
따라서 본 발명의 목적은 폐 질환의 치료 또는 완화에 적합한 활성 물질 또는 활성제가 폐 세포에 의해, 특히 기관지 및 폐포 상피 세포에 의해 표적화된 방식으로 흡수될 수 있는 형태로 제공되게 하는 접합체를 제공하는 것이었다.
이 목적은 청구항 1에 정의된 접합체에 의해 해결된다.
놀랍게도, 폐 상피 세포, 즉, 기관지 상피 세포 및 폐포 상피 세포는 IP1 수용체를 가지며 이들 수용체는 활성 물질 포함 입자의 효율적인 전달을 위해 표적화될 수 있음이 밝혀졌다. 본 발명에 따른 접합체를 사용하면, 표적 탐색 구조체로서 적어도 하나의 프로스타시클린 유사체를 사용함으로써 기관지 및 폐포의 상피 세포가 이들 IP1 수용체를 통하여 성공적으로 표적화될 수 있다.
하기의 것에서, 본 발명의 주제가 상세하게 기술되며, 특징 및 이점이 더욱 더 상세하게 예시된다. 또한 본 발명은 첨부된 도면에 더욱 더 상세하게 제시되어 있으며, 여기서,
도 1은 인간 폐포 및 기관지 상피 세포의 IP1 수용체의 웨스턴 블롯 (Western Blot) 분석 결과를 도시한다.
도 2는 각각 FLUO-BSA-ILO 및 FLUO-BSA-TRP와 함께 인큐베이션한 후 A549 및 16HBE14o- 세포의 형광 강도를 도시한다.
도 3a는 상이한 세포주에서 FLUO-BSA-ILO와 비교하여 FLUO-BSA의 형광 강도를 도시하며; 도 3b 및 도 3c는 각각 CAY10449 및 ILO 농도의 증가시의 평균 형광 강도를 도시하며; 도 3d는 CAY10449의 첨가 후 FLUO-BSA-ILO의 평균 형광 강도를 도시하며; 도 3e는 표면 결합의 공초점 레이저 주사 현미경 사진을 도시한다.
도 4는 상이한 N/P 비를 갖는 PEI-g-ILO 구축물의 DNA 방출을 도시한다.
도 5a는 비변형 PEI와 비교하여 PEI-g-ILO 유전자 벡터로 트랜스펙션된 세포의 발현 정도를 도시하며; 도 5b는 PEI와 비교하여 PEI-g-ILO의 유전자 발현을 도시하며; 도 5c는 PEI와 비교하여 A549 및 BEAS-2B 세포에 있어서 PEI-g-ILO의 발현 정도를 도시한다.
도 6a는 루시페라제의 유전자 발현의 생체내 연구를 도시하며; 도 6b는 PEI 유전자 벡터와 비교하여 PEI-g-ILO FILO = 5의 유전자 벡터를 받은 마우스로부터 수득한 균질화된 폐 조직에서의 루시페라제 발현을 도시한다.
도 7a는 PEI로 처리되거나 또는 본 발명에 따른 구축물로 처리된 세포와 비교하여 비처리된 세포의 대사 활성을 도시하며; 도 7b는 비처리된 세포와 비교하여 PEI 또는 본 발명에 따른 구축물의 투여 후 시토카인 수준 변화를 도시한다.
도 8은 폐 세포 내로의 용량 의존적 유전자 벡터 전달을 도시한다.
놀랍게도, 표적 탐색 구조체로서 프로스타시클린 유사체를 포함하는 접합체가 폐의 상피 세포, 특히 기관지 및 폐포 세포를 표적화하는 데 적합하며, 고도로 효과적인 방식으로 작용제를 상기 세포 내로 도입할 수 있음이 밝혀졌다. 본원에서, 폐 상피 세포 내로 활성 성분을 도입하기 위한 작용제가 본 발명에 따라 지금에 와서야 제공된다. 이는 넓은 범위의 폐 질환의 치유적 치료의 신규한 가능성을 제공한다.
프로스타시클린은 프로스타글란딘류에 속하며, 프로스타글란딘 I2 또는 PGI2로 공지되어 있고; 이것은 프로스타시클린 (IP1) 수용체를 표적화하여 그에 결합한다. IP1 수용체는 내피 세포 상에서, 특히 근육 세포 상에서, 예를 들으 혈관의 근육 세포 상에서 주로 발견되는 7-막관통--단백질-커플링된 수용체이다 [15-17]. IP1 수용체 효능제에의 프로스타시클린의 결합은 클래트린 매개된 과정을 통한 수용체/리간드 복합체의 엔도좀 내재화에 이르게 된다 [18, 19]. 본 발명의 발명자는 이 효과가 폐포 및 기관지 상피 세포 내로의 활성제의 표적화된 전달의 개선에 그리고 폐에 유익하거나 또는 폐 병태를 치료하는 활성제의 흡수를 가능하게 하는 데 활용될 수 있음을 지금에 와서야 밝혀냈다.
따라서, 본 발명에 따르면 기관지 및 폐포 상피 세포에 대한 표적화 구조체로서 적어도 하나의 프로스타시클린 유사체를 포함하는 접합체가 제공된다. 프로스타시클린 그 자체는 너무 불안정하며, 너무 빠르게 분해되어서 의도된 목적에 사용되는 것이 가능하지 않을 수 있다. 그러나, 또한 IP1 수용체에 결합하고 효능제로 작용하는 공지된 안정한 프로스타시클린 유사체가 있다. 본 발명의 맥락에서, 프로스타시클린 유사체는 프로스탄산으로부터 유도된 화합물을 의미하며, 이는 프로스타시클린의 것에 비견되거나 또는 그보다 더 높은 IP1 수용체에의 결합 능력을 가지며 천연 프로스타시클린보다 더 안정하다. 이러한 유형의 화합물은 공지되어 있다. 공지된 프로스타시클린 유사체는 본 발명에 따른 접합체에 적합하다.
바람직하게 사용되는 리간드는 제약으로 승인된 두 프로스타시클린 유사체인 일로프로스트 및/또는 트레프로스티닐이다. 다른 프로스타시클린 유사체가 또한 사용될 수 있다.
본 발명에 적합한 프로스타시클린 유사체는 생리적 환경에서 및/또는 보관 동안 천연 프로스타시클린보다 더 안정한 것이다. 본원에서 상기에 명시된 바와 같이, 프로스타시클린은 매우 빠르게 분해되며; 이것은 생리적 환경에서, 즉, 혈액에서 반감기가 단지 몇 분이며, 장기간에 걸쳐 보관될 수 없다. 따라서 본 발명에 적합한 프로스타시클린 유사체는 생리적 환경에서 분해되거나 또는 불활성화되지 않고서 그의 특성을 20분 이상 동안, 바람직하게는 30분 이상 동안, 훨씬 더 바람직하게는 45분 이상 동안 유지하는 것, 또는 생리적 환경에서 반감기가 15분 이상, 바람직하게는 20분 이상, 더 바람직하게는 25분 이상인 것이다. 본 발명의 맥락에서, 반감기는 일반적으로 출발 물질 - 본 발명이 경우에 프로스타시클린 유사체 - 의 절반이 생리적 환경에서 분해되었거나 불활성화되었거나 또는 전환된 시간 기간인 것으로 이해된다. 반감기는 간단히 통상의 방식으로, 예를 들어 당해 프로스타시클린 유사체를 35-37℃의 온도의 생리적 용액 내에 둠으로써 결정될 수 있으며, 미분해 프로스타시클린의 양은 시작시에 그리고 소정의 기간 후에 결정된다.
더욱이 본 발명에 적합한 프로스타시클린 유사체는 IP1 수용체에의 결합 능력이 프로스타시클린의 것에 비견되거나 또는 그보다 더 높은 것이다. 프로스타시클린 유사체의 결합 능력의 결정 방법은 프로스타시클린 또는 공지된 프로스타시클린 유사체, 예컨대 일로프로스트 및/또는 트레프로스티닐 및 프로스타시클린 유사체 후보를 플루오레세인 및 소 혈청 알부민 (BSA)와 접합시키고, 그 후 다양한 폐 세포주에 첨가하며, 그 결과 결합 및 세포 흡수를 유동 세포측정법 및 공초점 레이저 주사 현미경법에 의해 연구하는 경쟁적 방법이다. 프로스타시클린 또는 일로프로스트 또는 트레프로스티닐에 동일하게 또는 그보다 더 결합하는 후보가 본 발명에 따른 접합체의 일부로서 또한 바람직하다. 동일한 결합 능력은 플루오레세인 표지된 후보가 플루오레세인 표지된 프로스타시클린 또는 플루오레세인 표지된 일로프로스트 또는 플루오레세인 표지된 트레프로스티닐과 적어도 동일한 정도로 결합함을 의미한다. 플루오레세인 표지된 후보의 비율이 더욱 낮을 경우, 이는 프로스타시클린 또는 일로프로스트 또는 트레프로스티닐이 후보를 결합으로부터 대체하여서 후자의 결합 능력이 그만큼 크지 않도록 함을 의미한다.
공지된 프로스타시클린 유사체가 폐 동맥 고혈압 (pulmonal arterial hypertension, PAH)의 치료에 사용되며, 일반적으로 정맥내로 투여되거나 또는 에어로졸의 형태로 투여되고 [20]; 상기 유사체는 이 목적을 충족시키기 위하여 당일 전체에 걸쳐 빈번하게 투여되는 분할된 용량으로 투여되어야 한다. 그러나, 본 발명에 있어서 프로스타시클린 유사체는 표적 탐색 구조체로서 이용되며, 폐 동맥 고혈압의 치료에 사용되는 것은 아니다. 양이온성 캡슐화 재료 및 작용제와의 본 발명에 따른 조합물 형태의 프로스타시클린 유사체는 항염증 활성을 가지며, 그에 의해 본 발명에 따른 접합체의 활성을 추가로 향상시킴이 밝혀졌다.
