KR20120097936A - 고구마 유래의 ＩｂＥＦ1 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고구마 유래의 IbEF1 (Ipomoea batatas early flowering 1) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포, 및 상기 재조합 벡터를 이용해 식물의 조기 개화를 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 분리된 IbEF1 유전자는 식물의 조기 개화를 유도할 수 있다.

Description

고구마 유래의 ＩｂＥＦ1 유전자 및 이의 용도{IbEF1 gene from sweet potato and uses thereof}

본 발명은 고구마 유래 IbEF1(Ipomoea batatas early flowering 1) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 벡터를 이용한 식물의 조기 개화를 유도하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 조기 개화가 유도된 식물체 및 상기 식물체의 종자 및 상기 유전자를 포함하는 식물의 조기 개화 유도용 조성물에 관한 것이다.

대부분의 식물은 영양생장 단계를 거쳐 생식생장 단계로 이행하여 꽃을 피운 후 종자를 형성하며 꽃이나 종자의 형성에는 일정기간이 요구된다. 개화에는 당, 온도, 지베렐린, 광 등의 여러 환경요인들이 관여한다. 이러한 환경요인의 영향을 받아 개화에 관여하는 많은 유전자들의 발현이 증가되거나 억제됨으로써 개화가 이루어진다.

식물은 꽃이나 종자를 이용하는 경우가 대부분이므로, 개화까지의 소요 기간이 식물의 산업적인 이용에 있어 가장 큰 제약의 하나로 여겨진다. 이러한 시간적 제약을 극복하기 위하여 기존에는 환경요인을 조절하여 개화를 조절하는 방법을 이용하여 왔으나, 환경요인을 조절하는 것 또한 제약이 따른다. 따라서, 최근에는 개화에 관련된 유전자들을 분자생물학적으로 조작함으로써 조기 개화를 유도하기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, cDNA 라이브러리의 스크리닝을 통해 탈수된 고구마의 백색 실뿌리로부터 분리된 cDNA 중의 하나인 조기 개화(early flowering)를 유도하는 후보 유전자의 기능을 규명하여, 상기 유전자를 IbEF1으로 명명하였다. 상기 유전자가 형질전환된 식물체를 통해 상기 유전자의 조기 개화 관련 특성을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고구마 유래 IbEF1(Ipomoea batatas early flowering 1) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 IbEF1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 IbEF1 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 이용한 식물의 조기 개화를 유도하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 조기 개화가 유도된 식물체 및 그의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 식물의 조기 개화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 분리한 IbEF1 유전자를 과발현시킨 형질전환 식물체를 이용한 개화시기 측정 실험에서 형질전환 식물이 대조식물에 비해 이른 개화를 보여 IbEF1 유전자가 개화에 있어 양성 조절자(positive regulator)로서 작용함을 보였다. 따라서 IbEF1 유전자를 식물의 조기 개화 유도에 활용할 수 있다.

