KR20120081762A - 폴리디아세틸렌 기반 바이오센서 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리디아세틸렌 기반 바이오센서에 관한 것으로, 보다 상세하게는 마이크로비드에 폴리디아세틸렌 베지클이 고정되어 원심분리를 통해 간단히 분리될 수 있고, 상기 베지클의 표면에 반응기 또는 기능성 리간드를 고정하여 표적 물질을 용이하게 검출할 수 있으며, 상기 반응기 또는 기능성 리간드로 유전자 변형 작물의 특이 단백질에 대한 항체를 사용함으로써 유전자 변형 작물을 간단히 판별할 수 있다.

Description

폴리디아세틸렌 기반 바이오센서{Polydiacetylene based biosenser}
본 발명은 마이크로비드와 결합된 폴리디아세틸렌의 색 전이를 통해 표적 단백질을 용이하게 검출할 수 있는 폴리디아세틸렌 기반 바이오센서에 관한 것이다.
공액 폴리디아세틸렌(Conjugated polydiacetylene, PDA)은 그것의 독특한 광학적 특징들로 인해 스마트 감지 소재로서 집중적으로 조사되어 왔다. 리포좀 내에 이중층으로서 공간이 있게 정렬된 단분자의 디아세틸렌 단량체는 1,4-부가를 통해 UV 조사 시 광중합을 겪는다. 결과적으로, π-결합된 중합체 사슬은 향상된 안정성과 육안으로 보이는 베지클의 푸른색을 제공한다.
상기 베지클은 외부 자극, 예를 들어, 열, pH 및 기계적 스트레스가 가해질 때 푸른색의 붉은색으로의 2색의 특징을 나타낸다. 생물학적 인지 사건들에 의해 유도된 PDA의 색 전이는 병원성 박테리아, 바이러스, 독소 및 많은 다른 생물학적으로 관련된 흥미있는 분자들의 검출에 이용되어 왔다. 디아세틸렌 양친매성 화합물은 용액에 초음파 처리하여 자기-조립 콜로이드 입자들을 형성한 후 광중합을 통해 간단히 제조될 수 있다. 콜로이드 입자들은 표적 특이 리간드로 표면을 기능화한 후 표적 분자들의 존재 하에서 모니터하기 위한 센서 플랫폼으로서 쉽게 제조하고 널리 이용된다. PDA 베지클의 표면에 표적 분자들을 결합하는 사건은 PDA 베지클에서 중합체 사슬의 기하학에 영향을 주고, 푸른색의 붉은색으로의 색 변화에 의해 반영된다. 그러나, 콜로이드성 PDA 베지클의 단점은 콜로이드의 후 개질 작업, 예를 들어, 반응기 또는 기능성 리간드를 그들의 표면에 결합시키는 것은 미반응 화합물질로부터 PDA 콜로이드를 분리하거나 각 반응 단계에서 시약을 교환하기 위한 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 또는 투석(dialysis) 과정을 요구한다는 것이다.
이들 문제점들은 물리적 흡착, 비공유적 결합, 또는 공유반응을 통해 편평한 표면에 콜로이드성 PDA를 부착하여 해결될 수 있다. 그러나, 콜로이드성 PDA를 고체 표면에 고정하는 것은 2가 양이온들을 포함하는 것들을 포함하여 완충용액에 대한 PDA 반응을 감소시키는 단점이 있다.
한편, GMO(Genetic Modification Organism)는 작물 생산량을 향상시키기 위해 다른 종들로부터 다양한 유전적 특징들을 도입하여 많은 나라들에서 개발되고 상업화되었다. 유전자 변형 작물들에 널리 이용된 가장 일반적인 유전적 특징들로 공업용 제초제 저항성 및 식물 내 살충 단백질의 생성 등이 있다. 특히, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제(PAT)는 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes) 유래의 pat 코딩 서열에 의해 암호화 되며, 옥수수, 목화, 벼, 유채꽃 및 콩 등의 다양한 작물의 글루포시네이트-암모늄 저항성 식물 변이종들에서 발견된다. Pat 코딩 서열은 발현을 위해 적당한 프로모터 및 터미네이터에 결합되고 식물 게놈에 도입된다. PAT 단백질은 글루포시네이트-암모늄 제초제의 활성 이성질체인 L-포스피노트리신을 아세틸화 하며, 비 선택적인 제초제의 후발(post-emergent) 적용에 대한 형질전환 식물의 저항성을 유발한다.
상기 GMO(Genetic Modification Organism) 및 GM 식품의 조절을 위한 표지 시스템 및 안전 평가 시스템을 효과적으로 관리하기 위하여 간단하고 정확한 GMO 검출 방법에 대한 요구가 증가하고 있다.
본 발명의 목적은 간단한 원심분리를 통해 분리가 용이한 표면 개질된 폴리디아세틸렌 기반 바이오센서를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리디아세틸렌 기반 바이오센서를 이용하여 표적 단백질을 더욱 민감하고 효과적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리디아세틸렌 기반 바이오센서에 의한 표적 단백질의 검출을 통해 유전자 변형 작물을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로비드; 및
상기 마이크로비드에 고정된 폴리디아세틸렌(polydiacetylene) 베지클(vesicle)을 포함하는 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한 폴리디아세틸렌(polydiacetylene) 베지클을 마이크로비드 표면에 고정하는 단계를 포함하는 본 발명의 복합체의 제조방법을 제공한다.
한 가지 실시예에 있어서, 상기 폴리디아세틸렌 베지클을 마이크로비드에 고정하는 단계는
디아세틸렌 베지클을 마이크로비드에 고정하는 단계; 및
상기 베지클을 중합하는 단계를 포함할 수 있다.
한 가지 실시예에 있어서, 상기 디아세틸렌 베지클을 마이크로비드에 고정하는 단계의 디아세틸렌 베지클은 그 표면에 반응기 또는 기능성 리간드가 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명은 또한
마이크로비드;
상기 마이크로비드에 고정된 폴리디아세틸렌(polydiacetylene) 베지클(vesicle); 및
상기 폴리디아세틸렌 베지클에 결합된 반응기 또는 기능성 리간드를 함유하는 복합체를 포함하는 바이오 센서를 제공한다.
