MX2012003990A - Nanoparticulas fotoactivadas para dirigirse a células y tejidos. - Google Patents

Nanoparticulas fotoactivadas para dirigirse a células y tejidos.

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Daniel S Kohane
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Abstract

La presente invención se refiere, en parte, a un sistema novedoso y simple de partículas que dirige y une cualquier tejido selectivamente tras la iluminación con luz; el sistema de partículas puede utilizarse para el suministro dirigido de sustancias a células o tejidos predefinidos en un individuo.

Description

NANOPARTICULAS FOTOACTIVADAS PARA DIRIGIRSE A CELULAS Y TEJIDOS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la fecha de presentación de la solicitud de patente provisional de EEUU 61/247,535 presentada el 30 de septiembre de 2009 titulada "Phototriggered nanoparticles for cell and tissue targeting". Las enseñanzas y el contenido enteros de la solicitud provisional de referencia es incorporada en la presente como referencia.
INVESTIGACIÓN FEDERALMENTE PATROCINADA La invención fue apoyada, en su totalidad o en parte, por la Concesión No. GM073626 del Instituto Nacional de la Salud (NIH-National Institute of Health). El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.
CAMPO TÉCNICO La invención presente se relaciona a composiciones y métodos para la entrega dirigida de sustancias en un individuo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un inconveniente principal asociado con la terapia de fármacos es la incapacidad de llevar a los agentes terapéuticos a un sitio específico del cuerpo sin causar toxicidad no específica o terapia ineficaz. Con los avances en la nanotecnología, un enfoque central en la investigación de entrega de fármacos es dado a técnicas de desarrollo para modificar superficies de nanopartículas con porciones dirigibles que les permiten reconocer específicamente y unirse a propiedades únicas de células y tejidos enfermos y así, aumentar la eficiencia del direccionamiento. Tales dirigibles están compuestos generalmente de anticuerpos, péptídos o aptámeros y sus sitios de unión en las células son receptores específicos, canales u otras moléculas presentes en la membrana celular.
Estudios recientes han demostrado exitosamente que el direccionamiento selectivo de nanopartículas diseñadas a tumores y la viabilidad de tales sistemas de direccionamiento ya ha sido demostrado clínicamente. Para diseñar tales sistemas de direccionamiento, el sistema de nanopartículas es más efectivo si vence dos principales barreras en la trayectoria entre las células circulatorias y las diana. La primera valla es la capacidad ineficaz de los nanoportadores para dejar el sistema vascular penetrando entre las células endoteliales que comprenden los vasos sanguíneos. En los sistemas de direccionamiento diseñados . para el tratamiento de cáncer, los investigadores dependen de los vasos sanguíneos que escurren en el área enferma, lo que permite una penetración fácil de las nanopartículas y la infiltración hacia las células enfermas. La segunda valla es encontrar una expresión única de proteínas de membrana en las células enfermas y diseñar un ligando específico que pueda servir como un dirigible. Ya que muchas enfermedades no proporcionan a los investigadores el lujo de tener vasos sanguíneos que escurren donde las nanopartículas pueden salir fácilmente de la circulación, o las células no poseen biomarcadores únicos conocidos que pueden servir como dianas, hay una necesidad urgente de encontrar e investigar nuevos enfoques para dirigir nanopartículas cargados con agente terapéutico hacia tejidos y órganos enfermos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona, en un aspecto, al descubrimiento de composiciones para entregar agentes/sustancias a un sitio diana proporcionando una composición que incluye una porción de entrega unida a una porción de direccionamiento. Por consiguiente, un aspecto de la invención implica composiciones que comprenden una pluralidad de partículas, cada partícula contiene una cantidad efectiva de una sustancia a ser entregada a un individuo, en donde un ligando de direccionamiento desactivado por inmovilización que utiliza un grupo protector foto-removible está unido a la superficie de las partículas, en donde el ligando inactivo es activado por eliminación del grupo protector por irradiación de la composición, y en donde el ligando activo es capaz de enlazarse a un anti-ligando.
Según algunos aspectos de la invención, se proporcionan los métodos para la entrega dirigida de una sustancia a células o tejidos predefinidos en un individuo. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrar a un individuo en necesidad del mismo, una composición que comprende partículas que contienen una cantidad efectiva de una sustancia a ser entregada al individuo, en donde un ligando de direccionamiento desactivado por inmovilización que utiliza un grupo protector foto-removible está unido a la superficie de las partículas, y selectivamente irradiar células o tejidos predefinidos en el individuo para activar el ligando inactivo en las células o tejidos predefinidos irradiados por eliminación del grupo protector, en donde el ligando activo es capaz de enlazarse junto con las partículas unidas a un anti-ligando presente en las células o los tejidos predefinidos que llevan a la entrega dirigida de la sustancia al individgo.
Según algunos aspectos de la invención, se proporcionan los métodos para la entrega dirigida de una sustancia a células o tejidos predefinidos en un individuo. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrar a un individuo en necesidad del mismo, una composición que comprende partículas que contiene una cantidad efectiva de una sustancia a ser entregada al individuo, en donde un péptido de direccionamiento desactivado por inmovilización que utiliza un grupo protector foto-removible está unido a la superficie de las partículas; y selectivamente irradiar células o tejidos predefinidos en el individuo para activar el péptido inactivo en las células o tejidos predefinidos irradiados por eliminación del grupo protector, en donde el péptido activo es capaz de enlazarse junto con las partículas unidas a las integrinas presentes en las células o los tejidos predefinidos que llevan a la entrega dirigida de la sustancia al individuo.
Según algunos aspectos de la invención, se proporcionan composiciones que comprenden una pluralidad de partículas. En algunas modalidades, cada partícula es capaz de llevar una cantidad efectiva de una sustancia a ser entregada a un individuo, en donde un ligando de direccionamiento desactivado por inmovilización que utiliza un grupo protector foto-removible está unido a la superficie de las partículas, en donde el ligando inactivo es activado por eliminación del grupo protector por irradiación de la composición, y en donde el ligando activo es capaz de enlazarse a un anti-ligando, Las modalidades siguientes aplican igualmente a los varios aspectos de la invención asentada en la presente a menos que se indique de otro modo.
En algunas modalidades, el ligando comprende péptidos, anticuerpos, y/o aptámeros. En algunas modalidades, los péptidos comprende un motivo de aminoácido RGD o YIGSR (SEQ ID NO: 1). En algunas modalidades, el grupo protector foto-removible es seleccionado de un grupo que consiste en 2 nitobencilo, ésteres de benzoina, N-acil-7-nitindolinas, meta-fenol, fenacilos y derivados del mismo. En algunas modalidades el grupo protector foto-removible es un 4,5-dimetoxi-2- nitrobencilo (DMNB) o un derivado del mismo. En algunas modalidades el grupo protector foto-removible está unido covalentemente al ligando. En algunas modalidades dos o más diferentes ligandos de direccionamiento están unidos a la superficie de las partículas. En algunas modalidades por lo menos uno de los ligandos de direccionamiento es específico de tejido. En algunas modalidades el ligando de direccionamiento es de tipo específico de células. En algunas modalidades el tipo de célula es seleccionado del grupo que consiste en: HUVECs, MSCs, fibroblastos, cardiomiocitos y células germinales embrionarias humanas (hESCs).
Debe ser apreciado que una cantidad efectiva como se utiliza en la presente en el contexto de una partícula es una cantidad que es suficiente para lograr un efecto médico deseado en un sujeto cuando una composición que comprende una pluralidad de partículas es administrada al sujeto. En algunas modalidades, una partícula única puede ser efectiva si la cantidad en una partícula única es suficiente para tener el efecto deseado. Sin embargo, típicamente una pluralidad de partículas es administrada a un sujeto, y una cantidad efectiva para cada partícula es la cantidad que proporciona una dosis acumulativa total suficiente para lograr el resultado deseado en el sujeto con base en el número de partículas que son administradas y la frecuencia de la administración como es descrito en más detalle en la presente.
Cada una de las limitaciones de la invención puede abarcar varias modalidades de la invención. Es, por lo tanto, anticipado que cada una de las limitaciones de la invención que implica cualquier elemento o combinaciones de elementos pueden ser incluidos en cada aspecto de la invención. La invención puede tener otras modalidades y puede ser practicada o realizada de varias maneras. También, la fraseología y la terminología utilizadas en la presente son para el propósito de la descripción y no deben ser consideradas como limitantes. El uso de "incluye", "comprende", o "tiene", que "contiene", "implica", y las variaciones de los mismos en la presente, pretenden abarcar los artículos listados posteriormente y los equivalentes de los mismos así como artículos adicionales.
Estos y otros aspectos de las invenciones, así como varias ventajas y utilidades serán aparentes con referencia a la Descripción Detallada. Cada aspecto de la invención puede abarcar varias modalidades como será comprendido.
Todos los documentos identificados en esta solicitud son incorporados en su totalidad en la presente como referencia.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los dibujos adjuntos no pretenden estar dibujados a escala. En los dibujos, cada componente idéntico o casi idéntico que es ilustrado en varias figuras es representado por un numeral similar. Para propósitos de claridad, no cada componente puede ser marcado en cada dibujo.
La FIG 1 ilustra una modalidad no limitante de la presente invención. Los dirigibles no específicos (dirigidos a cada tipo de célula) en la superficie de las nanopartículas son inmovilizados para volverse no funcionales. Con la iluminación de luz, el grupo inmovilizado es liberado, el dirigible es activado y la nanopartícula puede unir cualquier tejido donde se aplique la luz.
Las FIGS. 2A-2C muestran modalidades no limitantes del tiempo de retención en la columna de HPLC del dirigible no inmovilizado (Figura 2A), dirigible inmovilizado no iluminado (Figura 2B) y diez segundos post-iluminación (Figura 2C). El tiempo de retención en la columna de HPLC del dirigible no inmovilizado fue -20 min (FIG. 2A) mientras que ese del dirigible inmovilizado no iluminado fue -30 min (FIG. 2B). Diez segundos post-iluminación un cambio en el tiempo de retención ha ocurrido y el dirigible ha salido de la columna después de -20 min (FIG. 2C).
