KR20120055216A - 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4를 도입한 췌장소도세포 및 이를 이용한 당뇨병 치료방법 - Google Patents
분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4를 도입한 췌장소도세포 및 이를 이용한 당뇨병 치료방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 엑센딘-4(Exendin-4)가 도입된 췌장소도세포 및 이를 이용한 당뇨병 치료방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 렌티바이러스를 이용하여 엑센딘-4를 췌장소도세포에 도입하여 지속적으로 효과 단백질인 엑센딘-4 단백질의 분비를 유도하고, 인슐린의 분비능력을 향상시키며, 세포괴사를 줄이고, 주사시 발생할 수 있는 전신적인 부작용을 최소화하는 효과를 나타내므로, 상기 엑센딘-4가 도입된 췌장소도세포는 당뇨병 치료방법으로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 엑센딘-4(exendin-4)가 도입된 췌장소도세포 및 이를 이용한 당뇨병 치료방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 렌티바이러스(Lentivirus) 벡터를 이용하여 분비신호펩타이드(secretion signal peptide)가 연결된 엑센딘-4 유전자를 췌장소도세포에 도입하는 방법 및 상기 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포를 이식하여 당뇨병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
엑센딘(exendin)은 독도마뱀 또는 구슬도마뱀의 독에서 발견되며, 엑센딘-3은 멕시코 구슬도마뱀인 헬로더마 호리덤(Heloderma suspectum)의 독에 존재한다. 엑센딘-4는 2번 및 3번 위치에서만 엑센딘-3과 상이하며, 포유동물류에서 DPP-IV에 의한 분해에 대해 저항성을 가지며 DPP-IV에 대해 2분 이하의 반감기를 갖는 GLP-1 보다 더 긴 반감기를 갖고 있다(Kieffer TJ et al.,1995). 또한, in vivo 실험에서 2 ~ 4시간의 반감기를 나타내며, 1일 2 ~ 3회 복강투여로 충분한 혈중 농도에 도달할 수 있음이 밝혀진 바 있다(Finemam MS et al.,2003). 또한, 엑센딘-4는 위장관 운동성을 조절하고 음식섭취를 감소시켜주며 혈장 글루카곤을 억제한다고 알려져 있는데(미국 등록특허 제 6,858,575호, 제 6,956,026호, 제 6,872,700호), 엑센딘-4의 혈당조절작용은 엑센딘-4 단일요법뿐만 아니라 설포닐우레아 및/또는 메트포민 등의 항 당뇨병 치료제와의 병용요법 모두에서 28일간의 투여 후 HbAlc 수치를 1% 범위 내에서 낮추었다고 보고 되었다(Egan JM et al.,2003). 최근에는 ByettaTM 라는 상표로 합성 엑센딘-4가 미국 식품의약품안정청(US Food and Drug Administration)으로부터 시판 허가되었다.
제 1 형 당뇨병 치료에 있어서 일반적이 치료방법은 인슐린(insulin) 주사를 이용하는 것이다. 하지만 인슐린 주사에 의한 저혈당 쇼크(hypoglycemia)가 일어나는 치명적인 부작용이 있고, 인슐린 주사의 경우 매일매일 주사를 맞아야하는 불편함과 통증을 느낄 수 있으며, 식사조절과 함께 주사를 해야 함으로써 삶의 질이 떨어질 수 있다.
위와 같은 단점을 극복할 수 있는 이상적인 치료법의 하나로 췌장소도세포의 이식이 있다. 췌장소도세포는 인슐린을 분비하는 세포가 포함되어 있는 세포 클러스터로 혈중의 포도당 농도에 따라 생물학적으로 자발적인 분비능을 조절할 수 있기 때문에, 이식 후에 인슐린의 주사 없이 당뇨를 치료할 수 있게 된다. 하지만, 이러한 췌장소도세포 이식의 경우에도 몇 가지 풀어야한 문제점이 있다. 그 중 하나는 췌장소도세포를 이식받은 수여자의 면역 반응이다. 외부에서 이식받은 췌장소도세포를 다른 조직으로 인식하고 그에 따른 면역 반응이 활성화되어, 이식된 췌장소도세포가 수여자의 면역 세포에 의해 공격받아 파괴되는 것이다. 이러한 문제점들은 면역 억제제를 사용하거나, 췌장소도세포 표면의 개질을 통하여 해결하고자 하는 방법이 많이 연구되고 있는 중이다. 또 하나의 문제는 췌장소도세포의 공급 문제이다. 최소 2 ~ 4명의 공여자가 한 사람의 당뇨병 환자를 치료할 수 있다. 따라서, 췌장소도세포가 필요한 환자가 있다 하더라도, 충분한 공급이 이뤄지지 않아 췌장소도세포를 이식하지 못하는 경우가 생길 수 있다.
