KR20120102297A

KR20120102297A - 신규한 트랜스-아네솔 산화효소

Info

Publication number: KR20120102297A
Application number: KR1020110020367A
Authority: KR
Inventors: 허호길; 한동페이; 류지영
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2011-03-08
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2012-09-18
Also published as: KR101240430B1

Abstract

본 발명에서 트랜스-아네솔의 산화적 분해를 촉진하는 트랜스-아네솔 유전자를 최초로 기술하였다. TAO는 또한 특정 1-프로페닐 화합물에서 알데하이드 화합물을 형성시킬 수 있다. TAO는 신규의 산화효소이며, 기질에 대한 입체 선호적인 산소 공격을 보여주었다. 또한, TAO는 NAD(P)H 의존 산화효소이다. 트랜스-아네솔에 대한 전체 반응의 경로는 도 6에서 제시하였다. 기질 범위가 확장된 TAO의 능력을 고려하면, TAO는 바닐린과 같은 방향족 화합물을 합성하는데 매우 유용할 것이다.

Description

신규한 트랜스-아네솔 산화효소{Novel Trans-Anethole Oxidase}

감마프로테오박테리아에서 대사 물질의 변환 반응에 관여하는 유전자에 대한 발명이다.

페닐프로파노이드계 물질 및 미생물에 의해 변형된 대사 중간체는 전통적으로 향신료 및 향수 산업에서 아로마 화학 물질의 화학 합성에서 출발 재료로서 이용되어왔다. 여러 미생물에서 프로페닐벤젠에서 방향족 알데하이드로 변형시킬 수 있는 능력을 가지고 있음이 보고되었다(3, 6, 7, 11, 14). 이러한 신규의 분리된 박테리아는 향료를 생산하는데 환경 친화적인 대체적 대상임을 보여주었다. 프로페닐벤젠이 방향족 알데하이드로 생전환(biotransformation)되는 것은 프로페닐 가지가 알데하이드로 산화되는 것과 관련된다. 어떤 효소들은 아이소유진올에서 바닐린으로의 전환에 관여하고 있음이 알려졌다(8,9).

트랜스-아네솔(파라-메톡시프로페닐벤젠)은 예컨대, 스타아니스, 아니스 열매 기름 및 스위트 펜넬과 같이 정유(essential oils)의 주요 구성 요소의 풍부한 페닐프로파노이드 화합물이다(11). 이는 베이킹, 사탕, 아이스크림, 껌 및 알콜 음료에서 향신 물질로 널리 사용되었다(5). 트랜스-아네솔은 1-프로페닐벤젠의 한 종류로서, 아이소유진올과 동일하게 1-프로페닐기를 가지 구조로서 포함한다. 따라서, 트랜스-아네솔 생전환 메커니즘에 대한 본 연구가 아이소유진올에서 바닐린으로의 전환을 이해하는데 기여를 할 것이다.

트랜스-아네솔을 유일한 탄소 공급원으로 사용할 수 있는 오직 두 가지 박테리아 균주인, Arthrobacter sp.TA13 및 Pseudomonas 균주 JYR-1을 분리하였다(7, 10). 트랜스-아네솔-유도 TA13은 파라-아니스 알코올, 파라-아니스알데하이드, 파라-아니스산, 파라-하이드록시벤조산 및 프로토카테큐 산을 유일한 탄소 공급원으로 사용하여 성장할 수 있었다. 게다가, 균주 TA13의 돌연변이체는 많은 양의 세 가지 대사 중간체인 트랜스-아네솔다이올, 파라-아니스산 및 4,6-다이카복시산염-2-피론을 축적하였다. 4개의 돌연변이체는 파라-아니스 알콜 및 파라-아니스알데하이드를 거의 축적하지 않았다. 따라서 균주 TA13은 에폭사이드 및 다이올을 경유하여 트랜스-아네솔에서 아니스 알콜로 그 후에 아니스알데하이드로 변형시키거나 또는 다이올에서 아니스알데하이드로 직접 변환시킬 것으로 가정하였다. JYR-1 균주의 신- 및 안티-아네솔-2,3-에폭사이드인 두 개의 입체 이성질체 에폭사이드는, 트랜스-아네솔의 생전환이 일어나는 과정 동안 대사 중간체로서 확인되었다(7). 파라-아니스산 및 파라-하이드록시벤조산도 또한 JYR-1 균주의 세포 배양에서 관찰되었다(7). 두 개의 트랜스-아네솔 분해 균주는 트랜스-아네솔 뿐 아니라 트랜스-아네솔과 구조적으로 유사한 방향족 화합물로도 변환된다. 균주 TA13은 에스트라골(estragole)을 이용할 수 있으나, 유진올, 아이소유진올, 사프롤 또는 아이소사프롤을 유일한 탄소 공급원으로 이용할 수 없다(10). 그러나 아이소유진올, 유진올, 아이소사프롤 및 사프롤이 있는 글루코스에서 자란 균주 TA13은 각 기질을 각기 바닐린(vanillin) 및 바닐린 산(vanillic acid), 바닐린 산 및 페룰산(ferulic acid), 피페로닐 산(piperonylic acid) 및 하이드록시차비콜(hydroxychavicol)로 변환시켰다(10). 사프롤(safrole)을 제외한 각 화합물의 대사 산물은 균주 TA13가 프로페닐벤젠 화합물의 사슬의 산화 반응을 시작할 수 있음을 가리켰다(10). 방향족 고리 3번 탄소에 붙어 있는 메톡시 기를 제거하기 위한 디메틸라아제 없이는 아마 벤젠 고리의 분해 및 방향족 화합물의 이용에 방해될 것이다(10). 반면에, 균주 JYR-1은 카페인 산(caffeic acid), 파라-쿠마르산(p-coumaric acid) 뿐 아니라, 유일한 탄소 공급원으로서 벤젠 고리의 3번 탄소에 연결된 메톡시 기를 지니고 있는 아이소유진올 및 페룰산도 사용할 수 있었다. 그러나 균주 JYR-1은 트랜스-아네솔에서 자라는 휴지 세포(resting cell)에 의해서는 유진올을 분해할 수 없었다. 이러한 결과들은 두 박테리아 균주 사이에 기질 범위가 다소 차이가 있음을 시사한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

다양한 방향족 화합물을 대사하는 박테리아의 능력을 고려하면, 트랜스-아네솔-분해 유전자는 아직 발표되지 않은 신규한 유전자일 것이다. 본 발명자들의 이전 연구에서 트랜스-아네솔을 유일한 탄소 공급원으로 사용하고 100 mM까지 높은 농도의 트랜스-아네솔 조건에서 성장할 수 있는 균주 JYR-1를 조사하였다(7). 이번 연구에서 본 발명자들은 우선 트랜스-아네솔의 대사에 관여하는 유전자들을 제시하고, 이들 유전자들을 균주 JYR-1의 약 12-kb 구역에 클러스터링 하였다.

트랜스-아네솔 산화효소(trans-Anethole Oxidase, TAO)는 E.Coli에서 트랜스-아네솔의 대사 과정의 첫 단계를 시작하는 과정에서 이종적으로 발현된다. TAO는 트랜스-아네솔 뿐 아니라 다른 여러 페닐프로파노이드 화합물을 기질로 받아들일 수 있었다. 추론되는 TAO의 아미노산 서열은 TAO가 지금까지 보고된 추정되는 보존 부위가 아닌 새로운 산화효소로 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 목적은 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질 발현용 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질 발현용 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을 기질과 접촉시켜 벤즈 알데하이드 유도체의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을 제공한다.