Las FIGS. 3A-3B muestran modalidades no limitantes de la liberación del grupo inmovilizado de las nanopartículas conjugadas del dirigible. La FIG. 3A sigue la desaparición del enlace de éter en el dirigible como se valora por FTIR, mientras la FIG. 3B sigue el grupo inmovilizador D NB libre liberado a los medios post-iluminación.
Las FIGS. 4A y 4B son modalidades no limitantes de evaluaciones cualitativas de direccionamiento HUVEC en cultivos iluminados y no iluminados. Las partículas aparecen en color blanco. Las FIGS. 4C y 4D son porcentajes de SCs dirigidos y HUVECs, respectivamente.
La FIG. 5 muestra una imagen no limitante de ciertas nanopartículas inmovilizadas. Los péptidos/dirigibles inmovilizados terminados en amina fueron conjugados a la superficie de nanoparticulas de poliestireno terminado en carboxilo (328+ 2 nm) utilizando química de activación de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y sulfo-N-hidroxisuccinimida (NHS).
Las FIGA. 6A-6C demuestran modalidades no limitantes de direccionamiento de HUVECs. La FIG. 6A es una vista macroscópica bajo iluminación UV de nanoparticulas fluorescentes que se adhieren específicamente a células en una pequeña área que ha sido iluminada a 340 nm por 1 min (flecha). La FIG. 6B es una vista microscópica de las células en el área iluminada, mientras la FIG. 6C es una vista microscópica de las células situadas 1 cm lejos. El citoplasma de la célula fue teñido con anticuerpo de ß actina y los núcleos teñidos por Hoechst. Las nanoparticulas aparecen como motas blancas en la FIG. 6B.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Aspectos de la invención se relacionan a composiciones para entregar agentes/sustancias a un sitio diana proporcionando una composición que incluye una porción de entrega unida a una porción de direccionamiento. La porción de entrega puede ser una partícula que contiene el agente/sustancia a ser entregada. La porción de direccionamiento puede ser un ligando de direccionamiento que es desactivado reversiblemente por un mecanismo que permite la activación del ligando de direccionamiento in situ después de que la composición es administrada a un individuo. La desactivación reversible del ligando de direccionamiento puede ser lograda utilizando una o más modificaciones sensibles a la luz, sensibles al calor, sensibles a la presión, y/o sensibles al pH, sensibles a las microondas, sensibles a los rayos X, y/o una o más modificaciones que son sensibles a una o más de otras entradas tal como una o más otras formas de entrada de energía. Los aspectos de la invención permiten el uso de ligandos específicos y no específicos de tejido que pueden ser utilizados para dirigir selectivamente a un área de interés. En algunas modalidades, el ligando de direccionamiento activo se une a una molécula diana (anti-ligando) por ejemplo en una superficie de célula, con lo cual se une y/o concentra la composición en la vecindad del anti-ligando (y/o la célula o el tejido en que el anti-ligando está presente).
En algunas modalidades, la invención presente se basa, por lo menos en parte, en un sistema particulado novedoso que puede dirigirse y unirse a cualquier tejido selectivamente con iluminación de luz con un potencial de diagnóstico de liberación y/o a sustancias/agentes terapéuticos en cualquier sitio deseado (FIG. 1). El primer componente es la "partícula/portador" que puede llevar cargas de diagnóstico y/o terapéuticas (por ejemplo, compuestos de formación de imagen, fármacos, factores de crecimiento, citocinas, etc.). Actualmente, los polímeros y lípidos naturales y sintéticos son utilizados típicamente como vectores de entrega de fármaco.
El segundo componente en este sistema incluye "sustancias/agentes de diagnóstico y/o terapéuticos". Las partículas pueden ser cargadas con una variedad de sustancias incluyendo fármacos, factores de crecimiento, quimiocinas y moléculas de formación de imagen. Los portadores pueden ser utilizados para aumentar la concentración local de fármaco llevando al fármaco dentro y concentrándolo y/o controlando su liberación cuando se enlaza a una diana.
El tercer componente en este sistema es el "ligando de direccionamiento". En algunas modalidades, el ligando de direccionamiento es desactivado por inmovilización utilizando un grupo protector foto-removible. En algunas modalidades, el ligando inactivo es una macromolécula inmovilizada, (por ejemplo, uno o más péptidos, anticuerpos, aptámeros, receptores y/o los antígenos, inmovilizados). La idea detrás de la técnica de inmovilización es que un ligando de direccionamiento puede volverse temporalmente biológicamente no funcional (o inmovilizado) por modificación química con un grupo protector foto-removible. La irradiación puede ser utilizada para liberar el grupo protector de la superficie del ligando y restaurar su capacidad de unirse a un anti-ligando, por ejemplo, en una célula de interés. En algunas modalidades, el anti-ligando es el socio de unión natural del ligando. Por ejemplo, el anti-ligando puede ser un receptor de superficie en una célula y el ligando de direccionamiento es el ligando natural (o una porción del mismo) del receptor. Por consiguiente, el ligando de direccionamiento puede ser un socio de unión natural (o un fragmento de unión del mismo) de una molécula de superficie celular (por ejemplo, proteína u otra molécula de superficie celular). Sin embargo, debe ser apreciado que en algunas modalidades el ligando puede ser una molécula sintética (por ejemplo, un péptido sintético, ácido nucleico, u otra molécula sintética) que se une a una molécula de superficie celular (el anti-ligando). Debe ser apreciado que el anti-ligando dirigido puede ser una molécula que existe en la naturaleza. En algunas modalidades, el anti-ligando dirigido puede ser específicos de célula o tejido (por ejemplo, presente únicamente o de manera preferencial en células o tejidos específicos). En ciertas modalidades, un anti-ligando puede estar naturalmente presente en dos o más tipos de células o tejidos (por ejemplo, no específico de célula o tejido). En algunas modalidades, un anti-ligando puede ser específico para una condición particular (por ejemplo, un estado de enfermedad, por ejemplo una molécula variante asociada con una enfermedad tal como cáncer). En algunas modalidades, el anti-ligando puede ser un receptor, proteina de canal, glucoproteina, proteoglicano, molécula de adhesión o cualquier otra molécula de superficie celular. En algunas modalidades, el anti-ligando puede ser una proteína de empalme de vacío tal como una connecina 43, un canal tal como un canal de ion y/o un canal de ATP, una molécula adhesiva o de adhesión tal como CD31 (VECAM), N-cadherina, VE cadherina, y/o E cadherina, una glucoproteina tal como CD44 y/o CD133, un receptor tal como VEGFR2 y/o angiotensina y/o un proteoglicano tal como sulfato de heparan y/o aggrecano.
En algunas modalidades, la invención se relaciona a una composición que comprende una pluralidad de partículas que contiene una cantidad efectiva de una sustancia de diagnóstico y/o terapéutica. Un ligando de direccionamiento desactivado por inmovilización puede ser unido a la superficie de las partículas. El ligando desactivado puede ser activado por la eliminación del grupo inmovilizador por irradiación de la composición (por ejemplo, in situ después de la administración a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano). En algunas modalidades, otras formas de energía pueden ser utilizadas para activar el ligando que ha sido inmovilizado utilizando otras técnicas. En algunas modalidades, las partículas no contienen ninguna sustancia de diagnóstico y/o terapéutica. Por consiguiente, en algunas modalidades, una partícula unida a un ligando puede ser proporcionada para que pueda ser cargada con una sustancia de interés. El ligando puede ser inmovilizado o no puede ser inmovilizado antes de que la partícula sea cargada.
En algunas modalidades, la invención se relaciona a un método para la entrega dirigida de una sustancia a células o tejidos predefinidos utilizando una composición como se describió antes. En algunas modalidades dos o más diferentes ligandos de direccionamientos están unidos a la superficie de las partículas. Los ligandos de direccionamientos pueden ser específicos o no específicos de tejidos. En algunas modalidades, los ligandos de direccionamiento pueden ser encontrados sólo en un tipo específico de célula. En algunas modalidades, los anti-ligandos pueden ser receptores, proteínas de canal, glucoproteínas, proteoglicanos, moléculas de adhesión o cualquier otra molécula de superficie celular.
Los aspectos de la invención pueden ser útiles para la entrega dirigida de fármacos, y para el direccionamiento en células que no tienen algún biomarcador único. La tecnología permite conferir especificidad espacial y temporal en un ligando de direccionamiento no específico. Los métodos de la invención proporcionan la liberación rápida y localizada de las moléculas de interés a cualquier tejido en el cuerpo. Los compuestos y los métodos de la invención permiten la entrega de composiciones terapéuticas a regiones discretas del cuerpo en virtud de la capacidad de activar ligandos de direccionamiento inmovilizados por un rayo enfocado de luz (por ejemplo, ultravioleta o infrarroja) u otra fuente de energía. Por ejemplo, este enfoque puede ser utilizado para la entrega dirigida al ojo, a la piel, y a la oreja y también puede ser utilizado para tratar otros órganos internos con ayuda de la tecnología mínimamente invasiva de fibra óptica u otra óptico (por ejemplo, cerca de infrarrojo) u otra tecnología de activación que puede penetrar el cuerpo de un sujeto para activar el ligando de direccionamiento en una región de interés (por ejemplo, adyacente a un sitio de la enfermedad, ejemplo cerca de un tumor u otro tejido canceroso). El enfoque también podría ser utilizado para unir dispositivos inyectados o implantados que portan una molécula de interés. El último tiene muchos usos potenciales, tal como el problema de recargar el contenido de fármaco de sistemas implantados de entrega de fármaco, tratar hardware infectado, etc.
Los aspectos de la invención también pueden ser útiles para transferir fármacos a través de la barrera de cerebro-sangre. Las composiciones de la invención pueden ser producidas utilizando ligandos de direccionamiento que se pueden unir a anti-ligandos específicos presentes en la barrera de cerebro-sangre. En algunas modalidades, el ligando de direccionamiento es la transferina o insulina. En algunas modalidades, los ligandos de direccionamiento no específicos de tejido son utilizados en combinación con los ligandos específicos de tejido.