췌장소도세포의 공급문제 해결을 위해서 돼지 췌장소도세포를 이용한 타종간의 이식 연구도 활발하고, 줄기세포를 이용한 연구도 진행되고 있다. 그리고 또 하나의 방법으로 GLP-1 과 같은 항 인슐린 인자의 이용으로 인슐린의 분비능을 향상시켜 이식 세포를 줄이는 연구도 진행되고 있다. 하지만 이 물질의 경우 체내 반감기가 수분에 불과하기 때문에, 효과적이지 못하다. 따라서, GLP-1 수용체(Receptor)의 작용제(agonist)중 하나로 체내 반감기가 긴 도마뱀 침샘에서 유래한 엑센딘-4의 물질을 많이 사용하고 있으며, 이는 제 2 형 당뇨병의 치료제로 임의 시판중인 약물이다. 이 물질은 췌장소도세포 안에 있는 베타 세포의 인슐린 감도 증가, 괴사 억제, 분화 유도 등의 기능뿐 아니라, 글루카곤 분비의 억제 및, 식욕 억제 등 많은 기능들을 가지고 있다고 밝혀졌다. 따라서, 췌장소도세포 이식시 엑센딘-4(Exendin-4) 단백질을 이용하여, 이식시 췌장소도세포를 줄일 수 있는 효과를 연구하였지만, 매일 단백질 약물을 주사해야 하고, 이로 인해서 복약 순응도의 감소와 삶의 질의 하락을 가져 올 수 있는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 효능 단백질인 엑센딘-4 유전자를 렌티 바이러스를 이용하여 췌장소도세포에 도입함으로써, 췌장소도세포가 지속적으로 효과단백질인 엑센딘-4를 분비할 수 있게 유도하고, 인슐린의 분비능력이 향상되며, 세포의 괴사를 줄이고, 국소적인 엑센딘-4 유전자의 작용으로 주사시 발생할 수 있는 전신적인 부작용을 최소화하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 렌티바이러스(Lentivirus) 벡터를 이용하여 분비신호펩타이드(secretion signal peptide)가 연결된 엑센딘-4(exendin-4)를 췌장소도세포에 도입하는 방법, 및 상기 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포를 이용하여 당뇨병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분비신호펩타이드(secretion signal peptide)를 암호화하는 유전자와 엑센딘-4(Exendin-4)를 암호화하는 유전자가 작동하도록 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 만들고, 이를 도입한 췌장소도세포를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 분비신호펩타이드를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 및
2) 단계 1)의 벡터를 췌장소도세포에 형질전환시키는 단계로 이를 통해 인슐린 분비능이 향상되고 포도당에 대한 감도가 증가된 췌장소도세포의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 분비신호펩타이드를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도세포를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 분비신호펩타이드를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도세포를 당뇨병에 걸린 개체의 췌장에 이식하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료방법을 제공한다.
본 발명은 렌티바이러스(Lentivirus) 벡터를 이용하여 분비신호펩타이드(secretion signal peptide)가 연결된 엑센딘-4 유전자(Exendin-4)를 췌장소도세포에 도입함으로써, 적은 양의 췌장소도세포를 이용하여 포도당에 대한 반응성 증가와 그에 따른 인슐린의 분비능 향상효과를 가지므로, 당뇨병 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 렌티바이러스(Lentivirus) 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 렌티바이러스 벡터를 이용한 분비신호펩타이드(secretion signal peptide)가 연결된 엑센딘-4(Exendin-4) 유전자를 도입하고 3일 뒤 찍은 광학 현미경 사진이다.
도 3은 렌티바이러스 벡터를 이용한 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자를 도입한 후, 형광 현미경으로 찍은 사진이다.
