KR20120080615A - 세포 및 조직 표적화를 위한 광촉발형 나노입자 - Google Patents

세포 및 조직 표적화를 위한 광촉발형 나노입자 Download PDF

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KR20120080615A
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ligand
composition
protecting group
targeting
peptide
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KR1020127010831A
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English (en)
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탈 드비르
다니엘 에스. 코헤인
매튜 리안 뱅하트
로버트 에스. 랭거
Original Assignee
메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
더 칠드런스 메디칼 센터 코포레이션
프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
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Abstract

본 발명은 부분적으로는 조광시에 선택적으로 임의의 조직을 표적화하고 그에 결합하는 신규의 간단한 미립자 시스템에 관한 것이다. 이 미립자 시스템은 개체에서 미리 정해진 세포 또는 조직으로 물질을 표적화된 방식으로 전달하는 데 사용될 수 있다.

Description

세포 및 조직 표적화를 위한 광촉발형 나노입자{PHOTOTRIGGERED NANOPARTICLES FOR CELL AND TISSUE TARGETING}
관련 출원
본 출원은 2009년 9월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 61/247,535 (발명의 명칭: "Phototriggered nanoparticles for cell and tissue targeting")의 출원일에 대한 혜택을 주장한다. 참조된 가출원의 전체 교시 내용 및 전문이 본원에 참고로 포함된다.
연방 지원 연구
본 발명은 승인 번호 GM073626에 의해 미국 국립 보건원(NIH: National Institute of Health)으로부터 전부 또는 일부 지원을 받았다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가진다.
발명의 기술 분야
본 발명은 개체에서 물질을 표적화된 방식으로 전달하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
약물 요법과 관련하여 큰 걸림돌은 비특이적인 독성 또는 비효율적인 요법을 유발하지 않으면서 치료제를 신체의 특정 부위로 운반하지 못한다는 점이다. 나노기술이 진보해 감에 따라, 나노입자가 이환 세포 및 조직의 독특한 특성을 특이적으로 인식함으로써 그에 결합하여 표적률을 증가시킬 수 있게 하는 표적화 부분으로 나노입자의 표면을 변형시키는 개발 기법으로 약물 전달 연구에서의 주요 관심이 집중되었다. 그러한 표적자는 보통 항체, 펩티드 또는 압타머로 구성되며, 세포 상의 그의 결합 부위는 특이적인 수용체, 채널, 또는 세포막 상에 존재하는 다른 분자이다.
공학처리된 나노입자를 종양으로 선택적으로 표적화하는 것이 최근 연구를 통해 성공적으로 입증되었으며, 그러한 표적화 시스템의 실현가능성에 대해서는 이미 임상적으로 입증된 바 있다. 나노미립자 시스템이 순환 세포와 표적 세포 사이의 경로 상에 놓인 2가지 주된 장벽을 극복할 수 있다면, 상기 표적화 시스템을 공학처리하는 데 있어 나노미립자 시스템은 더욱 효과적일 수 있다. 첫번째 난관은 내피 세포를 포함하는 혈관 사이로 침투함으로써 혈관계를 떠날 수 있는 나노캐리어의 능력은 비효율적이라는 점이다. 암 치료용으로 디자인된 표적화 시스템에서, 연구원들은 이환 부위내 혈관 누수에 의존하는데, 이를 통해 나노입자는 용이하게 침투될 수 있고, 이환 세포 쪽으로 쉽게 침습될 수 있다. 두번째 난관은 이환 세포 상에서의 막 단백질의 독특한 발현을 찾아내고, 표적자로서 작용할 수 있는 특이적인 리간드를 디자인하는 것이다. 다수의 질환으로 인해 연구원들은 나노입자가 순환에서 쉽게 빠져나올 수 있는 혈관 누수를 얻을 수 있는 호사를 누릴 수 없거나, 세포가 표적으로서 작용할 수 있는 공지의 독특한 바이오마커를 소지하고 있지 않은 바, 치료제가 적재된 나노입자를 이환 조직 및 기관 쪽으로 표적화하는 신규한 접근법이 시급하게 요구되고 있다.
발명의 개요
한 측면에서, 본 발명은 표적화 부분에 부착된 전달 부분을 포함하는 조성물을 제공함으로써 작용제/물질을 표적 부위로 전달하기 위한 조성물의 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 한 측면은, 복수 개의 입자를 포함하며, 각 입자는 개체에게로 전달시키고자 하는 유효량의 물질을 함유하고, 여기서, 광-제거가능한 보호기를 사용하는 케이징 (caging)에 의해 불활성화된 표적화 리간드가 입자의 표면에 부착되어 있고, 여기서, 불활성 리간드는 조성물에의 조사에 의해 이루어지는 보호기의 제거로 활성화되고, 여기서, 활성 리간드는 항-리간드에 결합할 수 있는 것인, 조성물을 포함한다.
본 발명의 일부 측면에 따라, 개체에서 미리 정해진 세포 또는 조직으로 물질을 표적화된 방식으로 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은, 개체에게로 전달시키고자 하는 유효량의 물질을 함유한 입자를 포함하며, 여기서, 광-제거가능한 보호기를 사용하는 케이징에 의해 불활성화된 표적화 리간드가 입자의 표면에 부착되어 있는 것인 조성물을 미리 정해진 세포 또는 조직으로 물질을 표적화된 방식으로 전달하는 것이 필요한 개체에게 투여하는 단계, 및 개체에서 미리 정해진 세포 또는 조직에 선택적으로 조사하여 조사된 미리 정해진 세포 또는 조직 중의 불활성 리간드를 보호기의 제거에 의해 활성화시키고, 여기서, 활성 리간드는 부착된 입자와 함께 미리 정해진 세포 또는 조직 상에 존재하는 항-리간드에 결합할 수 있고, 이를 통해 개체에게 물질을 표적화된 방식으로 전달하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 측면에 따라, 개체에서 미리 정해진 세포 또는 조직으로 물질을 표적화된 방식으로 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 개체에게로 전달시키고자 하는 유효량의 물질을 함유한 입자를 포함하며, 여기서, 광-제거가능한 보호기를 사용하는 케이징에 의해 불활성화된 표적화 펩티드가 입자의 표면에 부착되어 있는 것인 조성물을 미리 정해진 세포 또는 조직으로 물질을 표적화된 방식으로 전달하는 것이 필요한 개체에게 투여하는 단계, 및 개체에서 미리 정해진 세포 또는 조직에 선택적으로 조사하여 조사된 미리 정해진 세포 또는 조직 중의 불활성 리간드를 보호기의 제거에 의해 활성화시키고, 여기서, 활성 펩티드는 부착된 입자와 함께 미리 정해진 세포 또는 조직 상에 존재하는 인테그린에 결합할 수 있고, 이를 통해 개체에게 물질을 표적화된 방식으로 전달하는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 측면에 따라, 복수 개의 입자를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 각 입자는 개체에게로 전달시키고자 하는 유효량의 물질을 운반할 수 있고, 여기서, 광-제거가능한 보호기를 사용하는 케이징에 의해 불활성화된 표적화 리간드가 입자의 표면에 부착되어 있고, 여기서, 불활성 리간드는 조성물에의 조사에 의해 이루어지는 보호기의 제거로 활성화되고, 여기서, 활성 리간드는 항-리간드에 결합할 수 있는 것이다.
하기 실시양태는 달리 언급되지 않는 한, 본원에 기재된 본 발명의 각종 측면에 동등하게 적용된다.
일부 실시양태에서, 리간드는 펩티드, 항체, 및/또는 압타머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 RGD 또는 YIGSR (서열 1) 아미노산 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 광-제거가능한 보호기는 2-니토벤질, 벤조인 에스테르, N-아실-7-니트인돌린, 메타-페놀, 페나실 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서 광-제거가능한 보호기는 4,5-디메톡시-2-니트로벤질 (DMNB) 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서 광-제거가능한 보호기는 리간드에 공유적으로 부착되어 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 상이한 표적화 리간드가 입자의 표면에 부착되어 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 중 1종 이상은 조직 특이적이다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 세포 유형 특이적이다. 일부 실시양태에서, 세포 유형은 HUVEC, MSC, 섬유모세포, 심근세포 및 인간 배아 줄기 세포 (hESC)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 바, 입자와 관련하여 유효량이란 복수 개의 입자를 포함하는 조성물을 대상체에게로 투여할 때 대상체에서 원하는 의학적 효과를 달성하는 데 충분한 양이라는 것을 이해하여야 한다. 일부 실시양태에서, 단일 입자 중의 양이 원하는 효과를 발휘하는 데 충분하다면 단일 입자도 유효할 수 있다. 그러나, 전형적으로는 복수 개의 입자가 대상체에게 투여되고, 각 입자에 대한 유효량이란 본원에서 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, 투여되는 입자의 개수와 투여 빈도에 기초한, 대상체에서 원하는 결과를 달성하도록 하는데 충분한 총 누적 용량을 제공하는 양이다.
본 발명의 제한사항들 각각은 본 발명의 다양한 실시양태를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 한 요소 또는 요소들의 조합을 포함하는 본 발명의 제한사항들 각각이 본 발명의 각 측면에 포함될 수 있는 것으로 예측된다. 본 발명은 다른 실시양태일 수도 있고, 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 어구 및 용어는 설명을 목적으로 한 것이며, 제한하는 것으로서 간주되지 않아야 한다. 본원에서 "~비롯한(including)," "~포함하는(comprising)," 또는 "~가진," "~함유하는," "~포함하는(involving)" 및 그의 파생어들의 사용은 이하 열거되는 사항 및 그의 등가물 뿐만 아니라, 추가의 사항들도 포함한다는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 측면 및 다른 측면 뿐만 아니라, 다양한 이점 및 유용성은 상세한 설명을 참고함으로써 자명해질 것이다. 본 발명의 각 측면은 다양한 실시양태를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
본 출원에서 확인되는 모든 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
첨부된 도면은 일정 비율로 확대되거나 축소되어 그려진 것은 아니다. 도면에서, 다양한 도면에 도시된 각각의 동일 또는 거의 동일한 성분들은 유사 번호로 표시된다. 명확성을 위해, 도면마다 모든 성분들이 표지된 것은 아닐 수 있다.
도 1은 본 발명의 비-제한적인 실시양태를 도시한 것이다. 나노입자 표면 상의 (모든 세포 유형을 표적화하는) 비특이 표적자를 케이징시켜 비-기능성이 되도록 만든다. 조광시, 케이징 기는 유리되고, 표적자는 활성화됨으로써 나노입자는 광이 가해진 임의의 조직에 결합할 수 있게 된다.
