KR20120092767A - 인간 항-ＣＤ23 Ｆａｂ 항체 및 이를 포함하는 종양 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IM-9 세포 표면에 발현하는 CD23에 특이적으로 결합하는 Fab 항체 및 이를 포함하는 종양 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 항-CD23 인간 Fab 항체를 이용하면, CD23에 대한 특이성이 높아서, 종양 치료용 약학 조성물 및 백혈병 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

Description

인간 항-ＣＤ23 Ｆａｂ 항체 및 이를 포함하는 종양 치료용 약학 조성물 {A human anti-CD23 Fab antibody and a Pharmaceutical composition for treating tumor comprising the same}
본 발명은 IM-9 세포 표면에 발현하는 CD23에 특이적으로 결합하는 Fab 항체 및 이를 포함하는 종양 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
특정 B 세포 마커에 특이적으로 결합하는 인간 항체의 개발은 치료용 항체 개발에 꼭 필요하며, 특히 B 세포 림프구에 대한 치료 발전에 큰 영향을 준다. Fludarabine (FA), cladribine (2-CdA-chlorodeoxyadenosine) 그리고 pentostatin (DCF, 20-deoxycoformycin)과 같은 화학치료제와 함께 단클론 항체(mAbs)는 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma, NHL) 과 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia, CLL) 환자들의 관리에 극적인 변화를 주었다. 예를 들어 rituximab(Rituxan®과 almetuzumab (Campath-1H®)은 임상에서 중대한 가치를 입증하였다 (Coiffer et al., 2006 ; Hallek et al., 2009). Rituximab을 단일 물질로 환자에게 처리하였을 시 항체 의존성 세포 독성 (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)과 보체 의존성 세포 용해(complement-dependent cytotoxicity CDC)를 이끌어 냈고 직접적인 세포사멸의 유도에 의해 B 세포 림프종의 거의 모든 subtype을 갖는 환자에서 명확한 반응을 나타냈다 (Golay et al.,2000 ; Pederson et al., 2002 ; Robak et al., 2007). 단클론 항체는 비록 세포 표면에서 CD20의 높은 수준의 발현과 임상 반응 사이의 관계가 불분명하여도 (ManShouri et al., 2003) CD20 발현이 CLL 보다 높게 나타나는 공격적인 B cell 비호지킨 림프종 (NHLs)을 갖는 환자(Keating et al., 2002)에게 화학적치료 물질과 함께 처리하였을 시 가장 큰 이점을 나타낸다. 항-CD52 alemtuzumab 은 FA로도 다루기 힘든 CLL 환자에게서 중요한 활성을 보였고 장기 생존의 향상을 기인하는 골수에서 미세 잔존 질환 (MRD)을 제거하는 기능은 rituximab보다 우수하다 (Moreton et al.,1998).
비록 rituximab이 B 세포 림프종의 치료에서 효과적인 물질일지라도 relapsed/refractory CD20+ 소낭 모양의 림프종을 갖는 환자들 중 대략 50%는 초기치료에서 반응하지 않고 (McLaughlin et al ., 1998) 사전에 Rituximab에 반응하는 환자들 중 60%는 원인이 불분명한 습득된 저항력 때문에 치료에 더 이상 유용하지 않다고 보고되고 있다(Davis et al., 2000). Alemtuzumab의 경우, CD52가 림프구와 단혈 백혈구에서 흔히 발현되어 지므로 rituximab 보다 더 많은 주입, 혈청과 면역독성을 상당히 야기시키므로 잠재적인 감염에 대한 예방의 주의 깊은 모니터링이 필요하다 (Moreton et al., 2005). Rituximab 과 alemtuzumab 의 다른 효능과 부작용으로 인해 B 세포 림프종에 선별적인 결합능력을 갖는 다양한 수의 인간 항체가 개발되어야 한다 (Moreton et al., 2005). 따라서 최근 새로운 단클론 항체들이 연구되고 있고 CLL을 포함하는 B세포 림프종 치료 성공의 가능성을 보여주었다 (Robak et al., 2007 ; Robak et al., 2009 ; Robak et al., 2008). 예를 들면 CD22, CD23, CD40, CD80 또는 HLA-DR beta 사슬과 같은 다양한 항원들을 표적으로 하는 인간화 단클론 항체들이 있으며, 키메릭 형태인 rituximab의 결점을 줄이기 위한 완전한 인간항체인 ofatumumab(HuMaxCD20)이 있다(Celeste et al., 2007).