본 발명에 따른 접합체의 두 번째 부분은 작용제 복합체, 즉, 캡슐화 재료에 의해 캡슐화된 작용제이다. 캡슐화 재료는 작용제를 보호하는 역할을 하며, 이와 동시에 세포 내로의 흡수를 간섭하지 않거나, 실제 적절할 경우 세포 내로의 흡수를 향상시키는 역할을 한다.
활성 성분 또는 활성 물질로서 활성을 갖는 본 발명에 따른 접합체의 성분은 프로스타시클린을 제외한, 본 발명에 따른 표적 탐색 리간드에 의해 표적화되는 세포에서 유리한, 치유, 완화 또는 조절 활성을 발휘하는 임의의 작용제일 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 작용제의 예로는 특히 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드, 활성 물질 또는 추적자 및/또는 전술한 물질들의 유도체 및/또는 이들의 혼합물이 있다. 본 발명에 따라 사용되는 작용제는 바람직하게는 폐 병태를 완화시키거나 또는 치유할 수 있는 작용제여야 한다. 이와 관련하여, 본 발명에 따르면, 프로스타시클린 유사체는 활성 물질로서뿐만 아니라 표적 탐색 리간드로서도 사용된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 작용제는 결함 또는 결핍이 폐 질환을 초래하거나 면역조절 활성 단백질, 특히 항원을 코딩하는 유전자 또는 유전자 단편을 포함하는 핵산이다. 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 이것은 하나 이상의 유전자 또는 단편을 포함할 수 있다. 핵산은 자율적 복제 서열 또는 통합 서열일 수 있으며, 이것은 플라스미드, 벡터의 형태 또는 당업자에게 공지된 또 다른 형태일 수 있다. 이것은 선형 또는 원형일 수 있으며, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 세포에서 활성을 갖는 임의의 핵산이 이 목적에 적합하다. 게다가, 핵산은 그 자체 공지된 방식으로, 유전자 발현에 필요하거나 또는 상기 발현에 유용한 추가의 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 신호 서열 등을 포함할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 접합체의 활성 성분은 폐 질환에 이르게 되는 단백질 결핍 또는 단백질 결함을 복구하는 데 적합하거나 또는 면역조절 활성을 갖는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질 단편이다.
더욱이, 본 발명에 따른 접합체의 활성 성분은 이것이 기관지 및/또는 폐포 상피 세포에 존재할 때, 폐에서 병리적 상태를 치유하거나 또는 완화시키는 활성 물질일 수 있다. 예로는 예를 들어 천식의 치료에 이용되는 스테로이드와 같은 항염증제가 있다. 리간드는 항염증 작용을 또한 갖기 때문에, 이러한 조합은 고도로 유효한 조성물을 생성한다.
추가의 실시양태에서, 작용제는 세포 내로의 흡수가 진단적으로 중요한 정보를 제공할 수 잇는 리포터 분자일 수 있다. 진단에 적합한 리포터 분자는 당업계의 숙련자에게 공지되어 있으며, 적합한 리포터 분자의 예로는 당업계의 숙련자에게 공지된 방사성 또는 형광 추적 분자가 있다. 리포터 분자는 예를 들어 폐의 상태 또는 치료의 진행의 모니터링에 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 접합체의 추가의 필수 성분은 작용제를 캡슐화하여 이것을 분해 또는 변화로부터 보호하고 세포 내로의 도입을 간섭하지 않거나 상기 도입을 실제로 촉진하는 캡슐화 재료이다. 캡슐화 재료는 적합하게는 양이온성 또는 중성 재료, 예를 들어 중합체 또는 임의의 다른 층 형성 재료이다. 중요한 것은 캡슐화 재료가 생물학적으로 그리고 생리학적으로 허용되며, 수송 동안 작용제를 보호하며, 세포에서 분해되어 생리학적으로 허용되는 분자를 제공하며, 작용제에 대하여 불활성이며, 즉, 작용제와 반응하지 않는다는 것이다. 적합한 캡슐화 재료는 공지되어 있으며, 많은 형태로 입수가능하다. 양이온성 캡슐화 재료가 핵산 캡슐화에 바람직한 반면, 다른 작용제, 예컨대 단백질, 활성 물질 또는 추적자는 양이온성 또는 중성 캡슐화 재료를 이용하여 캡슐화될 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 특히 작용제가 핵산일 경우, 사용되는 캡슐화 재료는 양이온성 중합체이다. 양이온 하전 입자가 중성 또는 음이온 하전 입자보다 더 쉽게 세포에 의해 흡수될 수 있지만, 양이온 하전 입자는 또한 더욱 비특이적인 부착을 촉진할 수 있음이 밝혀졌다. 양이온성 캡슐화 재료가 활성 성분으로서의 핵산을 캡슐화하는 데 바람직하며, 그 이유는 핵산이 양이온성 물질에 의해 매우 쉽게 캡슐화되고 보호될 수 있기 때문이다. 적합한 방법은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다.
캡슐화 재료는 천연, 합성, 또는 양이온성 유도체화 천연 물질, 예를 들어 지질 또는 중합체 또는 올리고머일 수 있다. 천연 올리고머의 예로는 스페르민이 있다. 합성 중합체의 예로는 질소함유 생분해성 중합체, 특히 양성자화될 수 있는 질소 원자를 포함하는 것이 있다. 특히 적합한 것은 폴리에틸렌이민, 특히 분지형 폴리에틸렌이민이며, 이는 상업적으로 입수가능하다. 적합한 재료는 예를 들어 평균 분자량이 25 kDa인 분지형 폴리에틸렌이민이며, 이는 상업적으로 입수가능하다. 표적 탐색 리간드와 조합된 이 중합체는 매우 충분히 관용됨이 밝혀졌다. 천연의, 임의로 유도체화된 층 형성 캡슐화 재료로서 사용될 수 있는 재료로는 또한 지질, 특히 양이온성 및 중성 지질이 있다. 지질은 많은 변이체 형태로 입수가능하며, 이는 예를 들어 리포솜 형성에 사용될 수 있다. 특히 적합한 것은 겐자임 지질 67로 수득가능한 양이온성 유도체화 지질이다. 덜 적합한 것은 당 분자, 예컨대 전분 또는 전분 유도체를 기재로 하는 중합체이며, 따라서 이들은 본 발명에 따른 캡슐화 재료로서 사용되지 않는다.
당업자에게 공지된 다수의 적합한 중합체가 다른 작용제, 예컨대 단백질, 활성 물질 또는 추적자용으로 존재한다. 적합한 것은 생체적합성이며, 적어도 본 발명에 따른 프로스타시클린과 조합시 비염증성이거나 세포에 어떠한 방식으로든 손상을 입히지 않으며, 일단 표적, 즉, 세포에 도달하였으면 작용제를 방출시키는 것이다.
코팅재 및 작용제로 이루어진 작용제 복합체는 그 자체 공지되고 그 제법이 공지된, 예를 들어 나노입자 또는 나노캡슐, 리포솜 등으로 이루어질 수 있다. 예를 들어 적합한 수단은 제어가능하게 방출되는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리락티드 및/또는 폴리글리콜리드 중에서의 캡슐화이다. 이와 관련하여, 코팅재는 작용제가 소정의 방식으로 방출되도록 선택될 수 있다. 그러한 코팅재는 많은 경우 문헌에 기술되었으며, 당업자라면 다수의 물질로부터 당면 목적에 가장 적합한 물질을 선택할 수 있다.
활성제는 그 자체 공지된 방식으로 캡슐화 재료로 캡슐화되거나, 또는 그로 코팅된다. 작용제와 캡슐화 재료의 이러한 복합체는 이하에서 "작용제 복합체"로 칭해진다. 본 발명의 맥락에서, "캡슐화하는"이라는 것은 작용제가 생리학적 환경으로부터 중합체에 의해 차폐되어서 이것이 표적에 도달할 때까지 변경되지 않거나 분해되지 않도록 함을 의미한다. 캡슐화는 작용제를 둘러싸는 단지 하나의 층일 수 있지만, 이것은 또한 작용제가 매립되거나 또는 봉입되는 리포솜 또는 나노입자 또는 마이크로입자일 수 있다. 이것은 또한 복합체 형성에 의해 봉입될 수 있다. 당업계의 숙련자라면 표적 탐색 리간드가 수용체에 결합하는 것 및 세포 내로의 접합체의 도입 및 작용제의 세포 내에서의 방출을 간섭하지 않는다면 본 발명에 따른 접합체에 이용될 수 있는 작용제의 다양한 형태의 캡슐화 또는 코팅에 친숙할 것이다. 캡슐화 재료에 의한 작용제의 캡슐화 및/또는 적합한 입자의 제조는 통상의 방법을 이용하여 행해질 수 있다. 가장 간단한 실시양태에서, 활성제, 예를 들어 핵산은 캡슐화 재료, 예를 들어 양이온성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌이민 - 적절할 경우 용해된 형태 - 과 혼합된다.
본 발명에 따라 표적화 구조체로서 사용되는 적어도 하나의 프로스타시클린 유사체는 캡슐화 전 또는 그 후 캡슐화 물질에 결합된다. 리간드를 캡슐화 재료에 결합시키는 것은 작용제의 활성에 부정적인 영향을 미치지 않는다. 리간드(들)의 결합 또는 고정은 수용체에의 결합 능력을 간섭하지 않아야 한다. 리간드를 고정시키는 방법은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있으며, 공지된 방법이 여기서 사용될 수 있다. 당업계의 숙련자는 캡슐화 물질과 리간드의 조합물의 적합성을 간단한 방식으로, 그로부터의 요망되는 작용제 복합체를 제조하고 상기 복합체의 결합 능력을 유리 리간드의 결합 능력과 비교함으로써 확인할 수 있다. 더욱이, 작용제와 관련하여 캡슐화 물질의 적합성은 작용제의 방출 후 작용제의 활성을 측정하고 이것을 캡슐화 전의 유리 작용제의 것과 비교함으로써 확인할 수 있다.
