KR20120081451A - 벼 유래 ＯｓＩＤＤ10 유전자의 발현을 조절함으로써 식물의 뿌리 형태를 조절하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 OsIDD10 유전자의 발현을 식물체에서 조절함으로써 식물의 뿌리 형태를 조절하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 뿌리 형태가 조절되는 식물체 및 식물의 뿌리 형태 조절용 조성물에 관한 것이다.

Description

벼 유래 ＯｓＩＤＤ10 유전자의 발현을 조절함으로써 식물의 뿌리 형태를 조절하는 방법{Method for regulating root morphology of plant by controlling expression of OsIDD10 gene isolated from rice}
본 발명은 OsIDD10(Oryza sativa Indeterminate domain 10) 유전자의 발현을 식물체에서 조절함으로써 식물의 뿌리 형태를 조절하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 뿌리 형태가 조절되는 식물체 및 식물의 뿌리 형태 조절용 조성물에 관한 것이다.
질소는 고등 식물을 위한 주된 영양 공급원이다. 질산염은 질소 공급원 중 하나로 유전자 발현 조절을 위한 신호 분자로서 널리 알려져 있으며, 질산염이 호기성 고산 조건에서 재배되는 식물을 위한 주된 질소 공급원인 반면, 암모늄은 논에서 재배되는 벼를 위한 주된 질소 공급원이다. 대다수의 고산 식물에 있어서 과량의 암모늄은 독성 증후군을 야기하므로, 효율적인 암모늄 수송 및 연이은 동화과정이 뿌리에서 고도로 조절되어야만 한다. 벼의 물관 수액 중의 주된 질소 구성성분은 Gln 및 Asn 이다 [Fukumorita & Chino 1982 Plant Cell and Physiol . 23: 273-283].
암모늄 흡수 및 수송, 연이은 동화과정이 생리학적 및 분자적 관점에서 집중적으로 검증되어 있다. 아라비돕시스 암모늄 수송체(transporter)인 AtAMT1 :1, AtAMT1:2, AtAMT1 :3 및 AtAMT2는 아라비돕시스에서 그 기능 및 질소 의존적 유전자 발현에 대한 특성이 밝혀져 있다 [Viviane et al. 2009 Plant cell . 21: 3610-3622]. 벼에서는 AMT1 상동체 (OsAMT1 :1, OsAMT1 :2, OsAMT1 :3), OsAMT2 :1, 및 OsAMT3 :1가 동정되었으며, 그 기능 및 발현 양상에 대해 분석되었다 [KUMAR et al. 2003 Plant Cell and Environment . 26: 907-914]. 암모늄 이온은 수송체들을 통해 뿌리로 신속히 흡수된다. 뿌리 내부에서, 암모늄 이온들은 연이어 글루타민 합성효소 (glutamine synthetase: GS)에 의해 글루타민의 아미드 잔기로 동화된다. 글루타메이트 신타아제 (glutamate synthase: GOGAT)에 의해 글루타민으로부터 변환된 글루타메이트는 다수 아미노산의 합성에 이용된다. 더욱이, 질소 및 탄소 대사의 상호작용이 밝혀졌다. Lea 및 Miflin [1974 Nature . 251: 614-616]에 의해 GS/GOGAT 사이클이 발견된 이래, 상기 사이클이 주로 정상적인 조건 하의 식물에서 NH4 + 동화를 위한 유일한 경로인 것으로 간주되었다 [Lea & Miflin 2003 Plant Physiology and Biochemistry. 41, 555-564]. GS는 두 가지 유형으로 구분된다: GS1은 세포질에 위치하며, GS2는 엽록체에 위치한다. GS1:1은 GS1 유형에 속하며, 벼에서의 Tos17 삽입 녹아웃 돌연변이 분석에 의해 식물 생장 및 종자 임실 (grain filling)에 중요한 것으로 밝혀졌다 [Mayumi et al. 2005 Plant J. 42: 641-651].
벼에서 암모늄 동화 관련 유전자로 암모늄 의존성 발현이 분석되었다. AMT1 :1 및 AMT1 :2 mRNA는 질소 공급 중단 후 외부 암모늄 처리에 의해 신속하게 유도되는 반면, AMT1 :3는 벼 뿌리에 암모늄 공급에 의해 하향조절되었다. 또한, AMT1 :2가 뿌리 특이적 암모늄 수송체로 밝혀졌다 [Yutaka et al. 2003 Plant Cell and Physiol. 44: 726-734]. GS1 및 NADH - GOGAT의 유전자들이 동정되었으며, 이어 이들의 암모늄 의존적 유전자 발현에 대해 증명되었다. 이들 중에서도, GS1 :2 및 NADH - GOGAT1는 주로 뿌리에서 발현되고, 벼에서 유묘(seedlings)가 높은 농도의 암모늄에 노출될 때 고도로 유도되었다 [Mayumi et al. 2007 Journal of Experimental Botany . 58: 2319-2327]. 글루타메이트 합성을 위한 2-옥소글루타레이트의 기원을 알기 위해, 미토콘드리아에 위치하는 NAD-의존적 이소시트레이트 디히드로게나아제 (isocitrate dehydrogenase: IDH) 및 글루타메이트 디히드로게나아제 (glutamate dehydrogenase: GDH)가 또한 분석되었다. IDH 및 GDH는 또한 외부 암모늄 처리에 의해 상이한 양상으로 유도되는 것으로 나타났다 [Tomomi et al. 2005 Plant Cell and Physiol . 46: 1724-1734]. AMT1:1 및 1:2의 발현에 대한 내부 질소 구성성분의 피드백 조절이 벼에서 보고되었다. 질소 공급 중단에 이은 암모늄 처리는 AMT1 :1 및 1:2의 전사 수준을 증가시켰다. 그러나, 암모늄과 함께 글루타민 합성효소 저해제 MSO를 공급한 경우에는, 그러한 암모늄 반응이 나타나지 않았다. 글루타민 또는 아스파라긴 공급은 AMT1 :1 및 1:2의 전사를 유도했다 [Yutaka et al. 2003 Plant Cell and Physiol . 44(12): 1396-1402].
IDD (Indeterminate domain) 단백질은 식물에서 전사 인자로 추정된다. 이들 중 일부는 식물 발달과정에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. IDD 유전자 ZmID1은 최초로 옥수수에서 보고되었고, ZmID1은 N-말단 영역에 2 개의 C2H2 및 2 개의 C2HC로 이루어진 징크핑거 도메인 (zinc finger domain)을 보유한다. 돌연변이체는 개화기의 지연을 나타냈다 [Joseph et al. 1998 Cell . 93: 193-603]. 최근, 다른 IDD 유전자의 기능에 대한 보고가 있었다. SGR5 는 신초(shoot)의 굴지성을 조절한다. Jackdaw 및 Magpie 는 아라비돕시스(Arabidopsis)의 뿌리에서 비대칭적 세포 분열을 조절한다. 또한, 옥수수 ID1의 벼 오쏘로그(ortholog) OsId1의 돌연변이는 지연된 개화기를 나타냈다 [Park et al. 2008 Plant J. 56: 1018-1029]. 옥수수 IDD 단백질의 일부가 시험관 내에서 DNA 결합능력에 대해 시험되었다. 결과는 IDD 단백질이 전사 인자로서 작용할 수 있음을 보여줬다 [Kozaki et al. 2004 Nucleic Acids Res . 32: 1710-1720].
본 발명에서는 벼 유래의 OsIDD10 유전자의 발현을 조절함으로써 식물체의 뿌리 형태가 변화되는지 확인하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래의 OsIDD10 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 식물의 뿌리 형태를 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환되어 식물의 뿌리 형태가 조절되는 식물체 및 그의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 식물의 뿌리 형태 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 OsIDD10 유전자의 발현을 식물체에서 조절함으로써 식물체의 뿌리 형태를 조절할 수 있다.
도 1은 벼 유묘의 종자근 및 종자근의 길이를 보여준다. 발아한 종자를 0.8% 아가(agar) 및 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 또는 5.0 mM 암모늄 또는 질산염 이온이 포함된 배지에 파종하여 5일간 키웠다. (A)는 파종 5일 후의 사진이다. (B)는 파종 5일 후 유묘의 종자근 길이에 미치는 암모늄 또는 질산염 이온의 영향을 보여준다.
도 2는 옥수수, 벼, 아라비돕시스(Arabidopsis)의 IDD 단백질의 계통수를 보여준다. 15 가지 옥수수, 12 가지 벼 및 15 가지 아라비돕시스 IDD 단백질이 사용되었다. 기능이 밝혀진 IDD 단백질의 위치 및 등록번호(accession numbers)를 화살표로 표시하였으며, 해당 명칭을 우측에 표기하였다. 상기 유전자들은 7개의 아군(subclasses)으로 나눠진다.