파지 디스플레이 라이브러리는 원하는 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위해 광범위하게 사용되고 있다(Azzazy et al., 2002 ; Marks et al., 2004). 치료용 항체의 개발에 있어 파지 디스플레이 기술은 완전한 인간 항체를 얻을 수 있는 장점을 지녔다(Hoogenboom et al., 2000 ; Aires et al., 2008). 본 연구에서는 'Biopanning and Rapid Analysis of Selective Interact Ligands (BRASIL)'(Giodarno et al., 2001) 이라 명하는 세포 패닝 (cell panning)을 이용하여 IM-9 세포에 대한 인간 나이브(naive) Ig repertoires 를 포함하는 1차(primary) 파지 디스플레이 항체 라이브러리를 제작하여 인간 B lymphoblastic 세포 표면에 발현하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 성공적으로 선별하였으며, 이중 면역글로블린 E(IgE)에 낮은 친화력을 갖는 수용체(FcRII)에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하였다.
이에 본 발명자들은 인간 B lymphoblastic 세포 표면에 발현하는 CD23 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하여 완전한 인간 나이브(naive) 기원으로부터 선별된 IM-L6-5 Fab 항체가 종양치료에 사용되고 있는 기존의 항체보다 더 개선된 치료용 항체로 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 항-CD23 인간 Fab 항체를 제조하기 위하여, 선별된 중사슬 가변영역 및 경사슬 가변영역을 포함하는 CD23에 대한 단일클론 항체 Fab 부위를 암호화하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 선별된 중사슬 가변영역 및 경사슬 가변영역을 포함하는 CD23에 대한 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편(Fab) 및 이를 함유하는 종양 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 일 구체예에서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3로 표시되는 가변영역을 포함하는 CD23에 대한 단일 클론 항체 Fab 부위의 중사슬을 암호화하는 유전자를 제공한다.
일 구체예에서, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6로 표시되는 가변영역을 포함하는 CD23에 대한 단일 클론 항체 Fab 부위의 경사슬을 암호화하는 유전자를 제공한다.
일 구체예에서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 벡터를 제공한다.
일 구체예에서, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6을 포함하는 벡터를 제공한다.
일 구체예에서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 구체예의 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포를 제공한다.
일 구체예에서, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 구체예의 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포를 제공한다.
일 구체예에서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 중사슬 가변영역을 함유하고, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 경사슬 가변영역을 함유하는 CD23에 대한 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편(Fab)을 제공한다.
일 구체예에서, 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 중사슬 가변영역을 함유하고, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 경사슬 가변영역을 함유하는 CD23에 대한 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편을 함유하는 종양 치료용 약학조성물을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 종양은 백혈병인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 면역 반응에 관여하는 면역 항체를 의미하며, 면역글로불린(immunoglobulin)이라고도 한다. 이러한 항체는 Y자 형의 단일 분자로, 중쇄 (heavy chain) 및 경쇄 (lightchain)으로 이루어져 있다. 따라서 본 발명의 항체는 면역학적으로 특정 항원(antigen)과 반응성인 면역글로불린 분자를 포함하며, 다클론항체 (polyclonal antibody) 및 단일클론항체 (monoclonal antibody)를 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체 (chimeric antibody)(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전 공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "단일클론항체"란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위 (에피토프(epitope))에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 달리, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 (hybridoma)의 배양 또는 파지디스플레이 (phage display) 방법에 의해 생산될 수 있기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 장점을 갖는다.
본 발명에 따른 항-CD23 인간 Fab 항체를 이용하면, CD23에 대한 특이성이 높아서, 종양 치료용 약학 조성물 및 백혈병 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 유속세포분석기를 이용하여 6개의 Fab 클론의 IM-9 세포에 대한 특이적인 결합을 확인한 것이다.
도 2는 ELISA를 이용하여 인간 Fab 클론의 항원 특이적 결합을 확인한 것이다.