리간드는 캡슐화 재료가 작용제의 캡슐화에 이용되기 전에 캡슐화 재료에 직접적으로 결합될 수 있다. 이러한 실시양태는 예를 들어 캡슐화 재료가 양이온성 중합체이고 작용제가 핵산일 경우 바람직하다. 또한 먼저 작용제 복합체를 형성하고 그 후 리간드를 결합시키는 것이 가능하다. 이러한 실시양태는 작용제 복합체가 나노입자, 나노구체 또는 리포솜의 형태로 만들어질 때 바람직하다. 적절할 경우, 캡슐화 재료에의 리간드의 결합은 또한 결합 활성을 갖는 리간드의 부위가 결합에 이용가능해지게 되도록 스페이서를 통하여 초래될 수 있다. 이는 활성제가 결합에 의해 영향을 받지 않으며 표면 상의 적어도 하나의 프로스타시클린 유사체가 IP1 수용체에의 결합에 자유롭게 이용가능해지는 접합체를 생성한다. 리간드, 즉, 프로스타시클린 유사체는, 결합이 리간드를 고정시키기에 충분하기만 하다면, 그리고 수용체에의 그의 결합 능력이 부정적으로 영향을 받지 않기만 하다면, 임의의 유형의 결합, 예컨대 공유 결합, 이온 결합 또는 배위 결합, 수소 결합 형성 등에 의해 캡슐화 재료에 결합될 수 있다. 따라서, 프로스타시클린 유사체는 예를 들어 공유 결합 또는 이온 결합을 통하여 직접적으로 또는 스페이서를 통하여 캡슐화 재료에 커플링될 수 있다. 당업계의 숙련자에게 공지된 스페이서의 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 있다.
접합체 입자 당 리간드로서 표현되는 커플링 정도, 즉, 접합체, 또는 캡슐화된 입자에 리간드가 로딩되는 정도는 작용제의 방출에 영향을 주며, 따라서 세포에서 작용제의 활성에 영향을 준다. 캡슐화 입자에 결합되는 리간드의 양은 바람직하게는 과도하게 높지 않아야 하며, 그 이유는 그렇지 않을 경우 수용체의 표적화가 입체 장애의 결과로서 간섭될 수 있기 때문이다. 당업계의 숙련자라면 일상적인 실험에 의해 이상적인 로딩 정도를 찾아낼 수 있다. 리간드의 양은 캡슐화 재료의 성질 및 입자의 크기에 따라 달라진다.
높은 커플링 정도는 단지 작용제의 방출을 불완전하게 할 수 있음이 도한 밝혀졌다. 따라서, 양이온성 중합체가 캡슐화에 사용될 경우, 커플링 정도는 중합체 당 15개의 리간드 이하에 이르러야 한다. 한편, 표적화를 초래하기 위하여 적어도 하나의 프로스타시클린 유사체가 각각의 캡슐화 입자에 결합되어야 한다.
각각의 경우에, 접합체 또는 입자 당 하나의 유형의 프로스타시클린 유사체가 결합될 수 있다. 2가지 이상의 프로스타시클린 유사체의 혼합물을 결합시켜서 적절할 경우 세포 내로의 흡수 및/또는 결합 능력을 향상시키는 것이 또한 가능하다.
캡슐화 재료 대 활성재의 비는 활성에 영향을 줄 수 있음이 밝혀졌다. 충분하지 않은 캡슐화 재료가 존재할 경우, 활성제는 충분히 보호되지 않는다. 캡슐화 재료의 비율이 너무 높다면, 첫째, 양립가능성 문제가 생길 수 있고, 둘째, 부당하게 높은 비율의 캡슐화 재료가 활성제의 방출을 불가능해지게 할 수 있다. 둘 모두의 경우에, 전달 효율이 손상된다. 당업계의 숙련자라면 각각의 경우에 약간의 일상적인 실험에서 최상으로 적합한 비를 찾아낼 수 있다. 중량을 기준으로 10:1 내지 1:4의 범위의 캡슐화 재료 대 활성제의 비가 특히 적합한 것으로 입증되었다. 4:1 내지 1:4의 캡슐화 재료 대 작용제의 비가 특히 바람직하다. 접합체가 작용제로서 핵산 및 중합체로서 폴리에틸렌이민을 포함할 경우, 중합체의 비율이 중합체 질소 함량 대 DNA 포스페이트 함량의 몰비에 의해 또한 나타내어질 수 있으며; 이 비는 바람직하게는 2 내지 10의 범위, 특히 바람직하게는 4 내지 8이다. 4:8의 중합체 질소 함량 대 DNA 포스페이트 함량의 몰비의 접합체 입자의 유체역학적 직경은 50 내지 100 nm의 범위이며, 이는 흡수 특징에 최적이다.
더욱이, 최적 접합체는 리간드 로딩 밀도가 캡슐화 정도에 맞추어 수정될 때 수득됨이 밝혀졌다. 캡슐화 재료의 비율이 상대적으로 높을 경우, 로딩 밀도는 너무 크지 않아야 하며, 그 이유는 그렇지 않을 경우 작용제가 부당하게 차폐되기 때문이다. 캡슐화 재료의 비율이 더욱 낮은 범위에 있을 경우, 로딩 밀도는 그에 상응하게 더 위쪽의 범위에 있을 수 있다.
본 발명에 따른 접합체는 활성 물질을 기관지 및/또는 폐포 상피 세포 내로 도입하는 데 이상적인 작용제임이 밝혀졌다. 종래 기술에 개시된 표적 리간드 또는 표적화 리간를 포함하지 않는 입자의 단지 5% 이하가 그의 표적, 즉, 세포에 도달하고, 또한 종래 기술에 개시된 리간드 함유 접합체의 단지 50% 이하가 표적에 도달하여 그의 기능을 나타낼 수 있는 반면, 본 발명에 따른 접합체의 경우 본 발명에 따른 접합체의 50% 초과, 빈번하게는 60% 이상, 실제로는 80% 이하가 세포에 의해 흡수되어 그의 작용제를 방출함이 실험적으로 입증되었다.
따라서, 활성 성분을 고도로 효율적인 방식으로 표적 세포 내로 도입시키는 수단이 제공되며, 여기서, 한편으로는 활성제는 세포 내로의 수송 동안 잘 보호되어서 세포에 도달하는 활성제의 비율이 매우 높아지게 되며, 둘째, 흡수 효율이 본 발명에 따른 접합체의 구조 때문에 매우 높아지게 된다.
추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 접합체는 폐에서의 생존 시간을 추가로 증가시키기 위하여 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함하는 캡슐화 재료, 예를 들어 양이온성 중합체로 캡슐화된 입자를 추가로 제공함으로써 더욱 더 개선될 수 있다. PEG화 (PEGylation)에 의한 핵산과 같은 활성 분자의 보호는 그 자체 공지되어 있으며, 일반적인 방법이 여기서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 접합체는 다양한 폐 질환의 치료에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 접합체는 유전자 또는 단백질 결함으로 인한 폐 질환의 치유 또는 완화에 적합하다. 그의 예로는 낭성 섬유증이 있다. 본원에서 상기에 언급된 바와 같이, 결여 또는 결핍 유전자를 세포 내로 도입하는 것이 가능할 뿐만 아니라 결여 또는 결핍 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 세포 내로 도입하는 것도 또한 가능하다.
본 발명에 따른 접합체의 추가의 응용 분야는 백신으로서의 용도이다. 이러한 실시양태에서, 접합체의 활성 성분은 면역조절 또는 면역학적 활성 펩티드 또는 단백질 또는 면역조절 또는 면역학적 활성 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 유전자이다 [1, 2]. 본 발명의 이러한 실시양태의 이점은 백신이 비침습적 방식으로, 예를 들어 분무기 또는 에어로졸을 이용하여 폐를 통하여 투여될 수 있다는 것이다. 이러한 기술은 복잡하지 않으며, 심지어 주사제 투여가 위생적 환경으로 인하여 또는 적합하게 훈련된 직원의 결여로 인하여 문제시되는 장소에서 사용을 가능하게 하며, 복잡하지 않은 다회 투여를 가능하게 하여 면역 반응을 향상시킨다. 더욱이, 폐는 그의 큰 표면적 및 면역학적 활성 세포의 존재로 인하여 백신화 목적에 매우 적합하다.
본 발명에 따른 접합체는 폐 내로의 투여용으로 제공된다. 이 목적을 위하여, 이는 흡입을 통하여 또는 분무를 통하여 폐 내로 도입되는 제약 조성물로서 그 자체 공지된 방식으로 제제화될 수 있다. 적합한 제제는 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 따라서, 접합체는 불활성 가스를 담체로 하여 에어로졸로서 또는 분무기를 통하여 현탁액 또는 에멀젼으로서 제조될 수 있다. 이것은 또한 분말로서 이용될 수 있다.
본 발명을 하기 실시예로 더욱 더 상세하게 제시하며, 이는 이러한 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1
캡슐화 재료로 코팅되고 표적 탐색 구조체로서 일로프로스트 또는 트레프로스티닐을 함유하는 입자의 접합체를 제조하고 연구하였다.
재료 및 방법
화학물질 및 플라스미드의 공급처 및 사용 농도는 하기와 같았다:
일로프로스트, 트레프로스티닐 및 CRY10449: 케이맨 케미칼스 (Cayman Chemicals) (미국 미시간주)
분지형 폴리에틸렌이민 (평균 분자량: 25　kDa), N-히드록시술포숙신이미드 (술포-NHS), 소 혈청 알부민 (BSA), 인산나트륨, 피크릴술폰산 용액, 4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-에탄술폰산 (HEPES) 및 헤파란 술페이트: 시그마 알드리치 (Sigma Aldrich; 독일 슈넬도르프)
PEI를 이중 증류수 (주사용수, 베. 브라운 멜순겐 아게 (B. Braun Melsungen AG; 독일 멜순겐)에 희석시키고, pH를 수성 염산을 이용하여 7이 되게 하였다.