Por consiguiente, los aspectos de la invención pueden ser utilizados para dirigir moléculas terapéuticas, de diagnóstico/formación de imagen, y/u otras a cualquier sitio diana de interés en un sujeto. Por ejemplo, una composición puede ser activada selectivamente en un sitio de tejido enfermo dondequiera en el cuerpo de un sujeto. En algunas modalidades, la diana puede estar en o cerca de un órgano que está enfermo (por ejemplo, canceroso). En algunas modalidades, la diana puede ser una porción de un tejido u órgano. Por ejemplo, una composición puede ser activada en o cerca del hígado, páncreas, pulmón, colon, vejiga, cervix, corazón, hueso, riñon, tejido de hueso, tejido de músculo, o una porción del mismo. En algunas modalidades, tejido vascular en o cerca de un órgano o tejido diana de interés puede ser dirigido por activación (por ejemplo, utilizando luz u otra fuente de energía descrita en la presente). Debe ser apreciado que aspectos de la invención pueden ser utilizados para tratar o diagnosticar (o ayudar en el tratamiento o el diagnóstico) de un organismo pluricelular, por ejemplo, un vertebrado, un mamífero (por ejemplo, un humano, un mamífero agrícola o doméstico) u otro animal. Debe ser apreciado que las composiciones de la invención pueden ser administradas en cualquier manera conveniente. En algunas modalidades, una composición puede ser inyectada, administrada oralmente, o administrada de otro modo. En algunas modalidades, una composición puede ser administrada intravenosamente, intraperitonealmente, o de otro modo. Por consiguiente, en algunas modalidades, una composición puede ser proporcionada sistémicamente. En algunas modalidades, una composición puede ser proporcionada localmente. Debe ser apreciado que una composición puede ser activada localmente, en una o más ubicaciones, o más generalmente en un sujeto (por ejemplo, un paciente en necesidad de diagnóstico y/o tratamiento).
Debe ser apreciado que uno o más agentes de diagnóstico y/o terapéuticos pueden ser administrados a un sujeto en una cantidad efectiva. Una cantidad efectiva de un agente es una dosis suficiente para proporcionar un resultado médicamente deseable y puede ser determinado por un experto en la técnica que utiliza los métodos rutinarios. En algunas modalidades, una cantidad efectiva es una cantidad que tiene como resultado cualquier mejora en la condición que es tratada. En algunas modalidades, una cantidad efectiva puede depender del tipo y la extensión de la enfermedad o la condición que es tratada y/o el uso de uno o más agentes terapéuticos adicionales. Sin embargo, un experto en la técnica puede determinar dosis e intervalos apropiados de agentes terapéuticos a utilizar, por ejemplo con base en pruebas in vitro y/o in vivo y/u otro conocimiento de dosis de compuestos. Asimismo, cantidades efectivas de un agente de diagnóstico pueden ser determinadas con base en la aplicación de diagnóstico deseada. Por consiguiente, ya que los agentes descritos en la presente son administrados en partículas, una cantidad efectiva para cada partícula es una cantidad suficiente para contribuir a una cantidad efectiva total de agente teniendo en cuenta el número de partículas que son administradas a un sujeto y la frecuencia de la administración.
Cuando es administrado a un sujeto, las cantidades efectivas de un agente terapéutico dependerán, por supuesto, de la enfermedad particular que es tratada; la gravedad de la enfermedad; los parámetros individuales del paciente incluyendo la edad, el estado físico, el tamaño y el peso, tratamiento concurrente, la frecuencia de tratamiento, y del modo de la administración. Estos factores son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden ser tratados con no más que la experimentación de rutina. En algunas modalidades, una dosis máxima es utilizada, es decir, la dosis segura más alta según el buen juicio médico. Asimismo, cantidades efectivas de un agente de diagnóstico pueden depender de uno o más parámetros, incluyendo la edad, el estado físico, el tamaño, el peso, y otras condiciones médicas de un sujeto.
En algunas modalidades, una cantidad efectiva de un agente terapéutico o de diagnóstico variará típicamente de aproximadamente 0.001 mg/kg a aproximadamente 1000 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 750 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg, de aproximadamente 1.0 mg/kg a aproximadamente 250 mg/kg, de aproximadamente 10.0 mg/kg a aproximadamente 150 mg/kg en una o más administraciones de dosis, por uno o por varios días (dependiendo por supuesto del modo de la administración y los factores discutidos antes). Por consiguiente, la cantidad efectiva de un agente a ser cargado en una partícula descrita en la presente (por ejemplo, una partícula dirigida) dependerá del número de partículas y frecuencia de la administración de partículas a un sujeto. Debe ser apreciado que un experto en la técnica puede determinar los regímenes terapéuticos y/o de diagnóstico apropiados con base en la cantidad de agente que es cargado por partícula, el número de partículas que son administradas a un sujeto en cada dosis, y en la frecuencia de la administración. En algunas modalidades, cada uno de estos parámetros puede ser variado para entregar una cantidad deseada (por ejemplo, efectiva) de agente(s) a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano). En algunas modalidades, el número de partículas administradas en una dosis única puede estar en el intervalo de 100 a1020.
Los niveles de dosis actuales de un agente de diagnóstico o terapéutico pueden variar (por ejemplo, variando la cantidad por partícula, la frecuencia de la administración, el número de partículas que son administradas, o una combinación de los mismos) para obtener una cantidad que es efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, para las composiciones, y por el modo de la administración. El nivel seleccionado de la dosis depende de la actividad del agente particular, la ruta de la administración, el tejido a ser tratado, y la historia clínica previa del paciente a ser tratado. Sin embargo, está dentro de la experiencia en la técnica comenzar dosis del agente (por ejemplo, las dosis alcanzadas utilizando una pluralidad de partículas) a niveles más bajos que lo requerido para lograr el esfuerzo terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que el efecto deseado sea alcanzado.
A. Partículas/Portadores En ciertas modalidades de la invención las "partículas" de la invención comprenden un polímero biocompatible, que es preferiblemente biodegradable. Los polímeros convenientes incluyen, pero no se limitan a poli(ácido láctico-co-ácido glicólico), polianhidridos, acetato de etilen vinilo, ácido poliglicólico, quitosán, poliortoésteres, poliéteres, ácido poliláctico, y poli (beta amino ésteres). Los péptidos, las proteínas tales como colágeno, y los dendrímeros (por ejemplo, dendrímeros de PAMAM) también pueden ser utilizados. En ciertas modalidades de la invención un compuesto de poli(beta amino éster), o una sal o derivado del mismo, es utilizado como un portador. El portador puede ser utilizado en forma de micropartículas, nanopartículas, artículos sólidos de entrega de fármaco, y/o como un complejo soluble de escala nanométrica con un ácido nucleico.
En ciertas modalidades de la invención las partículas pueden ser dispositivos de entrega de fármaco que comprenden un material sólido tal como una matriz polimérica impregnada con, o que encapsula, un agente terapéutico. El dispositivo es implantado en el cuerpo en la ubicación del tejido de diana o en la vecindad del mismo, o en una ubicación lejana del tejido diana. El agente terapéutico es liberado de la matriz polimérica con la irradiación de luz. El agente terapéutico puede ser liberado por difusión, la degradación de la matriz polimérica o captación celular.
Una matriz polimérica que comprende la partícula de la invención puede asumir varias formas diferentes. Por ejemplo, microparticulas de varios tamaño (que también puede ser referidas como perlas, microperlas, microesferas, nanopartículas, nanoperlas, nanoesferas, etc.) pueden ser utilizadas. Las microparticulas poliméricas y su uso para la entrega de fármacos son bien conocidas en la técnica. Tales partículas son típicamente aproximadamente esféricas en la forma pero pueden tener formas irregulares. Generalmente, una micropartícula tendrá un diámetro de 500 mieras o menos, por ejemplo, entre 50 y 500 mieras, entre 20 y 50 mieras, entre 1 y 20 mieras, entre 1 y 10 mieras, y una nanopartícula tendrá un diámetro de menos de 1 miera. Si la forma de la partícula es irregular, entonces el volumen típicamente corresponderá a ese de las microesferas o nanoesferas. La matriz polimérica puede ser formada en varias formas de nonparticulado tales como hostias, los discos, las barras, etc., que pueden tener un intervalo de tamaños y volúmenes diferentes. Los métodos para incorporar a agentes terapéuticamente activos en matrices poliméricas son conocidos en la técnica.
Las nanopartículas o microparticulas sólidas pueden ser formadas utilizando cualquier método conocido en la técnica incluyendo, pero no limitado a, secado por aspersión, separación de fases, evaporación de solvente de emulsión simple o doble, extracción de solvente, y coacervación sencilla y compleja. Ciertos métodos incluyen el secado por aspersión y el procedimiento de emulsión doble. Las composiciones poliméricas que contienen el agente sólido, también pueden ser formadas utilizando granulación, extrusión, y/o esferonización. Las nanoparticulas utilizadas en la invención presente son bien conocidas en la técnica e incluyen esas descritas a detalle en Mallidi, S. et al. Nano Letters 2009, 9, (8), 2825-31 ; Bagaikot, V. et al. Nano Lett 2007, 7, (10), 3065-70; and Farokhzad, O. C. et al. Proc Nati Acad Sci U S A 2006, 103, (16), 6315-20. En algunas modalidades, las nanoparticulas son liposomas. En algunas modalidades, las nanoparticulas son nanoparticulas de poliestireno terminadas en carboxilo. En algunas modalidades, las nanoparticulas de poliestireno terminadas en carboxilo tienen un diámetro de 328+ 2 nm (FIG. 5).