도 4는 췌장소도세포에서 분비되는 엑센딘-4 단백질양을 나타낸 그림이다.
도 5는 바이러스를 처리하지 않은 췌장소도세포를 광학 현미경으로 찍은 사진이다.
도 6은 바이러스를 처리하지 않은 췌장소도세포의 형광 현미경 사진이다.
도 7은 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포의 광학현미경 사진이다.
도 8은 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포의 형광현미경 사진이다.
도 9는 CCK-8 assay를 통한 세포 생존율을 측정한 그림이다.
도 10은 인슐린 분비량을 측정한 도이다.
도 11은 고농도의 포도당 용액에서 분비되는 인슐린량을 저농도의 포도당 용액에서 분비되는 인슐린량으로 나눈 값을 나타낸 도이다.
도 12는 바이러스 처리하지 않는 췌장소도세포 50개를 누드 마우스에 이식한 그림이다.
도 13은 바이러스 처리하지 않는 췌장소도세포 100개를 누드 마우스에 이식한 그림이다.
도 14는 바이러스 처리하지 않는 췌장소도세포 150개를 누드 마우스에 이식한 그림이다.
도 15는 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포 25개를 누드 마우스에 이식한 그림이다.
도 16은 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포 50개를 누드 마우스에 이식한 그림이다.
도 17은 포도당 내성 테스트 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 바이러스 처리를 하지 않은 췌장소도세포의 신장의 HE 염색결과, 인슐린, 엑센딘-4 단백질을 나타낸 그림이다.
도 19는 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포의 신장을 HE 염색하고, 인슐린 및 엑센딘-4 분비 여부를 면역 염색법으로 확인한 그림이다.
도 2는 렌티바이러스 벡터를 이용한 분비신호펩타이드(secretion signal peptide)가 연결된 엑센딘-4(Exendin-4) 유전자를 도입하고 3일 뒤 찍은 광학 현미경 사진이다.
도 3은 렌티바이러스 벡터를 이용한 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자를 도입한 후, 형광 현미경으로 찍은 사진이다.
도 4는 췌장소도세포에서 분비되는 엑센딘-4 단백질양을 나타낸 그림이다.
도 5는 바이러스를 처리하지 않은 췌장소도세포를 광학 현미경으로 찍은 사진이다.
도 6은 바이러스를 처리하지 않은 췌장소도세포의 형광 현미경 사진이다.
도 7은 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포의 광학현미경 사진이다.
도 8은 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포의 형광현미경 사진이다.
도 9는 CCK-8 assay를 통한 세포 생존율을 측정한 그림이다.
도 10은 인슐린 분비량을 측정한 도이다.
도 11은 고농도의 포도당 용액에서 분비되는 인슐린량을 저농도의 포도당 용액에서 분비되는 인슐린량으로 나눈 값을 나타낸 도이다.
도 12는 바이러스 처리하지 않는 췌장소도세포 50개를 누드 마우스에 이식한 그림이다.
도 13은 바이러스 처리하지 않는 췌장소도세포 100개를 누드 마우스에 이식한 그림이다.
도 14는 바이러스 처리하지 않는 췌장소도세포 150개를 누드 마우스에 이식한 그림이다.
도 15는 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포 25개를 누드 마우스에 이식한 그림이다.
도 16은 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포 50개를 누드 마우스에 이식한 그림이다.
도 17은 포도당 내성 테스트 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 바이러스 처리를 하지 않은 췌장소도세포의 신장의 HE 염색결과, 인슐린, 엑센딘-4 단백질을 나타낸 그림이다.
도 19는 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포의 신장을 HE 염색하고, 인슐린 및 엑센딘-4 분비 여부를 면역 염색법으로 확인한 그림이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 분비신호펩타이드(secretion signal peptide)를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4(Exendin-4)를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도세포를 제공한다.