인산나트륨을 이중 증류수 중에 0.5　mM의 농도로 용해시키고, pH를 수산화나트륨을 이용하여 7.5가 되게 하였다.
HEPES를 0.1 M의 농도로 증류수에 용해시키고, pH를 수산화나트륨을 이용하여 7.4가 되게 하였다.
헤파란 술페이트를 이중 증류수 중에 5　mg/ml로 용해시켰다.
에탄올 (분석 등급) 및 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS): 머크 (Merck; 독일 다름스타트)
MOPS를 이중 증류수 중에 0.1　M의 농도로 용해시키고, pH를 수성 염산을 이용하여 6이 되게 하였다.
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 5- (및 6-)카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (플루오레세인-NHS): 피어스 (Pierce; 미국 록포트)
디티오트레이톨 (DTT): 아머샴 바이오사이언시즈 (Amersham Biosciences; 미국 사우스 샌프란시스코)
D-루시페린: 신켐 (Synchem) OHG (독일 알텐부르크/플렌베르크)
초기 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터의 제어 하에 포티누스 피랄리스 (Fotinus pyralis) 루시페라제 유전자를 함유하는 플라스미드 pCMV-luc, 및 pCpG-luc를 이. 콜라이 (E. coli)에서 증식시켰으며, 이는 플라스미드 팩토리 게엠베하 (Plasmid Factory GmbH; 독일 비엘레펠드)에 의해 고도로 정제된 형태로 제공하였다 (LPS 함량 ≤ 0.1　E.U./㎍의 DNA). 수퍼코일 (Supercoil) pDNA의 양은 pCMV-luc의 경우 ≥ 90% ccc (공유적 폐쇄 원형; covalently closed circular)였고, pCpG-luc의 경우 ≥ 98% ccc였다.
이용한 세포주
A549 세포 (인간 폐포 상피 세포): DSMZ (독일 생물 자원 센터 (deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen) [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures], 독일 브라운슈바이크)
BEAS-2B (인간 기관지 상피 세포), H441 (인간 세기관지 상피 세포): ATCC (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션; American Type Culture Collection)
16HBE14o- 세포: 인간 기관지 상피 세포
A549, BEAS-2B 및 16HBE14o- 세포주는 10% 송아지 태아 혈청 (FCS, 깁코-비알엘 (Gibco-BRL; 독일 칼스루헤))을 보충한 최소 필수 배지 (minimal essential medium; MEM, 깁코-비알엘, 독일 칼스루헤))에서 공기 중 5% CO2의 가습 분위기에서 37℃에서 성장시켰다. H441 세포주는 10% FCS가 보충된 로스웰 파크 메모리알 인스티튜트 (Roswell Park Memorial Institute) 배지 1640 (RPMI1640, 깁코-비알엘, 독일 칼스루헤)에서 공기 중 5% CO2의 가습 분위기에서 37℃에서 성장시켰다.
동물
14주령 암컷 BALB/c 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈 (Charles River Laboratories; 독일 슐츠펠트))를 특정한 무병원체 조건 하에 유지하였다. 실험 전에, 마우스를 7일 이상 동안 적응시켰다. 모든 동물 절차는 지역 윤리 위원회가 승인하고 체크하였으며, 독일 동물 생명 보호법 (German Recht zum Schutz von Tierleben [German Law on the Protection of Animal Life])의 지침에 따라 실시하였다.
웨스턴 블롯 분석
A549-, BEAS-2B 및 16HBE14o- 세포를 PBS로 세척하고, 얼음 위에서 20　mM 트리스 (Tris)-HCl (pH 7.5), 100　mM NaCl, 1　mM EDTA, 1% 트리톤 (Triton) X-100 및 0.05% 나트륨 데옥시콜레이트를 함유하는 용해 완충제에서 용해시켰다. 1　mM DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈 다이아그노스틱스 게엠베하 (Roche Diagnostics GmbH; 독일 만하임)을 사용 직전에 새롭게 첨가하였다. 단백질 농도를 바이오라드 (Biorad) 단백질 검정 (바이오라드, 독일 뮌헨)을 이용하여 측정하였다. 각각의 세포주에 있어서, 50　㎍의 단백질을 SDS 샘플 로딩 완충제 (62.5　mM 트리스-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 10% 글리세롤, 2% DTT, 0.001% 브로모페놀 블루)에 희석시켰으며, 이는 5분 동안 끓였고, 이를 7.5% 트리스-HCl 겔 (바이오라드, 독일 뮌헨) 상에서 분리하고, PVDF 막 (밀리포어 (Millipore), 독일 슈발바흐)으로 옮겼다. 5% 탈지유 분말 (시그마 알드리치, 독일 다이센호펜)을 포함하는 TBS-T (20　mM 트리스-HCl (pH 7.6), 137　mM NaCl, 0.1% 트윈 (Tween)-20)를 이용하여 실온에서 1시간 동안 막을 차단시켰다. IP1 수용체에 대한 일차 폴리클로날 항체 (케이맨 케미칼, 미국 미시간주) (1:500으로 희석)를 0.5% 탈지유에서 밤새 인큐베이션하였다. 막을 TBS-T로 세척하고, 0.5% 탈지유 중에서 실온에서 1.5시간 동안 이차 HRP-접합된 항-토끼 항체 (1:15 000으로 희석; 바이오라드, 독일 뮌헨)와 함께 인큐베이션하였다. TBS-T를 이용한 수회의 세척 단계 후, 제조업자의 지시에 따라 ECL 검출 키트 (피어스, 미국 록포트)를 사용하여 화학발광에 의해 검출을 실시하였다.
플루오레세인-BSA-일로프로스트 (FLUO-BSA-ILO) 및 플루오레세인-BSA-트레프로스티닐 (FLUO-BSA-TRP)의 합성
20　mg (0.3　μmol)의 BSA를 pH 7.5의 2.5　ml의 인산나트륨 완충제에서 희석시키고, 10배 몰 과량의 플루오레세인-NHS와 혼합하였다. 실온에서 1시간 동안 교반시킨 후, 혼합물을 PBS-평형화 세파덱스 (Sephadex) G25 MPD-10 칼럼 (지이 헬스 케어 (GE Health Care; 스웨덴 웁살라))에서 정제하였다. 0.7　mg (1.8　μmol)의 ILO 또는 0.8 mg (1.8　μmol)의 TRP 중 어느 하나를 130　㎕의 분석 등급 에탄올에 용해시키고, 370　㎕의 MOPS 완충제 - 0.1　M, pH 6 - 와 혼합하였다. 0.5　mg (5　mM)의 술포-NHS (MOPS 완충제 중) 및 0.2　mg (2　mM)의 EDC (MOPS 완충제 중)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반시켰다. 그 후, 5　㎕ (20　mM)의 DTT (증류수 중)를 첨가하고, 0.5　M 포스페이트 완충제 190　㎕ 및 210　㎕ 중 3　mg (45.2　nmol)의 FLUO-BSA를 반응 혼합물 내로 즉시 피펫팅하여 넣었다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시킨 후, 이것을 PBS-평형화 세파덱스 G25 MPD-10 칼럼 (지이 헬스 케어; 스웨덴 웁살라)에서 정제하였다. BSA 표준 곡선을 이용하여 바이오라드 단백질 검정에서 BSA의 양을 정량적으로 평가하였다. 최종 생성물과 중간체의 커플링 효율을 TNBS 검정에 의해 결정하고 [21], 흡광도를 495　nm에서 측정하였다. BSA-ILO 및 BSA-TRP의 커플링 정도는 BSA 1 mol 당 ILO 또는 TRP 10　mol인 것으로 밝혀졌다.
일로프로스트-그라프팅된 PEI 중합체 (PEI-g-ILO)의 합성
반응 혼합물에 첨가하는 EDC의 양을 변화시킴으로써 다양한 정도의 커플링의 PEI-g-ILO를 합성하였다. 1　mg (2.8　μmol)의 ILO를 100　㎕의 분석 등급 에탄올에 희석시키고, 1　mg (5　mM)의 술포-NHS 및 900　ml의 HEPES 완충제 - 0.1　M, pH 7.4 - 중 68　nmol의 PEI와 혼합하였다. 다양한 양의 EDC를 각각 25　mM, 50　mM, 60　mM 또는 100　mM의 최종 농도로 첨가하고, 혼합물을 교반하면서 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 이중 증류수로 평형화한 세파덱스 G25 MPD-10 칼럼 (지이 헬스 케어, 스웨덴 웁살라)에서 정제하였다. 웅가로 (Ungaro) 등이 설명한 바와 같이 CuSO4 시험에서 PEI의 농도를 결정하였다 [22]. PEI-g-ILO의 1H-1D NMR 스펙트럼을 브루커 (Bruker) AV 250　MHz 분광계에서 D2O 중에서 기록하였다. PEI-g-ILO의 커플링 정도는 δ (1H) = 2.5 내지 3.1　ppm에서의 PEI (CH2-CH2-NH-)의 넓은 다중선 및 δ (1H) = 1.73　ppm에서의 ILO (-C≡C-CH3)의 말단 메틸기의 단일선을 적분함으로써 계산하였다. PEI에의 ILO의 공유적 접합은 4가지의 상이한 커플링 정도를 생성하였다 (FILO (mol ILO/mol PEI) = 2, 5, 8, 16). PEI-g-ILO 구축물을 적은 분취물로 나누고, 액체 질소에서 급속 냉동시키고, 추가로 사용할 때까지 -80℃에서 유지하였다.