Las condiciones utilizadas para preparar las micropartículas pueden ser alteradas para rendir partículas de un tamaño o propiedad deseadas (por ejemplo, hidrofobicidad, hidrofilicidad, la morfología externa, "adherencia", forma, etc.). El método para preparar la partícula y las condiciones (por ejemplo, el solvente, la temperatura, la concentración, el caudal de aire, etc.) utilizado también puede depender del agente que es encapsulado y/o la composición de la matriz de polímero. Si las partículas preparadas por cualquiera de los métodos antes mencionados tienen un intervalo de tamaño fuera del intervalo deseado, las partículas pueden ser dimensionadas, por ejemplo, utilizando un cedazo u otra técnica de separación de tamaño. Los métodos desarrollados para hacer micropartículas para la entrega de agentes encapsulados son descritos en la literatura.
Las composiciones sólidas del polímero-agente (por ejemplo, los discos, las hostias, los tubos, las hojas, las barras, etc.) pueden ser preparadas utilizando cualquiera de una variedad de métodos que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, en el caso de polímeros que tienen un punto de fusión debajo de la temperatura en que la composición será entregada y/o a la que el polímero se degrada o llega a ser indeseablemente reactivo, un polímero puede ser fundido, mezclado con el agente a ser entregado, y entonces solidificado por enfriamiento. Un artículo sólido puede ser preparado por fundido en solvente, en que el polímero es disuelto en un solvente, y el agente es disuelto o es dispersado en la solución de polímero. Después de la evaporación del solvente, la sustancia es dejada en la matriz polimérica. Este enfoque requiere generalmente que el polímero sea soluble en solventes orgánicos y que el agente sea soluble o dispersable en el solvente. En todavía otros métodos, un polvo del polímero es mezclado con el agente y entonces comprimido para formar un implante.
Muchos de los polímeros útiles contienen ambos grupos amino cargables, para permitir la interacción iónica con el fosfato con carga negativa del ADN, y una región degradable, tal como un enlace de éster hidrolizable. Ejemplos de éstos incluyen ácido poli(ácido alfa-(4-aminobutilo)-L-glicólico), poli(amino éster) en red, y poli(beta-amino ésteres). Estos agentes de complejación pueden proteger al ADN contra la degradación, por ejemplo, por las nucleasas, componentes de suero, etc., y crean una carga de superficie menos negativa, que puede facilitar el pasaje por las membranas hidrófobas (por ejemplo, citoplásmicas, lisosomales, endosomales, nucleares) de la célula. Ciertos agentes de complejación facilitan los acontecimientos intracelulares de trafico tales como escape endosomal, transporte citoplásmico, y entrada nuclear, y pueden disociarse del ácido nucleico. Ha sido propuesto que tales agentes pueden actuar como una " esponja de protones" dentro del endosoma.
B. Agentes de diagnóstico/terapéuticos Una gran variedad de "agentes de diagnóstico y/o terapéuticos" puede ser incorporada en las partículas. Por "terapéutico", como es utilizado en la presente, se entiende un agente que tiene un efecto beneficioso en el paciente. Como es utilizado en la presente, el término terapéutico es sinónimo con el término fármaco. Agentes adecuados terapéuticos incluye, pero no es limitado a: agentes antineoplásicos, las hormonas, citocinas, citotoxinas, agentes anti-microbianos (anti-micóticos, anti-víricos, antiprotozoarios), los antibióticos, las vitaminas, antituberculares, antireumáticos, agentes anti-alérgicos, fármacos circulatorias, antianginales, los anticoagulantes, los narcóticos, glicósidos cardiacos, bloqueadores neuromusculares, los sedantes (hipnóticos), y anestésicos locales y generales.
Los agentes anti-neoplásicos incluyen, pero no son limitados a, compuestos de platino (por ejemplo, spiroplatina, cisplatina, y carboplatina), methotrexato, adriamicina, mitomicina, ansamitocina, bleomicina, arabinósido de citosina, adenina de arabinosilo, mercaptopolilisina, vincristina, busulfan, clorambucil, melfalan (por ejemplo, PAM, L-PAM o mostaza fenilalanina), mercaptopurina, mitotano, dactinomicina de clorhidrato de procarbazina (actinomicina D), clorhidrato de daunorubicina, clorhidrato de doxorubicina, taxol, mitomicina, plicamicina (mitramicina), aminoglutetimida, fosfato de estramustina sódica, flutamida, acetato de leuprolido, acetato de megestrol, citrato de tamoxifen, testolactona, trilostano, amsacrina (M-AMSA) asparaginasa (L-asparaginasa) asparaginasa de Erwina, etopósido (VP-16), interterón ct-2a, interferón a-2b, tenipósido (VM-26), sulfato de vinblastina (VLB) sulfato de vincristina, bleomicina, sulfato de bleomicina, metotrexato, adriamicina, y arabinosil.
Ejemplos de hormonas incluyen, pero no son limitadas a, la hormona del crecimiento, hormona que estimula melanocitos, estradiol, dipropionato de beclometasona, betametasona, acetato de betametasona y fosfato sódico de betametasona, fosfato disódico de vetametasona, fosfato sódicode vetametasona, acetato de cortisona, dexametasona, acetato de dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, flunisolida, la hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, cipionato de hidrocortisona, fosfato sódico de hidrocortisona, succinato sódico de hidrocortisona, metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, succinato sódico de metilprednisolona, acetato de parametasona, prednisolona, acetato de prednisolona, fosfato sódico de prednisolone, tebutato de prednisolona, prednisona, triamcinolona, acetónido de triamcinolona, diacetato de triamcinolona, hexacetónido de triamcinolona y acetato de fludrocortisona.
Citocinas potencialmente útiles incluyen, pero no se limitan a, a linfocinas, a interleucinas, a los interferones, y a las quimiocinas.
Ejemplos de citotoxinas contempladas incluyen, pero no son limitadas a, toxina de cólera, ricina, toxina LT, la toxina C3, toxina de Shiga, toxina de pertussis, toxina de tétano, saporina, modeccina, gelanina y factor de necrosis de tumor.
Ejemplos no limitantes de antibacteriales incluyen antivirales tales como acyclovir, azidotimidina de amantadina (AZT o Zidovudina), monohidrato de ribavirina y vidarabina (arabinósida de adenina, el ara-A) agentes anti-micóticos tales como ketoconazol, como nystatina, como griseofulvina, como flucytosina (5-fc), como miconazol, como amfotericina B, como ricina, y como antibióticos de pMactam (por ejemplo, sulfazecina); antiprotozoarios tales como cloroquina, hidroxicloroquina, metronidazol, antimonato de quinina y meglumina; y modificantes de la respuesta biológicas tales como muramildipéptido, componentes de la pared celular microbiana, linfocinas (por ejemplo, endotoxina bacteriana tal como lipopolisacárido, factor de activación de macrófago), la subunidad de bacterias (tales como Micobacteria, Corynebacteria), el dipéptido sintético N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutamina.
Los antibióticos incluyen, pero no son limitados a, dapsona, cloramfenicol, la neomicina, cefaclor, cefadroxil, cephalexina, eritromicina de cephradina, clindamicina, lincomicina, amoxicillina, ampicillina, bacampicillina, carbenicillina, dicloxacillina, cyclacillina, picloxacillina, hetacillina, methicillina, naícillina, oxacillina, la penicilina G, la penicilina V, nfampin de ticarcillina y tetraciclina.
Ejemplos de antiinflamatorios incluyen, pero no son limitados a diflunisal, ibuprofeno, indomethacina, meclofenamato, ácido mefenamico, naproxeno, oxifenbutazona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetin, la aspirina y los salicilatos.
Ejemplos de vitaminas incluyen pero no son limitadas al ácido cianocobalamin neinoico, retinoides y derivados tales como palmitato de retinol, y a-tocoferol.
Ejemplos de antituberculares incluyen pero no son limitados al ácido para-aminosalicílico, a isoniazid, a cicloserina sulfato de capreomicina, a etionamida de clorhidrato de etambutol, a pirazinamida, a rifampina, y a sulfato de estreptomicina.
Ejemplos de antireumáticos incluyen, pero no se limitan a la penicilamina.
Ejemplos de agentes anti-alérgicos incluyen pero no son limitados al amelexanox; agentes anti-coagulación tales como fenprocoumon y heparina.
Ejemplos de fármacos circulatorios incluyen pero no son limitados al propranolol; potenciadores metabólicos tales como la glutationa.
Ejemplos de antianginales incluyen pero no son limitados al diltiazem, nifedipina, verapamil, tetranitrato de eritritol, dinitrato de isosorbide, la nitroglicerina (trinitrato de glicerilo) y tetranitrato de pentaeritritol.
Ejemplos de anticoagulantes incluyen pero no son limitados al fenprocoumon, la heparina.
Ejemplos de narcóticos incluyen pero no son limitados al paregoric; opiáceos tales como la codeína, la heroína, la metadona, la morfina y el opio.
Ejemplos de glicósidos cardiacos incluyen pero no son limitados al deslanosido, digitoxina, digoxina, digitalina y digitalis.
Ejemplos de bloqueadores neuromusculares incluyen pero no son limitados al mesilato de atracurio, trietiyoduro de gallamina, bromuro de hexafluorenio, yoduro de metocurina, bromuro de pancuronio, cloruro de succinilcolina (cloruro de suxametonio), cloruro de tubocurarina y bromuro de vecuronio.
Ejemplos de sedantes (hipnóticos) incluyen pero no es limitados al amobarbital, amobarbital sódico, aprobarbital, butabarbital sódico, hidrato doral, etclorvinol, etinamato, clorhidrato de flurazepam, glutetimids, clorhidrato de metotrimeprazins, metiprilon, clorhidrato de midazolam, paraldehído, pentobarbital, pentobarbital sódico, fenobarbital sódico, secobarbital sódico, talbutal, temazepam y triazolam.
Ejemplos de anestésicos locales incluyen pero no son limitados al clorhidrato del bupivacaína, clorhidrato de cloroprocaína, clorhidrato de etidocaína, clorhidrato de lidocaína, clorhidrato de mepivacaina, clorhidrato de procaina y clorhidrato de tetracaína; los anestésicos generales incluyen pero no son limitados al droperidol, etomidato, citrato de fentanilo con droperidol, clorhidrato de ketamina, metohexital sódico y tiopental sódico; y partículas o iones radioactivos tales como estroncio, yoduro de renio e ¡trio.