도 3은 idd10의 게놈 구조 및 mRNA 수준을 보여준다. 삽입 돌연변이체는 T-DNA 삽입 집단으로부터 분리했다. T-DNA는 IDD10 좌의 두 번째 인트론에 삽입되어 있다. 흑색 및 백색 박스는 각각 ORF 및 UTR 구간을 나타낸다. 프라이머 세트 F+R을 이용한 RT-PCR은 idd10 돌연변이체에서 전사물이 검출되지 않았음을 보여줬다. 액틴1 mRNA을 대조구로 이용했다.
도 4는 IDD10의 발현 양상을 보여준다. GUS 발현은 IDD10 프로모터 GUS 융합 형질전환 식물을 이용하여 분석했다. 특이적 GUS 발현 영역은 관근 (1), 측근 원기 (2), 측근의 액포 (3), SAM 인접 조직 (4), 잎 정단 (5), 및 꽃 (6)에서 검출되었다 (A). 인시츄 혼성화를 수행하여 뿌리 기관에서의 IDD10 발현 양상을 보았다. IDD10은 횡단면에서 관근 (1) 및 측근 원기 (2)에서 특이적으로 발현되었다 (B). RT-PCR을 수행하여 IDD10의 생체 내 발현을 확인했다. RT-PCR 결과는 IDD10 전사물이 모든 조직에서 발현되는 것으로 나타났다 (C).
도 5는 IDD10의 세포 내 위치 및 전사 활성을 보여준다. C-말단 GFP 융합 형질전환 식물체의 종자근에서, GFP 이미지화는 IDD10이 핵 내에 있음을 보여준다 (A). IDD10의 상이한 구간의 교차활성화(Trans-activation) 활성을 분석했다. IDD10의 전장 (402 아미노산), N-말단 (255 아미노산) 및 C-말단 (147 아미노산) 구간을 GAL4 DNA 결합 도메인에 융합시키고 효모 세포로 형질전환했다. IDD10의 전장 및 C-말단 구간이 His3 및 LacZ 리포터 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있는 것으로 나타났다. AtNAC1는 양성 대조구로 이용했다 (B).
도 6은 idd10의 표현형 발현을 보여준다. 야생형 및 idd10 식물을 dH2O 또는 0.5x MS 배지에서 3일 동안 재배했다. 종자근 코일링(coiling: 꼬임현상)이 0.5x MS에서 재배한 idd10 식물에서 발생했다 (A). 야생형 및 idd10 식물체를 0.5x MS에서 4일 동안 명소 또는 암소에서 재배했다. 종자근 코일링은 명소에서 재배한 식물에서만 나타났다 (B). 명/암 사이클은 생장상(growth chamber)에서 16 시간/8 시간이었다.
도 7은 한가지 구성성분이 누락된 0.5x MS 배지에서의 뿌리 형태를 보여준다. MS 배지는 13 가지 구성성분으로 이루어지며, 각 구성성분의 농도는 좌측에 수록했다. MS의 어떤 성분이 뿌리 표현형의 원인인지 알기 위해, 각각의 구성성분이 누락된 0.5x MS에서 유묘를 재배했다. 뿌리 코일링은 NH4NO3가 포함되지 않은 배지에서는 발생하지 않았다 .
도 8은 idd10 표현형에 대한 두 가지 질소 형태의 분석을 보여준다. 야생형 및 idd10 식물체를 변형된 0.5x MS 배지 중; 10 mM NH4NO3이 포함되지 않은 배지 (A), NH4NO3 대신 10 mM KNO3이 포함되지 않은 배지 (B), NH4NO3 대신 5 mM (NH4)2SO4이 포함되지 않은 배지 (C), 및 NH4NO3 대신 5 mM K2SO4이 포함되지 않은 배지 (D)에서 재배했다.
도 9는 야생형 및 idd10 뿌리에서의 암모늄 흡수 및 동화 유전자의 발현 수준을 보여준다. 10 개의 후보자 유전자를 실시간 PCR로 분석했다. AMT1: 암모늄 수송체 1, GS1: 세포질 글루타민 합성효소, NADH - GOGAT: NADH 글루타메이트 신타아제, GDH: 글루타메이트 디히드로게나아제를 분석했다. 3 가지 AMT1 유전자 및 GS1 :2는 돌연변이체에서 더 낮은 발현 수준을 나타낸 반면, GDH2는 돌연변이체에서 약간 더 높은 발현 수준을 나타냈다. 상기 유전자들의 mRNA 수준은 액틴 mRNA의 발현 수준에 대해 정규화(normalization)되었다.
도 10은 MeA 흡수 및 암모늄 동화 관련 효소들의 활성을 보여준다. 암모늄 흡수 활성을 암모늄 유사체 메틸-암모늄 (MeA)을 이용하여 측정했다. 종자근 길이를 5 일령 식물에서 측정했다 (A). 글루타민 합성효소 (B), 글루타메이트 신타아제 (C), 및 글루타메이트 디히드로게나아제 (D)의 활성을 3 일령 식물의 신초 및 뿌리에서 측정했다.
도 11은 형질전환 식물을 이용한 상보성 분석을 보여준다. 상보성 구축물은 ORF cDNA 구동을 위해 2.5 kb 내재성 프로모터 구간을 이용했다 (A). 2 가지 상보성 계통은 0.5x MS 배지에서 정상적인 종자근 생장을 나타냈고, DD10 mRNA도 또한 복구되었다. 액틴을 내부 대조구로 이용했다 (B). 야생형 (작은 사각형), idd10 (큰 사각형), 및 두 상보성 계통의 종자근 길이를 측정했다 (com2: 삼각형, com3: 원) (C). *com: 상보성 계통.
도 12는 돌연변이체 및 상보성 계통에서의 암모늄 수송체 (AMT) 및 동화 유전자의 암모늄 매개된 신속한 유도를 보여준다. 1 mM 암모늄 처리에 이어, 전체 뿌리를 표시된 시간에 시료로 만들었다. 하기의 유전자들을 분석했다; AMT1 :1 (A), AMT1 :2 (B), GS1 :2 (C), NADH - GOGAT1 (D), GDH1 (E) 및 GDH2 (F). IDD10 돌연변이체 및 상보성 식물체를 동일한 시블링(sibling)으로부터 수득했다. 상기 유전자들의 mRNA 수준을 액틴 mRNA의 수준에 대해 정규화했다.
도 13은 야생형 및 과발현 계통 2에서 암모늄 수송체 (AMT) 및 동화 유전자의 암모늄 매개된 신속한 유도를 보여준다. 1 mM 암모늄 처리 후, 전체 뿌리를 표시된 시간에 시료로 만들었다. 하기의 유전자들을 분석했다; AMT1 :1 (A), AMT1 :2 (B), GS1:2 (C), NADH - GOGAT1 (D), GDH1 (E) 및 GDH2 (F). 상기 유전자들의 mRNA 수준을 액틴 mRNA의 수준에 대해 정규화했다.
도 14는 IDD10 및 OsAMT1:2의 mRNA 축적에 미치는 암모늄 또는 질소 대사물의 효과를 보여준다. 야생형 식물을 질소가 없는 배지에서 수경재배로 예비재배하고, 이어서 각각 하기한 것을 포함하며 질소가 없는 용액으로 옮겼다; 질소 없음 (-N), 1 mM NaNO3, 0.5 mM (NH4)2SO4, 1 mM MSO, 1 mM MSO/0.5 mM (NH4)2SO4 및 5 mM L-글루타민. 3 시간 후, 뿌리에서의 IDD10 (A) 및 OsAMT1 ;2 (B)의 mRNA 축적을 실시간 PCR로 분석했다. 두 유전자의 mRNA 수준은 액틴 mRNA의 수준에 대해 정규화했다.
도 15는 MSO 처리 후 표현형 발현 및 내부 암모늄 함량을 보여준다. 1 μM MSO (A)의 존재 또는 부재 하에 0.5x MS 배지에서 3일 동안 식물을 재배했다. 내부 암모늄 함량을 0 μM 또는 1 μM MSO를 3일 동안 처리한 뿌리에서 측정했다 (B).