도 2는 YIGSR (서열 1) 모티프를 포함하는 불활성 (패널 A) 및 활성 펩티드 (패널 B)에 대한 비-제한적인 실시양태를 도시한 것이다. GGGGYIGSR-NH2 (서열 2) 펩티드를 4,5-디메톡시-2-니트로벤질 (DMNB)로 케이징하였다. 조사 후, 케이징 기는 유리되고, 표적자는 활성화된다.
도 3은 비-케이징된 표적자 (패널 A), 비-조사된 케이징된 표적자 (패널 B) 및 조사 후 10초 경과시 (패널 C)의 HPLC 칼럼에서의 체류 시간에 관한 비-제한적인 실시양태를 나타낸 것이다. 비-케이징된 표적자의 HPLC 칼럼에서의 체류 시간은 약 20 min인 반면 (도 3A), 비-조사된 케이징된 표적자의 HPLC 칼럼에서의 체류 시간은 약 30 min이었다 (도 3B). 조사 후 10초 경과시에서 체류 시간 변화가 일어났고, 표적자는 약 20 min 후 칼럼을 빠져 나왔다 (도 3C).
도 4는 표적자-접합된 나노입자로부터의 케이징 기의 유리에 관한 비-제한적인 실시양태를 나타낸 것이다. 도 4A는 FTIR에 의해 평가된, 표적자 상의 에테르 결합의 소실에 대한 진행 상황을 추적한 것인 반면, 도 4B는 조사 후 매질로 유리된 유리 DMNB 케이징 기에 대한 진행 상황을 추적한 것이다.
도 5A 및 5B는 조사 및 비-조사된 배양물 중에서의 HUVEC 표적화에 대한 정성적 평가에 관한 비-제한적인 실시양태이다. 입자는 백색으로 보인다. 도 5C 및 5D는 각각 표적화된 MSC 및 HUVEC의 백분율을 나타낸 것이다.
도 6은 특정 케이징된 나노입자의 비-제한적인 영상을 나타낸 것이다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 술포-N-히드록시숙신이미드 (NHS) 활성화 화학법을 사용하여 아민-말단형 케이징된 펩티드/표적자를 카르복실-말단형 폴리스티렌 나노입자 (328±2 nm)의 표면에 접합시켰다.
도 7은 HUVEC의 표적화에 관한 비-제한적인 실시양태를 입증하는 것이다. 도 7A는 1 min 동안 340 nm으로 조사된 소면적 (화살표 표시) 내의 세포에 특이적으로 부착하는 형광성 나노입자에 대한 UV 조사하의 육안적 시야이다. 도 7B는 조사된 면적 내의 세포에 대한 현미경적 시야인 반면, 도 7C는 1 cm 떨어진 곳에 위치하는 세포에 대한 현미경적 시야이다. 세포의 세포질은 β 액틴 항체로 염색하고, 핵은 훽스트(Hoechst)로 염색하였다. 나노입자는 도 7B에서 백색 반점처럼 보인다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 측면은 표적화 모이어티에 부착된 전달 모이어티를 포함하는 조성물을 제공함으로써 작용제/물질을 표적 부위로 전달하기 위한 조성물에 관한 것이다. 전달 모이어티는 전달되는 작용제/물질을 함유하는 입자일 수 있다. 표적화 모이어티는 조성물이 개체에게로 투여된 후 계내에서 표적화 리간드의 활성화를 허용하는 기전에 의해 가역적으로 불활성화되는 표적화 리간드일 수 있다. 감광성, 감열성, 감압성, 및/또는 pH-감응성 변형, 마이크로파-감응성, X선-감응성 중 하나 이상, 및/또는 예를 들어, 하나 이상의 다른 형태의 에너지 입력과 같은, 하나 이상의 다른 입력에 감응성인 하나 이상의 변형을 사용함으로써 표적화 리간드를 가역적으로 불활성화시킬 수 있다. 본 발명의 측면을 통해 관심의 대상이 되는 부위를 선택적으로 표적화하는 데 사용될 수 있는 조직 특이적 및 비-특이적 리간드를 사용할 수 있게 된다. 일부 실시양태에서, 활성 표적화 리간드는 예를 들어, 세포 표면 상의 표적 분자 (항-리간드)에 결합함으로써 항-리간드 (및/또는 항-리간드가 존재하는 세포 또는 조직) 인근에 조성물을 부착 및/또는 집중시킨다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 적어도 부분적으로는 임의의 원하는 부위에 진단학적 및/또는 치료학적 물질/작용제를 유리시킬 수 있는 잠재능을 가지며, 조광시 선택적으로 임의의 조직을 표적화하고 그에 결합할 수 있는 신규한 미립자 시스템에 기초한다 (도 1). 제1 성분은 진단학적 및/또는 치료학적 적재물 (예를 들어, 영상화 화합물, 약물, 성장 인자, 시토카인 등)을 운반할 수 있는 "입자/캐리어"이다. 현재, 전형적으로는 천연 및 합성 중합체 및 지질이 약물 전달 벡터로서 사용된다.
상기 시스템에서 제2 성분은 "진단학적 및/또는 치료학적 물질/작용제"이다. 입자에 약물, 성장 인자, 케모카인 및 영상화 분자를 비롯한 다양한 물질이 적재될 수 있다. 캐리어를 사용하여 그 내부의 약물을 운반하여 이를 집중시키고/거나, 표적에 결합하였을 때에는 그의 유리를 조절함으로써 국소적인 약물 농도를 증가시킬 수 있다.
상기 시스템에서 제3 성분은 "표적화 리간드"이다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 광-제거가능한 보호기를 사용하는 케이징에 의해 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 불활성 리간드는 케이징된 거대분자, (예를 들어, 하나 이상의 케이징된 펩티드, 항체, 압타머, 수용체 및/또는 항원)이다. 케이징 기법의 배경이 되는 개념은 광-제거가능한 보호기를 사용하는 화학적 변형에 의해 표적화 리간드를 일시적으로 생물학상 비-기능성이 되도록 만들 수 있다는 (또는 케이징시킬 수 있다는) 것이다. 조사를 사용하여 리간드 표면으로부터 보호기를 유리시킬 수 있고, 예를 들어, 관심의 대상이 되는 세포 상의 항-리간드에 부착될 수 있는 그의 능력을 회복시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-리간드는 리간드의 천연 결합 파트너이다. 예를 들어, 항-리간드는 세포 상의 표면 수용체일 수 있고, 표적화 리간드는 수용체의 천연 리간드 (또는 그의 일부)이다. 따라서, 표적화 리간드는 세포 표면 분자 (예를 들어, 단백질 또는 다른 세포 표면 분자)의 천연 결합 파트너 (또는 그의 결합 단편)일 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 리간드는 세포 표면 분자 (항-리간드)에 결합하는 합성 분자 (예를 들어, 합성 펩티드, 핵산, 또는 다른 합성 분자)일 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 표적화된 항-리간드가 천연적으로 발생된 분자일 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 일부 실시양태에서, 표적화된 항-리간드는 세포 또는 조직 특이적일 수 있다 (예를 들어, 특정 세포 또는 조직에 우선적으로 또는 독특하게 존재할 수 있다). 특정 실시양태에서, 항-리간드는 천연적으로 2종 이상의 세포 또는 조직 유형에 존재할 수 있다 (예를 들어, 세포 또는 조직 비특이적). 일부 실시양태에서, 항-리간드는 특정 조건에 대해 특이적일 수 있다 (예를 들어, 질환 상태, 예를 들어, 질환, 예를 들어, 암과 관련된 변이체 분자). 일부 실시양태에서, 항-리간드는 수용체, 채널 단백질, 당단백질, 프로테오글리칸, 부착 분자 또는 임의의 다른 세포 표면 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-리간드는 간극 연접 단백질, 예를 들어, 코넥신 43, 채널, 예를 들어, 이온 채널 및/또는 ATP 채널, 부착제, 예를 들어, CD31 (VECAM), N-카드헤린, VE 카드헤린, 및/또는 E 카드헤린, 당단백질, 예를 들어, CD44 및/또는 CD133, 수용체, 예를 들어, VEGFR2 및/또는 안지오텐신 및 프로테오글리칸, 예를 들어, 황산 헤파란 및/또는 아그레칸일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 진단학적 및/또는 치료학적 물질을 함유하는 복수 개의 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 케이징에 의해 불활성화된 표적화 리간드가 입자의 표면에 부착될 수 있다. 불활성화된 리간드는 (예를 들어, 대상체, 예를 들어, 인간 대상체에게로 투여된 후 계내에서) 조성물에의 조사에 의해 이루어지는 케이징 기의 제거에 의해 활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다른 기법을 사용하여 케이징된 리간드를 활성화시키기 위해 다른 형태의 에너지가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 입자는 어떤 진단학적 및/또는 치료학적 물질도 함유하지 않는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 관심의 대상이 되는 물질이 적재될 수 있도록 리간드에 부착된 입자가 제공될 수 있다. 리간드는 입자 적재 이전에 케이징되거나, 케이징되지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 조성물을 사용하여 미리 정해진 세포 또는 조직으로 물질을 표적화된 방식으로 전달하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 상이한 표적화 리간드가 입자의 표면에 부착된다. 표적화 리간드는 조직 특이적 또는 비-특이적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 오직 특정 세포 유형에서만 발견될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-리간드는 수용체, 채널 단백질, 당단백질, 프로테오글리칸, 부착 분자 또는 임의의 다른 세포 표면 분자일 수 있다.
본 발명의 측면은 약물을 표적화된 방식으로 전달하는 데, 및 어떤 독특한 바이오마커도 없는 세포를 표적화하는 데 유용할 수 있다. 본 기술을 통해 시공간적 특이성을 비-특이적 표적화 리간드에 부여할 수 있다. 본 발명의 방법을 통해 체내의 임의 조직으로 관심 대상 분자를 신속하게 국소적으로 유리시킬 수 있다. 본 발명의 화합물 및 방법을 통해 집속 광빔 (예를 들어, 자외선 또는 적외선) 또는 다른 에너지원에 의해 케이징된 표적화 리간드를 활성화시킬 수 있는 능력을 수단으로 하여 치료학적 조성물을 신체의 개별 영역으로 전달할 수 있다. 예를 들어, 이러한 접근법은 눈, 피부, 및 귀로 표적화된 방식으로 전달하는 데 사용될 수 있고, 이는 또한 최소 침습 광섬유 기술, 또는 대상체의 신체를 투과하여 관심 대상 영역 (예를 들어, 질환 부위에 인접한, 예를 들어, 종양 또는 다른 암성 조직 인근의 영역)에 있는 표적화 리간드를 활성화시킬 수 있는 다른 광학 (예를 들어, 근적외선) 또는 다른 활성화 기술의 도움을 통해 다른 내부 기관을 치료하는 데에도 사용될 수 있다. 상기 접근법은 또한 관심 대상 분자를 포함하는 주입형 또는 삽입형 장치를 결합시키는 데에도 사용될 수 있다. 후자의 경우, 예를 들어, 삽입형 약물 전달 시스템의 약물 내용물을 재적재하는 문제, 감염된 하드웨어를 처리하는 문제와 같은 다수의 잠재적인 용도를 갖는다.