Otros terapéuticos incluyen material genético tal como ácidos nucleicos, como el ARN, y como el ADN, ya sea de origen natural o sintético, incluyendo ARN y ADN recombinantes, ARN y ADN antisentido y RNAsi u otro ARN pequeño. Los tipos de material genético que pueden ser utilizados incluyen, por ejemplo, los genes portados en vectores de expresión tales como plásmidos, fagémidos, cósmidos, la levadura cromosomas artificiales (YACs), y virus defectuosos o "asistentes", ácidos nucleicos de antigenos, ambos de ARN y ADN mono y doble catenados y análogos de los mismos, tales como fosforotioato y oligodeoxinucleótidos de fosforoditioato. Adicionalmente, el material genético puede ser combinado, por ejemplo, con proteínas u otros polímeros.
Si se desea, más de un terapéutico puede ser aplicado utilizando las microesferas. Por ejemplo, una microesfera única puede contener más de un terapéutico o microesferas que contienen diferente terapéuticos puede ser co-administradas.
Como se utiliza en la presente, "agente de diagnóstico" comprende a cualquier agente que puede ser utilizado en el diagnóstico de una enfermedad en un individuo. Ejemplos no limitantes incluyen a agentes de formación de imagen tales como radioisótopos, los tintes, los pigmentos y moléculas fluorescentes (tales como luciferase, y como fluoresceína) y metales pesados (tales como gadolinio).
Por consiguiente, debe ser apreciado que un agente de diagnóstico o terapéutico puede ser un péptido, proteína, ácido nucleico (ADN o ARN), pequeña molécula, o cualquier combinación de los mismos.
C. Liqandos de direccionamiento Como es utilizado en la presente, el "ligando de direccionamiento" comprende cualquier tipo de molécula para la cual existe otra molécula (por ejemplo, un "anti-ligando") que se une al ligando, debido a un cambio favorable (es decir, negativo) en la energía libre al contacto entre el ligando y el anti-ligando. La unión entre el ligando y el anti-ligando puede ser específica con afinidades de unión en el intervalo micromolar a picomolar. Los pares de ligando/anti-ligando pueden ser un antígeno/anticuerpo, enzima/sustrato, ADN/ADN, ADN/ARN, ARN/ARN, las incompatibilidades de ácido nucleico, ácidos nucleicos complementarios y ácido nucleico/proteínas. Será apreciado que cualquier molécula puede actuar ya sea como un ligando o un anti-ligando. En algunas modalidades, el ligando comprende un péptido, un anticuerpo, un aptámero, un receptor o un antígeno. El ligando de direccionamiento puede ser desactivado por inmovilización utilizando un grupo protector foto-removible, grupo sensible al calor, grupo sensible a la presión, sensible a microondas, un grupo sensible al pH o cualquier otro grupo que puede ser removido con la exposición a una fuente conveniente de energía. El ligando puede ser específico o no específico de tejido. En algunas modalidades, el ligando es no específico de tejido.
En algunas modalidades, el ligando de direccionamiento puede ser desactivado por inmovilización utilizando un grupo protector foto-removible. En general, la inmovilización utilizando cualquier técnica conveniente (por ejemplo utilizando un grupo fotoremovible o cualquier otro grupo conveniente) inhibe u oculta (por ejemplo, interrumpiendo enlaces que estabilizan normalmente una interacción con una molécula diana, modificando la hídrofobicidad o el carácter iónico de una cadena secundaria particular del ligando, o por impedimento estérico) una propiedad importante necesaria para la actividad biológica, por ejemplo, un sitio activo o un patrón de plegado, cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades, la presencia del grupo inmovilizador en el ligando de direccionamiento cambiará su conformación y así prevendrá el reconocimiento del ligando por su anti-ligando encontrado en la superficie celular. La eliminación del grupo inmovilizador activa el ligando. El ligando de direccionamiento está unido covalentemente a la superficie de una partícula.
En algunas modalidades, el ligando comprende un péptido, un anticuerpo, un aptámero, un receptor o un antígeno. En algunas modalidades, el ligando es un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene un motivo conocido por ser esencial para la unión celular mediada por el receptor de integrina. Como tal, el péptido puede ser volverse temporalmente biológicamente no funcional con respecto al correspondiente péptido por inmovilización que utiliza un grupo protector foto-removible (u otro grupo removible). El "péptido desactivado" es un "péptido" antes indicado que es vuelto biológicamente inactivo por modificación covalente (por ejemplo, por inmovilización) por la unión de un grupo protector foto-removible (u otro grupo removible). El "aducto de péptido/particula desactivado comprende un "péptido desactivado" que está unido covalentemente a la superficie de una partícula que comprende una sustancia de interés.
Debe ser apreciado que en algunas modalidades el ligando puede ser alguna molécula conveniente (por ejemplo, un péptido) que se une a una molécula de superficie celular (anti-ligando). La molécula de superficie celular puede ser un receptor de proteína u otra proteína de superficie celular que es capaz de la enlazarse a un ligando específico (ya sea un ligando natural o sintético).
En algunas modalidades, el ligando de direccionamiento puede ser específico para un anti-ligando que está presente en una célula endotelial (por ejemplo, un antígeno de superficie en una célula endotelial). Por consiguiente, con la activación del ligando de direccionamiento, una partícula unida puede unirse a una célula endotelial. En algunas modalidades, esto permite a las partículas en un vaso sanguíneo ser activadas para unirse a células endoteliales en la pared del vaso sanguíneo. En algunas modalidades, las partículas que se une a un área de una pared de vaso sanguíneo pueden cruzar la capa endotelial y entregar a un agente u otra sustancia a un tejido u órgano adyacente al área del vaso sanguíneo. Debe ser apreciado que el anti-ligando en la célula endotelial puede ser una molécula específica endotelial. Sin embargo, en algunas modalidades, puede ser una molécula que está presente en células endoteliales además de otras células. Según la invención, la unión a una región diana en una pared de vaso sanguíneo puede ser lograda activando el ligando en la vecindad de la región diana. Debe ser apreciado que en algunas modalidades el ligando de direccionamiento de una composición de la invención puede ser activado en un vaso sanguíneo (por ejemplo, por luz) corriente arriba de la región diana (por ejemplo, si la cinética de la activación y unión del ligando tendría como resultado la unión dentro de la región diana aunque la activación ocurriera corriente arriba de la región diana, debido al flujo sanguíneo que toma la composición activada de la región de activación a la región diana).
En algunas modalidades, el anti-ligando puede ser un receptor, proteina de canal, glucoproteína, proteoglicano, molécula de adhesión o cualquier otra molécula de superficie celular. En algunas modalidades, el anti-ligando puede ser una proteína de empalme de vacío tal como connecina 43, un canal tal como un canal de ion y/o un canal de ATP, un adhesivo tal como CD31 (VECAM), N-cadherina, VE cadherina, y/o E cadherina, una glicoproteina tal como CD44 y/o CD133, un receptor tal como VEGFR2 y/o angiotensina y un proteoglicano tal como sulfato de heparan y/o agrecan.
En algunas modalidades el aducto de péptido/partícula desactivado es preparado de un péptido que es inmovilizado primero con un grupo protector foto-removible, seguido por unión covalente del péptido inmovilizado a la partícula. En otras modalidades el aducto de péptido/partícula desactivado es preparado de una unión covalente de la partícula al péptido durante el primer paso, seguido por inmovilización de la porción peptídica del aducto de péptido/partícula con un grupo protector foto-removible. En modalidades adicionales, el aducto de péptido/partícula desactivado es preparado de una reacción de un solo paso de "un recipiente" del péptido, de la nanopartícula, y del grupo protector foto-removible.
En algunas modalidades, el péptido comprende un motivo de RGD de fibronectina. En otras modalidades, el péptido comprende un motivo YIGSR (SEQ ID NO: 1) de laminina. En algunas modalidades, el péptido comprende péptidos que contienen YIGSR sintético tal como CDPGYIGSR (SEQ ID NO: 3) y/o YIGSR-NH2 (SEQ ID NO: 1). Los grupos protectores foto-removible utilizados en la invención presente son bien conocidos en la técnica (Pillai, in Organic Photochemistry, Vol. 9, A Padwa, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, pp. 225-323). Ejemplos de grupos protectores foto-removibles convenientes incluyen, pero no son limitados a, de 2 nitobencilo, ésteres de benzoina, N-acil-7-nitindolinas, meta-fenoles, fenacilos y derivados de los mismos. En algunas modalidades, el grupo protector foto-removible es un derivado de 2 nitrobencilo, tal como un derivado de 4,5-dimetoxi-2-nitrobencil (DMNB).
En algunas modalidades, un sustituyente hidroxilo (-OH) del péptido reacciona con el grupo protector foto-removible. En otras modalidades un sustituyente amino (-NH2, o -NH-) del péptido reacciona con el grupo protector foto-removible. En algunas modalidades, un sustituyente tiol (-SH) del péptido reacciona con el grupo protector foto-removible. En otras modalidades un sustituyente de ácido carboxílico (-CO2H) o un derivado del mismo, tal como un sustituyente éster (-C02-Alifático), del péptido reacciona con el grupo protector foto-removible.
En algunas modalidades, el sustituyente hidroxilo (-OH) del péptido que reacciona con el grupo protector foto-removible es derivado de la cadena secundaria de serina, de treonina, de tirosina, o de hidroxiprolina. En otras modalidades, el sustituyente amino (-NH2, o -NH-) del péptido que reacciona con el grupo protector foto-removible es derivado de la cadena secundaria de triptofano, de histidina, de arginina, de lisina, o de ornitina. En algunas modalidades, el sustituyente tiol (-SH) del péptido que reacciona con el grupo protector foto-removible es derivado de la cadena secundaria de cistina. En otras modalidades, el sustituyente de ácido carboxílico (-CO2H) o un derivado del mismo, tal como un sustituyente éster (-CO2-AI¡fático), del péptido que reacciona con el grupo protector foto-removible es derivado de la cadena secundaria del ácido aspártico o del ácido glutámico.