본 발명은 또한
마이크로비드;
상기 마이크로비드에 고정된 폴리디아세틸렌(polydiacetylene) 베지클(vesicle); 및
상기 폴리디아세틸렌 베지클에 결합된 반응기 또는 기능성 리간드를 함유하는 복합체를 포함하는 단백질 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 복합체와 시료를 반응시키는 단계를 포함하는 목적물질의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 복합체와 시료를 반응시키는 단계를 포함하는 유전자 변형 작물의 판별 방법을 제공한다.
본 발명은 마이크로비드와 결합되어 간단한 원심분리를 통해 쉽게 분리할 수 있는 표면 개질된 폴리디아세틸렌 복합체를 제공할 수 있다.
본 발명의 마이크로비드/폴리디아세틸렌 복합체는 시료 용액에서 자발적으로 분산되어 표적 물질을 신속히 검출할 수 있다.
본 발명의 마이크로비드/폴리디아세틸렌 복합체는 표적 물질로 유전자 변형 작물에 특이적으로 발현하는 단백질을 효과적으로 검출함으로써 간단하고 정확하게 유전자 변형 작물을 판별할 수 있다.
도 1은 본 발명의 PDA 베지클-실리카 비드 결합체 바이오센서에 의한 PAT 단백질의 비색 검출의 모식도이다.
도 2는 아민-코팅된 실리카 비드에 PDA 베지클의 고정 및 이후 항-PAT 항체로 기능화된 본 발명의 PDA 베지클을 나타낸 것이다.
도 3은 PDA 베지클, 실리카 비드 및 본 발명의 PDA 베지클-실리카 비드 결합체의 DLS 측정에 의한 크기 분포를 나타낸 것이고(A). 80℃에서 5분 동안 열처리 후 PDA 베지클과 결합된 실리카 비드(a, b)와 PDA 베지클이 없는 실리카 비드(c, d)의 투과 및 형광 현미경 사진도를 나타낸 것이고, 붉은색 형광은 PDA 베지클-결합된 실리카 비드에서만 측정한 것이다(b).
도 4는 UV 조사(b), 스핀 다운(c) 및 열처리(d) 후 본 발명의 PDA 베지클-실리카 비드 결합체(1)를 포함하는 용액과 결합하지 않는 PDA 베지클과 실리카 비드의 혼합물(2)의 색깔 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 PAT 단백질의 농도별(0-2 μM) 반응에서 유리 PDA 베지클 (a) 및 본 발명의 PDA 베지클-실리카 비드 결합체(b, c 및 d)를 포함하는 용액의 색 변화를 나타낸 것으로, (a)는 항-PAT-PDA 베지클; (b)는 항-PAT-PDA(TCDA) 베지클-실리카 비드 결합체; (c)는 항-PAT-PDA(TCDA:DMPC=4:1) 베지클-실리카 비드 결합체; (d)는 BSA 단백질과 항-PAT-PDA (TCDA:DMPC=4:1) 베지클-실리카 비드 결합체의 반응결과이다.
도 6은 다른 베지클 조성 및 분석물질 농도에 따른 PDA 베지클 및 본 발명의 PDA 베지클-실리카 비드 결합체로부터 붉은색의 상대 강도 플랏을 나타낸 것이다.
도 7은 PAT 및 BSA 단백질의 농도별 반응에서 본 발명의 PDA 베지클-실리카 비드 결합체로부터 붉은색 형광의 정규화 강도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 마이크로비드; 및
상기 마이크로비드에 고정된 폴리디아세틸렌(polydiacetylene) 베지클(vesicle)을 포함하는 복합체에 관한 것이다.
본 발명의 복합체는 마이크로비드에 폴리디아세틸렌 베지클이 고정되어 있는 형태로서, 기존의 폴리디아세틸렌 베지클의 경우 기존의 초음파 처리를 통해 마이크로미터 이하의 크기를 가지며 원심분리에 의해 용이하게 분리하기 어렵고, 상기 베지클의 표면에 반응기 또는 기능성 리간드를 결합시킨 후 미반응 화학물질로부터 이들을 분리하기 어려우며, 고체 표면에 상기 베지클을 고정하여 반응기 또는 기능성 리간드를 결합시킬 경우, 완충용액, 특히 2가 양이온을 포함하는 완충용액에 대한 폴리디아세틸렌의 반응을 감소시키는 단점이 있는 반면, 본 발명의 마이크로비드/폴리디아세틸렌 베지클의 복합체는 표면 개질 후에도 원심분리를 통해 쉽게 침전될 수 있어 분리가 용이하므로 종래 기술의 단점을 해소하는 장점을 갖는다.
따라서, 본 발명의 복합체는 표적 물질과 반응 시 육안으로 관찰할 수 있는 폴리디아세틸렌 베지클의 색 전이(푸른색의 붉은색으로의 변화)를 통해 별도의 분석 장비 없이 진단 및 바이오센싱 적용이 가능한 용액 기반 콜로이드성 센서 또는 고체 표면에 부착된 형태의 센서로 사용할 수 있다.
상기 마이크로비드는 바람직하게는 직경이 1 내지 10 ㎛이며, 실리카(silica), 또는 유리(glass)를 포함하는 무기물; 금속(metal), 금속산화물 또는 자성물질을 포함하는 금속; 아가로스(agarose), 폴리스티렌(polystyrene), 라텍스(latex), 스티렌비닐톨루엔 중합체(styrene-vinyltoluene), 또는 폴리비닐톨루엔(polyvinltoluene)을 포함하는 고분자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한, 상기 마이크로비드는 폴리디아세틸렌 베지클과 화학적 결합이 가능하도록 기능기로 표면이 개질된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 아민기가 코팅된 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, EDC/NHS 하에서 아민기로 코팅된 실리카 마이크로비드와 폴리디아세틸렌 베지클을 반응시키면, EDC는 폴리디아세틸렌의 카르복실기와 반응하여 아민-반응성(석신이미딜) 중간체를 형성하고, NHS는 상기 아민-반응성 중간체를 아민-반응성 에스테르로 전환하여 상기 중간체를 안정화하여 실리카 마이크로비드의 아민기와 카보디이미드(carbodiimide) 결합을 통해 실리카 마이크로비드에 폴리디아세틸렌 베지클을 고정시킬 수 있다.