도 3은 유속세포분석기를 이용하여 IM-L6-E 및 IM-L8-G Fab 클론의 B 림프구성 세포주에 대한 결합 특이성을 확인한 것이다.
도 4는 단클론 ELISA를 통하여 CD23 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 항체의 선별을 나타낸 것이다.
도 5는 유속세포분석기를 이용하여 IM-L6-5 Fab 클론이 U937 세포 표면에 발현되는 CD23(CD23b)에 대한 결합력을 확인한 것이다.
도 6은 IM-L6-5 Fab 클론에 의한 CD23에 대한 인간 IgE의 결합력 저해를 확인한 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
1차 항체 라이브러리 HuDVFab -8L 로부터 항- CD23 Fab 클론의 분리
1-1: IM -9 세포에 결합하는 파지 항체의 선별
HuNH-D2 sublibrary (4.5 x 109 의 다양성을 갖는 인간 나이브(naive) 중사슬) 와 항원과의 특이적 결합력이 한정되지 않은 인간 나이브(naive) kappa 경사슬(HuL1-HuL8)을 이용하여 제작한 HuDVFab-8L Fab 항체라이브러리로부터 재조합 파지 항체를 준비하였다 (Hur et al., 2010). 인간 promonocytic U937세포와 파지 항체를 미리 결합시켜 비특이적 결합 파지 항체를 제거하였다. 그 후에 BRASIL 방법을 이용하여 세포 패닝을 4번 수행하여 인간 B lymphoblastic IM-9 세포에 결합하는 파지 항체를 선별하였다. BRASIL 선별과 세포 표면에 결합하는 파지를 얻기 위해 수용성층과 유기용매층을 이용하여 원심분리를 통해 세포에 결합된 파지를 선별하였다.
IM-9 세포에 결합하는 파지 항체의 선별은 기존에 보고된 'BRASIL'(Giodarno et al., 2001) 방법을 이용하여 수행하였다. 1차 항체 라이브러리인 HuDVFab-8L (IG Therapy Co., South Korea) 에 Ex12 헬퍼 파지 (IG Therapy Co.)를 이용하여 재조합 파지 항체를 준비하였다(Hur et al., 2010). 총 1012 파지 항체를 1% bovine serum albumin (BSA) 가 첨가된 1 ml의 차가운 RPMI를 이용하여 1x106 U937 세포와 4℃에서 1시간 30분 동안 반응시킨 후 원심분리 하여 파지 상등액을 1 x106 IM-9 세포에 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 1% BSA 가 첨가된 RPMI로 세포를 세척한 후 세포와 결합된 파지 400㎕를 유기용매 층 (dibutyl phthalate:cyclohexane 9:1 [v:v]) 400㎕에 조심스럽게 로딩하였다. 이것을 10,000 x g, 10분 동안 원심분리 하여 액체 질소에 넣어 냉동시킨 후 튜브의 상단을 절단하였다. 세포와 결합된 파지를 log phase까지 키운 1 ml의 E. coli TG1 세포에 첨가한 후, Ex12 헬퍼 파지를 이용하여 파지를 증폭하였다. 본 과정을 3번 수행하였다.
1-2: 항- CD23 Fab 클론의 선별
세포 패닝이 끝난 후에 용리된 파지의 콜로니 생성단위 (CFU)를 통해 HuL1, HuL2, HuL6, HuL8 경사슬을 이용한 1차 항체 라이브러리에서 특정 파지가 증가되는 것을 확인하였다 (표 1). 마지막 세포 패닝이 끝난 후 96 개의 E. coli 클론을 무작위로 선별하여 수용성 Fab-pIII 분자로 준비하여 통해 IM-9, U937 세포를 이용하여 FACS를 수행하였다. 그 결과 96개의 Fab 중 26개의 클론이 U937세포에 결합하지 않고 IM-9 세포에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였으며, VH 유전자를 DNA 분석을 통해 positive Fab 클론을 선별하였다 (데이터 나타내지 않음). 아미노산 분석을 통해 HuL1에서는 3개의 VH 유전자를 지니는 항체가 존재하였고 HuL2, HuL6, HuL8에서는 각각 1개의 VH 유전자를 지닌 Fab 단클론 항체가 존재함을 확인하였다. IM-9 세포에 특이적으로 결합하는 6개의 Fab 단클론 항체를 선별하였다. 이들을 IM-L1-1, IM-L1-B, IM-L1-C, IM-L2-D, IM-L6-E, IM-L8-G 라 명명하였다(도 1). 상기 6개의 Fab 클론들의 항원 결합 특이성을 ELISA를 이용하여 확인하였다.