도 16은 세 가지 피토크롬 유전자의 mRNA 발현 및 기능 분석을 보여준다. 뿌리 및 신초의 총 RNA는 어린 유묘로부터 분리했다. 신초 및 뿌리에서 OsPHYA, OsPHYB 및 OsPHYC 전사물을 검출하기 위해 RT-PCR을 수행했다. cDNA 및 게놈 DNA의 구분을 위해 게놈 DNA (gDNA)를 사용했다 (A). 0.5x MS 배지에서 재배한 3 일령 식물체의 idd10 단일 돌연변이체 및 피토크롬 돌연변이체와의 이중 유전자 조합 간에 뿌리를 비교했다. 이중 유전자 조합 식물체에서는 동형접합체 (좌측) 또는 이형접합체 (우측)의 상태에서 OsPHYA , OsPHYB 및 OsPHYC가 존재했다 (B).
도 17은 야생형, phyB, idd10, 및 phyB / idd10 식물체에서의 암모늄 매개된 OsAMT1:2 유도를 보여준다. 처음 2 주 동안은 식물을 dH2O에서 재배하고, 이어서 질소가 없는 배지에서 수경재배로 예비재배했다. 최종적으로, 이들을 0.5 mM (NH4)2SO4를 포함하고 질소가 없는 용액으로 옮겼다. 암모늄 공급 후 0, 3, 6 시간째에 전체 뿌리를 시료로 만들었다. OsAMT1 :2 유도를 측정하기 위해 실시간 PCR을 수행했다. 두 가지 유전자의 mRNA 수준을 유비퀴틴 mRNA의 수준에 대해 정규화했다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 벼 유래의 OsIDD10(Oryza sativa Indeterminate domain 10) 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 OsIDD10 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물의 뿌리 형태를 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 상기 OsIDD10 유전자의 발현을 억제하여 식물의 뿌리가 나선형(coil)으로 되게 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 유전자의 발현을 억제하여, 암모늄이 첨가되고 빛이 있는 조건에서 키워 식물의 뿌리가 나선형(coil)으로 되게 할 수 있다.
용어 "억제"는 본원에서 발현 또는 기능의 임의의 상대적인 감소 및 표적 유전자 산물의 발현 또는 기능의 완전한 저지 등의, 표적 유전자 산물의 발현 또는 기능의 임의 감소를 의미한다. 용어 "발현"은, 본원에서 유전자 산물 측면에서 유전자 산물의 전사 및/또는 번역 및/또는 조합 등의 유전자 산물의 생합성을 의미한다. 표적 유전자(즉, 원하는 유전자 산물) 산물의 발현 또는 기능의 억제는, 임의의 2 종의 식물들 간의 비교 측면에서, 예컨대 유전자 변형된 식물에서의 표적 유전자 산물의 발현 또는 기능 대 대응되는 야생형 식물에서의 표적 유전자 산물의 발현 또는 기능일 수 있다. 다른 예로, 표적 유전자 산물의 발현 또는 기능의 억제는 동일한 식물 내, 또는 식물들 간의 식물 세포, 세포소기관(organelle), 기관(organ), 조직 또는 식물의 일부분의 비교일 수 있으며, 동일 식물 내에서나 또는 식물들 간의 발생 단계 또는 시기적 단계 비교를 포함한다. 전사 또는 번역 수준에서 표적 유전자 산물의 발현을 하향 조절하거나, 또는 표적 유전자 산물의 기능적 활성을 하향 조절하는 임의 방법 또는 조성물을 사용하여, 표적 유전자 산물의 발현 또는 기능의 억제를 달성할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 재조합 식물 발현 벡터는 당업계에 공지된 임의의 식물 발현 벡터를 이용할 수 있다. 재조합 식물 발현 벡터에서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스(geminivirus) 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명에 따른 벼 유래의 OsIDD10 유전자는 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열의 돌연변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 돌연변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, OsIDD10 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 OsIDD10 유전자를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플랜타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 벼 유래의 OsIDD10 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환되어 식물의 뿌리 형태가 조절되는 식물체를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 식물체는 단자엽식물일 수 있으며, 예를 들면 벼, 밀, 보리, 귀리, 호밀, 잔디, 죽순, 옥수수, 사탕수수, 기장, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마, 또는 생강일 수 있으며, 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 식물체의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 종자는 단자엽식물의 종자이며, 더욱 바람직하게는 벼 종자이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 벼 유래의 OsIDD10 유전자를 포함하는 식물의 뿌리 형태 조절용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명의 식물의 뿌리 형태 조절용 조성물은 유효 성분으로서 벼 유래의 OsIDD10 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물의 뿌리 형태를 조절할 수 있는 것이다. 상기 식물은 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
재료 및 방법
1. T- DNA 녹아웃( knock - out ) 식물의 분리
OsIDD10 및 T-DNA 프라이머 (http:://www.postech.ac.kr/life/pfg)를 사용한 직접적인 PCR 스크리닝으로 벼 T-DNA 집단에서 T-DNA 삽입 돌연변이체를 동정하였다 [An et al. 2003 Plant Physiol. 133: 2040-2047]. IDD10 돌연변이체 (1D-046-26)의 T2 자손을 종자 증식을 위해 성숙할 때까지 키웠다. 자손의 유전자형은 IDD10 유전자 특이적 프라이머 및 T-DNA 경계부 프라이머를 이용하여 결정하였다.
2. 식물체 및 생육조건
자포니카 벼 재배품종 동진 및 화영을 본 발명의 모든 실험에 사용하였다. 식물을 진주 경상대학교의 논에서 키웠다. 유묘(seedling) (1달 된)를 포장에 이식하여 성숙할 때까지 키웠다 [Park et al. 2008 Plant J. 56: 1018-1029]. 광 실험을 위해서, 식물체를 생장상(growth chamber)에서 액체 또는 고체 0.5x MS 배지 상에서 키웠다. 본 발명에서 광 조건은 16시간 명소/8시간 암소이다.
유전자 발현에 미치는 암모늄의 효과를 분석하기 위해, 식물체를 발아 후 14일간 온실에서 수경재배하였다. 유묘를 질소가 포함되지 않은 배양액 (7 μM Na2HPO4ㆍ12H2O, 16 μM KCl, 7 μM CaCl2ㆍH2O, 15 μM MgCl2ㆍH2O, 36 μM FeSO4ㆍH2O, 9 μM MnSO4ㆍH2O, 45 μM H3BO4, 3 μM ZnSO4ㆍH2O, 0.2 μM CuSO4ㆍH2O, 0.05 μM Na2MoO4ㆍH2O)에서 3일간 더 키웠다. 상기 유묘를 0.5 mM (NH4)2SO4 (pH 5.5) 배양액으로 옮겨 더 키웠다. (NH4)2SO4 공급 후 0, 3, 6, 12 시간째 뿌리를 수확하였다 [Tomomi et al. 2005 Plant Cell and Physiol . 46(10): 1724-1734]. 질소대사물의 효과를 조사하기 위하여 유묘(seedling)를 하기 성분 (1 mM NaNO3, 0.5 mM (NH4)2SO4, 1 mM MSO, 1 mM MSO 및 0.5 mM (NH4)2SO4 , 및 5 mM L-Glutamine) 중 하나를 포함하는 질소가 포함되지 않은 배양액으로 옮겼다. 상기 처리 3시간 후 전체 뿌리를 수확하였다 [Yutaka et al. 2003 Plant Cell and Physiol . 44(12): 1396-1402].
간접적인 암모늄 흡수를 측정하기 위해, 암모늄 유사체인 메틸-암모늄 (MeA)을 이용하였다. NH4NO3가 포함되지 않은 변형된 0.5x MS에 0, 2.5, 5, 및 7.5 mM MeA를 첨가하였다. IDD10 뿌리 표현형에 미치는 GS 활성의 효과를 조사하기 위해, MSO (L-methionine sulfoximine) 1 μM을 0.5x MS 배지에 첨가하였다 [Tatsuya et al. 2008 Physiologia Plantarum . 134: 183-190].