도 1은 발현 벡터의 모식도이다. IbEF1 코딩 영역을 포함하는 pCAMLA의 T-DNA 영역을 보여준다. RB 및 LB: 각각 우측 및 좌측의 T-DNA 경계 서열; P35S/T35S: CaMV 35S 프로모터/터미네이터; HPT: 하이그로마이신 포스포트랜스라아제; Tnos: 노팔린 신타아제 터미네이터.
도 2는 IbEF1 cDNA의 뉴클레오티드 및 연역된 아미노산 서열이다. 우측의 숫자는 뉴클레오티드 및 아미노산의 위치를 나타낸다. 연역된 아미노산 서열은 뉴클레오티드 서열상에 single-letter code로 보여준다.
도 3은 IbEF1 유전자의 구조이다. 채워진 박스는 ORF를 나타내고, 박스 사이의 선은 인트론을 나타낸다. 숫자는 뉴클레오티드 수를 나타낸다.
도 4는 IbEF1 및 기타 상동성 단백질의 아미노산 서열을 비교한 것이다. (A) IbEF1과 포플러의 predicted protein (GenBank accession no. EEE93678; 63%), 포도의 unnamed protein product (CBI19977; 64%), 피마자의 conserved hypothetical protein (EEF36229; 61%) 및 옥수수(ACG39284; 55%), 알팔파 (ABD32948; 55%), 벼 (AAD38290; 55%, AAD38293; 56%), 애기장대 (AAM66077; 55%), 보리(CAA34641; 54%)의 병원균 관련(pathogen-elated) 단백질을 포함하는 높은 상동체의 연역된 아미노산 서열을 CLC Sequence Viewer 프로그램을 이용하여 정렬하였다 서열상의 블록은 IbEF1 단백질의 보존성이 높은 아미노산을 나타낸다. (B) (A)에서 수행된 상동성 분석을 바탕으로 유전자의 계통수 분석을 실시한 것이며, 분석은 CLC Sequence Viewer 프로그램을 이용하여 수행하였다.
도 5는 고구마 게놈 DNA의 서던 블롯 분석이다. 게놈 DNA를 제시된 제한효소로 절단하고, 아가로스 겔 상에서 분리하고, 블롯하고, DIG-표지된 IbEF1 단편으로 프로빙(probing)하였다. 왼쪽에 크기 마커를 보여준다.
도 6은 고구마의 상이한 조직에서 IbEF1 유전자의 발현 양상이다. 총 RNA를 고구마의 잎 (L), 잎자루 (P), 줄기 (St), 백색 실뿌리 (W), 진하게 착색된 뿌리 (TP) 및 괴근(tuberous root)(T)으로부터 추출하였다. 튜불린을 동일 양의 로딩에 대한 대조구로서 사용하였다.
도 7은 염 및 건조 스트레스 처리 후에 고구마의 뿌리 및 잎 조직에서 IbEF1 유전자의 발현 양상을 보여준다. 스트레스 미처리(NaC), 100mM NaCl 처리 (Na), 0 (C), 1 (D1), 2 (D2), 4 (D4) 및 8시간 (D8) 탈수 처리한 잎 및 뿌리로부터 총 RNA를 분리하였다. 동일 양의 로딩의 대조구로서 튜불린을 사용하였다.
도 8은 형질전환 식물에서 IbEF1 유전자의 삽입을 확인한 것이다. (A)는 형질전환 T₁ 담배 식물로부터 분리된 게놈 DNA의 서던 블롯 분석이다. 게놈 DNA를 제한효소 XbaI으로 절단하였다. M: DIG-표지된 DNA 분자량 마커; E14 및 E15: 형질전환 담배의 개별 라인. (B)는 형질전환 T₂ 담배 식물의 RT-PCR 분석이다. WT: 대조 라인; E14 및 E15: 형질전환 담배의 개별 라인. (C)는 형질전환 T₂ 담배 식물의 웨스턴 블롯 분석이다. WT: 대조 라인; E14 및 E15: 형질전환 담배의 개별 라인.
도 9는 IbEF1 유전자를 과발현하는 개별 형질전환 라인 및 야생형 식물 (대조구)의 파종 후 130일째의 표현형을 비교한 것이다.
도 10은 IbEF1 유전자를 과발현하는 개별 형질전환 라인 및 야생형 식물 (대조구)에서 꽃 기관 인식 유전자들의 파종 후 시기별 발현 양상을 RT-PCR을 통해 조사한 것이다. WT: 대조 라인; E14 및 E15: 형질전환 담배의 개별 라인; NtFul (GenBank accession No. DQ534202); NtMADS5 (accession No. AF068724); NtGLO (accession No. X67959); NtDEF (accession No. X96428); NAG1 (accession No. L23925); NtPLE36 (accession No. U63163); Actin (accession No. U60489).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 1의 아미노산서열로 이루어지는 고구마 유래의 IbEF1 (Ipomoea batatas early flowering 1) 단백질을 제공한다. 상기 단백질은 고구마 유래이며, 구체적으로는 고구마 율미(Ipomoea batatas (L.) Lam. cv. Yulmi) 유래이며, 221개 아미노산으로 이루어진 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다. 변이체는 아미노산 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 아미노산 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 아미노산 서열이다. 구체적으로, IbEF1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 IbEF1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 IbEF1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어지는 IbEF1 cDNA 또는 서열번호 3의 염기 서열로 이루어지는 IbEF1 게놈(genomic) DNA를 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 상기 %는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 수를 확인하여 정합 위치의 수를 산출하고, 그 정합 위치의 수를 비교 영역 내의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 상동성 %를 산출함으로써 계산된다. 비교를 위한 서열의 최적 배열은 공지된 연산방식의 컴퓨터에 의한 임플러먼테이션에 의해(예를 들면, GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFAST in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI, or BlastN and BlastX available from the National Center for Biotechnology Information), 또는 검사에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명의 IbEF1 유전자의 cDNA는 221개의 아미노산을 암호화하는 666 bp의 개방형 해독틀(open reading frame)을 포함하여 총 959 bp의 염기서열을 갖고, 고구마의 게놈 DNA에서 분리한 ORF 부분은 네 개의 엑손과 세 개의 인트론을 갖는다. IbEF1 단백질의 아미노산 서열은 Snoal-유사 도메인 슈퍼 패밀리의 멤버에 속하나, E-값과 서열 유사성을 고려하면 정말로 연관된 단백질인지 판단하기 어렵고 이러한 Snoal-유사 도메인 슈퍼 패밀리의 멤버 단백질들은 정확한 기능이 알려져 있지 않다. 따라서, 신규 유전자인 IbEF1을 상세하게 조사하였다.