FLUO-BSA-ILO 및 FLUO-BSA-TRP를 이용한 인큐베이션 실험
FLUO-BSA-ILO의 수용체 결합/흡수를 A549, H441, 16HBE14o- 및 BEAS-2B 세포에서 연구하였다. FACS 측정 실험에 있어서, 접합체를 첨가하기 24시간 전에 100　000개의 세포/웰을 24웰 플레이트 (티피피 (TPP; 스위스 트라사딩겐))에 접종하였다. FLUO-BSA-ILO, FLUO-BSA-TRP 및 FLUO-BSA 접합체를 0.5　μM의 농도로 MEM에 희석시키고, 세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 세척한 후, 세포를 트립신 처리에 의해 웰로부터 제거하고, FACS 측정을 벡톤-디킨슨 (Beckton-Dickinson) FACS 스캔 (미국 새너제이)을 이용하여 실시하였다. 공초점 레이저 주사 현미경법에 있어서, 챔버 당 25 000개의 세포를 이용하여 비디 팔콘 컬쳐 (BD Falcon Culture) (비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences; 미국 새너제이))로부터의 4개의 챔버를 갖춘 슬라이드에서 실험을 실시하였다. FLUO-BSA-ILO 및 FLUO-BSA의 인큐베이션을 상기에 기술한 바와 같이 수행하였다. 세포를 세척하고, 4% 파라포름알데히드에서 고정시키고, 후속적으로 표준 프로토콜을 이용하여 핵을 0.33　μM DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌)로 그리고 F-액틴을 알렉사플루오르 (Alexafluor)® 568 팔로이딘 (Falloidin) (인비트로겐 게엠베하 (Invitrogen GmbH; 독일 칼스루헤))으로 염색시켰다. 슬라이드를 매체 (벡타쉴드 (Vectashield), 벡터 래보러토리즈 인크. (Vector Laboratories Inc.; 미국 베를린게임))로 덮고, 공초점 레이저 주사 현미경 (라이카 (Leica; 독일 솔름스))으로 영상을 촬영하였다.
CAY10449에의 FLUO-BSA-ILO의 결합의 억제에 관한 실험
FLUO-BSA-ILO의 수용체 결합/흡수의 억제를 16HBE14o- 세포에서 연구하였다. 24웰 플레이트를 상기에 설명한 바와 같이 준비하였다. CAY10449를 15　μM, 30　μM 및 150　μM의 농도로 MEM에 희석시키고, 상기 혼합물을 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그 직후, FLUO-BSA-ILO 및 FLUO-BSA를 25　nM의 최종 농도로 첨가하고, 세포와 함께 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 결합/흡수를 FACS를 사용하여 측정하였다.
유전자 벡터 입자의 제조
루시페라제 리포터 유전자 (pCMV-luc)를 포함하는 플라스미드, 및 PEI 또는 PEI-g-ILO를 25　㎕의 이중 증류수에 개별적으로 희석시켰다. 다양한 N/P 비 (PEI 질소 대 DNA 포스페이트의 몰비)를 검사하였다. pCMV-luc 용액을 동일한 부피의 중합체 용액에 첨가하고, 위아래로 8회 피펫팅함으로써 조심스럽게 혼합하였으며, 이는 20　㎍의 pCMV-luc/ml의 농도를 갖는 입자를 생성하였다. 유전자 전달 입자를 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
입자 크기의 측정
입자 크기 (동적 광산란 (dynamic light scattering)에 의해 측정)를 제타 (Zeta) PALS/제타 전위 분석기 (브룩하벤 인스트루먼츠 코포레이션 (Brookhaven Instruments Corporation; 오스트리아 비엔나))를 사용하여 측정하였다. 유전자 벡터 입자를 본원에서 상기에 기술한 바와 같이 생성하였다. 하기 설정을 이용하였다: 샘플 당 1분의 측정을 이용하여 5회의 시행; 물에 있어서의 점도: 0.89 cP; 기준 인덱스: 1.330; 온도: 25℃.
DNA 지연 검정
N/P = 4인 다양한 정도의 커플링을 갖는 PEI/pCMV-luc 및 PEI/g-ILO/pCMV-luc 유전자 벡터 입자를 상기에 기술한 바와 같이 이중 증류수에서 제조하였다. 5　㎕의 각각의 입자 용액을 2　㎕의 이중 증류수 또는 2　㎕의 헤파란 술페이트 용액 (5　mg/ml) 중 어느 하나와 혼합하였다. 45분 동안의 인큐베이션 후, 샘플을 1　㎕의 로딩 완충제 (물 중 0.25% 브로모페놀 블루, 0.25% 크실렌 시아놀 FF, 30% 글리세롤)와 혼합하고, 0.8% 아가로스 겔의 개개의 웰 내로 로딩하고, 125 V에서 1시간 동안 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 겔을 에티듐 브로마이드로 염색하고, DNA 밴드를 UV광 하에서 가시화하였다.
시험관내 트랜스펙션 연구
트랜스펙션하기 24시간 전에, A549, 16HBE14o- 및 BEAS-2B 세포를 24웰 플레이트 (티피피, 스위스 트라사딩겐) 내로 100　000개의 세포/웰의 밀도로 접종하고, 0.1% (v/v)의 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 10% FCS를 함유하는 MEM에서 성장시켰다. 트랜스펙션 전에 세포를 PBS로 세척하고, 웰 당 450　㎕의 신선한 무혈청 배지를 첨가하였다. 그 후, 1　㎍의 pCMV-luc에 상응하는 50　㎕의 유전자 벡터 입자를 세포 상에 피펫팅하였다. 억제 실험에 있어서, 유전자 벡터 입자를 첨가하기 15분 전에 CAY10449를 150　μM의 농도로 신선한 배지에 첨가하였다. 4시간 동안 인큐베이션한 후, 10%의 FCS를 포함하고 0.1% (v/v)의 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 MEM으로 트랜스펙션 배지를 대체하였다. 트랜스펙션한지 24시간 후, 후트 (Huth) 등에 의해 설명된 바와 같이 왈락 빅터2 (Wallac Victor2) 1420 멀티라벨 카운터 (multilabel counter) (퍼킨 엘머, 미국 보스턴)를 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다 [23]. 그 결과를 단백질 표준물로서 BSA를 사용하고 바이오라드 단백질 검정을 이용하여 전체 세포 단백질 함량에 대하여 표준화하였다.
생체내 유전자 전달 연구
마우스에의 에어로졸 전달을 위한 유전자 벡터 입자의 제조를 위하여, pCpG-luc 및 PEI 또는 PEI-g-ILO FILO = 5를 각각의 경우에 주사용수 (베. 브라운 멜순겐 아게, 독일 멜순겐) 4.0　ml로 희석시켰으며, 이는 각각 250　㎍/ml의 pCpG-luc 및 130.4　㎍/ml의 PEI의 농도를 생성하였다 (이는 4의 N/P 비에 상응함). pCpG-luc 용액을 PEI 용액에 피펫팅하고, 위아래로 8회 피펫팅함으로써 혼합하였으며, 이는 125　㎍/ml의 최종 DNA 농도를 생성하였다. 상기 입자를 사용 전 20분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 루돌프 (Rudolph 등)에 의해 기술된 바와 같이, 수직 전신형 에어로졸 기구에 연결된 PARI LC+ 분무기 (PARI 게엠베하 (PARI GmbH; 독일 스타른베르크))를 갖춘 PARI 터보바디 (Turboboy)® 흡입 기구를 사용하여 분무하였다 [24]. 24시간 후, 마우스를 마취시키고, D-루시페린 기질 (1.5　mg/50　㎕ PBS/마우스)의 폐 투여를 스니핑 (sniffing)에 의해 제공하였다 [25]. 10분 후, 하기의 카메라 세팅을 이용하여 생물발광을 측정하였다 (IVIS 100 이미징 시스템 (Imaging System); 제노겐 (Xenogen; 미국 알라메다)): 시계: 10, F1 f-스톱 (stop), 고해상도 비닝 (binning), 및 노출 시간: 10분. 폐에서의 리포터 유전자의 발현 정도를 확인하기 위하여, 생체내 생물발광 영상화 후 경추 탈구에 의해 마우스를 희생시켰다. 정중선을 따라 절개에 의해 복막을 연 후, 동물의 폐를 해부하고, PBS를 관류시켰다. 폐를 액체 질소에서 급속 냉동시키고, 냉동된 상태로 균질화하였다. 400　㎕의 용해 완충제 (250　mM 트리스, pH 7.8, 0.1% 트리톤 X-100, 로슈 완전 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablet))의 첨가 및 얼음 상에서의 20분 동안의 인큐베이션 후, 상청액 중 루시페라제 활성을 루맛 (Lumat) LB9507 튜브형 조도계 (에게 운트 게 베르트홀드 (EG & G Berthold; 독일 뮌헨))를 사용하여 측정하였다. 재조합 루시페라제 (로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 만하임)를 폐 조직에서 발현된 루시페라제의 양의 계산을 위한 표준물로 사용하였다.
MTT-기재의 검정
PEI/pCMV-luc 또는 PEI-g-ILO FILO = 5/pCMV-luc 입자를 N/P 비를 4로 하여 16HBE14o- 세포에서 평가하였다. 실험하기 24시간 전에, 세포를 24웰 플레이트 내에 80　000개의 세포/웰의 밀도로 접종하였다. 상기에 기술한 바와 같이 트랜스펙션을 수행하였다. 4시간 후, 트랜스펙션 혼합물을 400　㎕의 배지로 대체하고, MTT-기재의 시험을 제조업자의 지시에 따라 세포 증식 키트 1 (로슈 다이아그노스틱스 게엠베하, 독일 만하임)을 사용하여 실시하였다. 비처리 세포는 상응하는 흡광도를 100% 생존율 세포로서 설정함으로써 기준물로 사용하였다.
혈청의 수집 및 시토카인 농도의 분석
에어로졸을 전달한지 24시간 후, 혈액 샘플을 마우스로부터 취하고, 4℃에 밤새 보관하였다. 혈액을 원심분리하고, 혈청을 수집하였다. 인터류킨-12 (IL-12) 및 인터페론-γ (IFN-γ)를 제조업자의 지시에 따라 마우스 IL-12 (P40/P70) 및 마우스 INF-γ-ELISA 키트 (레이 바이오테크 (Ray Biotech; 미국 노르크로스))를 사용하여 정량적으로 측정하였다. 비처리 마우스는 상응하는 농도를 1로 설정함으로써 기준물로 사용하였다.