본 발명의 측면은 또한 혈뇌 장벽을 통과하여 약물을 전달하는 데에도 유용할 수 있다. 혈뇌 장벽에 존재하는 특이적인 항-리간드에 결합할 수 있는 표적화 리간드를 사용하여 본 발명의 조성물을 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 트랜스페린 또는 인슐린이다. 일부 실시양태에서, 조직 비-특이적 표적화 리간드는 조직-특이적 리간드와 함께 조합하여 사용된다.
따라서, 본 발명의 측면은 치료학적 분자, 진단학적/영상화 분자, 및/또는 다른 분자를 대상체 내의 관심 대상의 임의의 표적 부위로 표적화시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 대상체의 체내의 어느 위치에서든 이환 조직 부위에서 선택적으로 활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적은 이환 (예를 들어, 암성) 기관에 또는 그 인근에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적은 조직 또는 기관의 일부일 수 있다. 예를 들어, 조성물은 간, 췌장, 폐, 결장, 방광, 자궁경부, 심장, 골, 신장, 골 조직, 근육 조직, 또는 그의 일부에서 또는 그 인근에서 활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 대상 기관 또는 표적 조직에 또는 그 인근에 존재하는 혈관 조직이 (예를 들어, 광 또는 본원에 기재된 다른 에너지원을 사용하는) 활성화를 위해 표적화될 수 있다. 본 발명의 측면이 다세포 유기체, 예를 들어, 척추 동물, 포유동물 (예를 들어, 인간, 농업용 또는 가축용 포유동물) 또는 다른 동물을 치료 또는 진단하는 데 (또는 치료 또는 진단을 보조하는 데) 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명의 조성물은 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 주사되거나, 경구적으로 투여되거나, 또는 다른 방식으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 정맥내로, 복강내로, 또는 다른 방식으로 투여될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 조성물은 전신으로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국소적으로 제공될 수 있다. 조성물은 하나 이상의 위치에서, 또는 더욱 일반적으로 대상체 (예를 들어, 진단 및/또는 치료를 필요로 하는 환자)에서 국소적으로 활성화될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
하나 이상의 진단제 및/또는 치료제가 대상체에게 유효량으로 투여될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 작용제의 유효량이란 의학상 바람직한 결과를 제공하는 데 충분한 용량이며, 이는 통상의 방법을 사용함으로써 당업자에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유효량은 치료받는 병태를 어느 면에서든 개선시키는 양이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 치료받는 질환 또는 병태의 유형 및 정도 및/또는 하나 이상의 추가 치료제의 사용에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 당업자는 예를 들어, 시험관내 및/또는 생체내 시험 및/또는 화합물 투여에 관한 다른 지식에 기초하여 사용하는 치료제의 적절한 용량 및 범위를 결정할 수 있다. 유사하게, 진단제의 유효량은 원하는 진단학적인 적용에 기초하여 결정될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 작용제는 입자 형태로 투여되는 바, 각 입자에 대한 유효량은 대상체에게 투여되는 입자의 개수 및 투여 빈도를 고려하였을 때 작용제의 전체 유효량에 기여하는 데 충분한 양이다.
대상체에게 투여될 때, 치료제의 유효량은 물론 치료받을 특정 질환; 질환의 중증도; 연령, 신체 상태, 크기 및 체중을 비롯한 개별 환자의 파라미터; 동시 치료; 치료 빈도; 및 투여 방식에 따라 달라지게 될 것이다. 이러한 인자들은 당업계의 숙련가에게 주지되어 있으며, 이는 단지 통상적인 실험만으로도 처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 최대 용량, 즉, 타당한 의학적 판단에 따라 안전한 최고 용량이 사용된다. 유사하게, 진단제의 유효량은 대상체의 연령, 신체 상태, 크기, 체중 및 다른 의학적 상태를 비롯한 하나 이상의 파라미터에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료제 또는 진단제의 유효량은 전형적으로 (투여 방식의 진행 과정 및 상기에서 논의된 인자들에 따라) 1 또는 7일 동안 1회 이상의 용량 투여에서 약 0.001 mg/kg 내지 약 1,000 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 750 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 약 1.0 mg/kg 내지 약 250 mg/kg, 약 10.0 mg/kg 내지 약 150 mg/kg으로 달라질 것이다. 따라서, 본원에 기재된 입자 (예를 들어, 표적화된 입자)에 적재되는 작용제의 유효량은 입자 개수 및 대상체에게로의 입자 투여의 빈도에 따라 달라지게 될 것이다. 당업자는 입자 1개당 적재되는 작용제의 양, 각 용량으로 대상체에게 투여되는 입자의 개수, 및 투여 빈도에 기초하여 적절한 치료학적 및/또는 진단학적 요법을 결정할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 일부 실시양태에서, 원하는 양의 (예를 들어, 유효량의) 작용제(들)를 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에게 전달하기 위해 상기와 같은 파라미터들은 각각 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 용량으로 투여되는 입자의 개수의 범위는 100개 내지 1020개일 수 있다.
특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 원하는 치료학적 반응을 달성하는 데 효과적인 양을 수득하기 위해 (예를 들어, 입자 1개당 양, 투여 빈도, 투여되는 입자의 개수, 또는 그의 조합을 달리함으로써) 진단제 또는 치료제의 실제 투여량 수준을 다르게 할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 특정 작용제의 활성, 투여 경로, 치료받는 조직, 및 치료받는 환자의 이전 의학적 병력에 따라 달라진다. 그러나, 작용제 용량 (복수 개의 입자를 사용함으로써 달성되는 용량)은 원하는 치료학적 결과를 달성하는 데 필요한 것보다 낮은 수준에서 출발하여 원하는 효과를 달성할 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것은 당업계의 기술 범위내 포함된다.
A. 입자/ 캐리어
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 "입자"는 생체적합성 중합체, 바람직하게는 생체분해성인 것을 포함한다. 적합한 중합체로는 폴리(락틱-코-글리콜산), 폴리무수물, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리글리콜산, 키토산, 폴리오르토에스테르, 폴리에테르, 폴리락트산, 및 폴리(베타 아미노 에스테르)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 펩티드, 단백질, 예를 들어, 콜라겐, 및 덴드리머 (예를 들어, PAMAM 덴드리머) 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 폴리(베타 아미노 에스테르) 화합물, 또는 그의 염 또는 유도체가 캐리어로서 사용된다. 캐리어는 미세입자, 나노입자, 고체 약물 전달 물품 형태로, 및/또는 가용성 나노미터 크기의, 핵산과의 복합체로서 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 입자는 치료제가 함침되어 있거나, 그를 캡슐화하는 고체 물질, 예를 들어, 중합체 매트릭스를 포함하는 약물 전달 장치일 수 있다. 상기 장치는 표적 조직 위치에서 또는 그의 인근에서, 또는 표적 조직으로부터 떨어져 있는 위치에서 체내로 삽입된다. 치료제는 조광시에 중합체 매트릭스로부터 유리된다. 치료제는 확산, 중합체 매트릭스의 분해, 또는 세포 흡수에 의해 유리될 수 있다.
본 발명의 입자를 포함하는 중합체 매트릭스는 다수의 상이한 형상을 취할 수 있다. 예를 들어, 다양한 크기의 미세입자 (이는 또한 비드, 마이크로비드, 마이크로스피어, 나노입자, 나노비드, 나노스피어 등으로 지칭될 수 있다)가 사용될 수 있다. 중합체 미세입자 및 약물 전달을 위한 그의 용도는 당업계에 주지되어 있다. 그러한 입자는 전형적으로는 대략적으로 구형의 형상을 띠지만, 불규칙적인 형상을 가질 수도 있다. 일반적으로 미세입자의 직경은 500 마이크로미터 이하, 예를 들어, 50 내지 500 마이크로미터, 20 내지 50 마이크로미터, 1 내지 20 마이크로미터, 1 내지 10 마이크로미터일 것이며, 나노입자의 직경은 1 마이크로미터 미만일 것이다. 입자의 형상이 불규칙적일 경우, 이때 부피는 전형적으로 마이크로스피어 또는 나노스피어의 부피에 상응하는 것이 될 것이다. 중합체 매트릭스는 각종의 비미립자 형상, 예를 들어, 웨이퍼, 디스크, 로드 등으로 형성될 수 있으며, 이는 다양하게 상이한 크기 및 부피를 가질 수 있다. 치료학상 활성제를 중합체 매트릭스 내로 도입시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
분무 건조, 상 분리, 단일 및 이중 에멀젼 용매 증발, 용매 추출, 및 단일 및 복합 코아세르베이션을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용함으로써 고체 나노입자 또는 미세입자를 제조할 수 있다. 특정 방법은 분무 건조 및 이중 에멀젼 공정을 포함한다. 과립화, 압출, 및/또는 구형화를 사용함으로써 고체 작용제를 함유하는 중합체 조성물을 또한 제조할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 나노입자는 당업계에 주지되어 있으며, 문헌 ([Mallidi, S. et al,. Nano Letters 2009, 9, (8), 2825-31]; [Bagalkot, V. et al,. Nano Lett 2007, 7, (10), 3065-70]; 및 [Farokhzad, O. C. et al,. Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103, (16), 6315-20])에 상세하게 기재되어 있는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 리포솜이다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 카르복실-말단형 폴리스티렌 나노입자이다. 일부 실시양태에서, 카르복실-말단형 폴리스티렌 나노입자의 직경은 328±2 nm이다 (도 6).
미세입자를 제조하는 데 사용되는 조건을 변경하여 원하는 크기 또는 특성 (예를 들어, 소수성, 친수성, 외부 형태학적 성질, "점착성," 형상 등)을 가진 입자를 수득할 수 있다. 입자 제조 방법 및 사용되는 조건 (예를 들어, 용매, 온도, 농도, 공기유량 등) 또한 캡슐화되는 작용제 및/또는 중합체 매트릭스의 조성에 따라 달라질 수 있다. 상기 방법 중 임의의 방법에 의해 제조된 입자의 크기 범위가 원하는 범위 밖에 있는 경우, 예를 들어, 체 (sieve) 또는 다른 크기 분리 기법을 사용함으로써 입자 크기를 조정할 수 있다. 캡슐화된 작용제를 전달하기 위한 미세입자를 제조하기 위해 개발된 방법은 문헌에 기재되어 있다.