서던 혼성화 분석 결과 (도 5), IbEF1 유전자는 멀티진 패밀리에 속할 것으로 판단되었다. RT-PCR을 통해 IbEF1 유전자의 발현양상을 살펴본 결과, 상기 유전자는 스트레스를 처리하지 않은 고구마의 잎, 잎자루, 줄기 및 뿌리에서는 발현되지 않았으나 (도 6), 염 및 건조 스트레스 하에서는 뿌리에서 발현되었고 특히, 염 스트레스 하에서 발현량이 현저하였다 (도 7).

또한, 본 발명은 본 발명의 IbEF1 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 식물 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 진핵세포 배양에 대해 디히드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 내성을 포함한다. 가장 널리 이용되는 식물 형질전환 마커는 Tn5로부터 분리된 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II(nptII) 유전자이며, 또 다른 마커 유전자는 항생제 하이그로마이신에 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터이다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 상류 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 노팔린 신타아제(NOS) 또는 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 노팔린 신타아제(NOS) 터미네이터이다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J.1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽식물뿐만 아니라 단자엽식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기 천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 IbEF1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 조기 개화를 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 식물의 조기 개화를 유도하는 방법은, 본 발명의 IbEF1 유전자를 식물 내로 도입시켜 형질전환 식물을 만드는 제 1단계, 및 상기 형질전환 식물에서 상기 유전자의 과발현을 유도하는 제 2단계를 포함한다. 상기 "과발현"이란 발현량이 인위적인 조작이 없는 식물에서 일반적으로 발현되는 정도를 넘어서는 경우로서 정의된다. 바람직하게는, 발현량이 인위적인 조작이 없는 식물에서 일반적으로 발현되는 정도를 넘어서는 경우로서, 그러한 인위적인 조작이 없는 식물에서 나타나는 개화 시기보다 빨라지는 개화 시기를 보이는 모든 경우를 포함하는 의미로서 정의된다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 조기 개화가 유도된 식물 및 그의 종자를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 식물체는 토마토, 애기장대, 감자, 가지, 고구마, 담배, 고추, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 담배이다.

본 발명은 또한, 상기 IbEF1 유전자를 포함하는, 식물의 조기 개화 유도용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로서 IbEF1 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시켜 발현시킴으로써 식물의 조기 개화를 유도할 수 있는 것이다. 상기 IbEF1 유전자는 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 전장 IbEF1 cDNA 의 클로닝

cDNA 클론 및 이의 서열 정보는 S.H. Kim 박사 (서울대학교)에 의해 친절하게 제공되었다. 본 발명에 사용된 고구마 (Ipomoea batatas (L.) Lam. cv. Yulmi)를 16시간 암소/8시간 명소 조건하에 25±3℃의 배양실에서 키웠다. 전체 RNA를 6시간 동안 탈수 처리한 고구마의 백색 실뿌리로부터 변형된 CTAB 방법을 이용하여 추출하였다 (Kim SH & Hamada T (2005) Biotech. Lett. 27: 1841-1845). 고구마 cDNA 라이브러리의 구축, EST의 생성, 개별적인 EST의 클러스터링 및 상동성 서치를 또한 CAP3 프로그램 및 BLASTX 알고리즘을 이용하여 GenBank nr 데이타베이스에서 수행하였다.

추가적인 상세한 서열 정렬 및 비교를 CLC Sequence Viewer 프로그램 (CLC bio, Denmark) 및 NCBI 데이타베이스에서 단백질 BLSAT 프로그램을 이용하여 수행하였다.