3. 벡터 구축 및 형질전환
IDD10의 1.2 kb ORF (open reading frame) cDNA를 GFP 융합 벡터 제조에 사용하였다. cDNA를 PCR로 분리하였으며 pGA1611 벡터의 HindIII 및 KpnI 부위에 클로닝하였다. IDD10 cDNA 및 GFP를 클로닝하기 위하여, 하기 PCR 프라이를 사용하였다: IDD10 Hind5: 5'-TAC AAG CTT ATG GCA TCG AAT TCA TCG GC-3': 서열번호 2; IDD10 3: 5'-ACT CAT GGC GGC GGC GGC CTG GCT GGC ATG CTC ATG GCT AGAC-3': 서열번호 3; GFP5: 5'-GCC GCC GCC GCC ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT TTC-3': 서열번호 4 및 GFP3: 5'-GAC CAT GGA GGT ACC GTC GAC AAG ATC TGC-3': 서열번호 5. 상보 벡터를 제작하기 위해, IDD10 2.5 kb의 게놈 프로모터 단편을 pGA1611의 BamHI 및 HindIII 부위에 클로닝하였다. 동일한 구축물에, 1.2 kb ORF cDNA를 pGA1611 벡터의 HindIII 및 KpnI 부위에 클로닝하였다. 조직학적 분석을 위해, 2.5 kb IDD10 프로모터 구간을 pCAMBIA 1381 벡터의 EcoRI 및 SalI 부위에 클로닝하였다. 벼 형질전환을 LBA4404 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 공동배양(co-cultivation) 방법으로 수행하였다 [Lee et al. 1999 J. Plant Biol . 42: 310-316]. 모든 형질전환 벼 식물체를 온실에서 키운 후 제한된(confined) 논으로 옮겼다.
4. GUS 분석
GUS 활성에 대한 조직화학적 염색은 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indoyl glucuronide) 용액 (1 mg/mL)에서 반응시켜 수행하였다. 상기 용액에는 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.1% 트리톤(Triton), 2 mM 육시아노철(II)산칼륨(potassium ferrocyanide), 및 200 ㎍/mL 클로람페니콜(chloramphenicol)이 포함되어 있다. 시료를 암소에서 2일간 37℃에서 반응시키고, 30-70% 에탄올로 단계적으로 탈수시켰다 [Chin et al. 1999 Plant J. 19(5): 615-623].
5. GFP 형광의 검출
IDD10:GFP 형질전환 식물의 종자뿌리를 Olympus 공초점 레이저 주사현미경 (Fluoview FV 1000, http://www.olympus-global.com/)으로 분석하였다. 형광 방출 상(images)을 480-540 nm에서 수집하였다. 핵 및 세포벽 검출을 위해 PI (Propidium iodide) 염색을 하였다.
6. 교차활성화( Trans - activation ) 분석
LacZ 및 HIS3 리포터 유전자를 포함하는 효모 균주 PJ69-4A [James et al. 1996 Genetics. 144: 1425-1436]를 교차활성화 분석에 사용하였다. pGBT9 벡터 (Clontech, http://www.clontech.com/)를 사용하여 Gal4 DNA-결합 도메인을 완전한 IDD10 ORF DNA, 처음 255개의 아미노산을 암호화하는 5' IDD10 단편, 또는 255번째에서 402번째까지의 아미노산을 암호화하는 IDD10 단편에 융합시켰다. 143번째에서 324번째까지 아미노산을 암호화하는 3' AtNAC1 단편을 양성 대조구로 사용하였다. 상기 구축물 또는 공(empty) 벡터 pGBT9를 효모 세포에 개별적으로 도입하였다. 효모 형질전환체를 30℃에서 3일간 SD/Trp 및 SD/His-플레이트 상에서 키웠다. 형질전환체의 독립적인 콜로니를 2 일간 액체 배지에서 키워, 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase) 활성에 대한 정량적 분석을 기질로서 ONPG(o-nitrophenyl-b-galactopyranoside)를 사용하여 수행하였다.
7. 인시츄 혼성화 ( In situ hybridization )
야생형 및 idd10을 1주일 동안 고체 0.5x MS 배지 상에서 키웠다. 조직을 4% (w/v) 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에서 12시간 고정하여, 에탄올로 단계적으로 탈수하였다. 탈수 후, 조직에 파라플라스트(paraplast)를 침투시켜 8 μm 두께로 절단하여, 폴리-라이신(poly-lysine)을 처리한 슬라이드에 45℃에서 밤새 마운팅한 후 히스토클리어(Histoclear)로 파라핀을 제거하였다. RT-PCR의 IDD10 C-말단 특이적 단편을 pGEM-7zf 벡터 (Promega)에 서브클로닝하여, 서열분석하였다. C-말단 특이적 구간을 클로닝하기 위해, PCR 프라이머 (세트 1: 정방향: 5'-CGA CCA CCT GCT GTC-3': 서열번호 6 및 역방향: 5'-ATT GCC AGC GTC GTC-3': 서열번호 7; 세트 2: 정방향: 5'-GGG CAG CAC TCG TTC CTG-3': 서열번호 8 및 역방향: 5'-GTT GAA GAG GTT AGG TC-3': 서열번호 9; 세트 3: 정방향: 5'-CTC GGC TTC TTC GCC AAC-3': 서열번호 10 및 역방향: 5'-CCT GCA CCA CAT CTG AAC-3': 서열번호 11)를 사용하였다. 인시츄 혼성화를 위한 안티센스 프로브를 제조하기 위해 플라스미드를 사용하였다. 플라스미드를 EcoRI을 사용하여 선상으로 만들어, SP6 RNA 중합효소로 전사하였다. 슬라이드를 50℃에서 밤새 가수분해된 프로브와 혼성화한 후 수세하였다. 슬라이드를 상온에서 2시간 동안 항(anti)-DIG-AP와 반응시키고, 상온 암소에서 X-인산염 용액 (BCIP; 0.175 mg/ml) 및 NBT (nitroblue tetrazolium salt; 0.34 mg/ml)를 포함하는 발색(developing) 용액 [100 mM Tris (pH 9.5), 100 mM Nacl, 5 mM MgCl2 ]으로 항체를 검출하였다. 3일간 반응 후 현미경으로 관찰하였다.
8. RNA 추출 및 정량적 RT - PCR 분석
총 세포 RNA를 RNeasy Plant Mini Kits (Qiagen, http://www.qiagen.com/)으로 분리하였다. RT-PCR을 위해, 제1가닥 cDNA를 DNase-처리한 RNA 및 Oligo dT12 -18 프라이머 (Invitrogen, http://www.invitrogen.com/)를 포함하는 25 ㎕ 반응 혼합물에서 MMLV(Moloney Murine Leukemia Virus) 역전사효소 RNaseH (Toyobo, http://www.toyobo.co.jp/e/)를 사용하여, 제조사의 지침에 따라 합성하였다. 이후 반응 혼합물 (1 ㎕)을 PCR 증폭에 사용하였다. 액틴(Actin ) 및 유비퀴틴(ubiquitin ) mRNA를 cDNA 정량에서 정규화(normalization)를 위해 사용하였다. 사용한 프라이머 쌍을 표 1에 제시하였다. 하기 유전자의 발현 수준을 분석하였다: 유비퀴틴(Ubiquitin ) [Park et al. 2008 Plant J. 56: 1018-1029], 액틴(Actin ), GDH1, GDH2 [Tomom et al. 2005 Plant Cell and Physiol . 46(10): 1724-1734], GS1 :1, GS1:2, GS1 :3 [Mayumi et al. 2005 Plant J. 42: 641-651], NADH - GOGAT1, NADH -GOGAT2 [Mayumi et al. 2007 Journal of Experimental Botany . Vol.58: 2319-2327], AMT1 :1, AMT1 :2, AMT1 :3, 및 IDD10. 모든 실험을 2회 또는 3회 반복하였다. PCR 산물을 MJ Research Quantity 소프트웨어 (GeneEx Macro OM 3.0)를 사용하여 정량화하였으며, 값을 동일한 시료의 유비퀴틴 또는 액틴 cDNA의 수준에 따라 정규화(normalization)하였다.