당업계에 주지된 각종 방법들 중 임의의 것을 사용하여 고체 중합체-작용제 조성물 (예를 들어, 디스크, 웨이퍼, 튜브, 시트, 로드 등)을 제조할 수 있다. 예를 들어, 중합체의 융점이 조성물이 전달되는 위치의 온도보다 및/또는 중합체의 분해가 일어나거나 또는 비바람직한 반응성을 갖게 되는 온도보다 낮을 경우, 중합체를 용융시키고, 전달하고자 하는 작용제와 혼합한 후, 냉각에 의해 고형화시킬 수 있다. 중합체를 용매 중에 용해시키고, 작용제를 중합체 용액 중에 용해시키거나 분산시키는 용매 캐스팅에 의해 고체 물품을 제조할 수 있다. 용매를 증발시킨 후에는 물질이 중합체 매트릭스에 남게 된다. 이러한 접근법을 위해서는 일반적으로 중합체가 유기 용매(들)이어야 하고, 작용제는 용매 중에 가용성이거나 분산가능하여야 한다. 또 다른 방법에서, 중합체 분말을 작용제와 혼합한 후, 압착시켜 임플란트를 형성한다.
다수의 유용한 중합체들은 음으로 하전된 DNA 포스페이트와의 이온성 상호작용을 허용하는 하전가능한 아미노기, 및 분해가능한 영역, 예를 들어, 가수분해가능한 에스테르 결합, 둘 모두를 함유한다. 상기에 대한 일례로 폴리(알파-(4-아미노부틸)-L-글리콜산), 네트워크 폴리(아미노 에스테르), 및 폴리(베타-아미노 에스테르)를 들 수 있다. 이러한 복합체 형성제는 예를 들어, 뉴클레아제, 혈청 성분 등에 의한 분해로부터 DNA를 보호할 수 있고, 표면이 보다 작은 음의 하전성을 가지도록 할 수 있으며, 이를 통해 세포의 소수성 막 (예를 들어, 세포질 막, 리소좀 막, 엔도좀 막, 핵 막)을 통한 통과를 촉진시킬 수 있다. 특정의 복합체 형성제는 세포내 수송 사건, 예를 들어, 엔도좀 이탈, 세포질 수송, 및 핵 진입을 촉진시키고, 핵산으로부터 해리될 수 있다. 그러한 작용제는 엔도좀 내부에서 "양성자 스폰지"로서 작용할 수 있다고 제안된 바 있다.
B. 진단제 /치료제
매우 다양한 "진단제 및/또는 치료제"가 입자 내로 혼입될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "치료제"란 환자에 유익한 효과를 발휘하는 작용제를 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 치료제라는 용어는 약물이라는 용어와 동의어이다. 적합한 치료제로는 항신생물제, 호르몬, 시토카인, 세포독소, 항미생물제 (항진균제, 항바이러스제, 항원충제), 항생제, 비타민, 항결핵제, 항류마티스제, 항알레르기제, 순환성 약물, 항협심증제, 항응고제, 마약, 심장 글리코시드, 신경근육 차단제, 진정제 (수면제), 및 국소 및 전신 마취제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
항신생물제로는 백금 화합물 (예를 들어, 스피로플라틴, 시스플라틴, 및 카르보플라틴), 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 미토마이신, 안사미토신, 블레오마이신, 시토신 아라비노시드, 아라비노실 아데닌, 메르캅토폴리리신, 빈크리스틴, 부술판, 클로람부실, 멜팔란 (예를 들어, PAM, L-PAM 또는 페닐알라닌 머스타드), 메르캅토퓨린, 미토탄, 프로카르바진 히드로클로라이드 닥티노마이신 (악티노마이신 D), 다우노루비신 히드로클로라이드, 독소루비신 히드로클로라이드, 탁솔, 미토마이신, 플리카마이신 (미트라마이신), 아미노글루테티미드, 에스트라무스틴 인산나트륨, 플루타미드, 류프롤리드 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 타목시펜 시트레이트, 테스토락톤, 트릴로스탄, 암사크린 (m-AMSA), 아스파라기나제 (L-아스파라기나제) 에르위나 아스파라기나제(Erwina asparaginase), 에토포시드 (VP-16), 인터페론 a-2a, 인터페론 a-2b, 테니포시드 (VM-26), 빈블라스틴 술페이트 (VLB), 빈크리스틴 술페이트, 블레오마이신, 블레오마이신 술페이트, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 및 아라비노실을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
호르몬의 예로는 성장 호르몬, 멜라닌 세포 자극 호르몬, 에스트라디올, 베클로메타손 디프로피오네이트, 베타메타손, 베타메타손 아세테이트 및 베타메타손 인산나트륨, 베타메타손 이인산나트륨, 베타메타손 인산나트륨, 코르티손 아세테이트, 덱사메타손, 덱사메타손 아세테이트, 덱사메타손 인산나트륨, 플루니솔리드, 히드로코르티손, 히드로코르티손 아세테이트, 히드로코르티손 시피오네이트, 히드로코르티손 인산나트륨, 히드로코르티손 숙신산나트륨, 메틸프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 메틸프레드니솔론 숙신산나트륨, 파라메타손 아세테이트, 프레드니솔론, 프레드니솔론 아세테이트, 프레드니솔론 인산나트륨, 프레드니솔론 테부테이트, 프레드니손, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토니드, 트리암시놀론 디아세테이트, 트리암시놀론 헥사세토니드 및 플루드로코르티손 아세테이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
잠재적으로 유용한 시토카인으로는 림포카인, 인터류킨, 인터페론, 및 케모카인을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
주시되는 세포독소의 예로는 콜레라 독소, 리신, LT-독소, C3 독소, 쉬가(Shiga) 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 사포린, 모데신, 겔라닌 및 종양 괴사 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
항미생물제의 비-제한적인 예로는 항바이러스제, 예를 들어, 아시클로버, 아만타딘 아지도티미딘 (AZT 또는 지도부딘), 리바비린 및 비다라빈 1수화물 (아데닌 아라비노시드, ara-A); 항진균제, 예를 들어, 케토코나졸, 니스타틴, 그리세오풀빈, 플루시토신 (5-fc), 미코나졸, 암포테리신 B, 리신, 및 pMactam 항생제 (예를 들어, 술파제신); 항원충제, 예를 들어, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 메트로니다졸, 퀴닌 및 메글루민 안티모네이트; 및 생물학적 반응 조절제, 예를 들어, 무라밀디펩티드, 무라밀트리펩티드, 미생물 세포벽 성분, 림포카인 (예를 들어, 세균 내독소, 예를 들어, 지질다당류, 대식세포 활성화 인자), 세균 서브유닛 (예를 들어, 미코박테리아, 코리네박테리아), 합성 디펩티드 N-아세틸-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민을 포함한다.
항생제로는 답손, 클로람페니콜, 네오마이신, 세파클로르, 세파드록실, 세팔렉신, 세프라딘 에리트로마이신, 클린다마이신, 린코마이신, 아목시실린, 암피실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 디클록사실린, 시클라실린, 피클록사실린, 헥타실린, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 티카실린, 리팜핀 및 테트라시클린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
소염제의 예로는 디플루니살, 이부프로펜, 인도메타신, 메클로페나메이트, 메페남산, 나프록센, 옥시펜부타존, 페닐부타존, 피록시캄, 술린닥, 톨메틴, 아스피린 및 살리실레이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
비타민의 예로는 시아노코발아민 레티노 산, 레티노이드 및 유도체, 예를 들어, 레티놀 팔미테이트, 및 α-토코페롤을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
항결핵제의 예로는 파라-아미노살리실산, 이소니아지드, 카프레오마이신 술페이트 시클로세린, 에탐부톨 히드로클로라이드 에티오나미드, 피라진아미드, 리팜핀, 및 스트렙토마이신 술페이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
항류마티스제의 예로는 페니실라민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
항알레르기제의 예로는 암렉사녹스; 항응고제, 예를 들어, 펜프로코우몬 및 헤파린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
순환성 약물의 예로는 프로프라놀롤; 대사 작용 증강제, 예를 들어, 글루타티온을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
항협심증제의 예로는 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀, 에리트리톨 테트라니트레이트, 이소소르비드 디니트레이트, 니트로글리세린 (글리세릴 트리니트레이트) 및 펜타에리트리톨 테트라니트레이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
항응고제의 예로는 펜프로코우몬, 헤파린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
마약의 예로는 파레고릭; 아편제, 예를 들어, 코데인, 헤로인, 메타돈, 모르핀 및 아편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
심장 글리코시드의 예로는 데슬라노시드, 디기톡신, 디곡신, 디기탈린 및 디기탈리스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
신경근육 차단제의 예로는 아트라쿠리움 메실레이트, 갈라민 트리에티오디드, 헥사플루오레늄 브로마이드, 메토쿠린 아이오다이드, 판쿠로니움 브로마이드, 숙시닐콜린 클로라이드 (숙사메토니움 클로라이드), 투보쿠라린 클로라이드 및 베쿠로니움 브로마이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
진정제 (수면제)의 예로는 아모바르비탈, 아모바르비탈 나트륨, 아프로바르비탈, 부타바르비탈 나트륨, 클로랄 수화물, 에트클로르비놀, 에티나메이트, 플루라제팜 히드로클로라이드, 글루테티미드, 메토트리메프라진 히드로클로라이드, 메티프릴론, 미다졸람 히드로클로라이드, 파라알데히드, 펜토바르비탈, 펜토바르비탈 나트륨, 페노바르비탈 나트륨, 세코바르비탈 나트륨, 탈부탈, 테마제팜 및 트리아졸람을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
국소 마취제의 예로는 부피바카인 히드로클로라이드, 클로로프로카인 히드로클로라이드, 에티도카인 히드로클로라이드, 리도카인 히드로클로라이드, 메피바카인 히드로클로라이드, 프로카인 히드로클로라이드 및 테트라카인 히드로클로라이드를 포함하나, 이에 한정되지 않고; 전신 마취제로는 드로페리돌, 에토미데이트, 펜타닐 시트레이트 + 드로페리돌, 케타민 히드로클로라이드, 메토헥시탈 나트륨 및 티오펜탈 나트륨; 및 방사성 입자 또는 이온, 예를 들어, 스트론튬, 아이오다이드 레늄 및 이트륨을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다른 치료제로는 재조합 RNA 및 DNA, 안티센스 RNA 및 DNA 및 siRNA 또는 다른 소형 RNA를 비롯한, 천연 또는 합성 기원의 유전 물질, 예를 들어, 핵산, RNA, 및 DNA를 포함한다. 사용될 수 있는 유전 물질의 유형으로는 예를 들어, 발현 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 효모 인공 염색체 (YAC), 및 결함 또는 "헬퍼" 바이러스, 항원 핵산 상에서 운반되는 유전자로서, 단일 및 이중 가닥 RNA 및 DNA, 및 그의 유사체, 예를 들어, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함한다. 추가로, 유전 물질은 예를 들어, 단백질 또는 다른 중합체와 조합될 수 있다.