2. IbEF1 유전자의 구조 분석

전체 IbEF1 유전자를 얻기 위해, 총 게놈 DNA를 변형된 CTAB 방법 (Kim SH & Hamada T (2005) Biotech. Lett. 27: 1841-1845)을 이용하여 고구마 (Ipomoea batatas (L.) Lam. cv. Yulmi)로부터 추출하였으며, PCR을 상기 ORF에 대한 특이 프라이머를 이용하여 수행하였다. 반응을 주형으로서 DNA 30ng, 10x 버퍼 5㎕, 2.5mM dNTPs 4㎕, 10pmol 프라이머 1㎕ 및 2.5U ExTaq 중합효소 (Takara, Japan)를 포함하는 총 부피 50㎕에서 수행하였다. 반응을 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 및 72℃에서 40초의 35 사이클을 수행한 후, 72℃에서 5분 동안 최종 연장을 하였다. 증폭된 PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 분석하였다. 정제된 PCR 단편을 T&A 벡터 (Real Biotech, Taiwan)에 삽입하고, 서열분석을 하였다. 서열 정렬 및 비교를 CLC Sequence Viewer 프로그램 (CLC bio, Denmark)을 이용하여 수행하였다.

3. 서던 혼성화 분석

총 게놈 DNA를 변형된 CTAB 방법 (Kim SH & Hamada T (2005) Biotech. Lett. 27: 1841-1845)을 이용하여 고구마 (Ipomoea batatas (L.) Lam. cv. Yulmi) 잎으로부터 분리하였다. 20㎍의 각 DNA 시료를 다양한 제한효소인 EcoRI, HindIII, BamHI 및 XbaI로 각각 밤새 절단하였다. 절단된 산물을 20V/cm로 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 정제 및 분리하였다. 전기영동 후에, 겔을 0.25N HCl을 포함하는 트레이에서 15분간 교반하고, 물로 간단히 세정하고, 다시 0.4N NaOH을 포함하는 트레이에서 30분간 교반하였다. 연이어, DNA를 나일론 막으로 옮겼다. 상기 막을 2x SSC에서 간단히 세정한 후에 건조시켰다. 234 bp IbEF1 유전자 단편을 PCR DIG 프로브 합성키트 (Roche Molecular Biochemicals, Germany)를 이용하여 2개의 프라이머 (5'- CTT GTT CAG GTA CTG GTG GAG AC -3': 서열번호 4; 5'- GCA AAG AGG TTT GGA GGA AGA C -3': 서열번호 5)에 의해 프로브로서 표지하였다. 혼성화, 세정 및 검출을 DIG 시스템 (Roche Molecular Biochemicals, Germany)에 대해 확립된 가이드라인에 따라 수행하였다.

4. 스트레스 처리

전사체 발현에 대한 다양한 비생물학적 스트레스의 효과를 시험하기 위해, 16시간 암/8시간 명 조건하에 25±3℃의 배양실에서 키운 고구마 (Ipomoea batatas (L.) Lam. cv. Yulmi)를 이용하였다.

탈수 처리를 위해, 고구마 식물을 포트에서 조심스럽게 뽑아내어 여과지에 옮겨 건조하였다. 고구마의 잎 및 뿌리를 탈수 처리 후 0(무처리 대조구), 0.5, 1, 2, 4 및 8시간에 수확하였다. 고구마 식물을 또한 48시간 동안 NaCl 100mM로 처리하였다.

스트레스 처리된 식물의 잎 및 뿌리를 바로 액체 질소에 냉동하고, RNA 추출 및 연이은 분석을 위해 -70℃에 저장하였다. 무처리 고구마의 잎 및 뿌리를 또한 모아, 즉시 액체 질소에 냉동하고, 사용시까지 -70℃에 저장하였다.

5. RT - PCR 분석

다양한 비생물학적 스트레스에 노출된 고구마의 잎 및 뿌리에서 IbEF1 전사체의 검출을 위해, 역전사효소(RT)-PCR을 수행하였다. 총 RNA를 변형된 CTAB 방법 (Kim SH & Hamada T (2005) Biotech. Lett. 27: 1841-1845)에 따라 스트레스 처리된 식물 및 무처리 식물 시료에서 추출하였다.

제1가닥 cDNA를 MMLV 역전사효소 (Takara, Japan) 및 올리고(oligo) dT 프라이머를 이용하여 1㎍의 총 RNA로부터 합성하였다. 역전사 반응을 42℃에서 2시간 동안 수행한 후에, 1㎕ RT 반응 혼합물을 10x 버퍼, 200mM dNTPs, 10pmol 유전자 특이적 프라이머 (5'- CTT GTT CAG GTA CTG GTG GAG AC -3': 서열번호 6; 5'- GCA AAG AGG TTT GGA GGA AGA C -3': 서열번호 7) 및 2.5U ExTaq 중합효소 (Takara, Japan)를 포함하는 50㎕ PCR-증폭 반응에서 주형으로서 이용하였다. 상기 PCR 반응을 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 및 72℃에서 1분의 30 사이클을 수행한 후, 72℃에서 5분 동안 최종 연장을 하였다. 내부 양성 대조구로서, 고구마 튜불린 유전자 서열에 기초하여 디자인된 프라이머 세트 (5'-CAA CTA CCA GCC ACC AAC TGT-3': 서열번호 8; 5'-CAA GAT CCT CAC GAG CTT CAC-3': 서열번호 9)를 모든 실험에 이용하였다. 증폭된 PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 관찰하였다.