실시간 PCR 프라이머 서열
프라이머 서열번호 서열
유비퀴틴 F 12 CACGGTTCAACAACATCCAG
유비퀴틴 R 13 TGAAGACCCTGACTGGGAAG
액틴 F 14 CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA
액틴 R 15 CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA
GDH1 F 16 CATCTGATCATCTCCCTGTT
GDH1 R 17 TTCAGGCAATTCATCACT AC
GDH2 F 18 GGCCATTAACAACACTCATA
GDH2 R 19 ACGCCGATCTATCTTGAAT
GS1:1 F 20 CAAGTCTTTTGGGCGTGATATTGTTGAC
GS1:1 R 21 CTCAAGAATGTAGCGAG
GS1:2 F 22 AAAGGCGTTCGGCCGCGACATCGTGGA C
GS1:2 R 23 CACTTGGTCAGCAGCGGCGATGCCAACT
GS1:3 F 24 TAAATCGTACGGGCGCGACATCGTTGAT
GS1:3 R 25 GACATGATCCCCTGCGGAGACGCCAA
GOGAT1 F 26 GTGCAGCCTGTTGCAGCATAAA
GOGAT1 R 27 CGGCATTTCACCATGCAAATC
GOGAT2 F 28 CCTGTCGAAGGATGATGAAGGTGAAACC
GOGAT2 R 29 TGCATGGCCCTACTATCTTCGCATCA
AMT1:1 F 30 AGTACGTCGAGGAGATCTAC
AMT1:1 R 31 ACGTCGTTCGTTCTGGATTG
AMT1:2 F 32 TAGACATGGCCTCCCATCTC
AMT1:2 R 33 TAAGCATGATGTTCATGGTG
AMT1:3 F 34 AGGAGTACGTCGAGCTGATC
AMT1:3 R 35 CTTGCTCCGGCGACTTTCTG
IDD10 F 36 ACCTCACCGGCATCAAGAAG
IDD10 R 37 AGAGGCTGAGCGCCATGTTC
9. RT - PCR 분석
총 세포 RNA를 RNeasy Kit (Qiagen, Germany)을 사용하여 유묘(seedling)로부터 분리하였다. RNA 시료에 37℃에서 30분간 DNase를 처리하고, 65℃에서 15분간 반응정지액을 처리하였다. RT-PCR을 위해, 3 ㎍의 DNase-처리한 RNA 및 Oligo dT12 -18 프라이머 (Invitrogen)를 포함하는 반응 혼합물 25 ㎕에서 M-MuLV 역전사효소 RNaseH (Toyobo, Japan)로 제조사의 지침에 따라 제1가닥 cDNA를 합성하여, 2 ㎕의 반응 혼합물을 PCR 증폭에 사용하였다. PCR 산물을 아가로즈 겔 상에서 분리하여, 에티듐브로마이드(ethidium bromide)로 염색하였다. RT-PCR에 사용한 프라이머를 표 2에 제시하였다. 하기 유전자의 발현 수준을 분석하였다: 유비퀴틴 [Park et al. 2008 Plant J. 56: 1018-1029], 액틴1, OsPHYA, OsPHYB, OsPHYC [Jeong et al. 2007 Plant Cell and Environment. 30(5): 590-599], ACO1, ACO2, ACO3, ACO5, ACO7 [IWAMOTO et al. 2010 Plant Cell and Environment. 33: 805-815], 및 IDD10.
RT-PCR 프라이머 서열
프라이머 서열번호 서열
유비퀴틴 F 12 CACGGTTCAACAACATCCAG
유비퀴틴 R 13 TGAAGACCCTGACTGGGAAG
액틴1 F 38 TCCATCTTGGCATCTCTCAG
액틴1 R 39 GTACCCGCATCAGGCATCTG
OsPHYA F 40 CAAGATAGCGTCATGAACAA
OsPHYA R 41 AGTTCGACGCTGAGGATGAA
OsPHYB F 42 ATGGAACAGACACAATGTT
OsPHYB R 43 AGCATACACCATATCAGCTT
OsPHYC F 44 ATTGCTCATCTAGAGTTCAG
OsPHYC R 45 CATGACAACACAAGTGAAGA
ACO1 F 46 CTGCGGCGATGGAGCAGCTGGA
ACO1 R 47 CACGAACTTGGGGTACGCCACGA
ACO2 F 48 GATAGCGTGTGTACCACAGCGACC
ACO2 R 49 CACGGTACAGCACGCCGCAC
ACO3 F 50 CGCCGCCGAGGTCGTCCACG
ACO3 R 51 GCCCGTTACACACACTTGAG
ACO5 F 52 CCGAAGGAGCTTCTTGATCGG
ACO5 R 53 ATTTTGGCGCCTTGACGGCC
ACO7 F 54 GTGATCGCG CCGGCGACGGC
ACO7 R 55 GGGGAACCCTGCGTACTAC
IDD10 F 36 ACCTCACCGGCATCAAGAAG
IDD10 R 37 AGAGGCTGAGCGCCATGTTC
10. 암모늄 함량 결정
냉동 종자근을 10 mM 이미다졸 및 0.5% (w/v) 베타-머캅토에탄올을 포함하는 냉 Tris-HCl (pH 8.0) 버퍼 1 ml에서 막자사발 및 막자를 이용하여 갈았다. 추출물을 4℃에서 10 분간 13000 rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 F-kit (Roche)를 사용하여 제조사의 지침 [Oliveira et al. 2002 Plant Physiol . 129: 1170-1180]에 따라 효소적으로 암모늄 함량 결정에 사용하였다.
11. 효소 분석
GS 및 GDH 효소 활성을 측정하기 위해, 3일 된 신초(shoots) 및 종자근을 10 mM MgCl2, 10 mM 베타-머캅토에탄올, 1 mM PMSF, 및 500 μM AEBSF를 포함하는 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) 버퍼에서 갈았다. 4℃에서 10분간 원심분리 후, 상등액을 사용하여, Ishiyama 등 (2004) [Ishiyama et al. 2004 Journal of Biological Chemistry . 279: 16598-16605]의 방법에 따라 Gln 산물을 정량화함으로써 GS 활성을 측정하였다. GDH 활성은 Masclaux 등 (2000) [Masclaux et al. Planta . 211: 510-511]의 방법을 약간 변경하여 Glu 생성을 정량화함으로써 결정하였다. GOGAT의 측정을 위해, 3일 된 모조(shoots) 및 종자근을 0.2% 베타-머캅토에탄올, 1 mM EDTA (pH 7.5), 2 mM PMSF, 500 μM AEBSF, 및 100 mM KCl을 포함하는 50 mM KH2PO4-KOH (pH 7.5) 버퍼에서 갈았다. 4℃에서 10분간 13000 rpm에서 원심분리 후, 상등액을 Toshihiko 등 (1990) [Plant Cell and Physiol . 31(8): 1071-1077]에 따라 GOGAT 측정에 사용하였다.
12. DNA 서열결정 및 분석
뉴클레오티드 서열결정은 전문회사에 의뢰하였다. 뉴클레오티드 분석 및 번역되는 아미노산 서열 분석을 Clone Map211 프로그램으로 수행하였다. 상동서열 검색은 인터넷을 통해 NCBI Entrez server (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/); Syngenta (http://www.tmri.org/index.html); Chinadatabase (http://btn.genomics.org.cn/rice/)에서 수행하였다.
13. 유전자 예측 및 분석
서열을 Gene Mark (http://opal.biology. gatech.edu/); NCBI Entrez server (http:/www.ncbi.nlm. nih.gov/Entrez/); China database (http://btn.genomics.org.cn/rice/); Syngenta (http://www.tmri.org/index.html)로부터 추출하였다. 예측된 유전자의 분석을 Tiger (http://tigrblast.tigr.org/eukblast/index.cgi?project=osa1) 또는 Pfam (http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/pfm/) 데이터베이스를 통해 수행하였다.
실시예 1: 식물에서 ID 도메인 단백질의 동정
데이터베이스 검색을 통해, 15 개의 벼, 12 개의 옥수수, 및 15 개의 아라비돕시스 IDD 단백질을 동정했다. IDD 단백질들의 분자계통학적 분석은 쌍떡잎식물 및 외떡잎식물 IDD 단백질이 상이한 하위 군으로 분류된다는 것을 보여줬다. 선행기술의 보고는 IDD 단백질들 중 일부가 식물 발생에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여줬다. 옥수수 ID1, 벼 OsID1, 아라비돕시스 sgr5 , 및 OsMPT1는 분자계통수에서 가까이 위치하고 있는 서브클래스 I, II 및 III에 속한다. 두 가지 아라비돕시스 IDD 단백질 Jackdaw 및 Magpie는 서로 멀리 떨어진 서브클래스에 위치한다 (도 2).
실시예 2: idd10 의 게놈 구조 및 mRNA 수준
IDD10은 벼 게놈의 염색체 4 번에 위치하며, 3 개의 엑손 및 2 개의 인트론으로 이루어진다. IDD10 돌연변이는 T-DNA 삽입 집단으로부터 분리되었다. T-DNA는 IDD10 좌의 두 번째 인트론에 삽입되어 있다. 각각 두 번째 및 세 번째 엑손에 위치하는 F 및 R 프라이머를 이용한 RT-PCR은 IDD10 돌연변이체로부터 아무런 전사물이 생성되지 않았음을 보여줬다 (도 3).