또한, 상기 폴리디아세틸렌 베지클은 직경이 100 내지 500 nm이며, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 중합체, 또는 상기 화학식 1의 화합물과 인지질(phospholipid)의 복합물로부터 유도된 것을 사용할 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00001

상기 식에서,
R1는 탄소수 1 내지 30의 알킬기이고,
R2는 탄소수 1 내지 30의 알킬렌기이며,
R3는 에폭시기, 아지리딘기, -OH, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -CON3, CH2C(NH2+)OCH3, -OP(O2-)OH, 또는 -SH를 나타낸다.
본 발명의 화합물의 치환체 정의에 사용된 용어는 하기와 같다.
"알킬"은 다른 기재가 없는 한, 탄소수 1 내지 30의 직쇄 또는 분지쇄 또는 고리형의 포화 탄화수소를 가리킨다. C1-30 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 이소헥실, 이소헵틸, 이소옥틸, 이소노닐 및 이소데실이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다. 또한 상기 알킬은 "시클로알킬"을 포함한다. 상기 시클로알킬은 다른 기재가 없는 한, 탄소수 3 내지 12의 비방향족, 포화 탄화 수소환으로서 단일환 및 융합환을 포함한다. C3-12 시클로알킬의 대표적 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 및 시클로옥틸이 포함되나, 이들에 제한되지 않는다.
"알킬렌"은 상기 알킬로부터 유도된 2가의 유기로서, 바람직한 탄소수의 범위는 상기 알킬과 동일하다.
상기 화학식 1의 화합물은 구체적으로,
R1는 탄소수 3 내지 18의 알킬기이고,
R2는 탄소수 3 내지 18의 알킬렌기이며,
R3는 -COOH 또는 -COH를 나타내는 화합물일 수 있다.
보다 구체적으로, 화학식 1의 화합물은
R1는 탄소수 6 내지 16의 알킬기이고,
R2는 탄소수 4 내지 10의 알킬렌기이며,
R3는 -COOH를 나타내는 화합물일 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 양쪽성 성질에 의해 수용액과 계면을 형성하므로 리포좀, 마이셀, Langmuir Blodgett 또는 Langmuir Schaeffer 필름과 같이 자기 조립이 가능하다. 자기 조립 시, 디아세틸렌 단량체들 사이의 거리가 충분히 좁으면 254 nm의 UV 빛으로 고분자화될 수 있는데, 이때 새로 형성된 고분자 결합에 의해 파란색을 띠게 된다. 여기서 고분자 결합의 색은 결합에 참여하는 π-컨쥬게이션(conjugation)과 밀접한 관련이 있으며, 외부 자극에 의해 고분자의 단량체들의 재배열이 일어나 π-축합이 짧아지면서 자극의 정도에 따라 점차 붉은색으로의 색 전이 현상을 보인다.
상기 폴리디아세틸렌 베지클은 구조 내에 하기 화학식 2로 표시되는 반복단위를 포함할 수 있다:
[화학식 2]
Figure pat00002

상기 식에서,
R1는 탄소수 1 내지 30의 알킬기이고,
R2는 탄소수 1 내지 30의 알킬렌기이며,
R3는 에폭시기, 아지리딘기, -OH, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -CON3, CH2C(NH2+)OCH3, -OP(O2-)OH, 또는 -SH를 나타내고,
n은 정수를 나타낸다.
또한, 폴리디아세틸렌 베지클은 광중합할 수 없는 인지질을 더 포함할 수 있다. 상기 인지질은 베지클의 형태, 크기 등에 영향을 주지 않으면서 외부 자극 시 색 전이에 대한 민감도를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 디아세틸렌 단량체로 된 중합체에 비해 디아세틸렌 단량체와 인지지의 혼합 중합체의 색 전이에 대한 민감도가 더 높다.
상기 인지질은 1,2-디미리스토일 포스파티딜 콜린(1,2-dimyristoyl phosphatidyl choline), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylserine), 포스파티딕엑시드(phosphatidic acid), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포티오에탄올(1,2-dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphothioethanol), 또는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-바이오티닐(1,2-dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(Biotinyl))등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 인지질은 폴리디아세틸렌 베지클에 대하여 1 내지 40 몰%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내일 경우, 외부 자극 시 베지클의 색 전이에 대한 민감도를 높일 수 있다.
또한, 상기 폴리디아세틸렌 베지클은 표면이 반응기 또는 기능성 리간드로 개질된 것을 사용할 수 있다.
상기 반응기 또는 기능성 리간드는 표적 분자와 결합할 수 있는 항체, 앱타머, DNA 프로브, RNA 프로브e, PNA 프로브, 바이오틴, 또는 단백질 기반의 수용체 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 항체로 유전자 변형 작물의 특이 마커인 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제(PAT), 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신테이즈(CP4EPSPS), 바네이즈(Ms8), 또는 크리스탈 단백질(Crystal protein((Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2A, Cry 1C, Cry1F, Cry3B, Cry9C, 또는 Cry3Bb1) 등에 특이적인 단클론 또는 다클론 항체일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 폴리디아세틸렌 베지클이 고정된 마이크로비드는 직경이 1 내지 10 ㎛ 일 수 있다.
본 발명은 또한 폴리디아세틸렌(polydiacetylene) 베지클을 마이크로비드 표면에 고정하는 단계를 포함하는 본 발명의 복합체의 제조방법에 관한 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 폴리디아세틸렌 베지클은 화학적 결합을 통해 마이크로비드에 고정될 수 있다.
이를 위해, 마이크로비드는 표면이 작용기로 개질된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 작용기로 아민기를 사용할 수 있다.
상기 마이크로비드의 표면 개질은 통상의 방법에 따라 실시할 수 있어 특별히 제한하지는 않는다.
상기 폴리디아세틸렌 베지클과 마이크로비드의 화학적 결합은 바람직하게는 카보디이미드(carbodiimide) 결합일 수 있다.