6. 식물 형질전환

25℃에서 16시간의 광주기에 키운 시험관 내 담배 식물 (Nicotiana tabacum cv. Xanthi)을 본 발명에 이용하였다. IbEF1 과발현 벡터를 구축하기 위해, KpnI 자리를 포함하는 정방향 프라이머 (5'-ATG GCT TGT TCA GGT ACT GGT G-3': 서열번호 10) 및 BamHI 자리를 포함하는 역방향 프라이머 (5'-TCA TCC ACT GCT TCC TCC CTT G- 3': 서열번호 11)를 이용하여 PCR에 의해 증폭된 IbEF1 유전자의 코딩 영역을 pCAMLA (pCAMBIA 1300 + P35S-Tnos 카세트) 벡터 (Lee et al., (2005) Plant Pathol. J. 21: 149-157) 내로 삽입하였다 (도 1). 이어서 상기 과발현 벡터를 동결 해동 방법 (An G (1987) Methods Enzymol. 153: 292-305)에 의해 아그로박테리움 튜머파시엔스 EHA 105 균주 내로 도입하였다.

식물 형질전환을 위해, OD 600 = 0.6~1.0의 박테리아 현탁액으로 5분간 접종된 담배 잎 디스크를 물로 세정하고, 멸균 여과지에서 건조하였다. 접종된 잎 디스크를 2일간 암소에서 배양한 후, 어린 가지(shoot) 유도를 위해 0.1mg/L NAA, 1.0mg/L BAP, 50mg/L 하이그로마이신 및 500mg/L 세포탁심을 첨가한 MS 배지에 옮겼다. 재분화된 어린 가지를 0.1mg/L NAA, 50mg/L 하이그로마이신 및 500mg/L 세포탁심을 포함하는 MS 배지에서 뿌리를 유도하였다.

하이그로마이신 내성에 기초하여 선발된 형질전환 라인을 IbEF1 특이적 PCR 및 서던 혼성화 분석에 의해 추가로 동정하였다. 확인된 형질전환 T1 세대 유묘를 포트에 이식하고, 자가수분시켜 T₂ 세대 식물체를 획득하였다. 상기 식물체를 추가 연구를 위해 온실에서 키웠다.

7. 형질전환 식물의 화아 형성 시기 조사

460nm 청색 및 630nm 적색 LED광 (DYLED 45, Dynebio, Korea) 하에서 파종 후 150일까지 재배하였다.

실시예 1: IbEF1 유전자의 클로닝 및 구조 분석

탈수된 고구마의 백색 실뿌리로부터 전장 enriched EST(Expressed 서열 Tag)를 분리 및 규명하기 위한 실험은 S.H. Kim 박사 (서울대학교)에 의해 이전에 수행되었다. 특유 전사체에 대한 개개 EST의 클러스터링 및 상동성 검색은 상기 EST들이 신호전달, 물질대사, 단백질 목적지(protein destination), 수송촉진, 단백질 합성 및 기타 기능을 포함하는 넓은 범위의 기능적 카테고리를 나타낸다는 것을 보여주었다. 이 중에서, 하나의 cDNA 단편을 사용하였다.

뉴클레오티드 BLAST 서치는 상기 유전자 IbEF1이 NCBI 데이터 베이스에 공개된 기능성 유전자와 서열 상동성이 없음을 보여주었다. 그러나, 염 및 건조 스트레스에 의한 강한 유도는 스트레스 반응에 관련될 수 있다는 것을 제시하였다.

서열 분석은 전장 IbEF1 cDNA가 959 bp 길이이며, 45 bp 5'-비번역 영역, 135 bp 3'-비번역 영역 및 221개 아미노산을 코딩하는 666 bp 개방형 해독틀 (ORF)로 이루어졌다는 것을 보여주었다 (도 2). 상기 ORF는 25 kDa의 예상된 분자량을 갖는 가상적인 단백질을 코딩하였다.