실시예 3: IDD10 의 발현 양상
생체 내 IDD10의 발현 양상을 연구하기 위해, 2.5 kb 내재성 IDD10 프로모터에 의해 구동되는 GUS 리포터 유전자를 보유하는 형질전환 식물을 생성했다. GUS는 관근, 측근 원기(premordia) 및 종자근 신장대의 유관속 부위에서 발현되었다. 또한, 상기 발현은 잎 정단, 꽃 기관, 및 신초(shoot) 정단분열조직 외측 부위에서 관찰되었다 (도 4A). GUS 발현 양상을 밝혀내기 위해, 안티센스 IDD10 프로브를 이용해 인시츄 혼성화 (in situ hybridization)를 수행했다. 횡단면에서, 관근 및 측근 원기에서의 특이적 발현이 확인되었다 (도 4B). IDD10의 이들 생체 내 발현 양상은 RT-PCR을 이용해 추가로 확인되었다. PCR은 IDD10 mRNA가 모든 조직에서 검출되었음을 보여줬지만, 어린 잎에서는 약한 발현 수준을 보였다 (도 4C).
실시예 4: 형질전환 식물에서 IDD10 : GFP 의 핵 내 위치
일부 옥수수 IDD 단백질은 DNA 결합능을 보이므로, IDD10은 전사 인자로 추정된다 (Akiko et al., 2004 Nucleic Acid Research . Vol. 32: 1710-1720). IDD10은 또한 N-말단 영역에 NLS (nuclear localization sequences)를 보유한다. IDD10이 세포 내 위치함은 IDD10을 전사 인자로 추정하는 증거이다. 세포 내 위치를 조사하기 위해, 유비퀴틴 프로모터에 의해 발현되는 IDD10의 C-말단에 GFP가 융합된 형질전환 식물을 만들었다. 형광 이미지화는 IDD10:GFP가 측근의 핵 내에 있다는 것을 보여줬다 (도 5A).
실시예 5: 효모에서 IDD10 의 교차활성화( Trans - activation ) 검정
IDD10이 전사 활성을 가졌는지 여부를 알기 위해, IDD10의 전장 (402 아미노산), N-말단 (255 아미노산) 및 C-말단 (147 아미노산) 영역을 pGBT9 벡터를 이용하여 발현시켰다. 상기 cDNA를 Gal4 DNA-결합 도메인에 융합시켰다. AtNAC1를 양성 대조구로 이용했다. 상기 형질전환체들의 효모 콜로니들은 전장 및 C-말단 형질전환체들이 His3 및 LacZ 리포터 유전자를 활성화할 수 있고, 특히 C-말단 영역은 강한 활성화 활성을 갖는다는 점을 보여줬다. 또한, AtNAC1 형질전환은 His3 및 LacZ 리포터 유전자의 강한 활성화를 초래했다 (도 5B).
실시예 6: idd10 의 표현형 발현
IDD10 돌연변이체의 표현형을 관찰하기 위해, 식물들을 노지 및 생장상(growth chamber)에서 재배했으나, 토양에서 재배한 식물에서는 주목할만한 표현형이 관찰되지 않았다. 흥미롭게도, idd10의 종자근 코일링이 액체 0.5x MS 재배 식물에서 관찰되었지만, 신초(shoot)는 정상적인 생장을 나타냈다. 종자근 코일링이 MS 배지와 관련되어 있는지 여부를 시험하기 위해, 돌연변이체를 dH2O에서 재배했다. 결과는, idd10의 종자근 코일링이 MS 배지에 좌우된다는 점을 보여줬다 (도 6A). 돌연변이체의 기타 뿌리 기관을 조사하기 위해, 식물을 액체 0.5x MS 배지에서 5일 동안 재배하고, 각 뿌리 기관의 길이를 측정했다. 결과는, 야생형 및 돌연변이체 식물 사이에 측근 및 관근의 길이에 있어서 차이가 없는 것으로 나타났다 (표 3). 이후 분석에서, 돌연변이체가 0.5x MS 배지에서 자라더라도 종자근 코일링은 암소에서는 발생하지 않는다는 것을 발견했다 (도 2B). 상기 결과는, 종자근의 코일링이 조건부 표현형이며, 빛 및 MS 배지에 의해 좌우된다는 것을 시사한다.
야생형 및 idd10의 뿌리 길이
종자근 길이 (mm) 측근 길이b (mm) 관근 길이c (mm)
야생형a 48±0.23d 9.19±0.91 33.7±1.81
idd10 24±0.32 9.23±0.85 32.5±2.25
a식물을 1/2 MS 배지에서 5일 동안 재배함.
b종자근의 시작점으로부터 0 내지 2 cm의 영역에서 식물마다 5 개씩 무작위로 선별한 측근의 길이를 측정함.
c식물마다 2 개씩 무작위로 선별한 관근의 길이를 측정함.
d나타낸 값은 10 개의 식물로부터의 평균±SDS 임.
실시예 7: NH 4 + 가 idd10 표현형의 원인
MS 배지에서의 idd10의 종자근 코일링이 어느 구성성분에 의한 것인지 알기 위해, MS 배지의 13 가지 구성성분들을 연이은 실험에서 조사했다. 돌연변이체 식물을 한가지 구성성분을 제거한 변형 MS 배지에서 재배했다. 3일령의 돌연변이체 식물을 분석하였고, 종자근 코일링은 10 mM NH4NO3 제거 배지를 제외한 모든 생장 배지에서 관찰되었다 (도 7). 도 7에 나타낸 바와 같이, 화합물은 NH4 + 및 NO3 -의 혼합물이다. 표현형 발생에 필요한 질소원을 확인하기 위해, 10 mM KNO3 또는 5 mM (NH4)2SO4를 NH4NO3 제거 배지에 첨가했다. 5 mM K2SO4를 황산염 대조구로 이용했다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 식물을 10 mM NH4NO3 부재 배지 (A), 10 mM KNO3 첨가 배지 (B) 및 5 mM K2SO4 첨가 배지 (D)에서 식물을 재배할 때에는 돌연변이 표현형이 검출되지 않았다. 종자근 코일링은 5 mM (NH4)2SO4가 첨가된 배지에서 재배한 식물에서 관찰되었다 (C). 이는, 암모늄이 idd10의 종자근 코일링 표현형의 원인이라는 것을 의미한다.
실시예 8: 야생형 및 돌연변이체 식물에서의 NH 4 + 매개된 유전자 발현
암모늄 이온은 암모늄 수송체 (AMT)를 통해 뿌리로 흡수되며, 연이어 글루타민의 아미드 잔기로 동화된다. 글루타민은 다수의 아미노산 합성에 이용되는 글루타메이트로 변환된다 [Mayumi et al. 2007 Journal of Experimental Botany . Vol.58: 2319-2327]. 야생형 및 돌연변이체 뿌리에서 암모늄 흡수 및 동화 유전자의 발현 수준을 분석하기 위해, 액체 0.5x MS에서 재배한 3 일령 식물 뿌리를 검사했다. 실시간 PCR을 수행하여 10 개의 후보 유전자의 발현 수준을 분석했다. 이들 중에서 3 개의 AMT1 (암모늄 수송체) 군 유전자 및 GS1 :2 (세포질 글루타민 합성효소1:2) 유전자는 돌연변이체에서 더 낮은 발현 수준을 나타냈다. 한편, GDH2 (glutamate dehydrogenase2)는 야생형 식물에 비해 돌연변이체에서 약간 더 높은 발현 수준을 나타냈다 (도 9). 실시간 PCR 데이터에 근거하여 암모늄 동화 관련 효소의 활성을 추가로 측정했다.
실시예 9: MeA 흡수 및 동화 관련 효소의 활성
MeA(Methyl-ammonium)은 뿌리에서 암모늄 수송체에 의해 흡수될 수 있는 암모늄 이온의 유사체이다. 이는 유묘 생장을 저해한다 [Dominique et al. 2006 Plant J. 48: 522-534]. 벼에서, 높은 농도의 MeA는 종자근 신장을 저해한다. 야생형 및 IDD10 돌연변이체 식물에서의 암모늄 흡수 활성을 조사하기 위해, 10 mM NH4NO3 대신 MeA가 첨가된 변형 0.5x MS 배지에서 식물을 재배했다. 3 가지 상이한 농도의 MeA를 용액에 첨가하고, 5 일령 식물의 종자근을 측정했으나, 야생형 및 돌연변이 식물 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다 (도 10A). 글루타민 합성효소, 글루타메이트 신타아제 및 글루타메이트 디히드로게나아제의 효소 활성은 액체 0.5x MS 배지에서 재배한 3 일령 식물의 뿌리 및 신초에서 측정했다 (도 10B-D). 글루타민 합성효소는 돌연변이체 뿌리에서 더 낮은 활성을 나타낸 반면, 신초에서는 차이가 검출되지 않았다. 뿌리 및 신초의 두 가지 모두 글루타메이트 신타아제에서는 비슷한 활성을 나타냈다. 글루타메이트 디히드로게나아제 활성은 야생형 뿌리보다는 돌연변이체 뿌리에서 더 높았지만, 돌연변이체 신초에서는 야생형 신초에서보다 더 낮은 활성을 나타냈다. 상기 결과는 실시간 PCR의 데이터와 일치했다.