En algunas modalidades un sustituyente amino (-NH2, o -NH-) del péptido o péptido inmovilizado reacciona con la nanoparticula. En otras modalidades un sustituyente de ácido carboxílico (-CO2H) o un derivado de ácido carboxílico protegido (-CO2-Alifático) del péptido o péptido inmovilizado reacciona con la nanoparticula.
En algunas modalidades un sustituyente amino (-NH2, o -NH-) de la nanoparticula reacciona con el péptido o péptido inmovilizado. En otras modalidades un sustituyente de ácido carboxilico (-C02H) o un derivado de ácido carboxilico protegido (-C02-Alifático) de la nanoparticula reacciona con el péptido o péptido inmovilizado.
En algunas modalidades, los péptidos, los grupos protectores foto-removibles, y las nanopartículas de la invención están unidas covalentemente según los métodos de síntesis que son bien conocidos en la técnica e incluyen esos descritos a detalle en Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999; and Chemistry oí Peptide Synthesis, N. Leo Benoiton, CRC Press, 2005; Smith and March March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001 ; and Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; la totalidad de los cuales es incorporada a la presente como referencia.
En algunas modalidades, heteroátomos de cadena secundaria (O, N, o S) de los péptidos están unidos covalentemente a las posiciones bencilo de los grupos protectores foto-removibles. En algunas modalidades, los heteroátomos de cadena secundaria (O, N, o S) de los péptidos reaccionan con un derivado de haluro de nitrobencilo, tal como cloruro de 4,5-dimetoxi-2-nitrobencilo o bromuro de 4,5-dimetoxi-2-nitrobencilo.
En algunas modalidades los péptidos o los péptidos inmovilizados de la invención están unidos covalentemente a las nanopartículas a través de enlaces de amida. En algunas modalidades, los enlaces de amida son formados de un grupo amina de los péptidos o los péptidos inmovilizados de la invención y los sustituyentes del ácido carboxílico de las nanopartículas. En algunas modalidades, el enlace amida es formado del sulfo-N-hidroxisuccinimida (NHS) y/o 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC).
Debe ser apreciado que las mismas modificaciones químicas o equivalentes pueden ser realizadas en otros tipos de ligandos (por ejemplo, ligandos no de péptido) para inmovilizarlos. También debe ser apreciado que las mismas modificaciones químicas o similares pueden ser utilizadas para unir cualquier grupo removible conveniente además de o en vez de un grupo foto-removible.
La activación del ligando de direccionamiento desactivado puede ser lograda con la exposición a la luz, calor, presión, microondas, un cambio en el pH, un cambio en el nivel de uno o más metabólicos, y/u otras fuentes de energía. En algunas modalidades, el grupo protector en el ligando es removido con la exposición a cualquier fuente de luz, convencional y conveniente. Ejemplos de tal fuente de luz incluyen, sin limitación, los láseres, (por ejemplo, láseres de excimer) que emiten energía en la porción ultravioleta del espectro o láseres (por ejemplo, el diodo, Ti: láseres de zafiro, láseres de holmio (y otros láseres de metales de tierras raras), neodimio (Nd) YAG, láseres de Nd YAG) que emiten radiación en la porción infrarroja del espectro, y que produce emisiones breves y altas de densidad de flujo. Si se desea, la irradiación en pulsos, que es útil para generar excitación de dos-fotones, puede ser generada por técnicas ópticas estándar de modulación conocidas en la técnica, tal como empleando láseres de modo-cerrado (utilizando, por ejemplo, dispositivos electro o acusto-ópticos). Los láseres que operan en un modo por pulsos en el infrarrojo, visible, y espectro cerca al infrarrojo incluye Nd: YAG, Nd: YLF, C02, excimer, tinte, Ti: zafiro, el diodo, el holmio (y otros materiales de tierras raras), y láseres de metal-vapor. Los anchos del pulso de éstas fuentes de luz son ajustables, y pueden variar de varias decenas de femtosegundos a cientos de microsegundos.
En general, los láseres son fuentes preferibles de irradiación porque proporcionan la longitud de onda espacialmente coherente bien definida de irradiación especialmente adecuada para des-inmovilizar grupos fotosensibles inmovilizados en regiones definidas. Además, tales fuentes de luz pueden ser entregadas por fibras ópticas y utilizarse para irradiar una región específica en una manera controlable. Los sistemas de entrega de fibra óptica son especialmente maniobrables, y pueden ser utilizados para irradiar una región del cuerpo, por ejemplo, un tejido, con lo cual se genera irradiación en lugares difíciles de alcanzar. Estos tipos de sistemas de entrega, cuando se acoplan ópticamente a láseres, son útiles porque pueden ser integrados en catéteres y dispositivos flexibles relacionados, y utilizarse para irradiar virtualmente cualquier órgano o región en el cuerpo (por ejemplo, el cuerpo humano). Además, la longitud de onda de la fuente óptica puede ser hecha a la medida fácilmente para generar la absorción apropiada en un tipo de célula o tejido particular; esto permite tratar de manera efectiva varias células o tejidos diferentes utilizando los compuestos y los métodos de la invención. En algunas modalidades, la longitud de onda de luz utilizada está entre 350-400 nm. En algunas modalidades, se utiliza radiación cerca de infra.
La fotolisis de los péptidos inmovilizados fotosensibles proporciona un medio de controlar la liberación, espacialmente y temporalmente, de péptidos biológicamente activos u otras moléculas. En particular, la fotolisis de moléculas inmovilizadas (por ejemplo, los péptidos) de la invención puede ser localizados con precisión a regiones discretas de una célula o tejido del cuerpo en virtud de la capacidad para activar el producto inmovilizado que utiliza un rayo enfocado de irradiación, por ejemplo, irradiación ultravioleta o infrarroja. En el último caso, es útil emplear las densidades altas de flujo para facilitar la excitación de dos fotones (Denk et al., Science 248: 73-76, 1990), que es especialmente ventajosa para terapias fotodinámicas que emplean las moléculas inmovilizadas (por ejemplo, los péptidos) de la invención, porque los tejidos del cuerpo son virtualmente opacos a la radiación ultravioleta pero transparentes a la radiación infrarroja. Este método permite a los rayos de luz ser enfocados dentro del cuerpo, con lo cual se controlan las reacciones en sitios específicos. Una ventaja adicional de las metodologías de excitación de dos fotones es que la probabilidad de fotoactivación de un compuesto es una función del cuadrado de la distribución de intensidad de iluminación que ocasiona una región sumamente definida para la activación. Además, la capacidad de la excitación de dos fotones para utilizar luz en la porción infrarroja del espectro es ventajosa ya que proporciona la oportunidad de utilizar una gran variedad de las longitudes de onda que son transmitidas dentro del cuerpo.
La invención presente es ¡lustrada además por el Ejemplo siguiente, que de ninguna manera debe ser interpretado como limitante adicional. El contenido entero de todas las referencias (incluyendo referencias de literatura, patentes concedidas, solicitudes de patente publicadas, y solicitudes de patentes copendientes) citadas a través de esta solicitud son por la presente incorporadas expresamente como referencia.
EJEMPLO Materiales y métodos Evaluación del potencial del dirigible sin inmovilizar. Los ensayos de HPLC fueron realizados en un sistema de HPLC HP 1 100. Las muestras fueron inyectadas en volúmenes en una columna C18. La columna fue eluida con una solución acuosa a 1 ml/min. Los péptidos fueron detectados por un detector UV con longitud de onda de absorbancia ajustada a 230 nm.
Síntesis de las partículas inmovilizadas. Un miligramo de suspensión fluorescente de nanopartículas de poliestireno carboxilado (328+2 nm, Merck Chimie S.A.S, Pithiviers, FR) fueron incubados con 100 mg de clorhidrato de 1 -(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodimida (EDC, Sigma) y 200 mg de sulfo- N-hidroxisuccinimida (NHS, Sigma) durante 2.5 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Las partículas resultantes activadas de NHS fueron ligadas covalentemente a 5 mg de péptido NH2-GGGGY(DMNB)IGSR-NH2 (SEQ ID NO: 2) (Pureza> 96% según HPLC, sintetizado a la medida por Peptech Corp. Burlington, MA) durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave. NH2-GGGGYIGSR-NH2 y el péptido desordenado NH2-GGGGFHPDYRVI-NH2 (SEQ ID NO: 4) (GenScript Corp. Piscataway, NJ) sirvieron como dirigibles de control.
IR Transformada de Fourier. Las soluciones de nanopartícula (200 g/mL) fueron iluminados por 0, 1 y 5 seg (365 nm: Entela, Upland, CA) en una placa de 6 pozos. La solución fue recolectada, centrifugada y el medio fue desechado. Las nanopartículas fueron entonces liofilizadas por 24 h y la espectroscopia de FTIR (Bruker Alpha-E, Billerica MA) fue utilizada para recolectar sus espectros. Las partículas no inmovilizadas sirvieron como control.