상기 분비신호펩타이드는 서열번호 1로 기재되는 염기서열인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 엑센딘-4 유전자는 서열번호 2로 기재되는 염기서열인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 벡터는 렌티 바이러스(Lentivirus) 벡터, 레트로 바이러스(Retrovirus) 벡터, 아데노 바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노-어소시에티드 바이러스(Adenovirus) 벡터 및 비-바이러스성 벡터(Non-viral vector)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 렌티 바이러스 벡터인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한가지 측면에서, 재조합된 렌티바이러스는 전이 벡터(transfer vector), pHR’CMV-SP-Ex-4-pgk-eGFP ,및 gag, Pol, Tat와 Rev 단백질을 암호화한 플라스미드(plasmid) pCMV8.91을 1:1:1의 비율로 구성된 것을 확인하였다(도 1 참조).
본 발명의 한가지 측면에서, 재조합된 췌장소도세포의 유전자 발현 여부를 형광현미경을 통해 확인한 결과, 췌장소도세포에 도입된 유전자가 제대로 발현되는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조).
또한, 본 발명은
1) 분비신호펩타이드를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 및
2) 단계 1)의 벡터를 췌장소도세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 인슐린 분비능이 향상되고 포도당에 대한 감도가 증가된 췌장소도세포의 제조방법을 제공한다.
상기 벡터는 렌티 바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노-어소시에티드 바이러스 벡터 및 비-바이러스성 벡터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고 렌티 바이러스 벡터인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한가지 측면에서, 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포의 인슐린 분비능을 ELISA 방법을 통해 측정한 결과, 본 발명의 췌장소도세포의 인슐린 분비능은 엑센딘-4가 도입되지 않은 췌장소도세포에 비해 2배 이상 인슐린 분비능이 향상되는 것을 확인하였다(도 10 참조).
또한, 본 발명은 분비신호펩타이드를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도세포를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 분비신호펩타이드를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도세포를 당뇨병에 걸린 개체의 췌장에 이식하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료방법을 제공한다.
상기 당뇨병은 제 1형 당뇨병인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 개체는 마우스, 랫드, 돼지, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이, 소 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한가지 측면에서, 본 발명의 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포를 EIA 방법을 통해 엑센딘-4 단백질 분비량을 측정한 결과, 엑센딘-4 단백질 분비가 2배 이상 향상되는 것을 확인하였고(도 4 참조), 세포 생존율을 측정한 결과, 세포에는 아무런 독성을 미치지 않는 것을 확인하였다(도 5 내지 도 9 참조).
본 발명의 한가지 측면에서, 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포를 췌장에 이식할 경우, 대조군인 췌장소도세포를 이식한 경우보다 췌장소도세포의 개수를 약 1/3로 줄일 수 있는 효과가 있는 것을 확인하였다(도 12 내지 도 16 참조).
본 발명의 한가지 측면에서, 췌장소도세포의 이식 후 포도당에 대한 반응성을 평가한 결과, 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포를 이식받은 마우스의 경우 포도당에 대한 반응성이 정상쥐와 유사한 프로파일을 확인하였다(도 17 참조).
본 발명의 한가지 측면에서, 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4가 도입된 췌장소도세포를 이식한 실험동물의 면역조직 검사를 실시한 결과, 30일이 지나도 지속적으로 엑센딘-4의 분비가 나오는 것을 확인하였고, 인슐린의 분비도 지속적으로 나오는 것을 확인하였다(도 18 및 도 19 참조).
따라서, 본 발명의 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포는 형광현미경을 통해 엑센딘-4의 발현 여부를 확인하였고, 세포독성이 없으며, 엑센딘-4 단백질 분비효과가 높을 것을 입증함으로써, 당뇨병 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있으며, 본 발명의 췌장소도세포를 당뇨병에 걸린 개체의 췌장에 이식한 결과, 포도당에 대한 반응성이 정상쥐와 유사한 프로파일을 확인하였고, 30일이 지나도 엑센딘-4 및 인슐린의 분비가 지속됨을 확인하였으므로, 당뇨병 치료방법으로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 분비신호펩타이드를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도세포를 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
상기 분비신호펩타이드를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도세포는 임상 투여 시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 분비신호펩타이드를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도세포는 실제 임상에서 이식시 여러 가지 형태로 이식될 수 있는데 표면개질없이 이식하거나, 알긴산을 이용한 마이코로 인캡슐레이션 그리고 다른 여러 가지 고분자를 이용하여 췌도세포 표면을 개질 하여 사용할 수 있다.