실시예 10: 형질전환 식물을 이용한 상보성( complementation ) 분석
IDD10 돌연변이체는 광 하에서 0.5x MS 배지에서 종자근의 코일링을 나타낸다. 종자근 코일링의 표현형이 IDD10의 돌연변이에 의해 초래되는지의 여부를 유전자 수준에서 확인할 필요가 있다. 상보성 시험을 위해, 2.5 kb 내재성 IDD10 프로모터 영역이 전장 cDNA를 발현하는 구축물로 감염된 IDD10 돌연변이체 캘러스로부터 10 개를 초과하는 독립적인 형질전환 식물을 재생시켰다 (도 11A). 상보성 계통들 중에서, 6개의 계통을 0.5x MS 배지에서 선별하여, IDD10의 mRNA 수준에 대해 추가로 분석했다. 뿌리 코일링 표현형 및 종자근 길이를 야생형, idd10 및 두 가지 상보성 계통에서 측정했다 (도 11B, C). 상보성 계통 2 및 3으로부터 분리된 상보성 식물 및 IDD10 돌연변이체를 또한 비교했다. 돌연변이 표현형은 IDD10 mRNA 수준과 연관성이 있었다. 상기 결과는 IDD10 돌연변이체의 종자근 코일링이 IDD10의 돌연변이의 결과임을 나타냈다.
실시예 11: 돌연변이체에서 NH 4 + 매개된 유전자 발현, 상보성 및 과발현
암모늄 수송체 및 동화 유전자는 외부 암모늄 공급에 의해 신속하게 유도되는 것으로 보고되었다 [Yutaka et al. 2003 Plant Cell and Physiol. 44(7): 726-734]. 돌연변이체 및 과발현체에서의 AMT 및 동화 유전자의 유도를 이해하기 위해, 식물을 발아 후 14일 동안 온실에서, dH2O에서 재배했다. 질소가 없는 영양 용액에서 유묘를 3 일간 더 재배했다. 이어서, 유묘를 pH 5.5에서 0.5 mM (NH4)2SO4를 함유하는 영양 용액으로 옮겼다. (NH4)2SO4 공급 후 0, 3, 6, 12 시간째에 전체 뿌리를 수확했다.
실시간 PCR을 수행하여 IDD10이 신속한 유도 과정에 관여하는지 여부를 분석했다. 분석한 유전자에는 2 가지 암모늄 수송체, AMT1 :1 및 AMT1 :2, 및 4 가지 동화 유전자, 글루타민 합성효소 (GS1 :2), 글루타메이트 신타아제 (NADH - GOGOAT1), 및 2 가지 글루타메이트 디히드로게나아제 (GDH1, GDH2)가 포함된다. 식물을 1mM 암모늄에 노출시키면, 돌연변이체 및 야생형 사이에서 유사한 역학으로 암모늄에 의해 상기 유전자들이 유도되나, AMT1 :1, 1:2, 및 NADH - GOGAT1의 유도 수준은 돌연변이체에서는 야생형 식물에서보다 현저히 더 낮았다 (도 12A-F).
IDD10의 가능한 표적 유전자를 동정하기 위해, 상기 유전자들의 유도 양상을 과발현 계통 2에서 분석했다. 과발현 계통 2에서, NADH - GOGAT1, GDH1 및 GDH2의 유도 수준은 야생형에서 약간 더 높았다. 한편, GS1 :2는 비교 대상인 과발현 계통 2 및 야생형 사이에서 유사한 유도 수준을 나타냈다. AMT1 :1 mRNA는 OX에서 야생형에 비해 더 낮은 수준으로 축적되었다. AMT1 :1은 OX 및 돌연변이체에서 유사한 양상을 나타냈다. 대조적으로, AMT1 :2의 유도는 OX에서 야생형보다 훨씬 더 높았다. 액틴을 각 유전자의 mRNA 수준의 정규화를 위한 대조구로 이용했다 (도 13A-F). 상기 결과들은 IDD10이 암모늄 매개된 유전자 유도에 관여한다는 점을 시사한다. 더욱이, AMT1 :2가 IDD10의 직접적인 표적일 가능성이 크다.
실시예 12: IDD10 발현에 미치는 NH 4 + 또는 질소 대사물 의 영향
AMT1 :1 및 1:2 발현에 미치는 내부 질소 구성성분의 피드백 조절을 검사했다. 질소 공급 중단에 이은 암모늄 처리는 AMT1 :1 및 1:2의 전사 수준을 증가시켰으나, 글루타민 합성효소 저해제 MSO를 암모늄과 함께 공급한 경우 암모늄 반응은 나타나지 않았다. 글루타민 또는 아스파라긴 공급은 AMT1 :1 및 1:2의 전사물 수준을 유도했다 [Yutaka et al. 2003 Plant Cell and Physiol . 44(12): 1396-1402]. IDD10의 발현에 미치는 암모늄 또는 내부 질소 구성성분의 효과를 이해하기 위해, 야생형 식물을 발아 후 14일 동안 온실에서 dH2O에서 재배했다. 질소가 없는 영양 용액에서 유묘를 3일 더 재배했다. 이어서, 유묘를 하기의 화학물질들 중 하나를 포함하며 질소가 없는 영양 용액으로 옮겼다: 1 mM NaNO3, 0.5 mM (NH4)2SO4, 1 mM MSO, 0.5 mM (NH4)2SO4 또는 5 mM L-글루타민이 함께 있는 1 mM MSO. 암모늄 공급 후 3 시간째에 전체 뿌리를 시료로 만들었다. IDD10 mRNA 수준을 실시간 PCR로 분석하고, 액틴을 대조구로 이용했다. 1 mM NaNO3, 0.5 mM (NH4)2SO4 및 5 mM L-글루타민은 IDD10 mRNA 수준을 하향조절한 반면, 1 mM MSO 및 0.5 mM (NH4)2SO4의 처리는 IDD10의 발현 수준을 변화시키지 않았다. 또한, MSO는 단독으로는 IDD10 발현 수준에 영향을 미치지 않았다 (도 14A). 따라서, IDD10은 흡수 및 동화에 대해 감수성인 것으로 보인다. OsAMT1 :2를 동일한 처리 하에 질소-피드백 조절에 대해 검사했다. 결과는 OsAMT1 :2가 글루타민 및 외부 NH4 +에 의해 유도되는 것으로 나타났다. OsAMT1 :2의 수준에 있어서 MSO 처리 결과는 내부 NH4 +에 의해 유도되지 않았으므로 (도 14B), 상기 결과는 IDD10이 글루타민에 대해서도 감수성임을 시사했다. 그러나, IDD10 및 OsAMT1 :2는 외부 글루타민 처리에 의해서는 상반되는 효과를 나타냈다.
실시예 13: MSO 공급은 idd10 표현형을 억제한다
외부로부터 고농도 암모늄의 공급에 의해 유도된 종자근의 코일링을 글루타민 합성효소 저해제 MSO가 복구시킨다는 보고가 있다 [Tatsuya et al. 2008 Physiologia Plantarum. 134: 183-190]. mRNA 검사로 IDD10 발현이 글루타민에 의해 조절되는 것으로 나타냈다 (도 14A). MSO에 의한 형태학적 효과를 조사하기 위해, 식물을 1 μM MSO의 존재 또는 부재 하에 1/2 MS 배지에서 3일 동안 재배했다. 흥미롭게도, 종자근 코일링 표현형은 MSO 처리된 돌연변이체 식물에서 사라졌다 (도 15A). MSO 공급은 글루타민 합성효소 작용을 차단하여 내부 암모늄 농도를 증가시킨다. 3 일령 식물로부터의 야생형 및 돌연변이 뿌리를 내부 암모늄 함량에 대해 분석했다. 1 μM MSO의 존재 하에, 야생형 및 돌연변이체는 MSO가 없는 것에 비해 매우 높은 농도의 암모늄을 축적했다 (도 15B). 상기 결과들은 내부 암모늄 자체가 돌연변이체 식물에서 종자근 코일링을 유도하는 것은 아니라는 것을 시사한다.