통계적 분석
결과를 평균±표준 편차로 제시하였다. 통계적으로 유의한 차이를 비대응 스튜던트 T-검정 (unpaired Student's T-test)에 의해 평가하였다. p < 0.01을 유의한 것으로 간주하였다.
결과
웨스턴 블롯에 의한 폐 세포에서의 IP1 수용체 발현의 확인
인간 폐포 (A549) 및 기관지 (BEAS-2B, 16HBE14o-) 상피 세포에서의 IP1 수용체의 발현을 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 47　kDa에서의 단백질 밴드를 검출하였으며 (도 1), 이는 상기 세포의 막 상에서 발현된 글리코실화된 형태의 IP1 수용체 단백질에 상응하였다 [26]. 따라서 단백질 또는 유전자의 전달에 있어서 IP1 수용체의 표적화된 어드레싱 (adressing)이 가능한지를 조사하였다.
상이한 IP1 수용체 리간드를 이용한 폐 세포의 어드레싱
수용체 매개된 유전자 전달에 있어서 IP1 수용체에 대한 표적화를 연구하기 위하여, TRP 및 ILO를 플루오레세인-표지된 소 혈청 알부민 (FLUO-BSA)에 화학적으로 커플링시켰는데, 이는 모델 물질로서 작용하였다. A549 및 16HBE14o- 세포를 FLUO-BSA와 함께 인큐베이션하면 비특이적 배경 결합이 생성되는 반면, FLUO-BSA-TRP 및 FLUO-BSA-ILO와 함께 인큐베이션하면 각각 5.5±0.5% 및 39.3±0.6%의 양성 A549 세포 및 51±1.8% 및 76.1±1.4%의 양성 16HBE14o- 세포가 생성되었다 (도 2). A549 및 16HBE14o- 세포의 평균 형광 강도 (mean fluorescence intensity; MFI)는 FLUO-BSA-TRP와 함께 인큐베이션한 후보다 FLUO-BSA-ILO와 함께 인큐베이션한 후에 유의하게 더 높았다. 이들 결과는 TRP 및 ILO가 페세포에의 모델 물질 FLUO-BSA의 성공적인 결합을 매개할 수 있지만 ILO가 더욱 효과적인 표적화 리간드임을 입증하였다.
다양한 폐 세포주에의 FLUO-BSA-ILO 결합의 특이성
ILO는 TRP와 비교하여 더욱 우수한 세포 결합/흡수 때문에 추가의 폐 세포주 상의 표적화 리간드로서 추가로 조사되었다. A549 및 16HBE14o- 세포에 더하여, H441 및 BEAS-2B 세포를 FLUO-BSA-ILO와 함께 인큐베이션하면 대조 FLUO-BSA보다 유의하게 더 높은 수 (p < 0.01)의 양성 세포 및 MFI가 생성되었다 (각각 9.1±1.9% 및 13.7±1.2%와 비교하여 각각 38.0±1.8% 및 82.7±1.6%) (도 3a). 이러한 효과는 클라라 (clara) (H441) 또는 폐포 (A549) 상피 세포에서보다 인간 기관지 상피 세포 (16HBE14o-, BEAS-2B)에서 더욱 현저하였다. 이들 결과는 인간 폐 세포의 유형에서의 IP1 수용체의 상이한 세포 표면 발현을 입증하는 것이었다.
폐 세포에서 FLUO-BSA-ILO의 관찰된 수용체 결합 특이성을 확인하기 위하여, 16HBE14o- 세포를 증가하는 양의 CAY10449의 존재 하에 FLUO-BSA-ILO와 함께 인큐베이션하였다. 이 화합물은 인간 IP1 수용체의 고도로 특이적인 강력한 길항제인 것으로 더욱 이른 시기에 이미 보고되었다 [27, 28]. 16HBE14o- 세포를 증가하는 농도의 CAY10449와 함께인 25　nM의 FLUO-BSA-ILO와 함께 인큐베이션하였다. CAY10449의 첨가는 형광 양성 세포의 수뿐만 아니라 MFI의 수의 유의한 용량 의존적 감소로도 이어졌다 (p < 0.01) (도 3b). 최고 CAY10449 사용 농도에서, 형광 양성 세포의 수는 95.7±0.7%로부터 7.4±0.9%로 감소하였다. FLUO-BSA 접합체와 함께 인큐베이션한 세포를 대조군으로 사용하였으며, 이는 CAY10449의 첨가시에 활성을 나타내지 않았다. 과량의 비접합된 ILO를 이용한 경쟁적 실험에서 유사한 결과를 수득하였다.
억제 실험과 함께인 FACS 측정은 폐 상피 세포 상에서의 IP1 수용체의 세포 유형 의존적 세포 표면 발현을 시사하였다. ILO가 FLUO-BSA-ILO의 세포내 흡수를 매개하는지를 추가로 시험하기 위하여, 공초점 레이저 주사 현미경법을 이용하여 추가의 실험을 실시하였다. 16HBE14o- 세포를 0.5　μM의 FLUO-BSA 또는 FLUO-BSA-ILO 중 어느 하나와 함께 인큐베이션하였다. 공초점 현미경법에 의한 세포의 가시화는 명백한 세포 표면 결합, 이어서 FLUO-BSA-ILO 접합체의 세포내 흡수를 보여주었으며 (도 3c), 반면에 FLUO-BSA의 흡수는 관찰되지 않았다.
PEI 및 PEI-g-ILO 유전자 벡터 입자의 특성화
ILO는 카르보디이미드 화학 FILO = 2, 5, 8 및 16을 통하여 PEI에 커플링시키고, 생성된 유전자 벡터 입자의 크기를 동적 광산란법에 의해 측정하였다 (표 1). N/P 비가 4 내지 8인, 커플링 정도 FILO = 2 및 5를 갖는 입자는 유체역학적 직경이 50 내지 100　nm였으며, 이는 PEI 유전자 벡터에 비견되었다. PEI N/P 2, PEI-g-ILO FILO = 2, N/P 2 내지 3 및 PEI-g-ILO FILO = 16 N/P 4는 불안정하였으며, 침전되었다. 150　nm보다 작은 입자의 다분산도는 < 0.2였다.
다음 단계는 PEI-g-ILO 구축물의 DNA 결합 친화도를 결정하는 것이었다. N/P 4인 입자를 제조하였으며, DNA 방출 검정을 실시하였다 (도 4). PEI, PEI-g-ILO FILO = 2 및 PEI-g-ILO FILO = 5에 있어서, 헤파란 술페이트를 첨가하면 DNA가 완전히 방출되었다. 16의 높은 커플링 정도에 있어서, DNA의 단지 부분적인 방출이 관찰되었으며, 이는 플라스미드에의 중합체의 더욱 강한 결합을 시사하는 것이었다. 따라서 16 이상의 커플링 정도는 덜 바람직하다.
시험관내 트랜스펙션 효율
다양한 폐 세포에서의 FLUO-BSA-ILO의 증가된 결합 및 흡수와, PEI-g-ILO/pCMV-luc 입자의 형성 가능성은 시험관내에서의 유전자 전달을 개선하기 위하여 리간드로서 ILO를 추가로 연구하는 이유가 되었다. 16HBE14o- 세포를 PEI-g-ILO 유전자 벡터로 트랜스펙션시키고, 대조군으로서 비변형 PEI와 비교하였다. 유전자 전달 효율을 N/P 비에 의해 증가시켰다. 최고의 유전자 발현 정도는 N/P 4 및 FILO = 5에 있어서 발견되었다. 이들 최적화 조건 하에서, 유전자 발현은 PEI보다 46배 더 유의하게 높았다 (도 5a). 더 높은 N/P 비 (> 4)에 의한 입자 형성은 유전자 발현의 임의의 추가의 생성으로 이어지지 않았다. 다른 커플링 정도를 갖는 PEI-g-ILO 접합체는 PEI와 비교하여 더욱 낮거나 또는 동일한 트랜스펙션 등급으로 이어졌다.
CAY10449를 이용한 경쟁적 억제에 대한 실험을 실시하여 PEI-g-ILO 유전자 벡터의 수용체 매개된 유전자 전달을 확인하였다. 16HBE14o- 세포를 150　μM의 CAY10449의 존재 또는 부재 하에 PEI 또는 PEI-g-ILO FILO = 5 유전자 벡터 (N/P는 4임)로 트랜스펙션시켰다. PEI-g-ILO FILO = 5에 있어서 관찰된 유전자 발현은 PEI에 비하여 유의하게 (p < 0.01) 33배 감소하였다 (도 5b). PEI로 트랜스펙션시킨 세포에서는 CAY10449에 의한 효과가 관찰되지 않았다.
더욱이, PEI-g-ILO FILO = 5를 A549 및 BEAS-2B 세포에서 또한 시험하였다. 최적화된 조건 하에서, PEI-g-ILO FILO = 5에 의해 매개된 발현은 각각 A549 및 BEAS-2B 세포에서 PEI보다 45배 및 14배 더 높았다 (도 5c).
생체내에서의 유전자 방출에 대한 조사
PEI-g-ILO FILO = 5 및 PEI 유전자 벡터 입자를 에어로졸을 통하여 BALB/C 마우스의 폐에 전달하고, 유전자를 전달한지 24시간 후에 유전자 발현을 분석하였다. 생체내 생물발광 영상에 대한 루시페라제 유전자 발현의 측정은 PEI-g-ILO FILO = 5 유전자 벡터로 처리한 마우스의 폐에서 강한 신호를 나타냈지만, PEI 유전자 벡터의 경우 검출 한계에 도달하였다 (도 6a). 폐 조직 1 mg 당 루시페라제의 정량적 평가를 위해, 마우스를 희생시키고, 폐를 단리하였다. 균질화된 폐 조직에서 측정한 루시페라제 발현은 PEI 유전자 벡터보다 PEI-g-ILO FILO = 5 유전자 벡터에 있어서 유의하게 14배 더 높았다 (도 6b).
