JP5748768B2 - 標的探索リガンドを有する結合体及びその使用 - Google Patents
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Description
化学物質及びプラスミドの供給元、並びに使用濃度は以下の通りである。
イロプロスト、トレプロスチニル、CRY10449:ケイマンケミカル社(米国ミシガン州)
分岐ポリエチレンイミン(平均分子量25kDa)、N−ヒドロキシスルホスクシンイミド(sulfo−NHS)、ウシ血清アルブミン(BSA)、リン酸ナトリウム、ピクリルスルホン酸溶液、4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸(HEPES)、及びヘパラン硫酸:シグマアルドリッチ社(独国、シュネルドルフ)
PEIを再蒸留水(注射用の水、Bブラウンメルズンゲンアーゲー社(独国メルズンゲン))に希釈し、塩酸水溶液を用いてpHを7に調節した。
リン酸ナトリウムを再蒸留水に溶解して、濃度を0.5mMとし、水酸化ナトリウムによりpHを7.5に調節した。
HEPESを蒸留水に溶解して、濃度を0.1Mとし、水酸化ナトリウムによりpHを7.4に調節した。
ヘパラン硫酸を再蒸留水に溶解して濃度を5mg/mlとした。
エタノール(分析グレード)及び3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS):メルク社(独国ダルムシュタット)
MOPSを再蒸留水に溶解して、濃度を0.1Mとし、塩酸水溶液を用いてpHを6に調節した。
1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸(EDC)及び5−(及び6−)カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(Fluorescein−NHS):ピアース社(米国ロックフォート)
ジチオスレイトール(DTT):アマシャムバイオサイエンス社(米国南サンフランシスコ)
D−ルシフェリン:シンケムOHG社(独国フレンスベルク/アルテンブルク)
初期サイトメガロウィルス(CMV)プロモーターの制御によりフォティナス・ピラリス(Fotinus pyralis)ルシフェラーゼ遺伝子を含有させたpCMV−lucプラスミド、及びpCpG−lucプラスミドは、大腸菌中で増殖され、高度に精製された状態(LPS含量≦0.1E.U./μgDNA)で、プラスミドファクトリー社(独国ビーレフェルト)により得た。スーパーコイルpDNAの量は、pCMV−lucでは90%ccc(共有結合閉環)以上であり、pCpG−lucでは、98%ccc以上であった。
A549細胞(ヒト肺胞上皮細胞):DSMZ(deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen[ドイツ国微生物及び細胞培養物コレクション]、独国ブラウンスヴァイク)
BEAS−2B(ヒト気管支上皮細胞)、H441(ヒト細気管支上皮細胞):ATCC(アメリカンタイプカルチャーコレクション)
16HBE14o−細胞:ヒト気管支上皮細胞
A549、BEAS−2B、及び16HBE14o−細胞株を37℃、空気中のCO2が5%の湿気環境で、基礎培地(MEM、ジブコ−BRL社製(独国カールスルーエ))中で培養し、10%ウシ胎仔血清(FCS、ジブコ−BRL社製(独国カールスルーエ))を追加した。H441細胞株を37℃、空気中のCO2が5%の湿気環境で、基礎培地(MEM、ジブコ−BRL社製(独国カールスルーエ))中で培養し、ロズウェルパーク記念研究所培地1640(RPMI1640、ジブコ−BRL社製(独国カールスルーエ))中で培養し、10%FCSを追加した。
14週齢メスBALB/cマウス(チャールズリバーラボラトリー社、独国スールツフェルト)を特定病原体未感染条件下で飼育した。実験に先立って、マウスを少なくとも7日間順応させた。すべての動物取り扱い手順は動物実験倫理委員会によって承認及び検査され、German Recht zum Schutz von Tierleben[独国動物生命保護法]によるガイドラインに従って実施した。