원하는 경우, 1종 초과의 치료제는 마이크로스피어를 사용하여 적용될 수 있다. 예를 들어, 단일 마이크로스피어는 1종 초과의 치료제를 함유할 수 있거나, 상이한 치료제를 함유하는 마이크로스피어들이 공동 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "진단제"는 개체에서 질환을 진단하는 데 사용될 수 있는 임의의 작용제를 포함한다. 비-제한적인 일례로 영상화제, 예를 들어, 방사선동위원소, 염료, 안료 및 형광성 분자 (예를 들어, 루시페라제, 및 플루오레세인) 및 중금속 (예를 들어, 가돌리늄)을 들 수 있다.
따라서, 진단제 또는 치료제는 펩티드, 단백질, 핵산 (DNA 또는 RNA), 소형 분자, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
C. 표적화 리간드
본원에서 사용되는 바, "표적화 리간드"는, 리간드와 항-리간드 사이의 접촉시 자유 에너지의 유리한 (즉, 음의) 변화에 기인하여 리간드에 결합하는 또 다른 분자 (예를 들어, "항-리간드")가 그에 대해 존재하는 것인 임의 유형의 분자를 포함한다. 리간드와 항-리간드 사이의 결합은 특이적일 수 있고, 결합 친화도 범위는 마이크로몰 내지 피코몰이다. 리간드/항-리간드 쌍은 항원/항체, 효소/기질, DNA/DNA, DNA/RNA, RNA/RNA, 핵산 미스매치, 상보적인 핵산 및 핵산/단백질일 수 있다. 임의의 분자가 리간드 또는 항-리간드로서 작용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 펩티드, 항체, 압타머, 수용체, 또는 항원을 포함한다. 표적화 리간드는 광-제거가능한 보호기, 감열성 기, 감압성 기, 마이크로파-감응성 기, pH 감응성 기, 또는 적합한 에너지원에 노출되었을 때 제거될 수 있는 임의의 다른 기를 사용하는 케이징에 의해 불활성화될 수 있다. 리간드는 조직 특이적 및 비-특이적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 조직 비-특이적이다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 광-제거가능한 보호기를 사용하는 케이징에 의해 불활성화될 수 있다. 일반적으로, (예를 들어, 광-제거가능한 기 또는 임의의 다른 적합한 기를 사용하는) 임의의 적합한 기법을 사용한 케이징은 (예를 들어, 보통 표적 분자와의 상호작용을 안정화하는 결합을 파괴하거나, 리간드의 특정 측쇄의 소수성 또는 이온 특징을 변형시킴으로써, 또는 입체 장애에 의해) 생물학적 활성에 필요한 중요한 특성, 예를 들어, 활성 부위 또는 폴딩 패턴, 및 그의 임의의 조합을 억제시키거나, 또는 은폐시킨다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드 상에 케이징 기가 존재하게 되면 그의 입체형태는 변하게 될 것이고, 이로써 세포 표면 상에서 발견되는 그의 항-리간드에 의한 리간드 인식은 이루어지지 못할 것이다. 케이징 기가 제거되면 리간드는 활성화된다. 표적화 리간드는 입자의 표면에 공유적으로 부착되어 있다.
일부 실시양태에서, 리간드는 펩티드, 항체, 압타머, 수용체 또는 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 인테그린-수용체 매개 세포 부착에 필수적인 것으로 알려진 모티프를 함유하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. 그에 따라, 상기 펩티드는 광-제거가능한 보호기 (또는 다른 제거가능한 기)를 사용하는 케이징에 의해 상응하는 펩티드와 비교하여 일시적으로 생물학상 비-기능성화될 수 있다. "불활성화된 펩티드"는 광-제거가능한 보호기 (또는 다른 제거가능한 기)의 부착에 의한 공유적 변형 (예를 들어, 케이징)에 의해 생물학상 불활성을 띠게 되는 상기에서 언급된 "펩티드"이다. "불활성화된 펩티드/입자 부가물"은 관심 대상 물질을 포함하는 입자의 표면에 공유적으로 부착되어 있는 "불활성화된 펩티드"를 포함한다.
일부 실시양태에서, 리간드는 세포 표면 분자 (항-리간드)에 결합하는 임의의 적합한 분자 (예를 들어, 펩티드)일 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 세포 표면 분자는 특이적인 리간드 (천연 또는 합성 리간드)에 결합할 수 있는 단백질 수용체 또는 다른 세포 표면 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 내피 세포 상에 존재하는 항-리간드 (예를 들어, 내피 세포 상의 표면 항원)에 특이적일 수 있다. 따라서, 표적화 리간드가 활성화되면, 부착된 입자는 내피 세포에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이를 통해 혈관내 입자는 활성화됨으로써 혈관벽 중의 내피 세포에 결합하게 된다. 일부 실시양태에서, 혈관벽 부위에 결합한 입자는 내피 층을 관통하여 작용제 또는 다른 물질을 혈관 부위에 인접한 조직 또는 기관으로 전달할 수 있다. 내피 세포 상의 항-리간드는 내피 세포-특이적 분자일 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 이는 다른 세포 이외에도 내피 세포 상에 존재하는 분자일 수 있다. 본 발명에 따라, 혈관벽 상의 표적 영역에 결합하는 것은 표적 영역 인근에 존재하는 리간드를 활성화시킴으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, 활성화된 조성물은 혈류를 통해 활성화 영역으로부터 표적 영역으로 수송되기 때문에 비록 활성화가 표적 영역의 상류 쪽에서 일어날지라도 리간드 활성화 및 결합의 동력학적 성질에 기인하여 표적 영역 내에서 결합이 이루어진다면) 본 발명의 조성물의 표적화 리간드는 표적 영역의 상류 쪽에 위치하는 혈관에서 (예를 들어, 광에 의해) 활성화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-리간드는 수용체, 채널 단백질, 당단백질, 프로테오글리칸, 부착 분자 또는 임의의 다른 세포 표면 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-리간드는 간극 연접 단백질, 예를 들어, 코넥신 43, 채널, 예를 들어, 이온 채널 및/또는 ATP 채널, 부착제, 예를 들어, CD31 (VECAM), N-카드헤린, VE 카드헤린, 및/또는 E 카드헤린, 당단백질, 예를 들어, CD44 및/또는 CD133, 수용체, 예를 들어, VEGFR2 및/또는 안지오텐신 및 프로테오글리칸, 예를 들어, 황산 헤파란 및/또는 아그레칸일 수 있다.
일부 실시양태에서, 불활성화된 펩티드/입자 부가물은 펩티드를 먼저 광-제거가능한 보호기로 케이징한 후, 케이징된 펩티드를 입자에 공유적으로 부착시킴으로써 제조된다. 다른 실시양태에서, 불활성화된 펩티드/입자 부가물은 상기 첫번째 단계 동안 입자를 펩티드에 공유적으로 부착시킨 후, 펩티드/입자 부가물의 펩티드 부분을 광-제거가능한 보호기로 케이징시킴으로써 제조된다. 추가의 실시양태에서, 불활성화된 펩티드/입자 부가물은 펩티드, 나노입자, 및 광-제거가능한 보호기의 '원-포트" 단일 단계 반응으로부터 제조된다.
일부 실시양태에서, 펩티드는 피브로넥틴의 RGD 모티프를 포함한다. 다른 실시양태에서, 펩티드는 라미닌의 YIGSR (서열 1) 모티프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 합성 YIGSR-함유 펩티드, 예를 들어, CDPGYIGSR (서열 3) 및/또는 YIGSR-NH2 (서열 1)를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 광-제거가능한 보호기는 당업계에 주지되어 있다 (문헌 [Pillai, in Organic Photochemistry, Vol. 9, A Padwa, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, pp. 225-323]). 적합한 광-제거가능한 보호기의 예로는 2-니토벤질, 벤조인 에스테르, N-아실-7-니트인돌린, 메타-페놀, 페나실 및 그의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 광-제거가능한 보호기는 2-니트로벤질 유도체, 예를 들어, 4,5-디메톡시-2-니트로벤질 (DMNB) 유도체이다.
일부 실시양태에서, 펩티드의 히드록실 (-OH) 치환기가 광-제거가능한 보호기와 반응한다. 다른 실시양태에서, 펩티드의 아미노 (-NH2, 또는 -NH-) 치환기가 광-제거가능한 보호기와 반응한다. 일부 실시양태에서, 펩티드의 티올 (-SH) 치환기가 광-제거가능한 보호기와 반응한다. 다른 실시양태에서, 펩티드의 카르복실산 (-CO2H) 치환기 또는 그의 유도체, 예를 들어, 에스테르 (-CO2-지방족) 치환기가 광-제거가능한 보호기와 반응한다.
일부 실시양태에서, 광-제거가능한 보호기와 반응하는 펩티드의 히드록실 (-OH) 치환기는 세린, 트레오닌, 티로신, 또는 히드록시프롤린의 측쇄로부터 유래된 것이다. 다른 실시양태에서, 광-제거가능한 보호기와 반응하는 펩티드의 아미노 (-NH2, 또는 -NH-) 치환기는 트립토판, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 또는 오르니틴의 측쇄로부터 유래된 것이다. 일부 실시양태에서, 광-제거가능한 보호기와 반응하는 펩티드의 티올 (-SH) 치환기는 시스틴의 측쇄로부터 유래된 것이다. 다른 실시양태에서, 광-제거가능한 보호기와 반응하는 펩티드의 카르복실산 (-CO2H) 치환기 또는 그의 유도체, 예를 들어, 에스테르 (-CO2-지방족) 치환기는 아스파르트산 또는 글루탐산의 측쇄로부터 유래된 것이다.
일부 실시양태에서, 펩티드 또는 케이징된 펩티드의 아미노 (-NH2, 또는 -NH-) 치환기가 나노입자와 반응한다. 다른 실시양태에서, 펩티드 또는 케이징된 펩티드의 카르복실산 (-CO2H) 치환기 또는 보호된 카르복실산 유도체 (-CO2-지방족) 치환기가 나노입자와 반응한다.
일부 실시양태에서, 나노입자의 아미노 (-NH2, 또는 -NH-) 치환기가 펩티드 또는 케이징된 펩티드와 반응한다. 다른 실시양태에서, 나노입자의 카르복실산 (-CO2H) 치환기 또는 보호된 카르복실산 유도체 (-CO2-지방족) 치환기가 펩티드 또는 케이징된 펩티드와 반응한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 펩티드, 광-제거가능한 보호기, 및 나노입자는, 당업계에 주지되어 있으며, 문헌 [Protecting Groups in Organic Synthesis , T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999]; 및 [Chemistry of Peptide Synthesis, N. Leo Benoiton, CRC Press, 2005]; [Smith and March March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001]; 및 [Larock, Comprehensive Organic Transformations , VCH Publishers, Inc., New York, 1989] (이들 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 상세하게 기재되어 있는 것을 포함하는 합성 방법에 따라 공유적으로 부착된다.