트랜스-아네솔(파라-메톡시프로페닐벤젠)의 IUPAC 명은 트랜스-1 메톡시-4-(프로프-1-에닐)벤젠[trans-1-methoxy-4-(prop-1-enyl)benzene]이다. 이는 방향성이며, 불포화 에터의 구조이다. 화학적으로는 물보다 에탄올에 더 잘 녹으며, 스타아니스, 아니스 열매 기름 및 스위트 펜넬과 같이 정유(essential oils)의 주요 구성 요소로 사용되고 산업적으로는 베이킹, 사탕, 아이스크림, 껌 및 알콜 음료에서 향신 물질로 널리 사용된다. 트랜스-아네솔은 1-프로페닐벤젠의 한 종류로서, 프로페닐기의 이중결합을 중심으로 양쪽의 치환기가 트랜스 위치하고 있는 구조를 가지고 있다. 아네솔은 시스, 트랜스 이성질체의 구조가 모두 존재하지만, 산업계에서 보다 널리 이용되는 구조는 트랜스 구조의 아네솔이다. 아이소유진올과 동일하게 1-프로페닐기를 가지 구조로서 포함한다.

트랜스-아네솔은 예컨대 아네솔 디싸이온(anethole dithione, ADT), 아네솔 트리싸이온(nethole trithione, ATT)과 같은 의약 성분으로 이용된다.

본 명세서에서 용어 “TAO(trans-anethole oxidase, 트랜스-아네솔 산화효소) 단백질”는 트랜스-아네솔 및 그 유도체의 산화반응에 관여하는 옥시게나아제 효소를 의미한다. 한편, 본 발명의 TAO 단백질은 트랜스-아네솔의 다양한 유도체의 산화 반응을 유도하여 프로페닐기를 알데하이드로 산화시키도록 유도할 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 TAO 단백질은 트랜스-아네솔, 아이소유진올, O-메틸 아이소유진올, 아이소사프롤을 산화하도록 유도하여 벤즈 알데하이드 유도체로 생전환하는 것을 촉매한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 TAO 단백질은 미생물로부터 유래된 것이다. 보다 바람직하게는 상기 TAO 단백질은 감마프로테오박테리아 강(gammaproteobacteria Class) 슈도모나달리스 목(Pseudomonadales Order) 슈도모나다지에 과(Pseudomonadaceae Family) 슈도모나스 속(Pseudomonas Genus) 미생물로부터 유래된 것이며, 가장 바람직하게는 감마프로테오박테리아 강(gammaproteobacteria Class) 슈도모나달리스 목(Pseudomonadales Order) 슈도모나다지에 과(Pseudomonadaceae Family) 슈도모나스 속(Pseudomonas Genus) 슈도모나스 퓨티다 종(P. putida Species) JYR-1종에서 유래된 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는데 있다.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 TAO 단백질의 기본적인 특성 및 활성을 갖도록 하는 변이를 갖는다면, 본 발명의 TAO는 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 TAO 자체에 변화를 가져올 수도 있다. TAO의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 TAO와 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.

본 발명의 TAO 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 TAO와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능 (interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값 (hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 TAO 단백질 또는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 40%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 50%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 60%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl. BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질 발현용 벡터를 제공하는데 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터(vector)"는 외부의 유전 물질을 다른 세포로 옮기는데 사용되는 전달 수단인 DNA 분자이다. 대표적으로 플라스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 코스미드 벡터, 인공 염색체를 이용한 벡터(예컨대, YAC, BAC) 등이 존재한다. 벡터를 이용하여 원하는 유전 물질을 대량 발현하는데 있으므로 벡터로서의 기능을 하기 위해 필요한 공통 요소가 존재하는데, 복제 원점(Replication Origin), 여러 제한효소 자리(Multicloning site), 선택표지(selective marker)가 반드시 존재하여야 한다. 벡터 그 자체는 DNA 염기 서열로 이식할 유전자(transgene)과 벡터 백본(backbone)을 포함한다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵 세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵 세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann . Rev . Genet ., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pTA163, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET, pEGFP, pCR 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환 세포를 제공한다.

명세서에서 사용되는 용어, "형질 전환"은 외부로부터 주어진 유전 물질에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 말한다. 형질 전환은 폐렴쌍구균, 대장균 등의 박테리아에서 주로 일어나지만, 최근에는 많은 실험들을 통해 식물이나 동물 등에 새로운 유전자를 이식하는 방식도 가능해지고 있다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환 시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 벤즈 알데하이드 유도체의 제조방법을 제공한다:

(a) TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을 준비하는 단계;

(b) 상기 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을 하기 화학식 1 또는 2의 화합물과 접촉시키는 단계; 및

(c) 하기 화학식 3 또는 4의 벤즈 알데하이드 유도체를 수득하는 단계;

화학식 1

화학식 2

화학식 3

화학식 4

상기 화학식 1 및 3에서, R₁ _,R₂ 및R₃은 서로 독립적으로 수소, 하이드록실기 및 메톡시기이고,

상기 화학식 2 및 4에서, R₄는 C₁-C₂ 알킬렌이고, R₅는 수소, 하이드록실기 및 메톡시기이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 화학식 1 또는 3에서 R₁ _,R₂ 및R₃은 하이드록실기 및 메톡시기이고, 화학식 2 또는 4에서 R₄는 메틸렌기, R₅는 하이드록실기, 수소인 것을 포함하며, 가장 바람직하게는 상기 화학식 1 또는 3에서 R₂는 메톡시기인 것을 특징으로 하며, 화학식 2 또는 4에서 R₄는 메틸렌기, R₅는 수소인 것을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)는 NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Hydrogen), NADPH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Hydrogen), Mg(Ⅱ) 및 타이론(Tiron)으로 구성된 군으로부터 선택되는 보조인자(cofactor)의 존재 하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

명세서에서 사용되는 용어, “NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Hydrogen)”은 여러 보조인자(cofactor) 중에 하나로서, 효소의 비단백질 구성요소로 효소활성을 증대시키는데 필요하다.

살아 있는 세포에서 발견되고, 아데닌 염기와 니코티나마이드의 두 종류의 염기로 구성된 디뉴클레오타이드는 인산기로 연결되어 있다. 대사과정에서 NADH는 산화 환원 반응(redox reaction)에 관여하여, 전자를 운반하는 운반체의 역할을 한다. NAD⁺는 산화제로 한 분자에서 전자를 받아들이면서 NADH의 환원형의 구조로 변환되어 다른 분자를 환원시키는 환원제의 역할을 담당한다. 또한 전사후 변형(posttranslational modifications)과정에서 NADH는 효소에 결합한 기질(substrate)을 떼어내거나, 반대로 효소에 기질을 결합시킬 수 있어 의약 개발에서 NAD⁺ 대사 과정이 관여되는 효소를 타킷으로 하는 연구가 진행 중이다.

명세서에서 사용되는 용어, “NADPH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Hydrogen)”은 NADH의 리보오스 고리의 2번 탄소에 인산기가 부착된 구조를 가진 여러 보조인자(cofactor) 중에 하나로서, 효소의 비단백질 구성요소로 효소활성을 증대시키는데 필요하다. 동화작용(anabolism), 지질 및 핵산 합성에관여하여 다른 분자를 환원시키는 환원제의 역할을 담당한다.