A549−,BEAS−2B、及び16HBE14o−細胞をPBSで洗浄して、20mMのTris−HCl(pH7.5)、100mMのNaCl、1mMのEDTA、1%のTritonX−100、及び0.05%のデオキシコール酸ナトリウムを含む溶解(lysis)バッファー中で氷冷溶解した。1mMのDTT及びプロテアーゼインヒビターカクテル(ロシュダイアグノスティックス社、独国マンハイム)を、使用前に直接新たに添加した。バイオラッドプロテインアッセイ(バイオラッド社、独国ミュンヘン)によりタンパク質濃度を測定した。各細胞株について、50μgのタンパク質をSDSサンプルローディングバッファー(62.5mMTris−HCl(pH6.8)、2%SDS、10%グリセロール、2%DTT、0.001%ブロモフェノールブルー)で希釈し、5分間沸騰させ、7.5%Tris−HClゲル(バイオラッド社、独国ミュンヘン)上で分離させ、PVDF膜(ミリポア社、独国シュヴァルバハ)に転写した。5%スキムミルク粉末(シグマアルドリッチ社、独国デイセンホッヘン)TBS−T(20mMのTris−HCl (pH7.6)、137mMのNaCl、0.1%のTween−20)で、室温で1時間、膜をブロックした。IP1受容体用の1次ポリクローナル抗体(希釈1:500)(ケイマンケミカル社、米国ミシガン州)を0.5%スキムミルク中で1晩培養した。膜をTBS−Tで洗浄し、2次HRP結合抗ラビット抗体(希釈1:15000、バイオラッド社、独国ミュンヘン)と共に0.5%スキムミルク中で、室温で1.5時間培養した。TBS−Tによる数回の洗浄ステップの後に、製造元の説明書に従って、ECL測定キット(ピアース社、米国ロックフォート)を用いた化学発光の測定を実施した。
BSAの20mg(0.3μmol)を2.5mlのリン酸ナトリウムバッファ(pH7.5)で希釈し、10倍モル過剰のフルオレセインNHSと混合した。室温で1時間攪拌した後、混合物をPBS平衡セファデックスG25MPD−10カラム(GEヘルスケア社、スウェーデン、ウプサラ)で精製した。0.7mg(1.8μmol)のILO又は0.8mg(1.8μmol)のTRPを130μlの分析グレードエタノールに溶解し、370μlのMOPSバッファー、0.1M、pH6、0.5mg(5mM)のsulfo−NHS(MOPSバッファー中)、及び0.2mg(2mM)のEDC(MOPSバッファ中)に添加して、混合物を室温で15分間攪拌した。その後、5μl(20mM)のDTT(蒸留水中)を添加し、190μl中3mg(45.2nmol)のFLUO−BSA、及び210μlの0.5Mリン酸バッファーを、ピペットによって迅速に反応溶液に注入した。混合物を室温で2時間混合して、PBS平衡セファデックスG25MPD−10カラム(GEヘルスケア社、スウェーデン、ウプサラ)で精製した。BSA標準曲線を用いたバイオラッドプロテインアッセイにおいて、BSAの量を定量的に評価した。最終産物及び中間産物のカップリング効率をTNBSアッセイによって測定し[21]、吸光度を495nmで測定した。BSA−ILO及びBSA−TRPのカップリング度は、BSA1molあたり、ILO又はTRPが10molであることが明らかとなった。
様々な程度のPEI−g−ILOのカップリングを、反応混合物に添加するEDC量を変化させて合成した。ILO1mg(2.8μmol)を分析グレードエタノール100μlに希釈し、900mlのHEPESバッファー(0.1M、pH7.4)中の68nmolのPEI及び1mg(5mM)のsulfo−NHSと混合した。様々な量のEDCを添加して最終濃度をそれぞれ25mM、50mM、60mM、又は100mMとし、混合物を室温で4時間攪拌しながら培養した。再蒸留水で平衡化したセファデックスG25MPD−10カラム(GEヘルスケア社、スウェーデン、ウプサラ)で反応混合物を精製した。PEI濃度を、ウンガロらによる文献[22]に記載のようなCuSO4テストで測定した。PEI−g−ILOの1H−1D NMRスペクトルを、D2O中で、ブルーカー社(Bruker)AV250MHzスペクトロメーターで測定した。PEI−g−ILOのカップリング度は、δ(1H)=2.5〜3.1ppmにおけるPEI(CH2−CH2−NH−)の幅広多重線(broad multiplet)と、δ(1H)=1.73ppmにおけるILO(−C≡C−CH3)の末端メチル基の一重線とを統合することによって算出した。ILOのPEIに対する共有結合は、4つの異なるカップリング度(FILO(mol ILO/mol PEI)=2,5,8,16)に反映される。PEI−g−ILOは、少量の等分量に分割し、液体窒素中で凍結保存し、この後使用するまで−80℃に維持した。