모든 재조합 단백질 항원은 R&D Systeme(USA)로부터 구입하였고, ELISA는 통상의 방법으로 수행하였다(Song et al., 2009). 재조합 융합 단백질인 CD23a, Ep-CAM-Fc, c-Met-Fc, CD40-Fc, CD33-Fc을 MaxiSorb ELISA 플레이트에 10㎍/ml 농도로 코팅하였으며, 음성 대조군(Negative cntrol) 항원인 BSA(Bovine serum albumin)도 코팅하였다. E. coli Fab 클론의 액체 배양을 통해 준비된 수용성 Fab-pIII 융합 분자를 각각의 웰에 첨가하였다. HRPO(horseradish peroxidase)가 컨쥬게이션된 염소-항-인간 kappa 경사슬 항체(Sigma-Aldrich) 를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 3,3', 5,5'-tetramethyl benzidine (TMB) 기질 (Sigma-Aldrich) 을 첨가하여 항원 특이적 항체의 결합력을 확인하였다. 450nm 흡광도에서 ELISA reader(Model-550, Biorad, USA)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 4개의 Fab 클론(IM-L1-A, IM-L1-B, IM-L1-C 그리고 IM-L2-D)은 어떤 항원과도 반응하지 않았다. IM-9 세포 용해물을 이용한 웨스턴블랏에서도 특정 결합력이 보이지 않는 것을 통해 각각의 타겟의 에피톱의 입체형상 부분을 인식하는 것을 확인하였다(데이터 나타내지 않음). 그러나 ELISA를 통해 2개의 Fab 클론(IM-L6-E, IM-L8-G)이 CD23 항원에 특이적으로 결합하는 것을 알 수 있었다.
1-3: IM -9 세포의 표면에 발현되는 CD23 에 특이적으로 결합하는 IM - L6 -E 및 IM-L8-G 클론의 선별
이들의 CD23에 대한 결합특이성을 확인하기 위해 CD23를 높은 수준으로 발현하는 SKW6.4 세포와 CD23를 굉장히 낮은 수준으로 발현하는 즉, CD23 음성(negative) 세포를 이용하여 유세포분석(FACS)를 수행하였다(도 3). 검은색 부분이 항체의 결합력을 나타내는 형광 시그널을 나타내며 흰색 부분은 2차 항체(FITC가 컨쥬게이션된 염소-항 인간 kappa)만을 처리한 형광 시그널을 나타낸다. Positive 컨트롤 항체인 쥐-항-CD23 단클론 항체는 SKW6.4 세포에서는 아주 강한 형광 시그널을 나타냈고, Raji 세포에서는 굉장히 약한 형광 시그널을 Ramos 세포에서는 어떠한 결합력도 보이지 않았다. 수용성 IM-L6-E, IM-L8-G Fab 분자 모두 마우스-항-CD23 단클론 항체와 같은 패턴을 나타냄을 확인하였으며 이를 통해 IM-L6-E 와 IM-L8-G Fab 분자가 세포 표면에 발현되는 CD23 단백질에 대한 결합특이성을 확인하였다. 이때 형광 시그널이 약한 이유는 항체의 낮은 친화력 또는 수용성 Fab-pIII 분자의 낮은 농도 때문이다.
2차 항체 라이브러리의 제작 및 경사슬 셔플링( light chain shuffling )에 의한 IM - L6 -E 및 IM - L8 -G Fab 의 친화도 성숙
2-1: 2차 항체 라이브러리의 제작
경사슬 최적화를 위해 IM-L6-E 와 IM-L8-G 의 중사슬을 1.4 x108 의 다양성을 갖는 인간 나이브(naive) kappa 경사슬 repertoires로 구성된 HuNL-D3 서브라이브러리에 셔플 하였다(Hur et al ., 2010 ; Hur et al ., 2010).