명세서에서 사용되는 용어, “Tiron”은 IUPAC 명이 sodium 4,5-dihydroxybenzene-1,3-disulfonate이며 우라늄, 철(Ⅲ)과 같은 독성이 높은 금속과 결합하여 세포 독성을 감소시키는 킬레이터로 작용한다. 본 발명에서 Tiron은 Fe(Ⅲ)을 포획하는 킬레이터로 이용되어 금속의 cofactor로서의 역할이 적절하게 작용하는지 확인하는데 이용된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 TAO 단백질은 정제된 단백질인 것에서 벤즈 알데하이드 유도체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 TAO 단백질은 감마프로테오박테리아(gammaproteobacteria)내에서 벤즈 알데하이드 유도체의 제조방법을 제공한다.

명세서에서 사용되는 용어, “감마프로테오박테리아(gammaproteobacteria)”는 프로테오박테리아계(proteobacteria Phylum) 중의 주요한 강(Class)의 하나로 16S rRNA의 서열의 차이로 알파프로테오박테리아(alphaproteobacteria), 베타프로테오박테리아(betaproteobacteria), 감마프로테오박테리아(gammaproteobacteria), 델타프로테오박테리아(deltaproteobacteria), 입실론프로테오박테리아(Elsilonproteobacteria), 제타프로테오박테리아(Zetaproteobacteria)로 구분된다 .

모든 감마프로테오박테리아는 그람 음성균으로, 외막은 주로 지질다당류(lipopolysaccharides)로 구성되며, 플라겔라(flagella) 또는 글라이딩(gliding)을 이용하여 운동성을 가진다. 대사작용은 주로 혐기성(anaerobic), 화학적독립영양(chemoautotrophs) 및 종속 영양성에 의한 방식으로 영양 공급을 받는다.

감마프로테오박테리아 종류는 Achromatiaceae , Aeromonadaceae , Alteromonadaceae , Azotobacteraceae, Beggiatoaceae , Branhamaceae , Chromatiaceae , Ectothiorhodospiraceae , Enterobacteriaceae(Escherichia coli ), Erwinia , Halomonadaceae , Legionellaceae , Leucotrichaceae, Lysobacteraceae , Methylococcaceae , Moraxellaceae , Nevskiaceae , Oleiphilaceae, Pasteurellaceae , Phlomobacter , Pseudomonadaceae , Succinivibrionaceae , Thiocapsaceae, Vibrionaceae , Xanthomonadaceae 등으로 분류할 수 있다.

보다 바람직하게는, Escherichia 및 Pseudomonadaceae 이며 가장 바람직하게는 E. coli BL21(DE3) 및 Pseudomonas putida이다.

E. coli BL21(DE3)는 lac 프로모터에 T7 중합효소를 인코딩하는 시퀀스를 가지고 있어, IPTG 등을 이용하여 lac 프로모터를 유도하면 T7 중합효소가 만들어지고 pET 또는 pRSET 등과 같은 발현벡터의 재조합된 단백질 유전자를 발현시키는데 주로 이용되는 시스템 중에 하나이다. 독성이 존재하는 경우 적은 양으로도 대장균이 잘 자라지 못하도록 할 수 있기 때문에 이를 조절하는 시스템이 필요하며 lac 프로모터와 T7 프로모터의 조합을 통해 유도가 안된 상태에서 외래 단백질의 발현을 효과적으로 억제하는데 박테리오파지 람다의 DE3 라이소젠을 발현시킨다.

Pseudomonas putida는 막대 구조의 그람 음성균이며, 16S rRNA 분석을 통한 분류학적 기준으로 P. putida종에 속한다. P. putida의 용도는 생물적 환경 정화(bioremediation) 또는 기름을 생분해 하는 미생물의 이용되어 스타이렌을 생분해될 수 있는 PHA로 변환시킨다. P. putida는 인간에게 병원을 일으키는 것으로 알려진 P. aeruginosa와 달리 안전한 박테리아 균주이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 신규 서열의 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질 서열을 제공한다.

(b) 본 발명의 TAO 단백질은 대사 과정에서 중요한 중간체로 전환되도록 페닐 프로파노이드 화합물(phenyl propanoid compounds)의 산화 반응을 촉매(catalyzing)하는 것을 특징으로 하는 단백질을 제공한다.

(c) 본 발명의 TAO 단백질에 의해 대사 과정에서 중요한 중간체로 전환되도록 페닐 프로파노이드 화합물(phenyl propanoid compounds)의 산화 반응에 의한 벤즈 알데하이드 유도체의 제조방법을 제공한다.

도 1은 슈도모나스 퓨티다 JYR-1의 20-kb 구역의 유전자 배열로. 14개 중 5개의 ORF가 트랜스-아네솔에서 프로토카테큐 산으로의 대사과정에 관여하는 것으로 예상되고, 관여되는 유전자는 각각 파라-아니스산 탈메틸화 효소, 환원효소(aniA), 파라-아니스산 탈메틸화 효소(aniB), 트랜스-아네솔 산화효소(tao), 파라-아니스알데하이드 탈수소화효소(adh) 및 파라-하이드록시벤조산 염 수산화효소(pbh)이고 tao 유전자에 표기된 세 개의 화살표는 Tn5가 삽입 부위임을 보여주는 그림이다.
도 2는 E. coli BL21(DE3)(pET-TAO)에서 트랜스-아네솔로부터 형성되는 대사물질의 HPLC 용출 프로파일로 패널(A)는 E. coli BL21(DE3)(pET-TAO)와 트랜스-아네솔이 반응 후 40분 후 측정한 용출 프로파일이고, 패널(B)는 6시간 후 측정한 용출 프로파일이며, 패널(C)는 E. coli BL21(DE3)(pET21-a)와 트랜스-아네솔의 반응시 측정값이고, 패널(D)는 비교 화합물인 트랜스-아네솔 및 파라-아니스알데하이드와의 반응으로 측정된 데이터를 보여주는 그림이다.
도 3은 E. coli에서 발현된 TAO의 휴지 세포에 의한 트랜스-아네솔의 생전환 운동론으로, E. coli BL21(DE3)(pET-TAO)(솔리드 심볼)의 휴지세포와 열로 살균처리한 E. coli(오픈 심볼)를 트랜스-아네솔과 함께 360분 간 배양하였다. 트랜스-아네솔 및 파라-아니스알데하이드은 각각 사각형과 삼각형으로 나타내었다.
도 4는 E. coli에서 발현된에 의한 트랜스-아네솔에서 파라-아니스알데하이드로의 전환에 대한 액체 크로마토그래피 질량 분석으로, 패널 (A)는 ₁₆O₂, H₂O¹⁶에서 배양한 결과의 그래프이고, 패널 (B)는 ₁₈O₂, H₂O¹⁶에서 배양한 결과의 그래프이고, 패널 (C)는 ₁₆O₂, H₂O¹⁸에서 배양한 결과의 그래프, 패널 (D)는 비교 화합물 파라-아니스알데하이드가 존재할 때의 질량 분석 수치를 나타낸 그림이다.
도 5는 TAO에 의해 촉매되는 트랜스-아네솔의 산화적 분해의 제안된 메커니즘으로 패널 (A)는 ₁₆O₂, H₂O¹⁶에서, 패널 (B)는 ₁₈O₂, H₂O¹⁶에서, 패널 (C)는 ₁₆O₂, H₂O¹⁸에서 배양할 때의 방사성 동위원소(¹⁸O)로 표지된 산소가 삽입된 위치를 보여주는 그림이다.
도 6은 균주 JYR-1에 의한 트랜스-아네솔의 제안된 대사 경로이며, 반응 경로에 관여할 것으로 예상되는 유전자들을 진한 이탤릭체로 기술하였고, 이들 이탤릭체로 표기된 유전자는 트랜스-아네솔 산화효소(tao), 파라-아니스알데하이드 탈수소화효소(adh), 파라-아니스산 탈메틸화효소(aniAB) 및 파라-하이드록시벤조산 염 수산화효소(pbh)를 보여주는 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험 방법