A549,H441,16HBE14o−及びBEAS−2B細胞について、FLUO−BSA−ILOの受容体結合/取り込みを調査した。FACS測定実験のために、24−ウェルプレート(TPP社、スイス国トラサディンゲン)に、結合体を添加する24時間前に100000細胞/ウェルを播種した。FLUO−BSA−ILO,FLUO−BSA−TRP、及びFLUO−BSA結合体をMEMに希釈して濃度を0.5μMとし、細胞を37度で5時間培養した。細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理によって細胞をウェルから除去し、ベクトン・ディッキンソンFACSスキャン(米国サンノゼ)を用いてFACS測定を実施した。共焦点レーザー走査顕微鏡のために、BDFalconカルチャー(BDバイオサイエンス社、米国サンノゼ)の4つのチャンバーを有するスライドであって、1つのチャンバーあたり25000個の細胞を有するスライドについて実験を実施した。FLUO−BSA−ILO及びFLUO−BSAの培養は上述のようにして実施した。細胞を洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、その後、標準的な手順で、核を0.33μMのDAPI(4‘,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)で染色し、F−アクチンをAlexafluor(登録商標)568ファロイジン(インビトロゲン社、独国カールスルーエ)で染色した。スライドに溶媒(Vectashield、ベクターラボラトリー社、米国ベーリンガム)を広げ、共焦点レーザー走査顕微鏡(ライカ社、独国ゾルムス)を用いて撮像した。
16HBE14o−細胞について、FLUO−BSA−ILOの受容体結合/取り込みの阻害を調査した。上述のようにして24−ウェルプレートを準備した。CAY10449をMEMに希釈して濃度を15μM、30μM、及び150μMとし、混合物を37℃で15分間培養した。その後、FLUO−BSA−ILO及びFLUO−BSAを添加して最終濃度を25nMとし、細胞と共に37℃で4時間培養した。結合/取り込みはFACSを用いて測定した。
ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するプラスミド(pCMV−luc)及びPEI又はPEI−g−ILOをそれぞれ25μlの再蒸留水に希釈した。様々なN/P比(PEI窒素のDNAリン酸塩に対するモル比)を試験した。pCMV−luc溶液を同一量のポリマー溶液に添加し、ピペッティングにより8回上下させて穏やかに混合し、20μgpCMV−luc/mlの濃度の粒子とした。遺伝子導入粒子を室温で20分間培養した。
粒子サイズ(動的光散乱によって測定する)をゼータパルス/ゼータ電位分析装置(ブルックヘブンインスツルメント社、オーストリア国ウィーン)を用いて測定した。遺伝子ベクター粒子は上述のようにして生成した。以下のような設定、即ち、1つの試料あたり1分間の測定を5回、水の粘度0.89cP、参照インデックス1.330、温度25℃、で測定を実施した。
N/P=4で、様々なカップリング度のPEI/pCMV−luc及びPEI−g−ILO/pCMV−luc遺伝子ベクター粒子を、上述のようにして再蒸留水中で調製した。各粒子溶液5μlを再蒸留水2μl又はヘパラン硫酸溶液(5mg/ml)2μlと混合した。45分間培養した後、試料を1μlのローディングバッファー(水に対して、ブロモフェノールブルー0.25%、キシレンシアノールFF0.25%、グリセロール30%)と混合し、0.8%アガロースゲルのウェルにそれぞれ充填し、125Vでアガロースゲル電気泳動を1時間実施して分離した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色して、UV光でDNAバンドを可視化した。