EDC/NHS 하에서 아민기로 코팅된 마이크로비드와 폴리디아세틸렌 베지클을 반응시킬 경우, EDC/NHS는 폴리디아세틸렌 베지클의 카르복실산을 석신이미딜 활성 에스테르로 전환하며, 상기 석신이미딜 활성 에스테르는 마이크로비드의 아민기와 카보디이미드 결합을 통해 폴리디아세틸렌 베지클이 고정되도록 한다.
일 구체예에 있어서, 폴리디아세틸렌 베지클을 마이크로비드에 고정하는 단계는
디아세틸렌 단량체를 함유하는 베지클을 마이크로비드에 고정하는 단계; 및
상기 베지클을 중합하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 디아세틸렌 베지클은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 상기 화학식 1의 화합물과 인지질의 혼합물로부터 제조될 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00003

상기 식에서,
R1는 탄소수 1 내지 30의 알킬기이고,
R2는 탄소수 1 내지 30의 알킬렌기이며,
R3는 에폭시기, 아지리딘기, -OH, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -CON3, CH2C(NH2+)OCH3, -OP(O2-)OH, 또는 -SH를 나타낸다.
상기 화학식 1의 화합물은 구체적으로, R1는 탄소수 3 내지 18의 알킬기이고,
R2는 탄소수 3 내지 18의 알킬렌기이며,
R3는 -COOH 또는 -COH를 나타낼 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 보다 구체적으로, R1는 탄소수 6 내지 16의 알킬기이고,
R2는 탄소수 4 내지 10의 알킬렌기이며,
R3는 -COOH를 나타낼 수 있다.
상기 인지질은 외부 자극 시 색 전이에 대한 민감도를 높이기 위해 사용될 수 있으며, 디아세틸렌 베지클에 대하여 1 내지 40 몰%로 포함될 수 있다.
상기 인지질의 종류는 전술한 바와 같다.
또한, 디아세틸렌 베지클은 마이크로비드에 고정하기 전에 상기 베지클 표면에 반응기 또는 기능성 리간드를 결합시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, EDC/NHS 하에서 디아세틸렌의 카르복실기를 석신이미딜 활성 에스테르로 전환시키고, 상기 활성화된 디아세틸렌 베지클과 항체를 반응시키면, 상기 석신이미딜 활성 에스테르와 펩티드 결합을 통해 항체가 가교될 수 있다. 항체가 결합된 디아세틸렌 베지클은 마이크로비드에 고정될 수 있다.
상기 디아세틸렌 베지클을 마이크로비드에 고정하는 방법은 화학적 결합을 통해 실시할 수 있으며, 예를 들어, 카보디이미드(carbodiimide) 결합을 통해 고정할 수 있다.
상기 화학적 결합을 위해 마이크로비드는 기능기로 표면 개질된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 아민기로 개질된 마이크로비드를 사용할 수 있으며, 상기 마이크로비드는 실리카 마이크로비드를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, EDC/NHS 하에서 아민기로 코팅된 실리카 마이크로비드와 디아세틸렌 베지클을 반응시키면, EDC/NHS는 디아세틸렌의 카르복실기를 석신이미딜 활성 에스테르로 전환하여 실리카 마이크로비드의 아민기와 카보디이미드(carbodiimide) 결합을 통해 실리카 마이크로비드에 디아세틸렌 베지클을 고정시킬 수 있다.
상기 단계를 거쳐 마이크로비드에 고정된 디아세틸렌 베지클은 중합과정을 거쳐 폴리디아세틸렌 베지클/마이크로비드의 복합체를 형성할 수 있다.
상기 중합은 자외선 조사를 통한 광중합일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 디아세틸렌 베지클의 중합은 마이크로비드에 고정 전 또는 후에 실시할 수 있으나, 폴리디아세틸렌 베지클의 원치 않는 붉은색으로의 전이 가능성을 배제하기 위해 디아세틸렌 베지클을 마이크로비드에 고정시킨 후 중합하는 것이 좋다.
상기 폴리디아세틸렌 베지클/마이크로비드의 복합체는 원심분리 과정을 통해 침전되어 쉽게 분리할 수 있다.
상기 원심분리는 500 내지 1000 g에서 3 내지 10 분 동안 실시할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 원심분리를 통해 분리된 폴리디아세틸렌 베지클/마이크로비드의 복합체는 완충용액에서 현탁되어 원심분리/재현탁의 과정을 수회 반복하여 미반응 화학물질을 제거할 수 있다.
상기 단계를 거쳐 제조된 폴리디아세틸렌 베지클/마이크로비드의 복합체는 직경이 1 내지 10 ㎛ 일 수 있다.
본 발명은 또한
마이크로비드;
상기 마이크로비드에 고정된 폴리디아세틸렌(polydiacetylene) 베지클(vesicle); 및
상기 폴리디아세틸렌 베지클에 결합된 반응기 또는 기능성 리간드를 함유하는 복합체를 포함하는 바이오 센서에 관한 것이다.
본 발명의 복합체는 표면에 반응기 또는 기능성 리간드가 결합된 폴리디아세틸렌 베지클이 마이크로비드에 고정된 형태로서 도 1에서와 같이, 표적 물질이 제공되면, 복합체의 표면에서 상기 표적 물질에 특이적인 반응기 또는 기능성 리간드가 표적 물질과 결합하면서 폴리디아세틸렌의 응집이 생긴다. 상기 응집은 폴리디아세틸렌 백본의 유의적인 틸팅을 유발하여 결합 길이를 효과적으로 감소시킨다. 이러한 폴리디아세틸렌의 π-π 밴드 갭에서의 변화는 폴리디아세틸렌 베지클의 광학적 특성에 영향을 미치게 된다. 즉, 푸른색이 붉은색으로의 색 전이를 나타내고, 이는 육안으로 관찰할 수 있다.
또한, 붉은색으로의 변화는 형광으로도 검출이 가능하다. 여기파장 540 nm, 방출파장 620 nm에서 표적 물질의 농도 의존적으로 형광 강도가 증가하므로 표적 물질을 선택적으로 검출할 수 있다.