플라스미드, 박테리아 균주 및 성장 환경

본 발명에서 이용되는 모든 플라스미드와 박테리아 균주는 표 1에 나열하였다. Pseudomonas putida JYR-1는 25℃에서 10 mM의 트랜스-아네솔이 함유된 TSB(tryptic soy broth) 배지 또는 MSB(Stanier’s minimal salt broth)배지(12) 에 접종하여 강한 진탕(200 rpm)조건으로 배양 시켰다. 균주 Escherichia coli는 37℃에서 LB 배지에 접종하여 일반적인 조건에서 배양 시켰다.

필요한 때에, 50 /ml의 앰피실린(Amp), 50 /ml의 카나마이신(Kan) 및 12.5 /ml의 클로로암페니콜을 E.Coli 선별에 사용하였다.

화학 물질

트랜스-아네솔, 파라-아니스알데하이드, 아이소유진올, 유진올, 프로페닐구아에솔, O-메틸 아이소유진올, 아이소사프롤, 신남산, 페룰산 및 4-쿠마르 산은 Sigma-Aldrich(Milwaukee, WI)에서 구입하였다. 유기 용매(LPLC 등급)은 Fisher Scientific(Fair Lawn, NJ)에서 구입하였다.

유전자 라이브러리 컨스트럭션 및 스크리닝

Pseudomonas putida JYR-1의 genomic DNA은 제조사의 지침에 따라 Qiagen DNA 완충용액 세트 및 Genomic-tip 100/G(Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 추출하였다. 대략 40-kb의 genomic DNA 절편을 만들었고 fosmid 라이브러리는 제조사의 지침에 따라 EpiFOSTM Fosmid Library Production Kit(Epicentre Biotechnologies, Madison, WI)를 이용하여 제작하였다.

600개의 클로로암페니콜 저항성 클론을 선별하였다. 클론 10개를 20 ml의 LB 배지 및 500 트랜스-아네솔이 포함된 위액 용기(serum bottle) 안으로 접종하였다. 세포들을 30℃에서 밤새도록 200 rpm에서 진탕 배양하였다. LB 배지에서 트랜스-아네솔 및 그의 대사산물을 추출하기 위해 동일 부피의 에틸 에세테이트를 용기에 첨가하였으며, 10분 동안 120 rpm에서 수직 진탕하였다. 추출물(4 ml)을 Speed vaccum (Vision Scientific Co. 수원, 대한민국)에서 건조시키고, 0.5 ml의 메탄올에 용해시키고 아래에 기술한 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)로 분석하였다.

pTA163의 Tn5 돌연변이 유발 및 돌연변이체의 스크리닝

트랜스-아네솔을 대사할 수 있는 클론 하나를 클론 TA163으로 지정하였다. pTA163클론으로부터 pTA163의 플라스미드 DNA를 제작하여 제조사의 지시에 따라EZ-Tn5^TM<KAN-2> Insertion Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA)의 트랜스포손과 함께 반응시켰다. pTA163이 삽입된 Tn5는 E. coli TransdorMax EC100 (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI)에 전기천공 방식에 의해 형질전환되었다. 클론이 삽입된 트랜스포손을 Kan(50 μg/ml) 및 Chl(12.5 μg/ml)이 포함된 LB 아가 플레이트에서 선별하였다.

트랜스-아네솔의 분해를 못하는 돌연변이체를 스크리닝하기 위해, 각 돌연변이체를 항생제가 포함된 LB 미디어에 접종시켜 밤새도록 배양하였고, 휴지 세포를 10분 동안 10,000g에서 원심분리 하여 분리하고 20 mM의 인산 완충용액(pH 7.0)에 두 번 세척하였다. 2 mM 트랜스-아네솔과 함께 현탁 세포를 25℃에서 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하였고, Speed vacuum로 건조시켰다. 나머지를 메탄올에 용해시키고 HPLC를 이용하여 분석하였다.

Tn5 트랜스포손 삽입 자리를 확인하기 위해, 트랜스-아네솔로 변형시키는 능력을 잃어버린 클론 pTA163-1C, pTA163-3A 및 pTA163-7C를 Ez-Tn5 <KAN-2> 트랜스포손-특이적 프라이머(유발 인자 키트에서 KAN-2 FP-1 정방향 프라이머 및 KAN-2 RP-1 역방향 프라이머 Tn5 돌연변이 유발 인자를 받음)를 이용하여 시퀀싱 하였다. 트랜스포손은 ORF 10의 119번째, 438번째, 682번째 염기에 삽입되었는데, Tn5 트랜스포손은 트랜스-아네솔의 첫 단계에 관여하는 것을 시사한다.

ORF 10, 트랜스-아네솔 산화효소(TAO)의 서브클로닝

ORF 10을 클로닝하기 위해, NdeI 인식 부위(5'- GGGAATTCCATATGGAGGACATCATGCAAGGC -3')에 붙어 있는 정방향 프라이머를 이용하여 BamHI 인식 부위(5'-CGCGGATCCTCAGTTAGTCCTCAAGTCGGAATT-3')에 붙어 있는 역방향 프라이머PCR을 진행하였다. pG-TAO을 얻고 E. coli DH5α에 형질전환하기 위하여 pGEM-Teasy vector(Promega, Madison, WI)에 PCT 생성물을 클로닝하였다. pG-TAO은 제한효소 NdeI 및 BamHI을 이용하여 절단하고 이후 tac 프로모터에 의해 조절되는pET21-a vector(Novagen, Madison, WI)에 결합하였다.

플라스미드 pET-TAO를 E. coli BL21(DE3)(Novagen, Madison, WI) 내부에 형질전환시켰다. 대조 실험으로, 카나마이신 저항 유전자, pUC4K 벡터에서 클로닝된 KanR2 절편을 pET-TAO 벡터로 옮기고 tao 유전자의 PstI 부위에 삽입하였다. 카나마이신 내성 유전자를 갖는 tao 유전자 블로킹 pET-TAOb 벡터를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환하였다.

트랜스- 아네솔 생전환의 속도론.

E. coli BL21(DE3)(pET-TAO)를 LB 배지에서 37℃에서 밤새도록 진탕(200 rpm) 배양하였다. 세포(1% (v/v))를 새로운 LB 미디어로 옮기고 37℃에서 2시간 반 동안 배양시키고, 20℃에서 30분 동안 추가적인 진탕(150 rpm) 배양시켰다. IPTG가 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가하였고, TAO의 발현을 12시간 동안 유도하였다. 세포를 10,000g로 10분 동안 원심분리하여 분리하였고, MSB(Steiner's basal medium) 배지에 현탁하였다. 세포를 10,000 x g, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 수집하고 MSB(Steiner's basal medium)에 현탁하였다. 두 번 반복 후, 최종적으로 세포를 MSB 배지에 재현탁하였고, 흡광도는 600 nm에서 2까지 조정하였다. 에너지원으로서 0.5 mM 글루코스를 추가한 휴지기 현탁액에 5 mM의 트랜스-아네솔(메탄올에서 만든 모액(stock solution) 100 mM로 부터)과 반응시켰다. 25℃에서 4시간 동안 진탕하여 반응시켰고, 세 배의 에틸 아세테이트로 반응 용액을 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출물은 Speed Vacuum으로 증발시키고, 남은 것을 적정량의 메탄올에 용해시켜 폴리비닐리딘 플루오라이드(PVDF)로 채워진 주사기 필터에 여과시켰다. 남은 트랜스-아네솔의 양 및 TAO에 의해 형성된 파라-아니스알데하이드 양은 HPLC를 통해 측정하였다.