전체 IbEF1 유전자는 상기 ORF의 특이적 프라이머를 이용하여 고구마 게놈 DNA로부터 증폭하였다. 게놈 DNA 서열과 IbEF1 cDNA의 비교로부터 게놈 DNA 서열이 cDNA 서열과 완벽하게 매치되는 4개의 엑손 및 255, 79 및 227bp 길이의 3개의 인트론으로 이루어졌다는 것을 알 수 있었다 (도 3).

실시예 2: 가상적인 IbEF1 단백질의 서열 분석

단백질 블라스트 분석에 따르면, IbEF1 단백질의 연역된 아미노산 서열은 포플러(Populus trichocarpa) 유래의 predicted 단백질 (GenBank accession no. EEE93678; 63%), 포도(Vitis vinifera)의 unnamed 단백질 (accession no. CBI19977; 64%), 및 옥수수(Zea mays) (accession no. ACG39284; 55%), 알팔파(Phaseolus vulgaris) (accession no. ABD32948; 55%), 벼(Oryza sativa Japonica) (accession no. AAD38293; 56%), 애기장대 (accession no. AAM66077; 55%)와 같은 식물의 병원균 관련 단백질과 높은 유사성을 가진다 (도 4A).

IbEF1 단백질의 아미노산 서열은 Snoal-유사 도메인 슈퍼 패밀리의 멤버에 속하나 E-값과 서열 유사성을 고려하면 기능적으로 연관된 단백질인지 판단하기 어렵다 (도 4B). 그러나 이러한 단백질에 대해 아직 식물에서의 정확한 기능이 알려져 있지 않다. 따라서, 신규 유전자인 IbEF1에 대해 더욱 상세하게 조사하기로 결정하였다.

실시예 3: IbEF1 유전자의 서던 혼성화

IbEF1 유전자의 잠재적인 카피 수를 결정하기 위해, 서던 혼성화 분석을 각각 EcoRI, EcoRⅤ, HindIII, BamHI 및 XbaI으로 절단된 고구마 게놈 DNA를 이용하여 높은 스트린전트 조건하에 수행하였다.

제한 효소 절단의 모든 경우에서 두 카피 이상의 IbEF1 유전자가 검출되었는데, 이는 IbEF1 유전자가 고구마 게놈에서 멀티 카피 유전자로 존재할 수 있다는 것을 나타낸다 (도 5).

실시예 4: IbEF1 유전자의 발현 양상

고구마의 상이한 조직에서 IbEF1 유전자의 발현 양상을 조사하기 위해, 총 RNA를 배양실에 키운 전체 식물의 뿌리, 줄기, 잎 및 잎자루로부터 추출하였다. IbEF1 유전자의 mRNA 발현 양상을 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. 결과는 IbEF1 유전자는 일반 재배상태의 식물 조직에서 발현되지 않음을 보여주었다 (도 6).

비생물학적 스트레스의 영향을 조사하기 위해, IbEF1 유전자 발현을 다른 식물에서 이전에 스트레스 신호전달 경로에 관여하는 것으로 증명된 비생물학적 스트레스 처리 후에 잎 및 뿌리 조직에서 평가하였다. RT PCR에 의한 발현 분석은 염 및 건조 스트레스에 노출된 식물 조직의 IbEF1 전사 수준이 대조구의 것보다 더 높다는 것을 보여주었다 (도 7). IbEF1 유전자의 발현은 특히 염(NaCl) 처리하의 뿌리에서 명백하게 더 높았다. 그러나, IbEF1 mRNA는 고온 또는 저온 노출 및 식물 호르몬의 영향으로는 잎 및 뿌리에서 현저하게 축적되지 않았다.

다양한 비생물학적 스트레스 하의 IbEF1 유전자의 이러한 다양한 발현 양상은 IbEF1 유전자가 다양한 스트레스에 대해 보편적으로 발현되지 않는다는 것을 나타낸다. 그러나, IbEF1 유전자가 건조 및 염 스트레스에 대한 반응에 관여할 가능성을 보여준다.

실시예 5: 형질전환 담배 식물의 생성

IbEF1 유전자의 효과를 분석하기 위해, CaMV 35S 프로모터에 의해 IbEF1 코딩 영역을 발현하는 바이너리(binary) 벡터로 형질전환된 담배 식물을 생성하였다.