일부 실시양태에서, 펩티드의 측쇄 헤테로원자 (O, N, 또는 S)는 광-제거가능한 보호기의 벤질 위치에 공유적으로 부착된다. 일부 실시양태에서, 펩티드의 측쇄 헤테로원자 (O, N, 또는 S)는 니트로벤질 할라이드 유도체, 예를 들어, 4,5-디메톡시-2-니트로벤질 클로라이드 또는 4,5-디메톡시-2-니트로벤질 브로마이드와 반응한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 펩티드 또는 케이징된 펩티드는 아미드 결합을 통해 나노입자에 공유적으로 부착된다. 일부 실시양태에서, 아미드 결합은 본 발명의 펩티드 또는 케이징된 펩티드의 아민기와 나노입자의 카르복실산 치환기로부터 형성된다. 일부 실시양태에서, 아미드 결합은 술포-N-히드록시숙신이미드 (NHS) 및/또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC)로부터 형성된다.
다른 유형의 리간드 (예를 들어, 비-펩티드 리간드) 상에서 그를 케이징하기 위해 동일하거나 또는 등가인 화학적 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 광-제거가능한 기 이외에 또는 그 대신에 임의의 적합한 제거가능한 기를 부착시키기 위해서도 동일하거나 또는 유사한 화학적 변형이 사용될 수 있다는 것 또한 이해하여야 한다.
광, 열, 압력, 마이크로파, pH 변화, 하나 이상의 대사산물 수준의 변화, 및/또는 다른 에너지원에의 노출시 불활성화된 표적화 리간드가 활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드 상의 보호기는 임의의 적합한 종래 광원에 노출시에 제거된다. 그러한 광원의 예로는 제한없이, 레이저 (예를 들어, 엑시머 레이저), 스펙트럼 또는 레이저 (예를 들어, 다이오드, Ti:사파이어 레이저, 홀뮴 레이저 (및 다른 희토류 금속 레이저), 네오디뮴 (Nd) YAG, Nd YAG 레이저)의 자외선부의 발광 에너지, 스펙트럼의 적외선부의 발광 방사선을 들 수 있으며, 이는 짧고 고도한 플럭스 밀도의 방출을 생성한다. 원하는 경우, 당업계에 공지된 표준 광 변조 기법에 의해, 예를 들어, (예를 들어, 전기 광학 장치 또는 음향 광학 장치를 사용하는) 모드-잠김(mode-locked) 레이저를 사용함으로써 2-광자 여기를 생성하는 데 유용한 펄스식 조사를 생성할 수 있다. 적외선, 가시광선, 및 근적외선 스펙트럼에서 펄스형 모드로 작동하는 레이저로는 Nd:YAG, Nd:YLF, CO2, 엑시머, 염료, Ti:사파이어, 다이오드, 홀뮴 (및 다른 희토류 물질), 및 금속-증기 레이저를 들 수 있다. 상기 광원의 펄스 폭은 조정이 가능하며, 수십 펨토초 내지 수백 마이크로초로 달라질 수 있다.
일반적으로, 레이저는 정의된 영역 내 감광성 케이징 기의 언케이징에 대해 특별히 적합화된, 잘 정의된 공간적 간섭성 파장을 제공하기 때문에 바람직한 조사 공급원이다. 추가로, 그러한 광원은 광섬유에 의해 전달될 수 있고, 조절이 가능한 방식으로 특정 영역을 조사하는 데 사용될 수 있다. 광섬유 전달 시스템은 특히 조정이 가능하고, 신체의 영역, 예를 들어, 조직에 조사함으로써 도달하기 어려운 위치를 조사하는 데 사용될 수 있다. 이러한 유형의 전달 시스템은 광학적으로 레이저와 커플링되었을 때에는 카테터 및 관련 가요성 장치로 통합될 수 있고, 사실상 신체 (예를 들어, 인체)의 임의의 기관 또는 영역을 조사하는 데 사용될 수 있는 바, 유용하다. 추가로, 광학 공급원의 파장은 특정 세포 또는 조직 유형에서 적절하게 흡수될 수 있게 그에 맞도록 용이하게 조정될 수 있고; 이로써 본 발명의 화합물 및 방법을 사용함으로써 다수의 상이한 세포 또는 조직은 효과적으로 치료될 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용되는 광 파장은 350 내지 400 nm이다. 일부 실시양태에서, 근적외선 조사가 사용된다.
감광성 케이징된 펩티드의 광분해는 시공간적, 둘 모두로 생물학상 활성인 펩티드 또는 다른 분자의 유리를 제어하는 수단을 제공한다. 특히, 본 발명의 케이징된 분자 (예를 들어, 펩티드)의 광분해는 집속 빔의 조사, 예를 들어, 자외선 또는 적외선 조사를 사용하여 케이징된 생성물을 활성화시킬 수 있는 능력에 의해 신체의 세포 또는 조직의 개별 영역으로 정확하게 국소화될 수 있다. 적외선 조사의 경우, 이는 2-광자 여기를 촉진시키기 위해 고도한 플럭스 밀도를 사용하는 데 유용하며 (문헌 [Denk et al., Science 248: 73-76, 1990]), 특히, 신체의 조직은 사실상 자외선에는 비투과성이지만, 적외선에는 투과성이기 때문에 본 발명의 케이징된 분자 (예를 들어, 펩티드)를 사용하는 광역학 요법에 이롭다. 본 방법을 통해 광빔은 체내에 포커싱될 수 있고, 이로써 특정 부위에서의 반응을 제어할 수 있다. 2-광자 여기 방법의 추가 이점은 화합물의 광활성화가 일어날 수 있는 가능성이 고도로 정의된 영역을 활성화시키는 조사 강도 분포의 제곱의 함수라는 점이다. 또한, 스펙트럼의 적외선 부분의 광을 사용할 수 있는 2-광자 여기의 능력은, 체내에서 투과되는 광범위한 파장을 사용할 수 있는 기회를 제공한다는 점에서 이롭다.
본 발명은 추가로 하기 실시예를 통해 예시되는데, 이러한 실시예가 추가로 제한하는 것으로서 해석되서는 결코 안된다. 본 출원 전반에서 인용된 (참조 문헌, 등록 특허, 공개된 특허 출원, 및 공-계류 중인 특허 출원을 비롯한) 모든 참고 문헌들의 전문이 명백하게 본원에 참고로 포함된다.
실시예
물질 및 방법
표적자 탈- 케이징 (un-caging) 잠재능 평가. HP 1100 HPLC 시스템 상에서 HPLC 검정을 수행하였다. C18 칼럼 상에 샘플을 50 ㎕ 부피로 주입하였다. 1 ml/min으로 수용액을 사용하여 칼럼을 용리시켰다. 흡광도 파장을 230 nm으로 설정하여 UV 검출기에 의해 펩티드를 검출하였다.
케이징된 입자 합성. 1 mg의 형광성 폴리스티렌 카르복실화된 나노입자 현탁액 (328±2 nm, 머크 시미 에스.에이.에스(Merck Chimie S.A.S: 프랑스 피티비에))을 100 mg의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC, 시그마(Sigma)) 및 200 mg의 술포-N-히드록시숙신이미드 (NHS, 시그마)와 함께 실온에서 2.5시간 동안 서서히 교반시키면서 인큐베이션시켰다. 생성된 NHS-활성화된 입자를 실온에서 밤새도록 서서히 교반시키면서 5 mg의 NH2-GGGGY(DMNB)IGSR-NH2 (서열 2) 펩티드 (HPLC에 따른 순도 > 96%, 펩테크 코포레이션(Peptech Corp.: 미국 매사추세츠주 벌링턴)에 의해 주문에 따라 합성된 것)에 공유적으로 연결시켰다. NH2-GGGGYIGSR-NH2 및 스크램블된 펩티드 NH2-GGGGFHPDYRVI-NH2 (서열 4) (겐스크립트 코포레이션(GenScript Corp.: 미국 뉴저지주 피츠카타웨이))가 대조군 표적자로서의 역할을 하였다.
푸리에 변환 IR . 6웰 플레이트 중 나노입자 용액 (200 ㎍/mL)에 0, 1 및 5 sec (365 nm: 엔텔라 (Entela: 미국 캘리포니아주 업랜드)) 동안 조사하였다. 용액을 수집하고, 원심분리하고, 매질을 버렸다. 이어서, 나노입자를 24 h 동안 동결건조시키고, FTIR 분광법 (브루커 알파-이 (Bruker Alpha-E: 미국 매사추세츠주 빌러리카))을 사용하여 나노입자의 스펙트럼을 수집하였다. 비-케이징된 입자가 대조군으로서의 역할을 하였다.
세포 단리. 문헌 [Barbash et al., Circulation 2003, 108, (7), 863-8]에 기재되어 있는 바와 같이 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 단리시켰다. 간략히, 멸균 조건하에서 2 내지 3개월령 스프래그-돌리 (Sprague-Dawley) 래트 (찰스 리버(Charles River: 미국 매사추세츠주 윌밍턴))의 대퇴골 및 경골을 잘라내었다. 배양 배지로 골수강을 플러싱시켜 골로부터 골수 플러그를 추출하였다. 균질 세포 현탁액을 수득한 후, 세포를 원심분리시키고 (600 g, 5 min), DMEM 중에 재현탁시키고, (75 ㎠ 배양 플라스크 당 50x106개의 세포로) 플레이팅시켰다. 3일 경과 후, 배지를 교체하고, 부착성 세포를 MSC로 간주하였다. 2차 계대접종 BM-MSC를 모든 실험에서 사용하였다. 앞서 기재된 바와 같이 (문헌 [Dvir et al., Tissue Eng 2006, 12, (10), 2843-52]) 심장 세포를 단리시켰다. 간략히, 단리된 심실을 저온의 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM: Dulbecco's modified Eagle's medium) 기반 완충제 (염화칼슘 2수화물, 1.8 mM; 염화칼륨, 5.36 mM; 황산마그네슘 7수화물, 0.81 mM; 염화나트륨, 0.1 M; 중탄산나트륨, 0.44 mM; 인산이수소나트륨, 0.9 mM; pH 7.4) 중에 놓고, 이를 대략 1 ㎣의 조각으로 절단하고, 콜라게나제 II형 (95 U/mL; 워싱턴(Worthington: 미국 뉴저지주 레이크우드)) 및 판크레아틴 (0.6 mg/mL; 시그마)을 포함하는 완충제 중에서 (6 내지 7회에 걸쳐) 반복적으로 인큐베이션 (37℃, 30 min)시켰다. 각각의 분해 회차 완료 후, 혼합물을 원심분리하고 (600 g, 5 min, 25℃), 세포 펠릿을 저온의 M-199 배지 중에서 재현탁시켰다.