TAO의 기질 스펙트럼을 조사하기 위해, 트랜스-아네솔과 유사한 화합물을 100 mM의 농도로 메탄올에서 만들고, 이를 최종 농도 1 mM에 0.5 mM 글루코스가 들어있는 세포 현탁액에 첨가하였다. 상기 조건 하에서 4시간 동안 반응한 후에 화합물을 상기 기술한 방법으로 추출하여 HPLC로 분석하였다. 각 대사산물은, 비교 화합물을 이용하여 UV 스펙트럼 및 LC-MS의 비교로 동정하였다.

세포 추출물 및 효소 어세이

E. coli BL21(DE3)(pET-TAO)를 배양하여 상기 기술한 바와 같이 tao 유전자를 유도하였다. 세포를 분리하여 20 mM Tris 완충용액(pH 8.0)으로 두 번 세척하였고 실험에 사용하기 전에 -70℃에 보관하였다.

세포 펠렛(습량 10 g)을 10% 글리세롤(TG 완충용액)이 함유된 20 mM의 Tris(pH 8.0) 20 ml에 재현탁시켰고, 70% 진폭으로 울트라소니케이터(Cole-Parmer, Chicago, IL, USA)를 20분동안(3.0 S on 및 9.0 S off) 세포를 파쇄하고, 30분간 4℃ 18,000 g에서 두 차례의 원심분리를 통해 추출물을 얻었다.

세포 추출물을 5배의 TG 완충용액으로 묽히고 Amicon YM-10 멤브레인(Millpore, Bedford, MA)을 통과시키는 초미세여과 방식을 이용하여 농축시켰으며 이후 4℃에서 한 차례 반복 시행하였다.

30℃에서 1 mg의 단백질이 들어있는 20 mM Tris-Cl(pH 8.0) 및 메탄올에 용해된 1 mM의 트랜스-아네솔을 총 부피 1 ml로 하여 TAO 어세이를 수행하였다. 한외 여과된 세포 추출물을 반응 용액에 첨가하여 30℃에서 5분 동안 사전 배양하였고 1분간 배양하였다. 트랜스-아네솔을 첨가하여 반응을 개시시켰고 30℃에서 10분 동안 수행하였고, 1 ml의 메탄올을 첨가하여 정지시켰다. 효소 용액을 4℃에서 13,000g로 20분간 원심 분리하여, 생성된 파라-아니스알데하이드의 양을 측정하기 위해 상층액을 HPLC로 분석하였다.

분석 방법

광 다이오드 어레이 검출기(Varian, Walnut Creek, CA)가 장착된 Varian ProStar HPLC 및 역상 C18 컬럼(입자크기: 5 μm, 4.6 mm × 25 cm, Milford, MA) 이용하여 분석용 HPLC를 수행하였다. 0.1% 폼산 및 물이 함유된 아세토나이트릴로 구성된 이동상을 다음과 같이 계획하였다: 시작시 10% 아세토나이트릴, 10분에 60% 아세토나이트릴, 20분에 90% 아세토나이트릴, 30분에 90% 아세토나이트릴. 10 μL을 주입하는데 유속은 1 mL/min이었고, UV 검출은 270 nm에서 검출하였다.

LC/MS를 Alliance 2695 LC system(Waters Corporation, Milford, MA)을 positive 모드의 전자 분사 이온화(electrospray ionization, ESI+)하는 Quattro LC 트리플 사중극자 이중 질량 분석기(Waters, Milford, MA)와 결합하여 측정하였다. LC 분석을 위해, SunFire C18 컬럼(3.5 m, 2.1 x 150 mm, Waters)를 이용하였고, 이동상, 용출 단계 및 검출은 상기 기술한 분석용 HPLC과 동일하였다; 유속은 0.2 ml/min이었다. MS 분석을 위해, 공급원 온도, 용매 제거 온도 및 캐필러리 전압은 각각 150℃, 350℃ 및 3.2 kV로 유지하였다. con 전압은 20 V였다. con 가스 및 용매 제거 가스는 각각 30 l/hr 및 500 l/hr인 초 순수 질소세트였다.

단백질 농도는 Bio-Rad protein assay(Bio-Rad, Richmond, CA)와 함께 브래포드 어세이 방법을 이용하여 측정하였으며, 소 혈청 알부민을 표준으로 삼았다.

¹⁸ O ₂ 및 H ₂ O ₁₈ 배양

¹⁸O₂ 배양을 두 주사기가 연결된 닫힌 시스템에서 수행하였다. 시스템을 닫기 전에 질소 가스로 반응 완충 용액에서 공기를 모두 제거하였다. 한 주사기를 이용하여, 총 부피의 50%의 질소 가스를 추출하였고, 다른 주사기로 추출한 부피에 해당하는 ¹⁸O₂ 가스를 주입하였다. 마지막으로, 대략 1:1로 N₂:¹⁸O₂ 비율을 인위적인 공기 조성을 포함하는 시스템을 구성하였다. 휴지 세포 및 1 mM 트랜스-아네솔이 포함된 50%의 H₂O₁₈로 만들어진 0.5 ml의 MSB 완충용액에서 H₂O₁₈ 배양 실험을 수행하였다. 반응, 추출 및 분석은 상기 기술한 동일한 방법으로 수행하였다.

뉴클레오타이드 서열 접근번호

본 발명에서 기술된 DNA 서열 및 그의 연역 단백질 서열은 접근번호 아래 GenBank 데이터베이스에 기탁하였다.

실험결과 및 토의 사항

트랜스- 아네솔 생전환 유전자의 클로닝

트랜스-아네솔 생전환 기능을 하는 유전자를 알아보기 위해, 포스미드(fosmid) 지노믹 라이브러리를 스크리닝 하였다. 35 kb의 P. putida JYR-1 크로모좀 DNA를 운반하는 양성 포스미드 클론 pTA163을 600개의 콜로니에서 선별하였다. E. coli(pTA163)에서 트랜스-아네솔을 파라-아니스산으로 전환하는 능력이 존재함을 발견하였다. pTA163 클론의 삽입된 DNA를 시퀀싱하였고 각각, 3.1 kb, 2.0 kb, 20.4 kb, 8.6 kb의 뉴클레오타이드를 가지는 콘티그 0, 1, 2, 3의 4개의 콘티그(contig)로 조립하였다. 이 중에서, 콘티그 2는 14개의 추정의 전사 해독틀(ORFs)를 포함하였다(도 1). 이 14개 ORF의 추정되는 아미노산 서열을 NCBI 단백질 데이터베이스에 블라스트하였다. table s2에서 블라스트 결과를 보여준다.