IM-L6-E 와 IM-L8-G 의 각각의 두번째 항체 라이브러리를 구축하였다. 두번째 항체 라이브러리는 기존에 보고된 DVS-III (Hoogenboom et al., 2000 ; Hur et al., 2010)를 이용하여 구축하였다. IM-L6-E 와 IM-L8-G Fab 항체의 VH 유전자를 내재하고 있는 재조합 pHg3f1-2 파아지미드 벡터를 SfiI 제한 효소를 처리하여 350bp VH 유전자를 획득하고, DVS-III pHg3A-3 플라스미드 벡터에 클로닝 한 후 E. coli TG1 세포에 형질전환시켰다. 형질전환된 세포에 HuNL-D3 라이브러리(Hur et al., 2010)에서 얻은 재조합 pLf1T-3 파아지미드를 형질전환시켜 2xYT/AT 배지에서 27℃, 8시간 동안 배양하였다. Ex12 헬퍼 파지를 이용하여 재조합 파지를 증폭한 후, PEG/NaCl 침전을 통해 재조합 파지를 획득하였다. 재조합 CD23 단백질이 고정된 MaxiSorb ELISA plates (Nunc, Denmark)를 이용하여 바이오 패닝을 수행하였다.
2-2: CD23 에 특이적으로 결합하는 Fab 클론의 선별
패닝이 끝난 후 각각의 라이브러리에서 24개의 E. coli 클론을 부작위로 선별하여 E. coli 액체 배양을 통해 수용성 Fab-pIII 분자를 준비하였다.
수용성 Fab-pIII 분자 및 수용성 Fab 분자를 준비하기 위해, DVS-II 를 내재한 E. coli TG1 세포에 아라비노오스(arabinose)(Sigma-Aldrich, USA) 와 isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, Sigma-Aldrich)를 각각 0.02 %, 0.1 mM 농도로 첨가하여 (Joo et al., 2008), 기존에 보고된 방법 (Song et al., 2009) 으로 주변세포질 추출물(periplasmic extract)을 획득하여 수용성 Fab-pIII 단백질을 생산하였다. 수용성 Fab 단백질은 Fd (VH+CH1) 부위를 pFdEx 플라스미드 (IG Therapy Co.) 벡터에 클로닝 한 후 E. coli TG1 세포에 형질전환시켜 2xYT/AT 배지에서 log phase 까지 배양한 후 아라비노오스와 IPTG를 각각 0.002% (V/V), 0.1mM(W/V) 농도로 첨가하여 27℃에서 15시간 동안 배양 한 후, 항-인간 IgG(Fab')2 항체(Pierce, USA)가 컨쥬게이션되어있는 CNBr-활성화 세파로오스 (CNBr-activated sepharose, Amersham-Pharmacia, Sweden)를 이용하여 정제하였다 (Hur et al ., 2010).
CD23에 특이적으로 결합하는 Fab 클론을 선별하기 위해 CD23, BSA 단백질을 이용하여 monoclonal ELISA를 수행하였다(도. 4). IM-L6-E 에서는 22개의 Fab 클론을 IM-L8-G 에서는 16개의 Fab 클론이 CD23 단백질에 특이적인 결합력을 보였다. Positive Fab 클론의 선별을 위해 VL 유전자를 DNA 분석을 한 결과 IM-L6-E 는 8개, IM-L8-G에서는 3개로 각각의 VH 와 짝을 이루는 VL 을 확인하였다. IM-L6-E에서 선별된 8개의 항체는 각각 IM-L6-1, IM-L6-3, IM-L6-5, IM-L6-9 그리고 IM-L6-13, IM-L6-14, IM-L6-18, IM-L6-19로 명명하였으며 IM-L8-G에서 선별된 3개의 항체는 각각 IM-L8-14, IM-L8-20, IM-L8-23으로 명명하였다(표 2). 선별된 항체의 V subgroup과 germline counterparts는 높은 상동성을 갖는 것을 확인하였다(표 3). 인간 V subgroup과 germline counteroarts 사이의 차이는 나이브(naive) HCDR1-HVDR2 와 niave HCDR3를 통해 제작한 HuDVFab-8L의 경사슬 레파토아와 나이브(naive) kappa L-CDR1 과 나이브(naive) L-CDR2-3를 통해 제작된 HuNL-D3의 경사슬 레파토아 때문이다(Hur et al ., 2010).