시험관내 및 생체내에서의 독성
유전자 벡터 입자 (PEI-g-ILO FILO = 5/pCMV-luc 또는 PEI/pCMV-luc)의 적용 후 시험관내 생존율을 MTT 검정을 이용하여 측정하였다. PEI와 비교하여, 세포독성 증가가 관찰되지 않았다 (PEI에 있어서의 89.2±3.2%와 대조적으로 PEI-g-ILO FILO = 5에 있어서 86.0±10.1%의 세포 생존율). 생체내 독성 및 염증을 결정하기 위하여, 혈청을 처리 마우스로부터 수득하고, 인터류킨-12 (IL-12) 및 인터페론-γ (INF-γ)를 포함하는 염증성 시토카인을 측정하였다. 시험관내 MTT 결과의 경우에서와 유사하게, 유전자를 전달한지 24시간 후 ELISA에 의하면 시토카인의 유의한 증가는 검출되지 않았다.
상기 실험은 프로스타글란딘-I2 유사체 ILO, IP1 수용체 효능제는 시험관내 및 생체내에서 폐 세포에서 PEI와 같은 양이온성 중합체의 유전자 전달을 개선하기 위한 표적화 리간드로서 사용될 수 있음을 입증하였다. 표적화 리간드로서 프로스타글란딘-I2 유사체와, 활성 물질을 위한 캡슐화 재료로서 양이온성 중합체를 포함하는 본 발명에 따른 접합체는 유전자 발현의 유의한 향상을 허용하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 연구에서는 리포터 유전자 발현이 인간 폐포 (A549) 및 기관지 상피 세포 (16HBE14o-, BEAS-2B)에서 유의하게 증가하였으며, 실제로 최대 46배 증가하였음이 입증되었다. 더욱이, 마우스 폐에서의 루시페라제 활성은 PEI의 경우에서보다 에어로졸 처리 후 유의하게, 실제 14배 더 높았다.
ILO 및 TRP는 인간 IP1 수용체의 효능제이다 [29]. 상기 둘 모두는 에어로졸 흡입을 통하여 또는 정맥내 (i.v.) 투여를 통하여 폐 동맥 고혈압의 치료용으로 승인되었다 [20, 30, 31]. IP1 수용체는 인간 및 마우스의 폐에서 발현되며 [15, 32-34], IP1 수용체/리간드 복합체는 세포 내로 내재화된다 [35, 36]. 이들 특성을 본 발명에 따라 활용하여 작용제의 폐 세포 내로의 도입을 위한 개선된 시스템이 이용가능해지도록 하였다.
다양한 유형의 폐 세포에서의 IP1 수용체 발현을 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. 폐 세포의 세포 표면 상에서의 IP1 수용체 발현을 더욱 더 상세하게 특성화하기 위하여, ILO 또는 TRP 중 어느 하나에 커플링된 플루오레세인-표지 BSA 접합체를 합성하였다. 그 후, 둘 모두의 구축물을 폐포 (A549) 및 기관지 (16HBE14o-) 상피 세포주와 함께 인큐베이션하고, 세포에의 결합을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 그 결과에 의하면, IP1 수용체가 각각의 시험한 세포주 상에 존재함이 나타났다. 그러나, ILO는 TRP보다 더 현저한 세포 표면 결합을 나타냈으며, 이는 ILO를 모든 후속 실험에서 표적화 리간드로서 사용한 이유가 되었다. IP1 수용체의 결합 특이성을 특이적 IP1 수용체 효능제 CAY10449를 이용한 억제 실험에 의해 [27, 28, 32] 그리고 과량의 유리 ILO에 의해 입증하였다.
이들 관찰을 확인하기 위하여, 공초점 레이저 주사 현미경법을 실시하였으며, 이는 세포 표면에의 FLUO-BSA-ILO의 결합 및 16HBE14o- 세포 내로의 세포내 흡수를 보여주었다. 따라서, 이들 결과는 유전자 벡터 나노입자의 수용체 매개된 흡수에 필수적인, FLUO-BSA와 같은 접합된 물질의 결합 및 세포내 흡수를 매개하는 표적화 리간드로서 ILO를 본 발명에 따라 사용할 수 있음을 확인해 주었다.
트랜스펙션 연구를 실시하기 위하여, ILO를 아미드 결합을 통하여 25 kDa의 분지형 PEI에 접합시켰다. 이 합성에 의해 FILO　=　2, 5, 8 및 16의 커플링 정도를 갖는 접합체가 생성되었다. PEI-g-ILO/pCMV-luc 입자를 16HBE14o- 세포에서 스크리닝하였으며, 최고 트랜스펙션 효율은 N/P 4 FILO = 5에서 관찰되었고, 반면에, 8 내지 16의 더욱 높은 커플링 정도는 트랜스펙션 비율을 더욱 낮아지게 하였다. 이는 더욱 높은 커플링 정도에서의 pCMV-luc의 불완전한 방출로 인한 것일 수 있는데, 이는 DNA 방출 검정을 이용하여 관찰하였다. PEI/p-DNA로부터의 pDNA의 방출은 성공적인 유전자 전달의 결정적인 파라미터인 것으로 이미 밝혀졌었다 [37]. ILO와 pDNA의 추가의 소수성 상호작용은 pDNA 결합을 강화시킬 수 있는 것으로 생각될 수 있다. 상이한 입자의 크기의 측정은 증가하는 양의 리간드가 PEI-g-ILO/pCMV-luc 입자에 있어서 1　μm 이하의 더욱 큰 유체역학적 직경으로 이어짐을 입증하였다. 클렌부테롤을 PEI에 커플링시켰을 때 유사한 결과가 엘핑거 (Elfinger) 등에 의해 수득되었다 [13]. PEI-g-ILO FILO = 5를 포함하는 입자의 유체역학적 직경은 100　nm 미만이었다. 유사한 크기의 입자는 더욱 큰 입자보다 더 효율적으로 내재화되었으며, 이는 이미 입증되었었다 [38]. N/P 4인, PEI-g-ILO FILO = 5/pCMV-luc 입자를 이용한 폐포 (A549) 및 기관지 (16HBE14o-, BEAS-2B) 상피 세포의 트랜스펙션은 모든 시험한 세포주에서 동일한 N/P 비를 갖는 PEI/pCMV-luc 입자와 비교하여 리포터 유전자 발현을 46배 증가시켰다. 관찰된 향상된 유전자 발현은, MTT 검정에서 측정할 경우 대사 독성의 더욱 큰 증가로 이어지지 않았다. 더욱이, 수용체 매개된 유전자 전달의 가설은 특이적 길항제에 의해 매개된 16HBE14o- 세포에서의 억제를 이용한 실험에 의해 추가로 지지되었다. CAY10449의 첨가는 PEI에 비견되는 정도로 유전자 발현을 감소시켰다.
CpG-비함유 루시페라제 발현 플라스미드 (pCpG-luc)를 동물 실험에 사용하였다. CpG-비함유 플라스미드는 CpG-함유 플라스미드보다 덜 현저한 염증 효과를 가짐이 나타났다. 또한, 이는 폐에서 더욱 높은 그리고 더욱 지속된 유전자 발현에 이르게 된다는 것이 입증되었다 [39]. 동물 실험 전에, PEI-g-ILO FILO = 5/pCpG-luc 및 PEI/pCpG-luc 유전자 벡터를 분무화하고, 다양한 분획물을 수집하여 (분무화, 비분무화) 입자의 안정성을 시험하였다. 겔 지연 검정 및 입자 크기 측정 둘 모두는 비분무화 입자와 비교하여 분무화 후 입자의 변화가 없음을 나타냈다. 이들 관찰은 에어로졸 형성이 입자에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 확인해 주는 것이었다. 동일한 결과가 이전에 보고되었다 [40]. 마우스 폐에 에어로졸을 투여한 후, 유전자 발현은 PEI/pCpG-luc 유전자 벡터에 있어서보다 PEI-g-ILO FILO = 5/pCpG-luc에 있어서 유의하게 14배 더 높았다. 매스 혈청 중 인터류킨-12 (IL-12) 및 인터페론-γ (INF-γ)의 측정은 이들 시토카인의 유의한 증가가 없음을 나타냈다. 이러한 관찰은 PEI-DNA 입자의 에어로졸 투여가 더욱 큰 시토카인 반응을 유도하지 않음을 입증한 가우탐 (Gautham) 등의 관찰과 합치되었다.
요약하면, 물질을 폐 내로 전달하기 위한 신규한 표적 탐색 구조체가 본 발명에 따라 제공된다고 할 수 있다. 표적화 목적을 위한 리간드로서 프로스타시클린 유사체, 특히 ILO의 잠재성이 본 발명자에 의해 인식되었으며, 이를 폐 세포 내로의 물질의 투여를 위한 "페리 (ferry)"로서 활용하였다. 특히, ILO 프로스타시클린 유사체는 에어로졸 형태로, 비바이러스 벡터를 위한 표적화 리간드로서 유용하다. 플루오레세인-기재의 분자형 접합체를 사용하여, IP1 수용체가 폐 세포에서의 수용체 매개된 유전자 전달에 적합한 후보임을 입증하였다. 분자형 접합체의 수용체 특이적 결합 및 흡수는 폐포 세포에서뿐만 아니라 기관지 상피 세포 및 클라라 세포에서도 입증되었다. 본 발명에 따른 접합체는 시험관내 및 생체내 유전자 발현의 특정한 유의한 증가를 가져왔다. 유전자 발현에 있어서의 10배 초과의 증가는 pDNA 및 유전자 담체의 양을 감소시키는 것이 가능해지게 하며, 이는 DNA- 또는 담체-매개된 독성 및 염증을 감소시킨다.