세포 배양 및 세포 결합. HUVEC (론자 워커스빌, 인크.(Lonza Walkersville, Inc.: 미국 메릴랜드주 워커스빌)) 및 MSC를 각각 EGM-2 및 DMEM 중의 8-챔버 슬라이드 중에서 성장시키고, DMEM를 100 유닛/mL 수성 페니실린, 100 g/mL 스트렙토마이신, 및 10% 소 태아 혈청으로 보충하였다. 세포를 약 90% 컨플루언스를 허용하는 농도로 성장시켰다. 실험 당일날, 미리 가온시킨 PBS로 세포를 세척하고, 20 ㎍/mL의 케이징된 나노입자가 첨가되어 있는, 미리 가온시킨 배지와 함께 인큐베이션시켰다. 배양물에 10 sec 동안 조사한 후, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, PBS로 3회에 걸쳐 세척하고, β 액틴 항체 (시그마)로 염색하고, 형광 현미경을 사용하여 가시화하였다. 형광 현미경에 의해 20X 배율로 하여 표적화된 세포의 수를 정량화하고, 전체 세포수로 나누었다. 케이징된-나노입자 표적화에 대한 정성적 평가 및 공간 실험을 위해, 200 ㎍/mL의 케이징된 나노입자를 함유하는 배지를 세포 배양물에 첨가하고, 1 min 동안 배양물 접시/플라스크에 조사하거나 (UV 램프 또는 자이스(Zeiss) 도립 현미경, 악시오버트(Axiovert) 200M (각각 정성적 표적화 평가 및 공간 표적화를 위한 것)), 조사하지 않고, 이어서 주의하여 세척한 후, UV 광 투과조명기 (TFX-35M, 라이프 테크놀러지스 (Life Technologies: 영국 페이즐리))에 의해 가시화하고, 영상을 사진으로 기록하였다 (코닥 디지털 사이언스 전기영동 문서화 및 분석 시스템 120 (Kodak digital science electrophoresis documentation and analysis system 120)).
면역형광 염색법. 앞서 기재된 바와 같이 면역형광 염색법을 수행하였다. 간략히, 샘플을 고정시키고, 저온의 메탄올 중에서 투과화시키고, 실온에서 1 h 동안 5% FBS를 함유하는 DMEM-기반 완충제 중에서 차단시켰다. 3회에 걸쳐 완충제로 세척한 후, 샘플을 항-β 액틴 (FITC-접합된 것, 시그마) 또는 β1 인테그린 (알앤디 시스템즈(R&D Systems)) 항체 (각각 1:500, 및 1:50)와 함께 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후, β1 인테그린에 대한 항체로 염색된 샘플을 세척하고, 염소 항-마우스 알렉사(Alexa) 488-접합된 항체 (1:150)와 함께 추가의 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 핵을 검출하기 위해, 세포를 훽스트 33258 (시그마)과 함께 3 min 동안 인큐베이션시키고, 세척하였다. 자이스 도립 형광 현미경 모델 악시오버트 200M을 사용하여 영상화를 수행하고, 악시오비전 4.5(AxioVision 4.5)를 사용하여 분석을 수행하였다.
결과
앞서 합성 YIGSR-함유 펩티드, 예를 들어, CDPGYIGSR (서열 3) 및 YIGSR-NH2 (서열 1)가 세포 부착 및 이동을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 세포막 상의 인테그린 β1에의 결합을 통해 세포가 라미닌에 부착하는 것으로 밝혀졌다. 제안된 표적 (β1 인테그린)은 HUVEC, MSC, 섬유모세포, 심근세포 및 인간 배아 줄기 세포 (hESC)를 비롯한 여러 세포 유형 상에 존재하는 것으로 나타났다. 이들 세포는, 나노미립자 시스템의 사용이 그에 대해 실현가능성이 있는 것인 광범위하게 다양한 표적 세포를 나타낸다.
앞서, YIGSR 펩티드 (서열 1)에서의 티로신의 돌연변이화 또는 결실을 통해 펩티드 활성의 유의적 손실이 초래되는 것으로 나타났다. 따라서, 본 연구에서는 YIGSR 펩티드 상의 상기 아미노산을 4,5-디메톡시-2-니트로벤질 (DMNB)로 케이징시켜 (도 2), 조사될 때까지 일시적으로 불활성화시켰다. DMNB는 문헌상의 기록에 의해 충분히 입증되어 있고, 앞서 생물학적 기질로부터 msec 속도로 유리되는 것으로 밝혀져 있는 바, 본 연구에서 사용되는 케이징 기로 선택되었다. DMNB는 탈-케이징 특성 면에 있어서 최적의 발색단이 아닐 수 있으며, 이는 본 연구에서는 단지 본 발명의 실시양태를 입증하는 역할만을 하였다. 널리 사용되는 케이징된 화합물에 대한 중요한 일례, 그의 디자인 특징, 합성 및 용도에 대해서는 앞서 엘리스-다비스(Ellis-Davis)에 의해 기재되었다.
활성 상태로의 변형을 초래하는 표적자 (예를 들어, 펩티드 GGGGY(DMNB)IGSR-NH2 (서열 2))의 탈-케이징 능력을 측정하기 위해, 비-케이징된 펩티드 (GGGGYIGSR-NH2) (서열 2) 용액, 또는 케이징된 펩티드 용액에 1 min 동안 조사하거나, 조사하지 않고, 이들을 HPLC-UV에 의해 평가하였다. 비-케이징된 표적자의 칼럼에서의 체류 시간은 약 20 min인 반면 (도 3A), 펩티드의 소수성을 증가시키는 케이징 기의 존재로 인해 비-조사된 케이징된 표적자의 체류 시간은 그보다 길었다 (약 30 min, 도 3B). 조사 후 10초 경과시 체류 시간 변화가 일어났고, 펩티드는 약 20 min 후 빠져 나왔다 (도 3C). 이러한 결과는 케이징 기가 펩티드로부터 빠르게 유리되었으며, 이로써 효율적인 세포 결합을 위해 펩티드가 신속하게 활성화되고 준비된다는 것을 시사한다.
이어서, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 술포-N-히드록시숙신이미드 (NHS) 활성화 화학법을 사용하여 아민 말단형 케이징된 펩티드/표적자를 카르복실-말단형 폴리스티렌 나노입자의 표면에 접합시켰다.
FTIR에 의하면 케이징된 나노입자는 약 1,100 cm-1 (에테르 스트레치와 일치)에서 넓은 피크를 가졌다. DMNB의 빠른 탈-케이징 시간을 입증하기 위해, 케이징된 표적자와 접합된 나노입자를 1 (C) 및 5 sec (B) 동안 조사한 후 분석하였다. 비-케이징된 표적자 IR 스펙트럼은 대조군 (A)로서의 역할을 하였다. 그 결과, 5 sec 후 표적자-접합된 나노입자로부터 에테르 결합이 소실된 것으로 나타났으며 (도 4A), 이는 빠른 표적자 활성자를 제안한다. 접합된 나노입자로부터 매질로 유리되는 케이징 기의 양에 대해 추가로 평가하기 위해, 1, 2 및 5 sec 동안 입자에 조사한 후, 분광광도계에 의해 DMNB의 흡광도를 측정하였다 (도 4B). 이어서, 유리된 DMNB를 유리 DMNB의 보정 곡선과 비교하였으며, 입자 상의 카르복실산 개수에 대한 수득 값과 공지의 이용가능한 값 사이의 비율은 약 85%의 DMNB가 유리되었음을 시사하였다. 각 나노입자가 약 5,000개의 표적자 분자에 접합된 바, 통계학상 활성화된 표적자의 양은 조사된 모든 입자의 활성화 및 세포 결합을 위해서 충분할 것으로 보였다. 추가로, 표적자의 활성화는 생체내에서 농도에 의존하는 바 (예를 들어, 입자 밀도가 보다 높을수록 광이 모든 입자를 통과하지 못하도록 방해받을 수 있다), 입자는 보다 더 풍부하게 존재할 것이며, 광은 광빔을 통해 순환하는 입자의 보다 빠른 활성화를 촉진시킬 수 있을 것으로 보였다.
나노입자는 조사시에 확실히 활성화되도록 한 후, 케이징된 입자가 광에 노출되었을 때 세포에 부착할 수 있는 능력에 대해 평가하였다. 제1 단계로서, 인간 제정맥 내피 세포 (HUVEC)를 60 mm 배양 접시에 시딩하였다. 24시간 경과 후, 배양 배지를, 케이징된 나노입자를 함유하는 배지로 교체한 후, 접시에 1 min 동안 조사하였다. 15 min 동안 인큐베이션시킨 후, 접시를 주의하여 세척하고, 세포 표적화를 가시화하기 위해 UV 광 투과조명기에 놓았다. 비-조사된 배양물은 대조군으로서의 역할을 하였다. 광에 적용된 접시 중의 (백색으로 보이는) 나노입자는 세포에 부착되어 있고, 배양 접시 면적 대부분을 뚜렷이 덮고 있는 반면(도 5A), 비-조사된 배양물에는 대부분 나노입자가 존재하지 않았으며, 나노입자 중 일부만이 가장자리에 부착되어 있었다 (도 5B).
실현가능하게 입자가 HUVEC에 부착할 수 있는지에 대해 정성적으로 확인한 후, 세포 표적화를 촉진시키는 조사의 효력에 대해 정량적으로 평가하였다. 상기 표적화 시스템이 상이한 세포 유형들을 선택적으로 식별할 수 있도록 디자인된 것은 아니지만, 광의 존재하에서 임의의 세포 또는 조직을 표적할 수 있도록 디자인된 것인 바, 인테그린 β1을 발현하는 보다 광범위한 세포 집단을 대표하는 것일 수 있는 2가지 세포 유형인 HUVEC 및 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 사용하여 표적화 실험을 수행하였다. HUVEC는 혈관을 포함하는 세포를 나타내고, MSC는 결합 조직 중에 존재하는 기질 세포를 나타내는 바, 상기와 같은 2가지 세포 유형을 선택하였다. 상기 세포 카테고리는 체내 모든 조직 및 기관에서 함께 및 개별적으로 발견된다. 따라서, 나노입자가 체내 특정 부위, 조직 및 기관을 표적화하고 그에 결합할 수 있는 잠재능은 오직 광-의존적이다.