이러한 색 변이의 정도를 수치화하면 표적 물질의 농도를 계산할 수 있다.
상기 반응기 또는 기능성 리간드는 표적 물질에 대한 특이성을 갖는 것일 수 있어, 표적 물질을 특이적이고, 선택적으로 검출할 수 있는 특징이 있다.
따라서, 상기 반응기 또는 기능성 리간드는 항체, 앱타머, DNA 프로브, RNA 프로브, PNA 프로브, 바이오틴, 또는 단백질 수용체 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 바이오 센서는 표적 물질을 검출하고자 하는 시료용액과 혼합하여 표적 물질의 유무 및 농도를 확인할 수 있는 통상의 키트로 제공될 수 있다.
본 발명은 또한
마이크로비드;
상기 마이크로비드에 고정된 폴리디아세틸렌(polydiacetylene) 베지클(vesicle); 및
상기 폴리디아세틸렌 베지클에 결합된 반응기 또는 기능성 리간드를 함유하는 복합체를 포함하는 단백질 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 단백질 검출용 조성물은 본 발명의 복합체 외에 완충용액을 포함할 수 있다. 완충용액의 종류 및 농도는 특별히 제한되지 아니하나, 상기 단백질 검출용 조성물의 적용 용도에 따라 적절히 변경할 수 있을 것이다. 보다 구체적으로는, pH 6 내지 8의 완충용액일 수 있다. 가장 구체적으로는, pH 6 내지 8의 HEPES 완충용액을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 복합체와 시료를 반응시키는 단계를 포함하는 목적물질의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 복합체는 수용액 하에서 쉽게 분산할 수 있고, 표적 물질과 특이적인 상호작용에 의해 색 전이를 나타내기 때문에, 시료 용액과 본 발명의 복합체를 반응시키면 복합체 표면에 결합된 반응기 또는 기능성 리간드가 표적 물질과 특이적으로 결합하여 용액의 색이 푸른색에서 붉은색으로 전이됨을 육안으로 관찰함으로써 목적물질을 확인할 수 있다.
또한, 상기 색 변화는 디지털 이미지 분석 소프트웨어, 예를 들어, ImageJ 소프트웨어에서 프로그램된 RGB 모듈을 통해 정량화할 수 있다.
붉은색으로의 변화는 형광으로도 검출이 가능하다. 여기파장 540 nm, 방출파장 620 nm에서 표적 물질의 농도 의존적으로 형광 강도가 증가하므로 형광 방출 거동을 이용하여 목적물질의 신호를 정량화할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 복합체와 시료를 반응시키는 단계를 포함하는 유전자 변형 작물의 판별 방법에 관한 것이다.
상기 반응기 또는 기능성 리간드로 유전자 변형 작물 특이 단백질, 예를 들어, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제(phosphinothricin acetyltransferase)에 대한 항체를 사용함으로써, 미지의 시료가 상기 단백질을 포함할 경우, 복합체에 결합된 항체와 특이적으로 결합함에 따른 용액 내 색 전이를 확인하거나, 형광 강도의 증가를 측정하여 유전자 변형 작물을 판별할 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
하기 실시예에서 사용된 10,12-Tricosadiynoic acid (TCDA)는 GFS Chemicals (Columbus, OH, USA)에서 구입하였다. 1,2-dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC), N-hydroxysuccinimide (NHS), 1-ethyl-3-(3-dimethyl amino-propyl)carbodiimide (EDC), 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) 및 ethanolamine는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 아민이 코팅된 실리카 비드는 직경이 대략 1.0㎛이며, Kisker (Steinfurt, Germany)에서 구입하였다. HPLC 등급의 클로로포름은 Fisher Scientific (Pittsburg, PA, USA)에서 구입하였다. 모든 실험에서 사용된 물은 2차 증류수이며, 멸균하였다.
<제조예 1> PAT 단백질 및 항-PAT 항체의 제조
포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제(Phosphinothricin acetyltransferase, PAT) 단백질은 다음과 같이 제조하였다.
유전자 변형 옥수수 Bt11 (Syngenta Crop Protection AG, Basel, Switzerland) 유래의 pat 유전자를 N-말단에 6-히스티딘 태그를 포함하는 발현벡터 pET-15b (Novagen, Madison, WI, USA)에 클로닝하였다. 간단히 말해, 유전자 변형 옥수수 Bt11에서 게놈 DNA를 추출하였다. 하기의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하였다:
Bt11 (pat)-F: gga att cca tat gtc tcc gga gag gag acc agt tga ga;
Bt11 (pat)-R: gcg cct cga gtc aga tct ggg taa ctg gcc taa ctg gc.
제한효소 사이트, NdeI 및 XhoI는 밑줄로 표시하였다. pat 유전자는 Mastercycler(Eppendorf, Hamburg, Germany)를 사용하여 하기 조건 하에서 증폭하였다:
95℃, 5분 동안 전-배양;
94℃, 30초 동안 변성, 60℃, 30초 동안 어닐링, 72℃, 1분 동안 신장 과정을 40 사이클 실시; 및
72℃, 8분 동안 최종 신장.