서열 정보에 근거하여, 가능한 ORF의 추정되는 아미노산 서열을 NCBI 단백질 BLAST에서 비교해 보았다. 콘티그 1에서 주석이 달린 ORF는 table s2에 나열되어 있다. 추정되는 ORF 중에서 ORF 7, 8, 11 및 13은 트랜스-아네솔의 대사 진행 과정과 관련이 있을 것으로 기대하였다. ORF 7 및 8의 추정되는 아미노산 서열은 각각, P. putida W619의 페레독신(62%) 및 바닐산 염 모노산소첨가효소(75%)의 서열과 매우 높은 상동성을 가졌다. 바닐산 및 파라-아니스산은 벤젠 고리의 3번 및 4번에 연결된 메톡시기 위치를 제외하고 유사한 구조를 지닌다. ORF7 및 8은 아마 파라-아니스산의 탈메틸화에 관여할 것으로 보여, 이에 파라-아니스산의 탈메틸화효소를 인코딩하는 aniA(ORF 7) 및 aniB(ORF 8)로 명명하였다. ORF11 및 13의 추정되는 아미노산 서열은 각각, 파라-하이드록시벤즈알데하이드 탈수소효소 및 파라-하이드록시 벤조에이트 수산화효소와 65% 및 74%의 상동성을 보였다. 파라-하이드록시벤즈알데하이드 및 파라-아니스알데하이드 사이의 구조적인 유사성을 고려하면, ORF 11은 파라-아니스알데하이드의 탈수소화 반응에 관여할 것으로 기대하였으며, ORF 13은 파라-하이드록시벤조산의 수산화를 가능케 할 것으로 보았다. 이에 본 발명자들은 ORF 11 및 13을 파라-아니스알데하이드 탈수소화효소(p-anisaldehyde dehydrogenase, adh) 및 파라-하이드록시벤조산 염 수산화효소(p-hydroxy benzoate hydroxylase, pbh)로 명명하였다. 트랜스-아네솔에서 프로토카테큐 산으로의 대사과정 중에 형성되었던 다른 산물들은 아세트알데하이드 및 포름 알데하이드이다(도 6). ORF 4 및 ORF 12의 추정되는 아미노산 서열은 글루타티온-비의존 포름알데하이드 탈수소효소 및 알데하이드 탈수소효소와 98% 및 91%로 매우 높은 상동성을 보였다. 포름 알데하이드는 포름 알데하이드 탈수소화효소에 의해 포름산으로 산화된다(13). 포름산에서 이산화탄소로의 추가적 산화는 4개의 유전자로 구성된 포름산 염 탈수소효소에 의해 촉매화된다(2). 게다가 ORF 1의 추정되는 아미노산 서열과 P. putida F1의 포름산 염 탈수소화효소 알파 소유닛 사이에 97%의 아미노산 서열의 상동성이 관찰되었다.

Tn5 돌연변이 유발 및 핵심 유전자 동정

트랜스-아네솔으로 변환하는 효소를 인코딩하는 구역을 알아보기 위해 pTA163의 랜덤 Tn5 돌연변이체를 준비하였다. 트랜스-아네솔로 변환하는 능력을 확인하기 위해 96개 저항 콜로니를 시험하였다. 변환 능력을 상실하는 콜로니의 삽입 부위를 양방향 시퀀싱으로 확인하였다. 도 1은 pTA163의 콘티그 2에서 ORF 10에 위치한 세 돌연변이체는 트랜스-아네솔 생전환 활성을 억제하는 결과를 낳았다. 이에, ORF 10 구역을 가리키는 결과는 트랜스-아네솔 전환 경로에 관여하는 핵심 유전자라는 것을 시사한다(7). 본 발명자들은 1,047 bp의 시퀀스를 tao 유전자라 명명하였다.

tao 유전자의 시퀀스 비교

추정되는 트랜스-아네솔 산화효소 (tao에 의해 인코딩되는)아미노산 서열은 어떠한 보존 부위를 포함하고 있지 않이므로 이는 새로운 효소이다. Genebank 데이터베이스로 단백질 블라스트 분석 결과 관련성 없는 단백질과 함께, 34%의 상동상을 보였다. 정렬된 결과 및 12개의 많은 단백질 계통수를 각각 표 4에 나타내었다.

E. coli 에서 트랜스- 아네솔 산화효소의 발현

ORF 10의 기능을 파악하기 위해, 개시 코돈에서 정지 코돈에 이르는 ORF 10을 발현 벡터 pET-21a(+)에 삽입하여 클로닝하였고, 그 결과 플라스미드 pET-TAO 는 tac 프로모토에 의해 조절되었다. 1 mM의 IPTG에 의해 유도된 BL21(DE3)(pET-TAO)의 휴지 세포는 약 6시간 동안 트랜스-아네솔을 파라-아니스알데하이드로 완전히 변환시킬 수 있었고(도 2), 따라서 ORF 10을 tao 유전자라 명명할 수 있었다. Simoni 등 논문(11)에서 균주 TA13을 분해하는 트랜스-아네솔은 트랜스-아네솔에서 아니스알데하이드로의 변환이 트랜스-아네솔 에폭사이드 및 다이올을 경유하며, 두 개 이상의 효소가 이 반응에 관여될 것으로 가정하였다. 그러나 오직 하나의 단일 유전자만이 트랜스-아네솔의 산화적 분해에 관여한다. 아이소유진올 모노산소첨가효소(Iem)를 인코딩하는 단일 유전자에 의해 아이오유진올에서 바닐린으로의 유사 분해 반응이 진행된다(4). 비록 TAO 및 Iem이 1-프로페닐기의 이중 결합을 산화적 분해 반응이 일어난 결과 형성되는 알데하이드와 같이 거의 유사한 효소적 반응을 보이지만, TAO와 Iem 사이에는 단지 11.5%의 아미노산 상동성을 갖는다. 이러한 결과는 두 단백질 사이에는 아무런 구조적 관련성이 없음을 시사한다. 따라서, 구조 분석은 새로운 산화효소인 TAO의 메커니즘을 이해하는데 도움을 줄 것이다.

대사산물의 동정

pET-TAO을 포함하는 E. coli BL21(DE3)에 의한 대사산물은 HPLC 크로마토그램의 정체 시간, UV-가시광선 스펙트로스코프(데이타는 없음) 및 LC-MS에 의해 확인된 분자량을 대응되는 비교 화합물과 비교하여 확인하였다. 반응 시간 1 시간시 추출된 샘플에서 HPLC 용출 프로파일에서 두 개의 피크가 관찰되었다. 피크 Ⅰ및 Ⅱ는 각각 14.5분 및 20.1분에서 비교 화합물인 대사물질과 기질로 알려진 파라-아니스알데하이드 및 트랜스-아네솔에서 나타나는 피크와 동일한 피크의 정체 시간을 보여주었다(도 2B). 반응 시간 4시간시 샘플에서 추출된 HPLC 용출 프로파일은 한 개의 피크가 나타났다. 피크 Ⅰ에서는 14.5분의 정체 시간에서 나타났고, 파라-아니스알데하이드가 대사물질인 것으로 확인되었다(도 2C). 양성 모드에서(도 3)의 전자스프레이 이온화 질량 스펙트럼은 137(M+H) 및 108(M-29+H)의 수치가 나타나 136의 분자 질량인 것과 일치하였다. 감소된 질량은 파라-아니스알데하이드의 토막내기에 의해 형성된 알데하이드기이다.