숙주 염색체 내로 삽입된 자리를 확인하기 위해, 서던 블롯 분석을 형질전환 T₁ 담배 식물의 잎으로부터 분리된 게놈 DNA를 이용하여 수행한 결과, IbEF1 유전자의 666 bp 단편을 형질전환 T₁ 식물의 DNA에서 확인하였고 (도 8A), 서던 블롯 결과로부터 확인된 독립적인 형질전환 2개의 라인(E14 및 E15)을 대조 라인과 같은 조건으로 재배하여 형질전환 식물의 추가의 표현형 분석에 이용하였다. 또한 형질전환 담배 식물에서 IbEF1 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인하고, 단백질 수준에서의 합성 여부도 확인하였다. RT-PCR 결과, IbEF1 유전자는 총 mRNA로부터 검출된 반면, 해당 밴드는 음성 대조구로서 이용한 비형질전환 식물에서는 검출되지 않았다 (도 8B), 또한, 형질전환 담배 식물에서는 IbEF1 단백질에 해당하는 25kD의 단백질이 검출된 반면, 비형질전환 식물체에서는 검출되지 않았다 (도 8C). 상기 결과는 IbEF1 유전자가 숙주 게놈 내로 안정하게 삽입되어 발현하고 단백질 수준까지 안정적으로 합성되고 있다는 것을 제시한다.

실시예 6: 형질전환 식물의 조기 개화 유도

IbEF1 유전자를 도입한 형질전환 식물체를 1/2 MS 배지에 파종한 후 460nm 청색 및 630nm 백색 LED광에서 20일 동안 재배하였다. 상기 재배한 식물체를 배양토가 담긴 화분에 이식하여 추가로 130일간 재배하여 형질전환 식물체의 조기 개화를 확인하였다 (도 9).

형질전환 식물체는 빠르면 파종 후 99일에 꽃봉오리가 형성되었고 꽃봉오리가 형성되는데 평균 114일이 소요되었다. 반면 대조 식물체는 평균 143일이 소요되었다. 형질전환 식물체는 조기개화에 따라 약 30개의 잎이 형성된 후에 꽃봉오리가 형성되었고, 대조 식물체는 45개의 잎이 형성된 후에 꽃봉오리가 형성되었다. 식물체의 높이도 형질전환체가 49cm, 대조 식물체가 60cm로 형질전환 식물체가 더 작았으므로 형질전환 식물체에서 더 이른 시기에 개화 단계로 이행됨을 추정할 수 있었다.

조기 개화를 유도하는 IbEF1과 화기 인식 유전자 간의 관계를 규명하고자 꽃봉오리가 형성되지 않은 시기인 60일, 75일, 90일에 줄기 정단부에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 통해 화기 인식 유전자들의 발현양상을 조사하였다 (도 10).

영양생장 단계에서도 발현하나 생식생장 단계에서 발현이 증가하는 것으로 알려진 NtFul 유전자 (SmyKal et al., (2007) Plant Mol. Biol. 65: 233-242)는 75일까지 대조 식물체와 형질전환 식물체 간에 큰 차이가 없었으나, 90일째에 형질전환 식물체에서 발현량이 증가하였다. 다른 화기 인식 유전자들도 형질전환 식물체에서는 90일째까지 모두 발현한 반면, 대조 식물체에서는 발현하지 않았으므로 IbEF1의 과발현으로 인해 유전자 수준에서 개화 단계로 조기 이행되었음을 알 수 있었다.