トランスフェクションの24時間前に、A549,16HBE14o−、及びBEAS−2B細胞を24ウェルプレート(TPP社、スイス国トラサディンゲン)に、100000細胞/ウェルで播種し、10%FCSを含み、0.1%(v/v)ペニシリン/ストレプトマイシンが補充されたMEM中で培養した。トランスフェクションの前に、細胞をPBSで洗浄し、450μlの未使用の血清非含有培地を各ウェルに添加した。その後、1μgのpCMV−lucに相当する50μlの遺伝子ベクター粒子を細胞上にピペットで滴下した。阻害実験のために、遺伝子ベクター粒子を添加する15分前に、濃度150μMでCAY10449を未使用の培地に添加した。4時間培養下の地、トランスフェクション培地を、10%FCSを含み、0.1%(v/v)ペニシリン/ストレプトマイシンが補充されたMEMによって除去した。トランスフェクションの24時間後に、Wallac Victor2 1420マルチラベルカウンター(パーキンエルマー社、米国ボストン)を用いて、フス等により記載されたようにして[23]、ルシフェラーゼ活性を測定した。バイオラッドプロテインアッセイを使用し、BSAをタンパク質の標準として、結果を全細胞タンパク質含量に正規化した。
マウスへのエアロゾル供給用のベクター粒子を準備するために、pCpG−luc及びPEI又はFILO=5のPEI−g−ILOを、注射用にそれぞれ4.0mlの水で希釈した(Bブラウンメルズンゲンアーゲー社、独国メルズンゲン)。これにより、濃度は、それぞれ、pCpG−lucが250μg/ml、PEIが130.4μg/mlとなった(N/P比4に相当)。pCpG−luc溶液をPEI溶液にピペット注入して、8回上下させて混合し、最終的なDNA濃度を125μg/mlとした。使用前に粒子を室温で20分間培養した。ルドルフらによる文献[24]に記載された縦方向全身エアロゾル装置に接続されたパリLC+噴霧器を有するパリ・ターボボーイ(登録商標)N吸入器(パリ社、独国シュタルンベルク)を用いて、粒子を噴霧した。24時間後、マウスを麻酔し、D−ルシフェリン基質(マウス1匹あたり1.5mg/50μlPBS)を経鼻投与(sniffing)により肺内投与した[25]。10分後、(IVIS100イメージングシステム、キセノジェン社、米国アラメダ)により生物発光を測定した。カメラ設定は、視野10、F1 f−ストップ、高解像度ビニング、露出時間10分とした。肺内のレポーター遺伝子の発現度を確認するために、インビボ生物発光イメージングした後に頸椎脱臼によりマウスを安楽死(sacrifice)させた。正中線に沿って切開して腹膜を開き、マウスの肺を切除してPBSでかん流した。肺を液体窒素で凍結保存して、凍結状態でホモジナイズした。400μlの溶解バッファー(pH7.8の250mMのTris、0.1%Triton X−100、ロシュコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル錠)を添加し、氷上で20分培養した後、上澄みのルシフェラーゼ活性をLumatLb9507チューブルミノメーター(EG&Gベルトールド社、独国ミュンヘン)を用いて測定した。組み換え型ルシフェラーゼ(ロシュダイアグノスティックス社、独国マンハイム)を肺細胞中で発現したルシフェラーゼ量を算出するための基準として使用した。
N/P比4で、16HBE14o−細胞について、PEI/pCMV−luc又はFILO=5のPEI−g−ILO/pCMV−luc粒子の毒性を評価した。実験の24時間前に、80000細胞/ウェルの密度で細胞を24−ウェルプレートに播種した。上述のようにしてトランスフェクションを実施した。4時間後、トランスフェクション混合物を400μlの培地と置き換えて、製造元の説明書に従って、Cell Proliferationキット1(ロシュダイアグノスティックス社、独国マンハイム)を用いてMTTベース試験を実施した。未処理の細胞の吸光度を100%生存細胞として設定して、未処理の細胞を参照として使用した。
エアロゾル供給の24時間後に、血液試料をマウスから採取し、4℃で一晩保存した。血液を遠心分離にかけて、血清を回収した。インターロイキン−12(IL−12)及びインターフェロン−γ(IFN−γ)を、製造元の説明書に従って、マウスIL−12(P40/P70)及びマウスINF−γ−ELISAキット(レイバイオテック社、米国ノークロス)を用いて定量的に測定した。未処置のマウスの濃度を1と設定して、未処置のマウスを参照として使用した。
結果を平均値±標準偏差で示す。統計的に有意な差を、独立スチューデントT検定によって評価した。p<0.01である場合に有意であるとした。
[ウェスタンブロットによる肺細胞内におけるIP1受容体の発現の確認]