2-3: 고친화도를 가진 클론의 선별
Fab 클론들의 상대적 친화도를 확인하기 위해 티오시안산염(thiocyanate)용출 (Macdonald et al., 1988) 방법을 이용하여 ELISA를 수행하였다. 수용성 Fab 분자들을 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.001% tween 이 첨가된 PBS (PBST)로 세척한 후, 0.1M 인산화 완충액 (pH 6.0)에 티오시안산암모늄(ammonium thiocyanate)을 0 M ~ 2 M 의 농도가 되게 조제하여 각 웰에 첨가 하고 20분동안 상온에서 반응시켰다. PBST를 이용하여 2회 세척하고 상기 ELISA 실험에서 동일한 이차 항체를 첨가하여 결과를 분석하였다.
CD23 단백질과 Fab 단편의 결합 친화도를 분석하기 위해 BIAcore X biosensor (BIAcore AB, Sweden)를 25 ℃에서 이용하여 분석하였다. CM5 sensor chip 의 carboxymethylated 덱스트란(dextran) 표면에 약 9000 response uinits (RU) 값으로 CD23 단백질을 고정하고 IM-L6-5 Fab 분자의 순차적인 농도를 180초 동안 1분에 30㎕의 속도로 주입하였다. 10 mM glycine (pH 2.5)을 1분에 30 ㎕의 속도로 주입하여 Fab CD23 단백질에 결합하는 Fab 분자를 제거하여 Dissociation (koff) 및 association (kon) 값을 획득하였으며, 이를 종합하여 친화도 (K D) 를 확인하였다. IM-L6-5 Fab 항체에 의한 CD23 단백질에 대한 리간드 (IgE, CD11b/CD18 and CD11c/CD18) 결합의 저해를 분석하기 위해 120초 동안 1분에 20㎕의 속도로 200 nM IM-L6-5 Fab 분자를 주입하였다. 그 후 100 nM의 IgE, CD11b/CD18 or CD11c/CD18 을 120초 동안 1분에 20㎕로 주입하여 측정하였다.
이 방법에 의하면 CD23 단백질에 대한 결합이 50% 가 되는 NH4SCN 농도를 통해 항체들 간의 상대적 친화력을 알아볼 수 있는 것이다(표 3). IM-L6-E 와 IM-L8-G는 각각 0.99 M, 0.47 M을 나타냈다. IM-L6-E에서 얻은 항체 중 IM-L6-5(IC50 < 2 M) 이 IM-L6-E 보다 높은 친화도를 갖는 것을 확인하였으며 이를 통해 경사슬 최적화가 성공적으로 이루어짐을 알 수 있었다. IM-L8-G 에서 얻은 항체 중 IM-L8-14(IC50 < 0.66 M) 클론이 IM-L8-G 보다 높은 친화도를 갖음을 확인하였다. 따라서 가장 높은 IC50 값을 갖는 IM-L6-5 Fab 클론을 선택하여 결합 친화도를 확인하기 위해 BIAcore를 수행하였다. 정제된 IM-L6-5 Fab 클론을 CM-5 센서 칩에 고정된 CD23에 흘린 결과 4.14x104 M-1s- 1 의 k on 값과 6.79x10-4 s- 1 의 k off 값을 통해 16 nM의 dissociate constant (K D) 얻을 수 있었다. 이것은 IM-L6-5 Fab 단클론 항체가 CD23에 대한 IgE 의 결합력인 106 ~ 107 M-1 (Fournier et al., 1992) 보다 10~100 배 높은 수준으로 CD23에 결합하는 것을 뜻한다.