<110> University of seoul Industry Cooperation Foundation <120> IbEF1 gene from sweet potato and uses thereof <130> PN10309 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 221 <212> PRT <213> Ipomoea batatas <400> 1 Met Ala Cys Ser Gly Thr Gly Gly Asp Lys Tyr Arg Asp Tyr Leu Ser 1 5 10 15 Glu Asp Glu Val Lys Asn Thr Lys Trp Arg Ser Gly Pro Pro Ser Tyr 20 25 30 Asp Val Val Asp Lys Leu Phe Glu Glu Gly Arg Thr His Val Trp Pro 35 40 45 Glu Gly Ser Leu Glu Glu Lys Val Gln Arg Leu Met Lys Thr Trp Glu 50 55 60 Met Glu Leu Val His Lys Ala Asp Pro Asn Asp Tyr Lys Thr Leu Asp 65 70 75 80 Pro Thr Lys Phe Arg Leu Phe Val Asn Gly Arg Lys Gly Leu Ser Leu 85 90 95 Glu Glu Thr Ala Lys Ile Gly Gly Ser Tyr Asn Val Phe Leu Gln Thr 100 105 110 Ser Leu Pro Glu Lys Tyr Arg Val Phe Asn Pro Ala Asp Glu Thr Phe 115 120 125 Val Ser Ser Gln Ala Ala Phe Arg Asn Ala Phe Pro Arg Gly Phe Ala 130 135 140 Ile Glu Ile Leu Gln Val Tyr Ser Gly Pro Pro Arg Ile Thr Tyr Arg 145 150 155 160 Phe Arg His Trp Gly Tyr Met Asp Gly Pro Phe Lys Gly His Pro Pro 165 170 175 Thr Gly Glu Ile Ala Glu Phe Phe Gly Met Gly Thr Phe Glu Leu Asp 180 185 190 Glu Glu Ser Asn Lys Ile Val Lys Ser Glu Leu Phe Phe Asp Arg Gly 195 200 205 Glu Leu Leu Gly Ala Leu Val Lys Gly Gly Ser Ser Gly 210 215 220 <210> 2 <211> 666 <212> DNA <213> Ipomoea batatas <400> 2 atggcttgtt caggtactgg tggagacaaa tacagggact atctcagtga agatgaggtg 60 aagaacacca aatggagatc tggtcctcct agctatgatg ttgtagacaa gctttttgaa 120 gagggcagaa ctcatgtgtg gcctgaagga tctctggagg aaaaagtgca gaggcttatg 180 aagacatggg agatggagct ggtgcacaag gcagatccta atgattataa gacacttgat 240 cctacaaaat ttagactctt cgtcaatggg agaaaaggtc tatccttgga agaaacagcc 300 aagattggag gaagctacaa tgtcttcctc caaacctctt tgcccgaaaa atatcgagta 360 ttcaaccctg ccgatgaaac atttgtttca tctcaggctg ctttcaggaa tgcatttcct 420 cgaggatttg ccatcgagat cctccaggtt tattcaggac cgccacgaat aacatacaga 480 ttcaggcatt ggggttacat ggatgggccc ttcaaaggcc atcctcctac tggagaaatt 540 gctgaattct ttggaatggg cactttcgag ttggatgaag agtctaacaa gattgtgaaa 600 tcagagttgt tctttgaccg tggagaactt cttggagccc tggtcaaggg aggaagcagt 660 ggatga 666 <210> 3 <211> 939 <212> DNA <213> Ipomoea batatas <400> 3 gtggctaaag aatagaacca ctacaatggc ttgttcaggt actggtggag acaaatacag 60 ggactatctc agtgaagatg aggtgaagaa caccaaatgg agatctggtc ctcctagcta 120 tgatgttgta gacaagcttt ttgaagaggg cagaactcat gtgtggcctg aaggatctct 180 ggaggaaaaa gtgcagaggc ttatgaagac atgggagatg gagctggtgc acaaggcaga 240 tcctaatgat tataagacac ttgatcctac aaaatttaga ctcttcgtca atgggagaaa 300 aggtctatcc ttggaagaaa cagccaagat tggaggaagc tacaatgtct tcctccaaac 360 ctctttgccc gaaaaatatc gagtattcaa ccctgccgat gaaacatttg tttcatctca 420 ggctgctttc aggaatgcat ttcctcgagg atttgccatc gagatcctcc aggtttattc 480 aggaccgcca cgaataacat acagattcag gcattggggt tacatggatg ggcccttcaa 540 aggccatcct cctactggag aaattgctga attctttgga atgggcactt tcgagttgga 600 tgaagagtct aacaagattg tgaaatcaga gttgttcttt gaccgtggag aacttcttgg 660 agccctggtc aagggaggaa gcagtggatg aagctgcaac atctgaagcc ccttcagcct 720 gccctttcat gaaaggagtt tagttttttg caggttgatt aaccagtaaa agaataagat 780 gtttgaacaa taagcgataa ctgcagaatg ggaatttgtc aatgcattca ttatactgta 840 ttaatgtgct ccttttatcc aatttcatcg tgttttcttc ataaaaatgt acgctttaac 900 ttatgtggtt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 939 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 cttgttcagg tactggtgga gac 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 gcaaagaggt ttggaggaag ac 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 cttgttcagg tactggtgga gac 23 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 gcaaagaggt ttggaggaag ac 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 caactaccag ccaccaactg t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 caagatcctc acgagcttca c 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 10 atggcttgtt caggtactgg tg 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 11 tcatccactg cttcctccct tg 22

Claims (10)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 고구마(Ipomoea batatas) 유래의 IbEF1(Ipomoea batatas early flowering 1) 단백질.
2. 제1항의 IbEF1 단백질을 코딩하는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
5. 제4항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
6. 제4항에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 IbEF1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 조기 개화를 유도하는 방법.
7. 제6항의 방법에 의해 제조된 조기 개화가 유도된 식물체.
8. 제7항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
9. 제7항에 따른 식물체의 종자.
10. 제2항의 유전자를 포함하는, 식물의 조기 개화 유도용 조성물.

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