본 발명의 분비신호펩타이드를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도세포의 이식양은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 분비신호펩타이드를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도세포는 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제와 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
분비신호펩타이드
(
secretion
signal
peptide
) 및
엑센딘
-4(
Exendin
-4)를 포함하는
렌티바이러스의
제조
엑센딘-4 cDNA를 화학적으로 합성을 하고 pβ 벡터의 EcoRI 및 XbaI 위치에 넣은 후, 분비 신호 펩타이드를 pβ-Ex-4의 KpnI 과 EcoRi 위에서 넣어서 pβ-SP-Ex-4를 만들었다. 그리고 퓨린 전달자리(furin cleavage site; RGRR)를 SP 및 엑센딘-4 cDNA사이에 넣어준 후, SP-Ex-4 단편(fragment)은 pβ-SP-Ex-4를 PCR방법을 이용하여 증폭을 시켰다. 그리고 PCR 유전자 단편(gene fragment)을 pHR’pgk-eGFP 벡터의 EcoRI 위치에 넣어주었다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 재조합된 렌티바이러스는 전이 벡터(transfer vector), pHR’CMV-SP-Ex-4-pgk-eGFP ,및 gag, Pol, Tat와 Rev 단백질을 암호화한 플라스미드(plasmid) pCMV8.91을 1:1:1의 비율로 구성이 되었다(도 1).
<
실시예
2>
분비신호펩타이드가
연결된
엑센딘
-4 유전자를
렌티
바이러스 벡터를 이용하여
췌장소도세포에
도입
췌장소도세포를 SD 랫트로부터 콜라겐 분해효소(Collagenase)를 이용하여 분리한 후, 800개의 췌장소도세포에 1 ㎖의 렌티바이러스용액(107 IU/㎖)을 15시간 동안 반응시키고 반응이 끝난 후 HBSS(Hank's balaced salt solution)을 이용하여 2번 세척하였다. 2번 세척 후 형광현미경을 통하여 세포의 형태적 변화와 도입된 유전자의 발현 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자를 렌티바이러스로 처리한 실험군의 경우 녹색형광단백질(green fluorescence protein)이 발현되는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3).
<
실시예
3>
시험관내(
In Vitro
)에서
엑센딘
-4가 도입된
췌장소도세포로부터
시간에 따른
엑센딘
-4 분비량 측정
분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4가 도입된 췌장소도세포, 분비신호펩타이드가 연결되지 않은 엑센딘-4가 도입된 췌장소도세포 및 대조군인 췌장소도세포를 엑센딘-4를 도입한 날부터 15일 동안 24 웰(well) 배양 접시에 100개씩 넣고 배지의 양은 1 ml로 하여 배양하였다. 배양 날로부터 하루에 한 번씩 1 ml의 배지를 갈아 주었고 취한 배지로부터 날짜별로 엑센딘-4 단백질의 양을 EIA 방법(enzyme immunoassay kit, Phoenix Pharmaceuticals INC, CA, 미국)을 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4를 도입할 경우 약 하루에 0.3 ng/100개씩 분비가 됐으며, 유전자가 도입된 이 후 3일째부터 일정한 속도로 분비되는 것을 확인하였다. 반면에 분비신호펩타이드가 연결되지 않은 엑센딘-4 유전자를 도입할 경우 분비량이 약 절반으로 감소하였고, 대조군 췌장소도세포의 경우 엑센딘-4의 분비는 관찰되지 않았다(도 4).
<
실시예
4>
시험관내에서
엑센딘
-4가 도입된
췌장소도세포의
생존성
측정
엑센딘-4가 도입된 췌장소도세포 및 엑센딘-4를 도입하지 않은 췌장소도세포를 배양배지에서 배양하였다. 먼저 배양한 세포를 HBSS로 2번 세척해주고 96 웰 배양 접시에 각 군당 5개의 웰을 사용하였으며, 각 웰 당 10개의 췌장소도세포를 담았다. 하루 동안 이산화탄소 인큐베이터(incubator)에서 배양한 후, 각각의 접시에 CCK-8 assay 용액(WST-8)을 처리하고, 4시간 후 450 nm에서 흡광도를 측정했다. 그리고 생존성을 이미지로 확인하기 위해서 아크리딘오렌지/프로피디움 요오드화물(Acridine orange/propidium iodide; AO/PI) 염색을 이용하여, 약 4분간 용액을 처리한 후, 형광 현미경을 이용하여 생존율을 확인하였다.