ヒト肺胞上皮細胞(A549)及び気管支上皮細胞(BEAS−2B,16HBE14o−)内におけるIP1受容体の発現をウェスタンブロット分析により確認した。47kDaにタンパク質バンドが検出された(図1)、このバンドは、細胞膜上で発現したIP1受容体タンパク質のグリコシル化型に対応する[26]。よって、タンパク質又は遺伝子を輸送するためにIP1受容体を標的としてアドレスすることが可能か否かを確認した。
受容体媒介遺伝子導入のためにIP1受容体を標的とすることを調査するために、TRP及びILOを、モデル物質として作用するフルオレセイン標識ウシ血清アルブミン(FLUO−BSA)に化学的にカップリングした。A549及び16HBE14o−細胞をFLUO−BSAと共に培養すると、非特異的バックグラウンド結合を生成し、FLUO−BSA−TRP及びFLUO−BSA−ILOと共に培養すると、5.5±0.5% 及び39.3±0.6%の陽性A549細胞と、51±1.8%及び76.1±1.4%陽性16HBE14o−細胞をそれぞれ生じる(図2)。A549及び16HBE14o−細胞の平均蛍光強度(MFI)は、FLUO−BSA−ILOで培養した方がFLUO−BSA−TRPで培養したものよりも有意に高かった。これらの結果は、TRP及びILOはモデル物質FLUO−BSAの肺細胞に対して結合することを媒介することができるが、ILOはより効率的な標的リガンドであることを示す。
TRPと比較して良好な細胞結合/取り込みを解明するために、追加の肺細胞株について、標的リガンドであるILOを更に調査した。A549及び16HBE14o−細胞に加えて、H441及びBEAS−2B細胞もFLUO−BSA−ILOと共に培養すると、それぞれ、対照FLUO−BSAよりも陽性細胞が有意に多く(p<0.01)、MSIが有意に高かった。FLUO−BSA−ILOを用いた場合、陽性細胞率はそれぞれ、38.0±1.8%及び82.7±1.6%であり、対照FLUO−BSAでは、それぞれ、9.1±1.9%及び13.7±1.2%であった(図3A)。このような効果は、ヒト気管支上皮細胞(16HBE14o−,BEAS−2B)の方が、クララ細胞(H441)上皮細胞又は肺胞(A549)上皮細胞よりも顕著であった。このような結果は、ヒト肺細胞の種類によって、細胞表面におけるIP1受容体の発現が異なることを証明した。
カルボイミジドの化学的性質によってILOをPEIに結合し、FILO=2,5,8及び16とし、得られた遺伝子ベクター粒子のサイズを動的光散乱で測定した(表1)。カップリング度がFILO=2及び5で、N/P比4〜8の粒子は、PEI遺伝子ベクターに相当する流体力学直径50〜100nmを有した。N/Pが2のPEI、FILO=2でN/Pが2〜3のPEI−g−ILO、及びFILO=16でN/Pが4のPEI−g−ILOによって調製した粒子は、不安定であり沈殿した。150nm未満の粒子は、多分岐性が<2であった。
様々な肺細胞における、FLUO−BSA−ILOの結合及び取り込みの増大や、PEI−g−ILO/pCMV−luc粒子を形成する可能性は、インビトロ遺伝子導入を改善するために、リガンドとしてILOを更に研究する理由である。PEI−g−ILO遺伝子ベクターによって16HBE14o−細胞をトランスフェクションし、対照である未改変PEIと比較した。遺伝子導入効率はN/P比に従って上昇した。N/Pが4、FILO=5の場合に、遺伝子発現度は最高であった。このような最適条件下では、遺伝子発現度はPEIよりも46倍有意に高かった(図5A)。比較的高いN/P比(>4)での粒子形成では、遺伝子発現度が更に上昇することは無かった。その他のカップリング度のPEI−g−ILO結合体では、PEIと比較してトランスフェクショングレードが同等かそれ以下であった。
FILO=5のPEI−g−ILO及びPEI遺伝子ベクター粒子をエアロゾルによってBALB/Cマウスの肺に投与し、遺伝子投与の24時間後に遺伝子発現を分析した。ルシフェラーゼ遺伝子発現の測定と対比して、インビボ生物発光画像は、FILO=5のPEI−g−ILO遺伝子ベクターで処理したマウス肺において強い信号を呈したが、PEI遺伝子ベクターの場合は検出限界に達した(図6A)。肺細胞1mg当たりのルシフェラーゼの定量評価のために、マウスを安楽死させて肺を摘出した。ホモジナイズした肺細胞についてルシフェラーゼ発現を測定した結果、FILO=5のPEI−g−ILO遺伝子ベクターの方がPEI遺伝子ベクターよりも16倍有意に高かった(図6B)。