3-1: IM - L6 -5 Fab 의 특이적 결합력
경사슬 셔플링은 Fab 항체의 항원에 대한 쉬프팅(shifting)을 일으키므로 본 연구에서는 FACS와 ELISA를 수행하여 Fab IM-L6-5 클론의 특이적 결합력을 확인하였다(도 1 내지 3). 그 결과 IM-L6-E와 같은 항원 특이적 결합력을 확인할 수 있었다(데이터 나타내지 않음). IM-L6-5 Fab 단클론 항체가 유도된 형태인 CD23 (CD23b) 단백질에 결합하는지를 확인하기 위해 U937 세포를 이용하여 FACS를 수행하였다. U937 세포는 일반적으로 CD23 단백질을 발현하지 않는 음성(negative) 세포로 알려져 있지만 이 세포에 IL-4를 첨가하였을 시 CD23 단백질이 발현된다(Ouaaz et al ., 1993 ; So et al ., 2002). IL-4를 첨가하지 않은 U937 세포에는 IM-L6-5 Fab 항체가 결합하지 않은 반면 (도 5의 왼쪽, 검은 부분) IL-4를 처리한 곳에서는 단클론 항체가 결합된 것을 확인하였으며(도 5의 오른쪽, 검은 부분), 이것은 IM-L6-5 Fab 단클론이 CD23b에 결합된 것을 의미한다. 마우스 항-CD23 단클론 항체 역시 이와 같은 패턴을 확인할 수 있었다(데이터 나타내지 않음).
3-2: 경쟁적 ELISA 및 SPR 분석
CD23 단백질과 인간 IgE 결합을 IM-L6-5 Fab 항체가 저해하는지를 확인 하기 위해 경쟁적 ELISA 와 SPR 분석을 수행하였다(도 6A 및 B). 경쟁적 저해 ELISA는 재조합 CD23 단백질을 microtiter 플레이트에 코팅하여 기존의 ELISA 방법을 기본바탕으로 수행하였다. 쥐-항-CD23 단클론 항체(R&D Systems) 와 IM-L6-5 Fab , negative 컨트롤인 상피 세포성 성장인자 수용체 (EGFR) (IG Therapy Co., unpublished)에 특이적으로 결합하는 EG-L4 Fab를 농도 별로 각각의 웰에 첨가하였다. 세척한 후, 인간 IgE를 각각의 웰에 첨가 한 다음, 4℃에서 2시간 동안 반응 시켰다. 단백질에 대한 항체의 결합은 분석하기 위해 HRPO가 컨쥬게이션된 염소-항 인간 IgE 항체 (BETHYL, USA)를 사용하였고 상기 실험과 같은 방법으로 TMB 기질을 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
경쟁적 ELISA 결과 정제된 IM-L6-5 Fab 의 50 nM 농도부터 CD23에 대한 인간 IgE의 결합을 방해하는 것을 알 수 있었다. 저해 효과는 IM-L6-5 농도에 따라 증가되는 것을 확인 하였다(도 6A). CD23에 K D 85 pM (데이터 나타내지 않음) 의 높은 친화도를 갖는 쥐-항-CD23 단클론 항체의 저해 효과는 12.5 nM부터 나타났다. IM-L6-5 에 의한 CD23 과 IgE의 결합 저해 효과를 SPR 분석을 통해 확인 하였다(도 6B). CM5 센서 칩에 고정된 CD23 단백질에 대한 IgE의 결합력이 200 nM IM-L6-5 Fab 에 의해 저해되는 것을 학인 하였으며 이는 IM-L6-5 Fab 가 결합하는 CD23 단백질의 에피톱 부위가 IgE가 결합하는 부위와 가까이 있다는 것을 나타낸다. CD23 단백질은 4개의 에피톱 (A-D)을 지닌다. 이중 A와D는 IgE 결합부위와 떨어진 곳을 나타내며 B와C는 IgE 결합부위 내에 있거나 가까이에 있는 곳을 나타낸다(Wakai et al ., 1993). IM-L6-5 Fab는 B 혹은 C 부위를 인식하기 때문에 B 세포에서 IL-4로 인해 유도되는 IgE의 합성을 저해할 수 있을 것이다(Wakai et al ., 1993).