이 실시예의 결과가 도 1 내지 7 및 표 1에 제시되어 있다.
표 1: 상이한 N/P 비의, 상이한 커플링 정도 (FILO = 2, 5, 8, 16)를 갖는 PEI-g-ILO를 사용한 PEI/pCMV-luc 및 PEI-g-ILO/pCMV-luc 유전자 벡터의 물리적 특성화:
입자 크기 및 다분산도 (괄호 내)의 측정. 결과를 평균±표준 편차로 제시하였다 (n = 3).
도 1
웨스턴 블롯은 인간 폐포 (A549) 및 기관지 (BEAS-2B, 16HBE14o-) 상피 세포에서 67　kDa의 IP1 수용체 단백질의 발현을 보여준다. 각각의 레인에 40　㎍의 단백질 추출물을 로딩하였다.
도 2
TRP 및 ILO를 이용한 IP1 수용체의 폐포 (A549) 및 기관지 (16HBE14o-) 상피 세포주에의 표적화. FLUO-BSA, FLUO-BSA-TRP 및 FLUO-BSA-ILO의 인큐베이션을 0.5　μM의 농도에서 수행하였다 (n = 4): FACS 측정. 결과를 평균±표준 편차로 제시하였다. **는 p < 0.01에서의 통계적 유의도를 의미한다.
도 3
폐포 (A549), 기관지폐포 (H441) 및 기관지 (16HBE14o-, BEAS-2B) 상피 세포에서의 IP1 수용체의 분포 및 수용체 결합. FLUO-BSA-ILO 및 FLUO-BSA와 함께 인큐베이션하는 것을 0.5　μM의 농도에서 수행하였다 (n = 4): FACS 측정 (a). 16HBE14o- (b,c) 및 A549 (d) 세포를 증가하는 농도의 CAY10449와 함께 25　nM의 FLUO-BSA-ILO 및 FLUO-BSA와 함께 인큐베이션하였다 (n = 4); FACS 측정 (b,c,d). 공초점 레이저 주사 현미경법에 있어서, 16HBE14o- 세포를 0.5　μM FLUO-BSA-ILO 및 FLUO-BSA와 함께 인큐베이션하였다 (e). 결과를 평균±표준 편차로 제시하였다. **는 p < 0.01에서의 통계적 유의도를 의미한다.
도 4
N/P = 4인 PEI 및 상이한 PEI-g-ILO 구축물에 있어서의 DNA 지연 검정. pCMV-luc와 복합체를 형성한 중합체를 헤파란 술페이트와 함께 (+) 그리고 헤파란 술페이트 없이 (-) 인큐베이션하고, 아가로스 겔 상에서 분리하고, 에티듐 브로마이드로 염색한 후 UV광 하에서 가시화하였다.
도 5
시험관내에서의 트랜스펙션 효율. 상이한 N/P 비의 다양한 PEI-g-ILO 구축물과 복합체를 형성한 pCMV-luc를 이용한 16HBE14o- 세포의 트랜스펙션 (n = 4): 루시페라제 유전자 발현의 측정 (a), CAY10449를 이용한, 4의 N/P 비를 갖는 PEI/pCMV-luc 및 PEI-g-ILO FILO = 5/pCMV-luc 입자의 억제 실험 (n = 3): 루시페라제 유전자 발현의 측정 (b). 4의 N/P 비를 갖는 PEI/pCMV-luc 및 PEI-g-ILO FILO = 5/pCMV-luc를 이용한 A549, 16HBE14o- 및 BEAS-2B의 트랜스펙션 (n = 6): 루시페라제 유전자 발현의 측정 (c). 세포 단백질 1 mg 당 10 s 동안 상대 광 단위 (relative light unit; RLU)의 발광으로서 루시페라제 유전자 발현을 측정하였다. 결과를 평균±표준 편차로 제시하였다. **는 p < 0.01에서의 통계적 유의도를 의미한다.
도 6
에어로졸 투여 후 BALB/c 마우스의 폐에서 N/P 비 = 4를 갖는 PEI/pCpG-luc 및 PEI-g-ILO FILO =5/pCpG-luc 입자를 이용하여 생체내 루시페라제 유전자 발현을 수득하였다 (n = 5). 24시간 후 노출 시간을 10분으로 한 생물발광 영상 (a). 노출 시간을 30 s로 하여 마우스의 폐 균질화물에서 루시페라제 발현을 측정하는 것을 트랜스펙션한지 24시간 후에 수행하였다 (b). 결과를 중앙치에서의 연직점으로서 제시하였다. **는 p < 0.01에서의 통계적 유의도를 의미한다.
도 7
PEI-g-ILO FILO =5/pCMV-luc 입자와 비교하여 그리고 비처리 세포와 비교하여, N/P = 4를 갖는 PEI/pCMV-luc 입자를 이용한 폐포 (A549) 및 기관지 (16HBE14o-), BEAS-2B) 상피 세포의 트랜스펙션은 MTT 검정에서 측정할 경우 대사 독성을 증가시키지 않았다 (a). 나아가, 마우스의 폐에 PEI-g-ILO FILO=10를 전달한 후 마우스 혈청에서 인터류킨-12 (IL-12) 및 인터페론-γ (IFN-γ)를 측정하고, 이를 PEI 및 비처리 마우스에서의 전달과 비교하였다. 이들 시토카인의 유의한 증가는 관찰되지 않았다.
실시예 2
폐 세포에서의 용량 의존적 유전자 벡터 표적화
pCMV-luc의 양을 1　㎍으로부터 0.25　㎍으로 감소시킴으로써 16HBE14o- 세포를 PEI 및 PEI-g-ILO 유전자 벡터 입자로 트랜스펙션시켰다 (도 8). 트랜스펙션한지 24시간 후, 유전자 전달 효율은 용량 의존적 방식으로 감소하였다. 최고의 유전자 발현 정도는 1　㎍의 pCMV-luc에서 발견되었다. 그러나, PEI-g-ILO FILO = 5와 복합체를 형성한 pCMV-luc 0.5　㎍은 비변형 PEI와 복합체를 형성한 pCMV-luc 1　㎍과 동일한 발현으로 이어졌다 (3.3*105 대 3.2*105 RLU/10 s/mg의 단백질).
유전자 전달 효율은 용량 의존적 방식으로 감소함을 입증하기 위하여, 유전자 벡터 입자의 양을 감소시킨 트랜스펙션 실험을 실시하였다. 이는 PEI-g-ILO FILO = 5 유전자 벡터 입자의 50%로의 감소가 100% PEI 유전자 벡터 입자와 비교하여 동일한 발현으로 이어짐을 입증하였다. 이들 데이터는, 동일한 발현 정도를 유지하면서 유전자 담체 및 pDNA의 양을 감소시킬 수 있음을 명백하게 입증하였다. 나아가, pDNA 및 담체 매개된 독성 및 염증 둘 모두를 감소시키는 것이 또한 가능하였다.
이 실시예의 결과가 도 8에 또한 제시되어 있다.
상세한 설명에서 참조된 참고문헌이 이하에 명시되어 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003

Claims (16)

  1. 캡슐화 재료로 캡슐화된 작용제를 포함하는 작용제 복합체와, 프로스타시클린 유사체인 적어도 하나의 표적 탐색 리간드의 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 프로스타시클린 유사체가 일로프로스트 또는 트레프로스티닐인 것을 특징으로 하는 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 작용제가 핵산 또는 그의 유도체, 펩티드, 폴리펩티드 또는 그의 유도체, 활성 물질 또는 추적자인 것을 특징으로 하는 접합체.
  4. 제3항에 있어서, 핵산이 결여 또는 결핍시 질환을 야기하는 DNA 또는 RNA이거나, 또는 결여 또는 결핍시 질환을 야기하거나 또는 면역조절 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 접합체.
  5. 제3항에 있어서, 작용제가 결여 또는 결핍시 질환을 야기하거나 또는 면역조절 활성을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 단백질 결함 또는 단백질 결여를 보상하는 생성물이며, 핵산, 단백질, 단백질 유도체 또는 단백질 단편 또는 폐에서 활성인 제약 또는 그의 혼합물 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 접합체.
  7. 제3항에 있어서, 활성 물질이 항염증 활성 물질 또는 스테로이드인 것을 특징으로 하는 접합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 리포터 분자, 특히 방사성 또는 형광 추적자인 것을 특징으로 하는 접합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 캡슐화 재료가 지질 또는 중합체 또는 올리고머와 같은 천연 발생, 합성 또는 유도체화 천연 물질인 것을 특징으로 하는 접합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 캡슐화 재료가 생분해성 질소함유 중합체와 같은 양이온성 중합체, 바람직하게는 양성자화될 수 있는 것, 특히 폴리에틸렌이민 또는 생분해성 폴리에틸렌이민, 스페르민과 같은 양이온성 올리고머 또는 양이온성 지질인 것을 특징으로 하는 접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 캡슐화 재료 및 핵산의 작용제 복합체가 추가로 PEG화된 (pegylated) 것임을 특징으로 하는 접합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 요법에서 사용하기 위한 또는 단백질 결함 또는 유전자 결함에 의해 야기되는 폐 질환, 특히 낭성 섬유증의 치료에 사용하기 위한 접합체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 질소 함량 대 DNA 포스페이트 함량의 몰비로 측정된 양이온성 중합체 대 핵산의 비가 10:1 내지 1:20의 범위인 것을 특징으로 하는 접합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 캡슐화 재료에 의해 캡슐화된 작용제가 나노캡슐, 나노입자 또는 리포솜의 형태로 존재하는 것임을 특징으로 하는 접합체.
  15. 폐 질환 치료에서 기관지 및/또는 폐포 상피 세포 내로 수송되는 작용제를 위한 표적 탐색 구조체로서 사용하기 위한 프로스타시클린 유사체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 접합체 및 통상의 제약 보조제를 포함하는, 흡입에 적합한 형태의 폐 장애 치료용 치료 조성물.
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