遺伝子ベクター粒子(FILO=5のPEI−g−ILO/pCMV−luc又はPEI/pCMV−luc)を適用した後のインビトロ生存率を、MTTアッセイにより測定した。PEIと比較して、細胞毒性に上昇は見られなかった(生存率は、FILO=5のPEI−g−ILOで86.0±10.1%であり、PEIで89.2±3.2%であった)。インビトロ毒性及び炎症を測定するために、処置マウスから血清を採取し、インターロイキン−12(IL−12)及びインターフェロン−γ(INF−γ)を含む炎症サイトカインを測定した。インビトロMTTの結果と同様に、遺伝子投与後24時間後のELISAによる測定では、サイトカインの有意な上昇は見られなかった。
ウェスタンブロットは、ヒト肺胞(A549)及び気管支(BEAS−2B,16HBE14o−)上皮細胞内の67kDaのIP1受容体タンパク質の発現を示す。各レーンには40μgの抽出タンパク質を投入した。
TRP及びILOをIP1受容体に標的投与して、肺胞(A549)及び気管支(16HBE14o−)上皮細胞株に標的投与した結果を示す。FLUO−BSA,FLUO−BSA−TRP、及びFLUO−BSA−ILOを0.5μM(N=4)の濃度で培養してFACS測定した。測定結果は、平均値±標準偏差として示す。「**」は、P<0.01における統計的有意性を意味する。
肺胞(A549)、気管支肺胞(H441)及び気管支 (16HBE14o−、BEAS−2B)上皮細胞における、IP1受容体の分散及び受容体結合を示す。FLUO−BSA−ILO及びFLUO−BSAを0.5μM(N=4)の濃度で培養し、FACS測定を実施した(a)。16HBE14o−(b,c)及びA549(d)細胞は、25nMのFLUO−BSA−ILO及びFLUO−BSA及び濃度を段階的に上昇させたCAY10449(n=4)とともに培養し、FACS測定を実施した(b,c,d)。共焦点レーザー走査顕微鏡観察のために、0.5μMのFLUO−BSA−ILO及びFLUO−BSAと共に16HBE14o−細胞を培養した(e)。測定結果は、平均値±標準偏差として示す。「**」は、P<0.01における統計的有意性を意味する。
PEI、及び、N/P=4の様々なPEI−g−ILO構造体のためのDNAリターデーションアッセイを実施した。pCMV−lucと結合したポリマーをヘパラン硫酸のある状態(+)及び無い状態(−)で培養し、アガロースゲル上で分離して、エチジウムブロマイドで染色した後にUV光で可視化した。
インビトロでのトランスフェクション効率を示す。様々なN/P比(n=4)の様々なPEI−g−ILO構造体と結合したpCMV−lucを有する16HBE14o−細胞のトランスフェクションであり、ルシフェラーゼ遺伝子発現の測定(a)、N/P比を4として、PEI/pCMV−luc、及びFILO=5のPEI−g−ILO/pCMV−luc粒子のCAY10449(n=3)の阻害実験を実施し、ルシフェラーゼ遺伝子発現を測定した(b)。N/P比4(n=6)で、A549、16HBE14o−、及びBEAS−2Bを、PEI/pCMV−luc及びFILO=5のPEI−g−ILO/pCMV−lucでトランスフェクションし、ルシフェラーゼ遺伝子発現を測定した(c)。ルシフェラーゼ遺伝子発現は、細胞内タンパク質1mgあたり10秒間、相対発光ユニット(RLU)における発光として測定した。測定結果は、平均値±標準偏差として示す。「**」は、P<0.01における統計的有意性を意味する。
N/P比=4で、PEI/pCpG−luc及びFILO=5のPEI−g−ILO/pCpG−luc粒子によって得られた、エアロゾル投与後のBALB/cマウスにおけるインビボルシフェラーゼ遺伝子発現(n=5)を示す。24時間後、露光時間10分で生物発光画像を取得した(a)。トランスフェクションの24時間後に、露光時間30秒で、マウス肺ホモジネートにおけるルシフェラーゼ発現を測定した(b)。測定結果は、平均値±標準偏差として示す。「**」は、P<0.01における統計的有意性を意味する。
FILO=5のPEI−g−ILO/pCpG−luc粒子、及び未処理の細胞と比較して、N/P=4でPEI/pCMV−luc粒子でトランスフェクションした、肺胞 (A549)及び気管支(16HBE14o−、BEAS−2B)上皮細胞は、MTTアッセイによる測定の結果、代謝毒性の増加は見られなかった(a)。更に、マウス肺にFILO=10のPEI−g−ILOを投与した後のマウス血清において、インターロイキン−12及びインターフェロンγ(IFN−γ)を測定し、PEIを投与したマウス及び未処置のマウスと結果を比較した。サイトカインに有意な増加は見られなかった。