HuDVFab-8L 라이브러리로부터 세포 패닝을 이용하여 선별된 인간 중사슬 가변부위 유전자의 아미노산 배열
Fab 클론 H-CDR 1 H-CDR 2 H-CDR 3
IM-L6-E GYYWS(서열번호1) EINYHSGSTNYNPSLKS(서열번호2) DWETAYG.ALGYY...GL(서열번호3)
IM-K8-G DTYMH RIDPANGNSKYVPKFQG DWDYGD.........YVF
HuNL-D3 라이브러리를 이용하여 경사슬 셔플을 통해 선별된 인간 경사슬 가변부위 유전자의 아미노산 배열
Fab 클론 L-CDR 1 L-CDR 2 L-CDR 3
IM-L6-E RASQSISS.YLN AASSLQS QQSYSTPPYT
IM-L6-1 RASQSVSSSYLA GASSRAT QQTYSTPPIT
IM-L6-3 RASQNIRN.YLS GASSLQS QQSYSAP.PT
IM-L6-5 RASETVSSRQLA
(서열번호4)		 GASSRAT
(서열번호5)		 QQSYSLP.WT
(서열번호6)
IM-L6-9 RASQSIDSDYLA GASNRAP QQYYSYPANT
IM-L6-13 RASQSIDSDYLA AASNRAL QQSYSIPY.T
IM-L6-14 RASQSVSN.NLA GASTRAT QQSYSIPY.T
IM-L6-18 RASQSVSSSYLA GASSRAT QQSYSSP.QT
IM-L6-19 RASQSISS.FLS GASRLES QQSFSTP.YT
IM-L8-G QASDKINN.YLN DASNLQT QQYNSYPYAT
IM-L8-14 RASQSVSS.YLA DASNRAT QQYGSLPI.A
IM-L8-20 RASQSVSGSYLA GASSRAT QQYGSLPI.A
IM-L8-23 RASQSISS.YLN AASSLQS QQYYSIPIT.
(점(dot)은 상응하는 아미노산이 없음을 나타냄)
Fab 클론 인간 VH
서브그룹		 homologous germline VH L chain variants 인간 VL
서브그룹		 homologous germline VL IC50 (M)*



IM-L6-E


Ⅱ


IGHV4-34		 L6 Ⅰ IGKV1-6 0.99
IM-L6-1 Ⅱ IGKV3-NL5 0.46
IM-L6-3 Ⅰ IGKV1-6 0.84
IM-L6-5 Ⅲ IGKV3-NL5 <2
IM-L6-9 Ⅲ IGKV3-NL5 0.43
IM-L6-13 Ⅲ IGKV3-NL5 0.2
IM-L6-14 Ⅲ IGKV3-15 0.6
IM-L6-18 Ⅲ IGKV3-NL5 0.48
IM-L6-19 Ⅱ IGKV1-6 0.35


IM-L8-G

Ⅰ

IGHV1-f
 L8 Ⅰ IGKV1-33 0.47
IM-L8-14 Ⅲ IGKV3-NL5 0.66
IM-L8-20 Ⅲ IGKV3-NL5 0.4
IM-L8-23 Ⅰ IGKV3-33 0.35
*IC50은 CD23 단백질에 대한 항체 단편의 50% 결합 감소를 일으키는 NH4SCN의 mol 농도(molar concerntration).
한국생명공학연구원 KCTC11837 20101231
<110> IG Therapy <120> A human anti-CD23 Fab antibody and a Pharmaceutical composition for treating tumor comprising the same <130> IPDB-40098 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Ile Asn Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15 Ser <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Trp Glu Thr Ala Tyr Gly Ala Leu Gly Tyr Tyr Gly Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Ala Ser Glu Thr Val Ser Ser Arg Gln Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Gln Ser Tyr Ser Leu Pro Trp Thr 1 5

Claims (14)

  1. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3로 표시되는 가변영역을 포함하는 CD23에 대한 단일 클론 항체 Fab 부위의 중사슬을 암호화하는 유전자.
  2. 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6로 표시되는 가변영역을 포함하는 CD23에 대한 단일 클론 항체 Fab 부위의 경사슬을 암호화하는 유전자.
  3. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함하는 벡터.
  4. 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6을 포함하는 벡터.
  5. 제 3항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  7. 제 4항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  9. 제 3항 및 제 4항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 숙주세포는 대장균인 기탁번호 KCTC 11837BP인 숙주세포.
  12. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 중사슬 가변영역을 함유하고, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 경사슬 가변영역을 함유하는 CD23에 대한 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편(Fab).
  13. 제 12항의 인간 단일클론 항체 또는 그의 항원결합 단편을 함유하는 종양 치료용 약학 조성물.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 종양은 백혈병인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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