PCR 산물 및 pET-15b 벡터는 NdeI(New England Biolabs, Beverly, MA, USA) 및 XhoI(New England Biolabs)로 절단하고, 16℃, 1시간 동안 T4 DNA 리가아제 (Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 라이게이션 하였다. 상기 라이게이션 된 플라스미드로 E. coli DH5 컴피턴트 세포(Novagen)를 형질전환 시켰다. 재조합 플라스미드는 ABIPRISM 3700 DNA analyzer(Perkin Elmer, Boston, MA, USA)를 사용하여 시퀀싱하였다. 재조합 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)(Novagen)에 형질전환 시키고, 형질전환체들은 암피실린(50㎍/mL) 함유 LB 아가 플레이트 상에서 선별하였다. 싱글 콜로니를 픽업하고, 5mL의 암피실린(50㎍/mL) 함유 LB 배지로 옮겨 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 2.5mL의 배양액을 50mL의 동일한 신선 배지로 옮기고, 600nm에서 배양액의 흡광도가 0.6에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 상기 배양액에 최종 농도가 0.4mM이 되도록 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)를 첨가하여 유도하고, 37℃에서 4시간 이상 더 배양하였다. 세포를 수확하고, 10mL의 바인딩 완충용액(5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)에서 현탁하였다. 초음파 처리하고, 5,000 g에서 15분 동안 원심분리한 후, 재조합 단백질을 포함하는 상등액을 2.5mL Ni2+-chelated nitrilotriacetic acid(Ni-NTA) agarose column(QIAGEN)에 부가하고, 세척용 완충용액(60mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척한 다음, 용출용 완충용액(1M 이미다졸, 0.5M NaCl, 10mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 단백질을 용출하였다. 다클론 항-PAT 항체를 생산하기 위해, 500㎕의 Freund's adjuvant complete(Sigma-Aldrich, F5881)에 녹인 500㎍의 항원(PAT)으로 토끼를 면역화하였다. 총량을 토끼의 등에 피하주사하였다. 상기 동물은 300㎕의 Freund's adjuvant incomplete에 녹인 300㎍의 항원을 피하주사하여 6주 동안 2주 마다 강화시켰다(boosted). 최종 면역화 후 7일째에 토끼로부터 완전 혈액을 빼내었다. 혈청을 제거하기 전 상기 혈액을 37℃에서 1시간 동안 응고시킨 다음 6,000g에서 30분 동안 원심분리하였다. 상기 혈청은 앨리쿼트 하여 -20℃에서 보관하였다.
<제조예 2> 디아세틸렌 베지클의 제조 및 특성 규명
TCDA 베지클은 공지된 방법에 따라 제조하였다(Su Y-l et al. (2004) Biointerfaces 38(1-2):29-33). 간단히 설명하면, 앰버 바이알에서 농도가 1mM이 되도록 TCDA를 10mL의 클로로포름(HPLC grade, Fluka, Buchs, Switzerland)에 녹였다. 디아세틸렌 베지클을 제조하기 위해, 클로로포름에 용해시킨 TCDA 및 DMPC를 총 최종 농도가 1mM이 되도록 일정 몰 비율로 혼합하였다. 질소 가스 스트림으로 클로로포름을 제거한 후, 10mL의 HEPES 용액(5mM, pH 7.5)을 부가하였다. 상기 용액을 80℃에서 1시간 동안 가열하고 나서, 20분 동안 프로브-초음파처리를 실시하였다(VCX-750, Sonics, Newtown, CT, USA). 상기 베지클 용액을 0.8㎛ 필터를 통해 여과시키고, 상기 여과된 용액은 4℃에서 오버나이트 동안 냉각시킨 후, 254 nm에서 조사 후 중합시켰다. 최종 용액은 짙은 푸른색을 나타냈다. 디아세틸렌 베지클의 크기는 dynamic light scattering spectrophotometer(ELS-Z2, Otsuka electronics, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다.
<실시예 1> 아민 코팅된 실리카 비드에 고정된 폴리디아세틸렌(PDA) 베지클의 제조
GMO 마커, PAT 단백질을 검출하기 위한 실리카 비드가 결합된 PDA 센서를 제조하기 위해 아민이 코팅된 실리카 비드를 사용하였다(도 1). 실리카 비드 용액(5mg/mL) 및 제조예 2에서 제조한 PDA 베지클(1mM)을 20mM EDC 및 20mM NHS과 함께 혼합하였다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 800g에서 5분 동안 원심분리 하여(Eppendorf 5415R, Eppendorf Geratebau, Hamburg, Germany) 용액으로부터 PDA 베지클이 결합된 실리카 비드를 분리하였다. 과잉의 미결합 화학물질들을 제거하기 위해, HEPES 용액(5mM, pH 7.5)에서 연속적인 원심분리/재현탁 단계를 통해 PDA 베지클이 결합된 실리카 비드를 3회 세척하였다. 실리카 비드에 PDA 베지클의 고정은 dynamic light scattering spectrophotometer를 사용하여 PDA 결합된 실리카 비드의 크기를 측정하여 확인하였다.
PDA/실리카 마이크로비드 결합체는 각각 직경이 대략 300 nm 및 1.0㎛인 PDA 베지클 및 실리카 마이크로비드로 제조하였다. EDC 및 NHS는 PDA 베지클을 아민 기능화된 실리카 마이크로비드에 고정하기 위해 사용하였다. PDA 베지클은 100% TCDA 또는 TCDA 및 DMPC를 25몰% 비율로 혼합하여 제조하였다. 디아세틸렌 베지클에서 DMPC와 같은 비-중합성 지질의 결합은 PDA 베지클을 형성하기 위한 디아세틸렌 성분들의 광중합을 방해하지 않았다. 더욱이, 순수 디아세틸렌 양친성 화합물로 구성된 베지클과 비교하여, 20-30몰% DMPC를 포함하는 PDA 베지클은 외부 자극 시 색 전이에서 증가된 민감도를 나타냈다. 본 실시예에서, PDA에 25몰% DMPC의 부가는 100% PCDA로 제조한 것과 비교하여 베지클의 형태 및 크기에서 유의적인 변화를 유발하지 않았다.
TCDA 단량체의 카르복실 헤드 그룹은 EDC/NHS와 반응한다. EDC는 카르복실기와 반응하여 아민-반응성 중간체를 형성한다. 이 중간체가 아민과 결합하지 않았다면, 가수분해하여 카르복실기를 생성하였을 것이다. N-hydroxysuccinimide(NHS)는 상기 중간체를 아민-반응성 NHS 에스테르로 전환하여 아민-반응성 중간체를 안정화하며, EDC에 의한 커플링 반응의 효율을 증가시킨다.
도 3에 나타난 바와 같이, DLS 측정에 따른 PDA/마이크로비드 결합체의 크기는 ~1.6㎛였다.