Aislamiento de célula. Las células germinales mesenquimales (MSCs) fueron aisladas como se describió en Barbash et al., Circulation 2003, 108, (7), 863-8. Brevemente, bajo condiciones estériles, el fémur y la tibia de ratas Sprague-Dawley de 2-3 meses de edad (Charles River, Wilmington, MA) fueron extirpados. Los tapones de médula ósea fueron extraídos de los huesos limpiando la cavidad de médula ósea con medio de cultivo. Después de que una suspensión homogénea de células fuera lograda, las células fueron centrifugadas (600 g, 5 min), resuspended en DMEM y colocadas en placas (50x106 células por 75-cm2 matraz de cultivo). Tres días después el medio fue reemplazado y las células adhesivas fueron consideradas SCs. BM- SCs de segundo paso fueron utilizadas en todos los experimentos. Las células cardíacas fueron aisladas como se describió antes (Dvir et al., Tissue Eng 2006, 12, (10), 2843-52). Brevemente, ventrículos aislados fueron colocados en amortiguador a base de medio de Eagle modificado de Dulbecco frío (DMEM) (cloruro de calcio dihídratado, 1.8mM; cloruro de potasio, 5.36mM; sulfato de magnesio heptahidratado, 0.81 mM¡, cloruro de sodio 0.1M;, bicarbonato de sodio 0.44mM;, fosfato ácido de sodio 0.9mM;, pH 7.4), cortados en pedazos de aproximadamente 1 mm3 e incubados (37°C, 30 min) repetidas veces (6-7 veces) en amortiguador con colagenasa tipo II (95U/ml_; Worthington, Lakewood, NJ) y pancreatina (0.6mg/ml_; Sigma). Después de cada ronda de digestión, la mezcla fue centrifugada (600 g, 5 min, 25°C), y la perla de células fue resuspendida en medio M-199 frío.
Cultivo celular y Unión Celular. Las HUVECs (Lonza Walkersville, Inc. Walkersvílle, MD), y MSCs fueron cultivadas en porta objetos de 8 cámaras en EGM-2 y DMEM respectivamente, el DMEM fue suplementado con 100 unidades/mL de penicilina acuosa, con 100 g/mL de estreptomicina, y con 10% de suero bovino fetal. Las células fueron cultivadas en concentraciones para permitir ~90% de confluencia. En el día de los experimentos, las células fueron lavadas con PBS pre-calentado e incubadas con medio pre-calentado con la adición de un 20 pg/mL de nanopartículas inmovilizadas. El cultivo fue iluminado por 10 seg, incubado durante 30 minutos a 37°C, y lavado con PBS tres veces, teñido con anticuerpo de ß actina (Sigma) y visualizado utilizando una microscopía fluorescente. El número de células dirigidas fue cuantificado por microscopía fluorescente a una ampliación de 20X y dividida por el número total de células. Para la evaluación cualitativa del direccionamiento de las nanopartículas inmovilizadas y eperimentos espaciales, medio que contenía 200 pg/mL de nanopartículas inmovilizadas fue añadido a los cultivos celulares y las cajas/matraces de cultivo fueron iluminados (lámpara UV o microscopio invertido de Zeiss, Axiovert 200M para la evaluación cualitativa del direccionamiento y direccionamiento espacial, respectivamente) o no por 1 min antes de ser lavado con cuidado, visualizado por iluminador de luz ultravioleta (TFX-35M, Life Technologies, Paisley, UK) y las imágenes fueron foto-documentadas (documentación de electroforesis de ciencia digital Kodak y sistema de análisis 120).
Tinción de Immunofluorescencia. Las tinciones de Immunofluorescencia fueron realizadas como se describió antes. Brevemente las muestras fueron fijadas y permeabilizadas en metanol frío, bloqueadas por 1 h a temperatura ambiente en amortiguador a base de DMEM que contenía 5% de FBS. Después de tres lavados con amortiguador, las muestras fueron incubadas por 1 h con anticuerpos anti-ß actina (FITC-conjugados, Sigma) o ß 1 integrina (R&D Systems) (1 :500, y 1 :50, respectivamente). Después de incubación, las muestras teñidas con anticuerpo contra ß 1 integrina fueron lavadas y fueron incubadas por 1 h adicional con anticuerpos conjugados cabra-anti ratón Alexa 488 (1 :150). Para la detección nuclear, las células fueron incubadas por 3 min con Hoechst 33258 (Sigma) y lavadas. La formación de imagen fue realizada con un microscopio de fluorescencia Zeiss invertido Modelo Axiovert 200M y el análisis fue realizado utilizando AxioVision Resultados Los péptidos que contenían YIGSR sintético tal como CDPGYIGSR (SEQ ID NO: 3) y YIGSR-NH2 (SEQ ID NO: 1 ) ha sido demostrado anteriormente que promueven la adhesión y migración celular. Además, se ha demostrado que la adhesión de las células a la laminina ocurre a través de unión a la integrina ß1 en la membrana celular. La diana propuesta (integrina ß1) estuvo presente en varios tipos de células incluyendo HUVECs, MSCs, fibroblastos, cardiomiocitos y células germinales embrionarias humanas (hESCs). Estas células representan el intervalo más ancho de células diana para las cuales el sistema de nanoparticulas es posible.
Anteriormente fue mostrado que la mutación o la deleción de tirosina en el péptido YIGSR (SEQ ID NO: 1) tuvo como resultado una pérdida significativa de la actividad peptídica. Por lo tanto, en esta investigación, este aminoácido en el péptido YIGSR fue inmovilizado con 4,5-dimetoxi-2-nitrobencilo (DMNB) (Fórmulas A y B) y asi desactivado temporalmente hasta que fuera iluminado. DMNB, el grupo inmovilizador utilizado en este estudio fue escogido ya que está documentado bien en la literatura y fue demostrado previamente que es liberado a una tasa de mseg de sustrato biológico. Esto no puede ser el cromóforo óptimo en función de las propiedades des-¡nmovilizadoras y en este estudio sólo sirvió para demostrar una modalidad de la invención. Ejemplos importantes de compuestos inmovilizados extensamente utilizados, sus características de diseño, la síntesis y el uso fueron descritos anteriormente por Ellis-Davis.
FÓRMULA A Y FÓRMULA B Representan una modalidad no limitante del péptido inactivo (Fórmula A) y activo (Fórmula B) que comprende el motivo YIGSR (SEQ ID NO; 1 ). El péptido GGGGYIGSR-NH2 (SEQ ID NO: 2) fue inmovilizado con 4,5- dimetoxi-2-nitrobencilo (DMNB). Después de la iluminación el grupo inmovilizado es liberado y el dirigible se vuelve activo Para determinar la capacidad de des-inmovilización del dirigible (por ejemplo, el péptido GGGGY (DMNB) IGSR NH2 (SEQ ID NO: 2)) llevando a su transformación al estado activo, las soluciones de péptido no inmovilizado (GGGGYIGSR-NH2) (SEQ ID NO: 2), o péptidos inmovilizados sujetos o no sujetos a 1 min de iluminación fueron evaluados por HPLC-UV. El tiempo de retención en la columna del dirigible no inmovilizado fue -20 min (FIG. 2A) mientras que ese del dirigible inmovilizado no iluminado fue más largo (~ 30 min, FIG. 2B) debido a la existencia del grupo inmovilizador que aumenta la hidrofobicidad del péptido. Diez segundos post-iluminación ocurrión un cambio en el tiempo de retención y el péptido salió de la columna después de ~20 min (FIG. 2C). Estos resultados indican que una liberación rápida del grupo inmovilizador del péptido había ocurrido, llevando a su activación y preparación rápidas para una unión celular eficiente.
En seguida, el péptido/dirigible inmovilizado terminado en amina fue conjugado a la superficie de las nanopartículas de poliestireno terminadas en carboxilo que utilizan química de activación de 1 -etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y sulfo-N-hidroxisuccinimida (NHS).
Las nanopartículas inmovilizadas tienen un pico ancho a— 1 100 cm'1 (coherente con la extensión de éter) por FTIR. Para demostrar un tiempo rápido de des-inmovilización del DMNB, las nanopartículas conjugadas con el dirigible inmovilizado fueron analizadas después de iluminación por 1 (C) y 5 seg (B). Los espectro de IR del dirigible no inmovilizado sirvieron como control (A). Los resultados revelan la desaparición del enlace de éter de las nanopartículas conjugadas de dirigible después de 5 seg (FIG. 3A) sugiriendo la activación rápida del dirigible. Para evaluar además la cantidad de grupos inmovilizados liberados al medio de las nanopartículas conjugadas, la absorbancia del DMNB por espectrofotometría fue medida después de iluminar las partículas por 1 , 2 y 5 seg (FIG. 3B). El DMNB liberado entonces fue comparado a una curva de calibración de DMNB libre y la proporción entre el valor obtenido y el número de ácido carboxílico disponible conocido en las partículas sugirió ~ 85% de liberación de DMNB. Ya que cada nanopartícula fue conjugada a - 5000 moléculas de dirigible, estadísticamente la cantidad de dirigibles activados será suficiente para la activación de cada partícula sujeta a la iluminación y para la unión celular. Además, ya que la activación del dirigible es dependiente de la concentración (por ejemplo, la densidad mayor de partículas puede impedir que la luz pase a todas las partículas), in vivo, las partículas serán más abundantes y la luz podrá promover más rápidamente la activación de las partículas que circulan a través del rayo de luz.
Después de asegurar que las nanopartículas son activados con la iluminación, la capacidad de las partículas inmovilizadas para adherirse a células cuando son expuestas a la luz fue evaluada. Como un primer paso, células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) fueron sembradas en cajas de cultivo de 60 mm. Veinticuatro horas más tarde, el medio de cultivo fue reemplazado con medios que contenían nanopartículas inmovilizadas y las cajas fueron iluminadas por 1 min. Después de 15 min de incubación, las cajas fueron lavadas con cuidado y fueron colocadas bajo un transilluminador de luz UV para la visualización del direccionamiento a células. Los cultivos no iluminados sirvieron como control. Mientras las nanopartículas (aparecen en blanco) en las cajas sujetas a la luz se adhirieron a las células y cubrieron claramente la mayor parte del área de la caja de cultivo (FIG. 4A) los cultivos ?? iluminados fueron en su mayor parte sin nanopartículas, con algunas nanopartículas adheridas a las orillas (FIG. 4B).