세포 (HUVEC 및 MSC)를 배양 슬라이드에 시딩하고, 회복시켰다. 시딩 후 24시간이 경과하였을 때, 10 ㎍ 형광성 케이징된 입자를 함유하는 배지로 배양 배지를 교체한 후, 1 min 동안 조사하고, 30 min 동안 인큐베이션시킨 후, 즉시 세척하고, 고정시키고, 염색하였다. 나노입자에 의해 표적화된 세포의 수를 현미경을 사용하여 계수하고, 이를 전체 세포수로 나누었다. 대조군으로서, 광에 노출되지 않은 케이징된 나노입자, 표적자로서 스크램블된 펩티드와 접합되고, 조사된 것인 나노입자 또는 탈-케이징된 YIGSR-NH2 접합형 나노입자 (양성 대조군)를 사용하였다.
두 세포 유형 HUVEC 및 MSC의 배양물 모두에서, 비-조사된 배양물과 비교하였을 때 조사 후 입자 부착율(%)은 유의적으로 더 높은 것으로 나타났다 (HUVEC (도 5C) 및 MSC (도 5D) 배양물에 대해 각각 p = 0.03 및 p < 0.0001). 나아가, 광에 노출된 케이징된 나노입자의 세포에의 결합은 양성 대조군인 탈-케이징된 표적자에 접합된 입자와 같은 수준이었는데 (MSC에서 p= 0.53), 이는 케이징 기의 효율적인 유리와 나노입자의 효율적인 활성화를 시사한다.
마지막으로, 케이징된 입자의 공간 표적화 능력에 대해 평가하였다. HUVEC를 25 cm2 T 플라스크 중에서 케이징된 나노입자와 함께 배양하였다. 플라스크를 마스크로 덮어 오직 그의 중심부 (d = 1 mm)에만 광이 투과되도록 하고, 암실에서 도립 현미경 하에 놓았다. 입자가 활성화된 후에는 매 플라스크 이동시마다 나노입자 변동 및 광에 노출되지 않은 부위에의 부착이 일어날 수 있는 바, 10 min 동안 플라스크를 암실에서 고정시킨 후, 1 min 동안 현미경 집속 광빔에 노출시켰다. 입자의 확산 거리를 최소화시키기 위해, 배양물을 단기간 동안 고농도의 케이징된 나노입자 (200 ㎍/mL)와 인큐베이션시켰다. 나노입자는 활성화되고, 광이 도입된 세포에 부착되었다. 입자는 원형 모양으로 정렬되었는데, 이는 마스크의 모양에 상응하는 것이었다. 비록 마스크 틈새의 직경이 1 mm 밖에 되지는 않았지만, 표적화된 세포는 약 6 mm 직경으로 위치하였는데, 이는 아마도 활성화 후 나노입자의 확산 또는 광빔의 산란에 기인한 것으로 추정된다. 광빔 중심에서의 94% 초과의 세포가 입자에 의해 표적화된 반면 (도 7B), 광에 노출되지 않은 부위에서는 세포의 표적화가 거의 관찰되지 않았다 (도 7C).
결론적으로, 본원에서는 조사시 선택적으로 세포에 결합할 수 있는 표적화 시스템을 기재한다. 이러한 세포는 체내 모든 조직에 존재하기 때문에, 본 표적화 시스템은 특이적인 마커의 발현에 대해 고려할 필요없이 이환 조직을 표적화하는 데 실현가능성 있게 사용될 수 있다.
참고 문헌
Figure pct00001
Figure pct00002
본 발명은 상기 상세한 설명에서 기술되거나, 도면에 도시된 성분들의 구성 및 정렬에 관한 설명으로만 제한적으로 적용되는 것은 아니다. 본 발명은 다른 실시양태일 수도 있고, 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 어구 및 용어는 설명을 목적으로 한 것이며, 제한하는 것으로서 간주되지 않아야 한다. 본원에서 "~비롯한," "~포함하는," 또는 "~가진," "~함유하는," "~포함하는" 및 그의 파생어들의 사용은 이하 열거되는 사항 및 그의 등가물 뿐만 아니라 추가의 사항들도 포함한다는 것을 의미한다.
SEQUENCE LISTING <110> Massachusetts Institute of Technology Children's Medical Center Corporation President and Fellows of Harvard College Dvir, Tal Kohane, Daniel Banghart, Matthew Langer, Robert <120> PHOTOTRIGGERED NANOPARTICLES FOR CELL AND TISSUE TARGETING <130> M0656.70186WO00 <140> Not yet assigned <141> Concurrently herewith <150> US 61/247535 <151> 2009-09-30 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Non-limiting example sequence of the invention <400> 1 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Non-limiting example sequence of the invention <400> 2 Gly Gly Gly Gly Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Non-limiting example sequence of the invention <400> 3 Cys Asp Pro Gly Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Scrambled peptide used as control <400> 4 Gly Gly Gly Gly Phe His Pro Asp Tyr Arg Val Ile 1 5 10

Claims (34)

  1. 복수 개의 입자를 포함하며, 여기서, 각 입자는 개체에게로 전달시키고자 하는 일정량의 물질을 함유하고, 여기서, 광-제거가능한 보호기를 사용하는 케이징 (caging)에 의해 불활성화된 표적화 리간드가 입자의 표면에 부착되어 있고, 여기서, 불활성 리간드는 조성물에의 조사에 의해 이루어지는 보호기의 제거로 활성화되고, 여기서, 활성 리간드는 항-리간드에 결합할 수 있는 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 리간드가 펩티드, 항체, 또는 압타머를 포함하는 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 펩티드가 RGD 또는 YIGSR (서열 1) 모티프를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 광-제거가능한 보호기가 2-니토벤질, 벤조인 에스테르, N-아실-7-니트인돌린, 메타-페놀, 페나실 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 광-제거가능한 보호기가 4,5-디메톡시-2-니트로벤질 (DMNB) 또는 그의 유도체인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 광-제거가능한 보호기가 리간드에 공유적으로 부착되어 있는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 2종 이상의 상이한 표적화 리간드가 입자의 표면에 부착되어 있는 것인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 표적화 리간드 중 1종 이상이 조직 특이적인 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 표적화 리간드가 세포 유형 특이적인 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 세포 유형이 HUVEC, MSC, 섬유모세포, 심근세포 및 인간 배아 줄기 세포 (hESC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  11. (a) 개체에게로 전달시키고자 하는 일정량의 물질을 함유한 입자를 포함하며, 여기서, 광-제거가능한 보호기를 사용하는 케이징에 의해 불활성화된 표적화 리간드가 입자의 표면에 부착되어 있는 것인 조성물을 미리 정해진 세포 또는 조직으로 물질을 표적화된 방식으로 전달하는 것이 필요한 개체에게 투여하는 단계;
    (b) 개체에서 미리 정해진 세포 또는 조직에 선택적으로 조사하여 조사된 미리 정해진 세포 또는 조직 중의 불활성 리간드를 보호기의 제거에 의해 활성화시키고, 여기서, 활성 리간드는 부착된 입자와 함께 미리 정해진 세포 또는 조직 상에 존재하는 항-리간드에 결합할 수 있고, 이를 통해 개체에게 물질을 표적화된 방식으로 전달하는 단계
    를 포함하는, 개체에서 미리 정해진 세포 또는 조직으로 물질을 표적화된 방식으로 전달하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 리간드가 펩티드, 항체, 압타머를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 펩티드가 RGD 또는 YIGSR (서열 1) 모티프를 포함하는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 광-제거가능한 보호기가 2-니토벤질, 벤조인 에스테르, N-아실-7-니트인돌린, 메타-페놀, 페나실 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 광-제거가능한 보호기가 4,5-디메톡시-2-니트로벤질 (DMNB) 또는 그의 유도체인 방법.
  16. 제11항에 있어서, 광-제거가능한 보호기가 리간드에 공유적으로 부착되어 있는 것인 방법.
  17. 제11항에 있어서, 2종 이상의 상이한 표적화 리간드가 입자의 표면에 부착되어 있는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 표적화 리간드 중 1종 이상이 조직 특이적인 것인 방법.
  19. 제11항에 있어서, 표적화 리간드가 세포 유형 특이적인 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 세포 유형이 HUVEC, MSC, 섬유모세포, 심근세포 및 인간 배아 줄기 세포 (hESC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. (a) 개체에게로 전달시키고자 하는 일정량의 물질을 함유한 입자를 포함하며, 여기서, 광-제거가능한 보호기를 사용하는 케이징에 의해 불활성화된 표적화 펩티드가 입자의 표면에 부착되어 있는 것인 조성물을 미리 정해진 세포 또는 조직으로 물질을 표적화된 방식으로 전달하는 것이 필요한 개체에게 투여하는 단계;
    (b) 개체에서 미리 정해진 세포 또는 조직에 선택적으로 조사하여 조사된 미리 정해진 세포 또는 조직 중의 불활성 펩티드를 보호기의 제거에 의해 활성화시키고, 여기서, 활성 펩티드는 부착된 입자와 함께 미리 정해진 세포 또는 조직 상에 존재하는 인테그린에 결합할 수 있고, 이를 통해 개체에게 물질을 표적화된 방식으로 전달하는 단계
    를 포함하는, 개체에서 미리 정해진 세포 또는 조직으로 물질을 표적화된 방식으로 전달하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 펩티드가 RGD 또는 YIGSR (서열 1) 모티프를 포함하는 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 제2 표적화 리간드가 입자의 표면에 부착되어 있는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 제2 표적화 리간드가 조직 특이적인 것인 방법.
  25. 복수 개의 입자를 포함하며, 여기서, 각 입자는 개체에게로 전달시키고자 하는 일정량의 물질을 운반할 수 있고, 여기서, 광-제거가능한 보호기를 사용하는 케이징에 의해 불활성화된 표적화 리간드가 입자의 표면에 부착되어 있고, 여기서, 불활성 리간드는 조성물에의 조사에 의해 이루어지는 보호기의 제거로 활성화되고, 여기서, 활성 리간드는 항-리간드에 결합할 수 있는 것인, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 리간드가 펩티드, 항체, 압타머를 포함하는 것인 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 펩티드가 RGD 또는 YIGSR (서열 1) 모티프를 포함하는 것인 조성물.
  28. 제25항에 있어서, 광-제거가능한 보호기가 2-니토벤질, 벤조인 에스테르, N-아실-7-니트인돌린, 메타-페놀, 페나실 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 광-제거가능한 보호기가 4,5-디메톡시-2-니트로벤질 (DMNB) 또는 그의 유도체인 조성물.
  30. 제25항에 있어서, 광-제거가능한 보호기가 리간드에 공유적으로 부착되어 있는 것인 조성물.
  31. 제25항에 있어서, 2종 이상의 상이한 표적화 리간드가 입자의 표면에 부착되어 있는 것인 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 표적화 리간드 중 1종 이상이 조직 특이적인 것인 조성물.
  33. 제25항에 있어서, 표적화 리간드가 세포 유형 특이적인 것인 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 세포 유형이 HUVEC, MSC, 섬유모세포, 심근세포 및 인간 배아 줄기 세포 (hESC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
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