커플링 반응 후, 고정된 베지클은 254nm에서 조사에 의해 중합되고, PDA/마이크로비드를 포함하는 용액은 푸른색으로 전환되었다(도 4b). PDA/마이크로비드는 800g에서 5분 동안 간단한 원심분리를 통해 쉽게 분리될 수 있다. 원심분리 후 상기 용액은 투명해지는데, 이는 모든 PDA 베지클이 실리카 마이크로비드와 결합되어 PDA/마이크로비드 결합체로 가라 앉았음을 뜻하는 것이다(도 4c-1). 반면, 커플링 반응 시 가교제를 부가하지 않았을 때, PDA 베지클은 용액에 남아있는 반면, 실리카 마이크로비드는 원심분리 후 흰색 펠렛으로 가라 앉았다(도 4c-2). 지질 상에서 PDA 베지클을 쉽게 수집할 수 있을 뿐만 아니라, 베지클의 푸른색 또는 붉은색의 흡광도를 증가시키면서 침전물은 PDA 베지클의 가시성을 촉진하였다.
<실시예 2> 실리카 비드에 고정된 항체가 결합된 PDA 베지클의 제조
PDA의 색 변화는 표적 단백질과 PDA 베지클의 표면에 있는 리간드 간의 상호작용에 의해 유발되는 베지클의 구조적 동요에 의해 생긴다.
동요 정도를 향상시키기 위해, 항원-항체 브리징에 의한 PDA/마이크로비드 결합체의 응집을 통해 PDA 베지클에 대한 추가적인 기계적 자극을 제공함과 동시에 실리카 마이크로비드와 결합시켰다. 이때, 목화, 옥수수, 벼 및 콩 등의 GM 작물에서 마커 단백질 중 하나인 PAT 단백질의 검출을 위한 제조예 1에서 제조한 항-PAT 항체를 사용하였다.
EDC/NHS 화학을 이용하여 베지클-항체 결합체를 제조하였다(도 2).
우선, 디아세틸렌 베지클의 표면의 카르복실산은 20 mM NHS 및 20 mM EDC를 포함하는 5mM HEPES 완충용액(pH 7.5)에서 실온에서 1시간 동안 활성화 되었다. 활성화된 디아세틸렌 베지클은 상기 제조예 2에서 제조한 항-PAT 항체(300 ㎍/mL)를 포함하는 HEPES 완충용액에서 현탁하여 디아세틸렌 베지클의 표면에 있는 석신이미딜 활성 에스테르와의 펩티드 결합을 통해 항체를 가교시킨 다음, 4℃에서 오버나이트 동안 인큐베이션하였다. 상기로부터 형성된 항체-결합된 디아세틸렌 베지클은 HEPES 완충용액(5mM, pH 7.5)으로 2회 세척하여 결합되지 않은 항체들을 제거하였다. 디아세틸렌 베지클의 표면에 남아있는 석신이미딜 활성 에스테르는 2mM 에탄올아민으로 불활성화 시켰다. 디아세틸렌 베지클은 원심분리하여 쉽게 침전되지 않기 때문에, 디아세틸렌 베지클의 수집 및 세척은 원심분리 필터 장치를 이용하여 실시하였다(분자량 컷오프(molecular weight cut off), 30,000 Da)(Microcon, Millipore, Bedford, MA, USA).
실리카 비드에 항체가 결합된 디아세틸렌 베지클을 고정하는 방법은 상기 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
디아세틸렌 베지클-실리카 비드 결합체는 800g에서 5분 동안 원심분리하여 용액으로부터 분리하였다. 상기 디아세틸렌 베지클은 254nm에서 조사 후 중합되었다(PDA 베지클).
베지클의 표면에 항-PAT 단백질을 결합시킨 후 TCDA 베지클의 광중합을 실시하여도, 항체의 기능은 변하지 않은 채 남아있었다. TCDA 베지클은 항체와의 결합 과정 전에 중합될 수 있으나, PDA의 원치 않는 붉은색으로의 전이가 유발될 수 있다.
<실시예 3> PAT의 정량 검출
PDA/마이크로비드 센서의 색 변화는 표적 분석물질의 존재 하에서 육안으로 보이므로, 간단한 RGB 분석을 통해 정량화할 수 있고, 표적 단백질 인지를 위한 유용한 도구로서 PDA/마이크로비드 시스템을 제조할 수 있다.
이를 위해, 96-웰 마이크로플레이트에서 PDA 베지클 또는 PDA-결합된 실리카 마이크로비드를 PAT 단백질의 농도별로 반응시켰다. 상기 반응은 항체-결합된 PDA-실리카 마이크로비드 및 0 내지 2μM 농도의 PAT 단백질을 포함하는 5mM HEPES 완충용액에서 37℃에서 1시간 동안 실시하였다. 반응 후, PDA-실리카 마이크로비드는 150g에서 5분 동안 원심분리하여 마이크로플레이트의 바닥에 펠렛화하였다. PDA 용액 또는 PDA-실리카 결합 펠렛의 색 변화를 관찰하기 위해 RGB-분석을 수행하였다. 색 변화를 정량하기 위해, ImageJ 소프트웨어(NIH, Bethesda, USA)에서 프로그램된 RGB 모듈을 이용하여 강도에 대한 막대 그래프를 계산하였다. 반응 후 PDA/실리카 마이크로비드의 붉은색 형광은 여기파장 540nm, 방출파장 620nm에서 형광 마이크로플레이트 리더(Infinite M200, Tecan, Grodig, Austria)를 이용하여 측정하였다.
도 5는 농도 별로 PAT 단백질을 첨가한 후 다양한 PDA 베지클의 색 반응을 나타낸 것으로 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 표적 단백질의 추가 후 PDA 센서의 가시광선 스펙트럼을 분석하였다.
도 6은 PAT 단백질에 대한 색 전이의 농도 의존성을 나타낸 것으로, 각 반응에서 붉은색 수치를 정량하기 위해, ImageJ 소프트웨어에서 RGB 모듈을 사용하여 붉은색의 강도를 계산하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, PAT 단백질을 PDA 또는 PDA/마이크로비드를 포함하는 용액에 부가하였을 때, PDA 베지클의 표면에서 특이 면역반응이 일어났다.