트랜스- 아네솔 생전환의 반응 속도론

트랜스-아네솔의 생전환 반응속도는 HPLC에 의해 탐색하였고 트랜스-아네솔 및 파라-아니스알데하이드의 표준 곡선과 비교하여 측정하였다. 도 5에서 보듯이, 2.5 mM의 초기 농도를 갖는 트랜스-아네솔은 반응 이후 그 농도가 급격히 낮아지고 4시간 만에 전부 파라-아니스알데하이드로 전환되었다. 그러나, 열처리하여 죽인 pET-TAO을 포함하는 E. coli BL2(DE3)은 12시간 배양 후에 중요한 생전환을 보이지 않았다.

파라- 아니스알데하이드에 대한 방사성 동위원소( ¹⁸ O) 표지

TAO에 의한 트랜스-아네솔의 산화성 분해가 일어나는 동안 파라-아니스알데하이드안으로 들어가는 산소 원자의 근원을 확인하기 위해, ¹⁸O로 표지된 O₂ 및 H₂O로 E. coli BL21(DE3)(pET-TAO)의 휴지 세포에 의해 생성된 파라-아니스알데하이드의 증가 질량을 LC/MS를 이용하여 측정하였다. m/z가 139인 파라-아니스알데하이드의 증가된 질량 피크는 오직 H₂O¹⁸에서 배양된 세포 안에서만 관찰되었다(도 3). 본 발명자들은 TAO에 의해 파라-아니스알데하이드 내부로 삽입된 ¹⁸O로 표지된 산소의 산소 삽입 메커니즘을 제안해 보았으며, 오직 H₂O¹⁸에서만 증가된 질량이 관찰된 것은 도 4의 경로 C를 통해 설명할 수 있었다. shimon 논문에서 Arthrobacter sp. TA13에 의해 트랜스-아네솔 트랜스-아네솔 에폭사이드 및 다이올을 경유하여 파라-아니스알데하이드로의 분해를 가정하였다(7). Ryu 논문에서는 P. putida JYR-1에 의해 진행하는 트랜스-아네솔 대사 과정 초기 단계에서 두 개의 트랜스-아네솔 이성질체를 확인하였다. 그들의 제안된 경로는 아이소유진올에서 바닐린으로의 경로와 유사하다. 그러나 TAO에 의한 산소 원자의 삽입 패턴은 IE27(15, 16) 및 P. nitroreducens Jin1.의 아이소유진올 모노산소첨가효소에 의해 산소 분자 및 물 분자가 바닐린 내부로 들어가는 패턴과 매우 다르다. Marasco 논문(4)에서는 박테리아의 카로티노이드 산소첨가효소에 의해 레스베라트롤 모노산소첨가효소 메커니즘 결과 효소를 ¹⁸O₂로 배양시 단일 동위 원소 ¹⁸O로 표지된 분해 생성물이 생성될 수 있음을 보여주었다. 이러한 결과들로 보아 TAO는 산소에 의한 공격시 입체 선호 자리를 가지고 모노산소첨가효소 반응을 경유하는 트랜스-아네솔의 촉진시킬 것으로 본다.

TAO 단백질에 의한 식물에서 유래된 페닐프로페노이드 생전환

E. coli BL21(DE3)(pET-TAO)의 휴지 세포를 1 mM의 페닐프로파노이드 화합물에 배양시켰을 때 트랜스-아네솔과 구조적인 유사성을 가진다. 표 2에서 보듯이, TAO가 기질로서 95.8%, 48% 및 99.9%의 전환 수율로 아이소유진올, O-메틸아이소유진올 및 아이소사프롤을 받아들인 결과 각각 알데하이드 화합물인 바닐린, 베라트라알데하이드 및 피페로날로 전환되었다. 그러나 유진올, 프로페닐구아에솔, 신남산, 페룰산 및 4-쿠마르산은 TAO에 의해 이용되지 않았다.

테스트된 화합적 구조를 고려하면, TAO는 21-프로페닐기가 아닌 1-프로페닐기를 필요로 하였으며, 벤젠 고리의 4번 위치에 메톡시기(-OCH₃) 및 하이드록시기(-OH)가 3번 위치에 수소원자(-H), 메톡시기(-OCH₃) 및 하이드록시기(-OH)가 연결된 구조를 선호하는 경향이 있었다. TAO는 또한 아이소사프롤처럼 3,4-메틸렌다이옥시를 받아들었다. 그러나, 3번 및 4번 위치에 다이옥시기의 존재시 TAO의 활성 능력이 감소하였다. 흥미롭게도, 프로페닐구에솔의 에톡시(-OCH₂CH₃)기는 1-프로페닐기가 같이 존재함에도 불구하고 TAO 활성을 강하게 억제하는 듯 보였다.

TAO 활성 시 금속 및 보조 인자의 효과

TAO 활성에서 보조인자의 효과를 관찰하기 위해, 본 발명자들은 E. coli BL21 (DE3)(pET-TAO)의 한외 여과된 세포 추출물을 준비하였고, 무기 보조인자 및 유기 보조인자의 존재 시 분석을 수행하였다. NADH 및 NADPH의 첨가 시 TAO 활성은 4.3배까지 증가하였고(표 3), 이는 TAO가 NAD(P)H 의존 산화효소일 것을 시사한다. Mg(Ⅱ)의 첨가 시 어떠한 TAO 활성 억제도 보이지 않았다. 그러나 Fe(Ⅱ), Fe(Ⅲ), Mn(Ⅱ), Ni(Ⅱ), Cu(Ⅱ), 및 Zn(Ⅱ) 등의 무기 보조인자를 첨가한 경우에 TAO 활성은 각각 상대적으로 89.5%, 75,7%, 68.6%, 28.3%, 7.7%, 및 12.4% 정도로 억제되었다(표 3).

본 발명자들은 또한 Fe² ⁺ 및 Fe³ ⁺이온 특이적 킬레이터인 1, 10-페난트롤린 및 타이론(Tiron)에서 오직 1, 10-페난트롤린에서만 약한 억제를 보여주었다. 이러한 결과는 TAO는 어떠한 금속 보조인자도 필요로 하지 않음을 보여주었다. TAO에서 어떠한 추정되는 보존 부위가 없기에, 본 발명자들은 NAD(P)H과 TAO 사이의 관계를 명확히 할 수 없었다. 따라서 모티프에 결합하는 NAD(P)H를 확인하기 위한 TAO에 대한 추가적인 구조적 연구 및 TAO의 효소적 메커니즘의 이해가 필요하다.

요컨대, 본 발명에서 트랜스-아네솔의 산화적 분해를 촉진하는 트랜스-아네솔 유전자를 최초로 기술하였다. TAO는 또한 특정 2-프로페닐 화합물에서 알데하이드 화합물을 형성시킬 수 있다. TAO는 신규의 산화효소이며, 기질에 대한 입체 선호적인 산소 공격을 보여주었다. 또한, TAO는 NAD(P)H 의존 산화효소이다. 트랜스-아네솔에 대한 전체 반응의 경로는 도 6에서 제시하였다. 기질 범위가 확장된 TAO의 능력을 고려하면, TAO는 바닐린과 같은 방향족 화합물을 합성하는데 매우 유용할 것이다.