pCMV−lucの量を1μgから0.25μgへ減らしつつ、PEI及びPEI−g−ILO遺伝子ベクター粒子で16HBE14o−細胞をトランスフェクションした(図8)。トランスフェクション後24時間で、遺伝子導入効率は投与量に依存して低下した。pCMV−lucが1μgである場合に、遺伝子発現度が最高であった。しかし、FILO=5のと結合したPEI−g−ILOが0.5μgである場合に、未改変のPEIに結合したpCMV−lucが1μgの場合と同一の遺伝子発現度となった(3.3×105対3.2×105RLU/10秒/mgタンパク質)。
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Claims (19)
- 作用因子複合体及び少なくとも1つの標的探索リガンドの結合体であって、前記作用因子複合体は、封入材料によって封入された作用因子を含み、前記標的探索リガンドはプロスタサイクリン類似体であることを特徴とする、結合体。
- 前記プロスタサイクリン類似体は、イロプロスト又はトレプロスチニルであることを特徴とする、請求項1に記載の結合体。
- 前記作用因子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、作用物質、又はトレーサーであることを特徴とする、請求項1又は2に記載の結合体。
- 前記核酸は、欠乏若しくは欠損が疾病を引き起こすDNA若しくはRNA、又は、欠乏若しくは欠損が疾病を引き起こすか、若しくは免疫調節活性を有するポリペプチドをコードするDNA若しくはRNAであることを特徴とする、請求項3に記載の結合体。
- 前記作用因子は、欠乏若しくは欠損が疾病を引き起こすか、又は免疫調節活性を有するペプチド又はポリペプチドであることを特徴とする、請求項3に記載の結合体。
- 前記作用因子は、タンパク質欠乏又はタンパク質欠損を補償する生成物であって、肺内で活性を有する、核酸、タンパク質若しくはタンパク質フラグメント、薬剤、又はこれらの混合物であることを特徴とする、請求項1〜5の何れか一項に記載の結合体。
- 前記作用物質は抗炎症作用物質又はステロイドであることを特徴とする、請求項3に記載の結合体。
- 前記作用因子はレポーター分子であることを特徴とする、請求項1〜7の何れか一項に記載の結合体。
- 前記レポーター分子は、放射性又は蛍光トレーサーであることを特徴とする、請求項8に記載の結合体。
- 前記封入材料は、天然物質、合成物質、又は天然物質の誘導体であり、例えば、脂質、ポリマー、又はオリゴマーであることを特徴とする、請求項1〜9の何れか一項に記載の結合体。
- 前記封入材料は、プロトン化することができる生物分解性窒素性ポリマーのようなカチオンポリマー、又は、スペルミン若しくはカチオン性脂質のようなカチオン性オリゴマーであることを特徴とする請求項1〜10の何れか一項に記載の結合体。
- 前記生物分解性窒素性ポリマーは、ポリエチレンイミン又は生物分解性ポリエチレンイミンであることを特徴とする請求項11に記載の結合体。
- 前記封入材料及び前記核酸の前記作用因子複合体は、付加的にペグ化されることを特徴とする、請求項1〜12の何れか一項に記載の結合体。
- タンパク質欠損又は遺伝子欠損に起因する肺疾患の、遺伝子治療又は肺疾患治療に使用するための請求項1〜13の何れか一項に記載の結合体。
- 前記タンパク質欠損又は遺伝子欠損に起因する肺疾患は、嚢胞性線維症である請求項14に記載の結合体。
- ポリマーの窒素含量のDNAリン酸塩含量に対するモル比として測定されるカチオン性ポリマーの核酸に対する比率は、10:1〜1:20の範囲であることを特徴とする、請求項1〜15の何れか一項に記載の結合体。
- 前記封入材料によって封入される前記作用因子は、ナノカプセル、ナノ粒子、又はリポソームとして存在することを特徴とする、請求項1〜16の何れか一項に記載の結合体。
- 肺疾患を治療するための医薬の製造のためのプロスタサイクリン類似体の使用であって、前記プロスタサイクリン類似体が、作用因子とともに投与されて前記作用因子の標的探索構造として働き、気管支上皮細胞及び/又は肺胞上皮細胞に輸送される、使用。
- 請求項1〜17の何れか一項に記載の結合体及び在来の薬剤アジュバントを含み、吸入に適した状態の、肺疾患治療用の治療用組成物。
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