실시예 14: OsPHYB 돌연변이는 idd10 표현형을 억제한다
IDD10 돌연변이체는 광 조건 하의 0.5x MS 배지에서 종자근 코일링 표현형을 나타냈다 (도 6). 식물은 원적색광, 적색광 및 청색광을 감지한다. 그들의 수용체 (피토크롬 및 크립토크롬)에 대한 특성분석은 꽤 많이 되어 있다. 종자근 코일링 및 광 신호전달 사이의 관계를 이해하기 위해, OsPHYA, OsPHYB 및 OsPHYC T-DNA 삽입 돌연변이체를 이용했다 [Miyo et al. 2006 Plant J. 47: 619-628]. 이들을 IDD10 돌연변이체와 교배했다. 세가지 피토크롬 유전자의 발현 양상을 뿌리 및 신초 조직에서 분석했다. RT-PCR 결과는 모든 세 가지 피토크롬 유전자가 뿌리 및 신초 조직에서 발현됨을 보여줬고, 액틴을 대조구로 이용했다 (도 16A). 이중 돌연변이체에서, phyA 및 phyC는 IDD10 돌연변이 표현형을 변화시키지 않았다. 그러나, phyB 돌연변이는 idd10 종자근 코일링 표현형을 강력하게 억제했다 (도 16B a-c).
실시예 15: phyB 뿌리에서 OsAMT1 :2 의 유도 증가
IDD10 돌연변이체 및 과발현 식물에서 6 가지 후보 유전자를 이용하여 암모늄 매개된 신속한 유도를 분석했다. 이들 중에서, 오직 OsAMT1 :2 만이 야생형 식물에 비해 돌연변이체에서는 현저히 낮은 유도를, 과발현체에서는 높은 유도를 나타냈다 (도 12B 및 도 13B). 이는 OsAMT1 :2가 IDD10의 표적 유전자일 수 있음을 의미한다. 종자근 코일링 표현형과 OsAMT1 :2 발현 수준 사이의 관계를 더 조사하고자, 야생형, phyB, idd10 및 phyB / idd10 식물에서 암모늄으로 유도된 OsAMT1 :2 발현 수준을 분석했다. 식물체를 질소가 없는 배지에서 수경재배로 예비재배하고, 이어서 0.5 mM (NH4)2SO4를 함유하고 질소가 없는 용액으로 옮겼다. 암모늄 공급 후 전체 뿌리를 0, 3, 6 시간째에 시료로 만들었다. OsAMT1 :2 발현 수준은 3 시간째에 최대에 이르렀다. OsAMT1:2 유전자 유도는 실시간 PCR로 측정했다. OsAMT1 :2의 발현 수준은 야생형에서보다 phyB 돌연변이 식물에서 더 높았다. 또한, OsAMT1 :2 유도는 idd10 단일 돌연변이에서보다 phyB / idd10 이중 돌연변이 식물에서 더욱 강했다. phyB / idd10 식물에서, OsAMT1:2 유도 수준은 야생형 식물의 수준에 달했다 (도 17).
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for regulating root morphology of plant by controlling expression of OsIDD10 gene isolated from rice <130> PN10298 <160> 55 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1206 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggcatcga attcatcggc tgcagctgcg gcggcgttct tcgggattag cagggatggg 60 gaccagcatg accagattaa gccgctgata tcacaccaac agcaccagca ccagcagcag 120 cagctggcag cgtcactgac cggcgtggca acagcggcgc ctactgcggc gtccagccaa 180 ggcgcaccgc cggcggcgcc accggccaag aagaagagaa atctaccaga cccggacgcg 240 gaggtgatag cgctgtcgcc caagacgctg ctggcgacga accggttcgt gtgcgaggtg 300 tgcaacaagg gattccagcg ggagcagaac ctacagctgc accggcgagg ccacaacctg 360 ccgtggaagc tgaagcagaa gaacccggcg caggcgcagc gccgccgcgt gtacctgtgc 420 ccggagccga cgtgcgtcca ccacgacccg gcccgcgccc tcggcgacct caccggcatc 480 aagaagcact tctgccgcaa gcacggcgag aagaagtgga agtgcgacaa gtgctccaag 540 cgctacgctg tccagtccga ctggaaggcc cactccaaga tctgcggcac ccgcgagtac 600 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP5 primer <400> 4 gccgccgccg ccatgagtaa aggagaagaa cttttc 36 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP3 primer <400> 5 gaccatggag gtaccgtcga caagatctgc 30 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR 1F primer <400> 6 cgaccacctg ctgtc 15 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR 1R primer <400> 7 attgccagcg tcgtc 15 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR 2F primer <400> 8 gggcagcact cgttcctg 18 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR 2R primer <400> 9 gttgaagagg ttaggtc 17 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR 3F primer <400> 10 ctcggcttct tcgccaac 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR 3R primer <400> 11 cctgcaccac atctgaac 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ubiquitin F primer <400> 12 cacggttcaa caacatccag 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ubiquitin R primer <400> 13 tgaagaccct gactgggaag 20 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> actin F primer <400> 14 cttcatagga atggaagctg cgggta 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> actin R primer <400> 15 cgaccacctt gatcttcatg ctgcta 26 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GDH1 F primer <400> 16 catctgatca tctccctgtt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GDH1 R primer <400> 17 ttcaggcaat tcatcactac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GDH2 F primer <400> 18 ggccattaac aacactcata 20 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GDH2 R primer <400> 19 acgccgatct atcttgaat 19 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS1:1 F primer <400> 20 caagtctttt gggcgtgata ttgttgac 28 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS1:1 R primer <400> 21 ctcaagaatg tagcgag 17 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS1:2 F primer <400> 22 aaaggcgttc ggccgcgaca tcgtggac 28 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS1:2 R primer <400> 23 cacttggtca gcagcggcga tgccaact 28 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS1:3 F primer <400> 24 taaatcgtac gggcgcgaca tcgttgat 28 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GS1:3 R primer <400> 25 gacatgatcc cctgcggaga cgccaa 26 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GOGAT1 F primer <400> 26 gtgcagcctg ttgcagcata aa 22 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GOGAT1 R primer <400> 27 cggcatttca ccatgcaaat c 21 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GOGAT2 F primer <400> 28 cctgtcgaag gatgatgaag gtgaaacc 28 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GOGAT2 R primer <400> 29 tgcatggccc tactatcttc gcatca 26 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMT1:1 F primer <400> 30 agtacgtcga ggagatctac 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMT1:1 R primer <400> 31 acgtcgttcg ttctggattg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMT1:2 F primer <400> 32 tagacatggc ctcccatctc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMT1:2 R primer <400> 33 taagcatgat gttcatggtg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMT1:3 F primer <400> 34 aggagtacgt cgagctgatc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMT1:3 R primer <400> 35 cttgctccgg cgactttctg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDD10 F primer <400> 36 acctcaccgg catcaagaag 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDD10 R primer <400> 37 agaggctgag cgccatgttc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> actin1 F primer <400> 38 tccatcttgg catctctcag 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> actin1 R primer <400> 39 gtacccgcat caggcatctg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHYA F primer <400> 40 caagatagcg tcatgaacaa 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHYA R primer <400> 41 agttcgacgc tgaggatgaa 20 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHYB F primer <400> 42 atggaacaga cacaatgtt 19 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHYB R primer <400> 43 agcatacacc atatcagctt 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHYC F primer <400> 44 attgctcatc tagagttcag 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHYC R primer <400> 45 catgacaaca caagtgaaga 20 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACO1 F primer <400> 46 ctgcggcgat ggagcagctg ga 22 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACO1 R primer <400> 47 cacgaacttg gggtacgcca cga 23 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACO2 F primer <400> 48 gatagcgtgt gtaccacagc gacc 24 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACO2 R primer <400> 49 cacggtacag cacgccgcac 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACO3 F primer <400> 50 cgccgccgag gtcgtccacg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACO3 R primer <400> 51 gcccgttaca cacacttgag 20 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACO5 F primer <400> 52 ccgaaggagc ttcttgatcg g 21 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACO5 R primer <400> 53 attttggcgc cttgacggcc 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACO7 F primer <400> 54 gtgatcgcgc cggcgacggc 20 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACO7 R primer <400> 55 ggggaaccct gcgtactac 19

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 벼 유래의 OsIDD10 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 OsIDD10 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물의 뿌리 형태를 조절하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 OsIDD10 유전자의 발현을 억제하여 식물의 뿌리가 나선형(coil)으로 되게 하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 벼 유래의 OsIDD10 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환되어 식물의 뿌리 형태가 조절되는 식물체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
  5. 제4항에 따른 식물체의 종자.
  6. 벼 유래의 OsIDD10 유전자를 포함하는 식물의 뿌리 형태 조절용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식물은 단자엽식물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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