균주 또는 플라스미드	설명	공급원
균주
Pseudomonas putida JYR-1	트랜스-아네솔 전환 균주	(7)
Escherichia coli EPI100	포스미드 라이브러리에 대한 숙주 균주	Epicentre
Escherichia coli EC100	트랜스포존 Tn5 삽입에 대한 숙주 균주	Epicentre
Escherichia coli DH5α	클로닝 벡터에 대한 숙주 균주	(1)
Escherichia coli BL21(DE3)	발현 벡터에 대한 숙주 균주	Novagen
플라스미드
pEpiFos-5	Cm^r; 지노믹 라이브러리 컨스트럭트를 위한 7.5-kb 포스미드 벡터	Epicentre
pGEM-Teasy	Ap^r; TA 클로닝 벡터	Promega
pET21-a	Ap^r; 발현 벡터	Novagen
pTA163	Cm^r; JYR-1의 tao유전자를 포함하는 41-kb pEpi Fos-5	본 발명
pTA163-1C, pTA163-3A, pTA163-7C	Cm^r Km^r; pTA163의 tao 유전자 내부에 트랜스포손 Tn5 삽입	본 발명
pG-TAO	Ap^r; pGEM- tao 유전자를 포함하는 T 이지 클로닝 벡터	본 발명
pET-TAO	Ap^r; pET21-tao 유전자를 포함하는 발현 벡터	본 발명

상기 표 1은 본 발명에서 사용된 박테리아 균주 및 플라스미드이다.

기질			전환율(%)	대사물질
화합물 명	구조	천연화합물여부	전환율(%)	화합물 명	구조
트랜스-아네솔		Yes	99.81	파라-아니스알데하이드
아이소유진올		Yes	95.80	바닐린
유진올		Yes	N/D	N/D
프로페닐구아에솔		No	N/D	N/D
O-메틸 아이소유진올		Yes	48.04	베라트라알데하이드
아이소사프롤		Yes	99.95	피페로날
신남산		Yes	N/D	N/D
페룰산		Yes	N/D	N/D
4-쿠마르산		Yes	N/D	N/D

상기 표 2는 tao 유전자로 검사한 여러 기질을 나타내었다.

보조인자 (1 mM)	상대적 활성도 (%)
No cofactor	100 ± 0.9
NADH	352.5 ± 4.4
NADPH	429.6 ± 2.0
Fe(Ⅱ) ⅡⅢ	89.5 ± 2.8
Fe(Ⅲ)	75.7 ± 3.8
NADH + Fe(Ⅱ)	289.9 ± 17.8
NADH + Fe(Ⅲ)	382.7 ± 3.1
Mg(Ⅱ)	103.5 ± 0.8
Mn(Ⅱ)	68.6 ± 4.8
Ni(Ⅱ)	28.3 ± 0.2
Cu(Ⅱ)	7.7 ± 0.6
Zn(Ⅱ)	12.4 ± 0.3
1,10-Phenanthroline	76.6 ± 0.3
Tiron	103.8 ±1.1

상기 표 3은 E. Coli에서 발현되는 TAO에서 추출한 한외 세포 추출물에 의한 트랜스-아네솔에서 파라-아니스알데하이드로의 전환 시 보조 인자의 영향에 대한 활성도 수치이다.

ORF	유전자명	위치		유전자 크기 (bp)	아미노산 크기(aa)	가장 유사한 단백질(트랜스-아네솔 대사에 대한 추정적 기능)	아미노산 유사(%)	유사 단백질의 접근번호
ORF	유전자명	시작	정지	유전자 크기 (bp)	아미노산 크기(aa)	가장 유사한 단백질(트랜스-아네솔 대사에 대한 추정적 기능)	아미노산 유사(%)	유사 단백질의 접근번호
ORF 1		2559	94	2466	82	포메이트 탈수소화, 알파 소유닛	97	YP_001265877
ORF 2		2572	3162	591	196	몰리브돕테린 산화환원효소 Fe₄S₄ 부위	98	YP_001265876
ORF 3		4474	4007	468	155	MarR 군 전사 조절인자	70	YP_001749976
ORF 4		4837	6033	1197	398	포름알데하이드 탈수소화효소 글루타티온-독립	98	YP_001666600
ORF 5		6204	7535	1332	443	MFS_1 주요 활성인자 초과	73	YP_001749979
ORF 6		7572	8849	1278	425	외막 포린	68	YP_001749980
ORF 7	aniA	9231	10184	954	317	페레독신(파라-아니스 산 탈메틸화 효소, 환원효소)	62	YP_001749977
ORF 8	aniB	10209	11294	1086	361	바릴산염 모노산소첨가효소 (파라-아니스 산 탈메틸화 효소)	75	YP_001749978
ORF 9		11380	12054	675	224	추정적 외막 단백질 W	49	YP_001022198
ORF 10	tao	12090	13136	1047	348	가정적 단백질 (트랜스-아네솔 산화효소)	32	XP_003040480
ORF 11	adh	13136	14608	1473	490	파라-하이드록시벤즈알데하이드 탈수소화효소(파라-아니스알데하이드 탈수소화 효소)	65	AAA75634
ORF 12		15156	16169	1014	337	알데하이드 탈수소화효소 (아세트알데하이드 탈수소화 효소)	91	YP_259329
ORF 13	pbh	16305	17489	1185	394	파라-하이드록시 벤조산염 하이드록시화 효소	74	AAG17455
ORF 14		20358	17992	일부	일부	아데닌 특이적 DNA 메틸전달효소	60	YP_755571

상기 표 4는 트랜스-아네솔의 대사 과정에 관여하는 콘티그 2에서 발견되는 14개의 ORF의 아미노산 서열의 상동성 분석자료이다.

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Claims

서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질.
상기 제 1 항의 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
제 2 항에 있어서, 상기 핵산 분자의 염기 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
상기 제 2 항 또는 제 3 항의 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질 발현용 벡터.
상기 제 4 항의 벡터를 포함하는 형질전환체.
제 1 항에 있어서, 상기 TAO 단백질은 페닐 프로파노이드 화합물(phenyl propanoid compounds)의 산화 반응을 촉매(catalyzing)하는 것을 특징으로 하는 단백질.
다음의 단계를 포함하는 벤즈 알데하이드 유도체의 제조방법:
(a) 상기 제 1 항의 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을 준비하는 단계;
(b) 상기 TAO(trans-anethole oxidase) 단백질을 하기 화학식 1 또는 2의 화합물과 접촉시키는 단계; 및
(c) 하기 화학식 3 또는 4의 벤즈 알데하이드 유도체를 수득하는 단계;
화학식 1

화학식 2

화학식 3

화학식 4

상기 화학식 1 및 3에서, R₁ _,R₂ 및R₃은 서로 독립적으로 수소, 하이드록실기 및 메톡시기이고,
상기 화학식 2 및 4에서, R₄는 C₁-C₂ 알킬렌이고, R₅는 수소, 하이드록실기 및 메톡시기이다.
제 7 항에 있어서, 상기 화학식 1 또는 3에서 R₂는 메톡시기인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 화학식 2 또는 4에서 R₄는 메틸렌기, R₅는 수소인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Hydrogen), NADPH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Hydrogen), Mg(Ⅱ) 및 타이론(Tiron)으로 구성된 군으로부터 선택되는 보조인자(cofactor)의 존재 하에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 TAO 단백질은 정제된 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 TAO 단백질은 감마프로테오박테리아(Gamma-proteobacteria) 내에 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 감마프로테오박테리아(Gamma-proteobacteria)는 슈도모나스(Pseudomonas) 또는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 슈도모나스(Pseudomonas)는 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida)인 것을 특징으로 하는 방법.