Después de haber confirmado cualitativamente la viabilidad de la adherencia de partículas a las HUVECs, la potencia de la iluminación en promover el direccionamiento a células fue evaluada cuantitativamente. Ya que este sistema de direccionamiento no fue diseñado para distinguir selectivamente entre tipos diferentes de células sino para dirigirse a cualquier célula o tejido en la presencia de luz, los experimentos de direccionamiento fueron realizados con HUVECs y células germinales mesenquimales (MSCs), dos tipos de célula que pueden representar una población más amplia de células que expresa la integrina i . Estos dos tipos de la célula fueron escogidos ya que las HUVECs representan células que comprenden vasos sanguíneos y las MSCs representan células estromales presentes en tejidos conectivos. Juntas y separadamente estas categorías de célula son encontradas en cada tejido y órgano en el cuerpo. Así, el potencial de las nanopartículas para dirigirse y para unirse a áreas específicas, tejidos y órganos en el cuerpo es sólo foto-dependiente.
Las células (HUVECs y MSCs) fueron sembradas en porta objetos de cultivo y se permitió su recuperación. Veinticuatro horas después de la siembra, el medio de cultivo fue reemplazado con medio que contenía 10 pg de partículas inmovilizadas fluorescentes, iluminadas por 1 min, incubadas por 30 min y entonces inmediatamente lavadas, fijadas y teñidas. El número de células que fueron dirigidas por las nanopartículas fue contado bajo el microscopio y dividido por el número total de células. Como control, se utilizaron ya sea nanopartículas inmovilizadas no expuestas a la luz, nanopartículas conjugadas con un péptido mezclado como un dirigible que fueron iluminados o con nanopartículas conjugadas YIGSR-NH2 no inmovilizadas (control positivo).
En ambos cultivos de tipo de célula, las HUVECs y las MSCs, el porcentaje de unión de partículas después de la iluminación fue apreciablemente mayor comparado a los cultivos no iluminados (p= 0.03 y P< 0.0001 para los cultivos de HUVECs (FIG. 4C) y de MSCs (FIG. 4D), respectivamente. Además, la unión de las nanopartículas inmovilizadas expuestas a la luz a las células estuvo en el mismo nivel que el control positivo, las partículas conjugadas a los dirigibles no inmovilizados (p = 0.53 en MSCs), indicando la liberación eficiente del grupo inmovilizador y la activación eficiente de las nanopartículas.
Por último, fue evaluada la capacidad de direccionamiento expacial de las partículas inmovilizadas. Las HUVECs fueron cultivadas con nanopartículas inmovilizadas en un matraz T de 25 cm2. El matraz fue cubierto con una máscara que permite la penetración de la luz sólo en su centro (d = 1 mm) y fue colocado en la oscuridad bajo un microscopio invertido. Ya que cada movimiento de los matraces después de que las partículas sean activadas tiene como resultado un cambio de nanopartículas y unión a áreas no sujetas a la luz, los matraces fueron fijados en la oscuridad por 10 min antes de la exposición al rayo de luz enfocado del microscopio por 1 min. Para minimizar la distancia de difusión de las partículas, los cultivos fueron incubados por este período corto con una concentración alta de nanopartículas inmovilizadas (200 pg/mL). Las nanopartículas fueron activadas y unidas a células donde la luz fue introducida. Las partículas fueron arregladas en una forma de círculo correspondiendo a la forma de la máscara. Aunque el diámetro hendido de la máscara fue sólo de 1 mm, las células dirigidas fueron situadas en un diámetro de ~ 6 mm probablemente debido a la difusión de nanopartículas después de la activación o dispersión del rayo de luz. Más de 94% de las células en el centro del rayo de luz fueron concentradas por las partículas (FIG. 6B) mientras casi ninguna célula de direccionamiento fue vista en el área no expuesta a la luz (FIG. 6C).
En conclusión, descrito en la presente es un sistema de direccionamiento capaz de unirse a células selectivamente con iluminación. Ya que estas células están presentes en cada tejido en el cuerpo, este sistema de direccionamiento puede ser utilizado posiblemente para direccionamiento en tejidos enfermos sin tomar en consideración la expresión de marcadores específicos.
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Esta invención no es limitada en su aplicación a los detalles de construcción y el arreglo de componentes expuestos en la descripción anterior o ilustrada en los dibujos. La invención puede tener otras modalidades y puede ser practicada o realizada de varias maneras. También, la fraseología y la terminología utilizadas en la presente son para el propósito de la descripción y no deben ser consideradas como limitantes. El uso de "incluye," "comprende," o "tiene," que "contiene", "implica", y las variaciones de los mismos en la presente, pretenden abarcar los artículos listados después y los equivalentes de los mismos así como artículos adicionales.

Claims (34)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Una composición que comprende: una pluralidad de partículas, cada partícula contiene una cantidad de una sustancia a ser entregada a un individuo, en donde un ligando de direccionamiento desactivado por inmovilización que utiliza un grupo protector foto-removible es unido a la superficie de las partículas, en donde el ligando inactivo es activado por eliminación del grupo protector por irradiación de la composición, y en donde el ligando activo es capaz de unirse a un anti-ligando.
2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el ligando comprende péptidos, anticuerpos, o aptámeros.
3.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el péptido comprende un motivo RGD o YIGSR (SEQ ID NO: 1 ).
4.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el grupo protector foto-removible es seleccionado de un grupo que consiste en 2-nitobencilo, ésteres de benzoina, N-acil-7-nitindolinas, meta-fenol, fenacilos y derivados de los mismos.
5. - La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el grupo protector foto-removible es un 4,5-dimetoxi-2-nitrobencilo (DMNB) o un derivado del mismo.
6. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el grupo protector foto-removible es unido covalentemente al ligando.
7. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dos o más diferentes ligandos de direccionamientos son unidos a la superficie de las partículas.
8. - La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque por lo menos uno de los ligandos de direccionamientos es específico de tejido.
9. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el ligando de direccionamiento es específico de un tipo de célula.
10. - La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el tipo célula es seleccionado del grupo que consiste en: HUVECs, MSCs, fibroblastos, cardiomiocitos y células germinales embrionarias humanas (hESCs).
1 1. - Un método para la entrega dirigida de una sustancia a células o tejidos predefinidos en un individuo que comprende: (a) administrar a un individuo en necesidad del mismo, una composición que comprende partículas que contienen una cantidad de una sustancia a ser entregada al individuo, en donde un ligando de direccionamiento desactivado por inmovilización que utiliza un grupo protector foto-removible es unido a la superficie de las partículas; (b) irradiar selectivamente células o tejidos predefinidos en el individuo para activar el ligando inactivo en las células o tejidos predefinidos irradiados por eliminación del grupo protector, en donde el ligando activo es capaz de unirse junto con las partículas unidas a un anti-ligando presente en las células o los tejidos predefinidos que llevan a la entrega dirigida de la sustancia al individuo.
12. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el ligando comprende péptidos, anticuerpos, apta me ros.
13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el péptido comprende un motivo RGD o YIGSR (SEQ ID NO: 1).
14.- El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque el grupo protector foto-removible es seleccionado de un grupo que consiste en 2- nitobencilo, ésteres de benzoina, N-acil-7-nitindolinas, meta-fenol, fenacilos y derivados de los mismos.
15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el grupo protector foto-removible es un 4,5-dimetoxi-2-nitrobencilo (DMNB) o un derivado del mismo.
16. - El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque el grupo protector foto-removible es unido covalentemente al ligando.
17. - El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque dos o más diferentes ligandos de direccionamiento son unidos a la superficie de las partículas.
18. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque por lo menos uno de los ligandos de direccionamientos es específico de tejido.
19.- El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque el ligando de direccionamiento es específico de un tipo de célula.
20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el tipo célula es seleccionado del grupo que consiste en: HUVECs, MSCs, fibroblastos, cardiomiocitos y células germinales embrionarias humanas (hESCs).
21. - Un método para la entrega dirigida de una sustancia a células o tejidos predefinidos en un individuo que comprende: (a) administrar a un individuo en necesidad del mismo, una composición que comprende partículas que contienen una cantidad de una sustancia a ser entregada al individuo, en donde un péptido de direccionamiento desactivado por inmovilización que utiliza un grupo protector foto-removible es unido a la superficie de las partículas; (b) irradiar selectivamente células o tejidos predefinidos en el individuo para activar el péptido inactivo en las células o tejidos predefinidos irradiados por eliminación del grupo protector, en donde el péptido activo es capaz de unirse junto con las partículas unidas a las integrinas presentes en las células o los tejidos predefinidos que llevan a la entrega dirigida de la sustancia al individuo.
22 - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el péptido comprende un motivo RGD o YIGSR (SEQ ID NO: 1).
23. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque un segundo ligando de direccionamiento es unido a la superficie de las partículas.
24. - El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el segundo ligando de direccionamiento es específico de tejido.
25.- Una composición que comprende: una pluralidad de partículas, en donde cada partícula es capaz de llevar una cantidad de una sustancia a ser entregada a un individuo, en donde un ligando de direccionamiento desactivado por inmovilización que utiliza un grupo protector foto-removible es unido a la superficie de las partículas, en donde el ligando inactivo es activado por eliminación del grupo protector por irradiación de la composición, y en donde el ligando activo es capaz de unirse a un anti-ligando.
26. - La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque el ligando comprende péptidos, anticuerpos, apta me ros.
27. - La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque el péptido comprende un motivo RGD o YIGSR (SEQ ID NO: 1 ).
28. - La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque el grupo protector foto-removible es seleccionado de un grupo que consiste en 2-nitobencilo, ésteres de benzoina, N-acil-7-nitindolinas, meta-fenol, fenacilos y derivados de los mismos.
29. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el grupo protector foto-removible es un 4,5-dimetoxi-2-nitrobencilo (DMNB) o un derivado del mismo.
30. - La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque el grupo protector foto-removible es unido covalentemente al ligando.
31. - La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque dos o más diferentes ligandos de direccionamientos son unidos a la superficie de las partículas.
32.- La composición de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque por lo menos uno de los ligandos de direccionamientos es específico de tejido.
33. -La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque el ligando de direccionamiento es específico de un tipo de célula.
34. - La composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque el tipo célula es seleccionado del grupo que consiste en: HUVECs, MSCs, fibroblastos, cardiomiocitos y células germinales embrionarias humanas (hESCs).
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