도 6에 나타난 바와 같이, 색 반응은 표적 단백질의 주어진 농도에서 실리카 마이크로비드가 없는 것과 비교하여 PDA/마이크로비드를 포함하는 용액에서 유의적으로 향상되었다. PDA 베지클에 부착된 마이크로비드는 응집 동안 PDA 베지클에 추가적인 기계적 스트레스를 제공하여 육안으로 명백히 구별할만한 수준으로 신호 증폭을 유도한다.
또한, DMPC 같은 비-중합성 인지질을 부가할 경우, 디아세틸렌 베지클의 색 전이 민감도를 확인하였다. 이를 위해, 4:1의 몰비율의 TCDA/DMPC로 구성된 PDA 베지클을 제조하고 상기 베지클에 실리카 마이크로비드를 결합시켰다.
PDA(TCDA:DMPC=4:1)/마이크로비드 결합체의 색 변화는 PDA(100% TCDA)/마이크로비드 결합체에 비해 더 높았다(도 5 및 6). 우태아혈청 알부민(BSA)과 PDA (TCDA:DMPC=4:1)/마이크로비드 결합체를 함께 배양할 경우, 어떠한 색 변화를 유발하지 않았으며(도 5d), 이는 센서 시스템의 특이성을 뜻하는 것이다.
면역반응으로부터 신호를 정량하기 위한 대안으로서 PDA의 형광 방출 거동을 이용하였다. 면역반응 후, PDA/마이크로비드는 540nm의 파장에서 여기되었고, 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 620nm에서 붉은색 형광이 측정되었다.
도 7에 나타난 바와 같이, PDA(TCDA:DMPC=4:1)/마이크로비드로부터 방출된 붉은색 형광은 농도 의존적인 방식으로 증가하였다. 최소 검출 한계는 2nM이었다.
따라서, 상술한 PDA/마이크로비드 센싱 시스템은 육안 또는 디지털 이미지 분석 소프트웨어를 통해 결과물을 모니터링하는 간단하고 편리한 방식을 제공한다.

Claims (20)

  1. 마이크로비드; 및
    상기 마이크로비드에 고정된 폴리디아세틸렌(polydiacetylene) 베지클(vesicle)을 포함하는 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    마이크로비드는 실리카(silica), 또는 유리(glass)를 포함하는 무기물; 금속(metal), 금속산화물 또는 자성물질을 포함하는 금속; 아가로스(agarose), 폴리스티렌(polystyrene), 라텍스(latex), 스티렌비닐톨루엔 중합체(styrene-vinyltoluene), 또는 폴리비닐톨루엔(polyvinltoluene)을 포함하는 고분자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    폴리디아세틸렌 베지클은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 중합체, 또는 상기 화학식 1의 화합물과 인지질(phospholipid)의 복합물로부터 유도된 복합체:
    [화학식 1]
    Figure pat00004

    상기 식에서,
    R1는 탄소수 1 내지 30의 알킬기이고,
    R2는 탄소수 1 내지 30의 알킬렌기이며,
    R3는 에폭시기, 아지리딘기, -OH, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -CON3, CH2C(NH2+)OCH3, -OP(O2-)OH, 또는 -SH를 나타낸다.
  4. 제3항에 있어서,
    R1는 탄소수 3 내지 18의 알킬기이고,
    R2는 탄소수 3 내지 18의 알킬렌기이며,
    R3는 -COOH 또는 -COH를 나타내는 복합체.
  5. 제3항에 있어서,
    인지질은 폴리디아세틸렌 베지클에 대하여 1 내지 40몰%로 포함되는 복합체.
  6. 제1항에 있어서,
    폴리디아세틸렌 베지클은 반응기 또는 기능성 리간드를 더 포함하는 복합체.
  7. 제6항에 있어서,
    반응기 또는 기능성 리간드는 항체, 앱타머, DNA 프로브, RNA 프로브, PNA 프로브, 바이오틴 및 단백질 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 복합체.
  8. 폴리디아세틸렌(polydiacetylene) 베지클을 마이크로비드 표면에 고정하는 단계를 포함하는 제1항의 복합체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    폴리디아세틸렌 베지클은 카보디이미드(carbodiimide) 결합을 통해 마이크로비드에 고정되는 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 폴리디아세틸렌 베지클을 마이크로비드에 고정하는 단계는
    디아세틸렌 베지클을 마이크로비드에 고정하는 단계; 및
    상기 베지클을 중합하는 단계를 포함하는 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    디아세틸렌 베지클을 마이크로비드에 고정하는 단계의 디아세틸렌 베지클은 그 표면에 반응기 또는 기능성 리간드가 결합되어 있는 제조방법.
  12. 마이크로비드;
    상기 마이크로비드에 고정된 폴리디아세틸렌(polydiacetylene) 베지클(vesicle); 및
    상기 폴리디아세틸렌 베지클에 결합된 반응기 또는 기능성 리간드를 함유하는 복합체를 포함하는 바이오 센서.
  13. 제12항에 있어서,
    반응기 또는 기능성 리간드는 항체, 앱타머, DNA 프로브, RNA 프로브, PNA 프로브, 바이오틴 및 단백질 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 바이오 센서.
  14. 마이크로비드;
    상기 마이크로비드에 고정된 폴리디아세틸렌(polydiacetylene) 베지클(vesicle); 및
    상기 폴리디아세틸렌 베지클에 결합된 반응기 또는 기능성 리간드를 함유하는 복합체를 포함하는 단백질 검출용 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    pH 6 내지 8 인 완충용액을 더 포함하는 단백질 검출용 조성물.
  16. 제12항의 복합체와 시료를 반응시키는 단계를 포함하는 목적물질의 검출방법.
  17. 제16항에 있어서,
    푸른색의 붉은색으로의 비색 변화를 통해 검출하는 목적물질의 검출방법.
  18. 제16항에 있어서,
    여기파장 540 nm, 방출파장 620 nm에서 형광 강도를 측정하여 검출하는 목적물질의 검출방법.
  19. 제12항의 복합체와 시료를 반응시키는 단계를 포함하는 유전자 변형 작물의 판별 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    복합체의 반응기 또는 기능성 리간드는 유전자 변형 작물 특이 단백질에 대한 항체를 포함하는 유전자 변형 작물의 판별 방법.
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