그 결과, 도 5 내지 도 9에 나타낸 바와 같이 본 실험 조건에서 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4 렌티바이러스를 도입할 경우에 세포에는 아무런 독성을 미치치 않는 것을 확인하였다(살아있는 세포-녹색형광, 죽은 세포-빨강형광)(도 5 내지 도 9).
<
실시예
5>
시험관내
엑센딘
-4 유전자가 도입된
췌장소도세포의
인슐린
분비능
측정
분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포 및 엑센딘-4 유전자를 도입하지 않은 췌장소도세포의 기능성을 평가하기 위하여 인슐린 분비능을 확인하였다. 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포와 대조군인 엑센딘-4 유전자를 도입하지 않은 췌장소도세포를 정치배양(Static culture)한 후, 인슐린의 양을 측정하였다. 2.2 mM의 포도당 용액에 각각 100개의 췌장소도세포를 담아서 1시간을 배양한 후, 안정화시키고 다시 배지를 갈아주고 2.8 mM 농도의 포도당 1 ㎖를 다시 넣어서 2시간 동안 배양하고 상기 배지를 모두 취하였다. 그리고 다시 배지를 28 mM 농도의 포도당 1 ㎖로 바꾼 후에 2시간 동안 배양하고 남은 배지 용액을 모두 취하였다. 상기 수득한 배지 ELISA 방법(Rat.Mouse insulin ELISA kit, MA, USA)를 이용하여 인슐린의 분비량을 측정하였다. 그리고 자극 지수(Stimulation Index)를 28 mM의 포도당에서의 인슐린 분비 농도를 2.8 mM의 낮은 농도의 포도당에서 나온 인슐린 분비 농도로 나누어서 실험 그룹별로 비교하였다.
그 결과, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이 분비신호펩타이드가 연결된 유전자를 도입한 실험군의 경우 인슐린 분비능력이 고농도의 포도당 용액에서 대조군과 비교하여 2배 이상 많은 분비되는 것을 확인하였고, 자극지수의 경우에도 대조군과 비교하여 3배 이상 증가한 것을 확인하였다(도 10 및 도 11).
<
실시예
6>
엑센딘
-4 유전자가 도입된
췌장소도세포
및 대조군
췌장소도세포의
이식
8주령의 Balb/c 누드 마우스에 220 mg/kg의 스트랩토조신(Streptozocin)을 주사하여 제 1 형 당뇨를 유발하였다. 혈중 농도가 2일 동안 350 mg/dl 이상을 나타내는 마우스를 수혜자로 사용하였다. 상기 당뇨가 유발된 수혜자에 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포와 대조군으로서의 췌장소도세포를 개수 별로 신장 캡슐에 이식하여 혈중 포도당의 농도가 조절되는 형태를 확인하였다.
그 결과, 도 12 내지 16에 나타낸 바와 같이 대조군인 정상 췌장소도세포의 경우 최소 150개를 이식하여야 정상 혈당을 지속할 수 있으나, 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포를 이식할 경우 50개의 췌장소도세포를 이식하여도 충분히 정상 혈당으로 유지되고 있음을 확인하였다. 따라서 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포를 이식할 경우 췌장소도세포의 개수를 약 1/3로 줄일 수 있는 효과를 확인하였다(도 12 내지 도 16).
<
실시예
7>
엑센딘
-4 유전자가 도입된
췌장소도세포
및 대조군
췌장소도세포의
이식 후 복강에 주사된 포도당의 내성 평가
이식된 췌장 소도세포의 포도당에 대한 반응성을 평가하기 위해서 6시간 이상 절식 후 복강에 포도당(20%, 10 ul/g)을 주사하고 시간별로 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다. 시간은 0, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 및 120분 후에 측정하였다. 실험이 끝난 후에는 이식받은 신장을 제거하였다. 실험 그룹은 엑센딘-4 유전자가 도입된 50개를 이식한 누드 마우스, 150 및 50 개의 대조군으로서 췌장소도세포를 이식한 누드 마우스, 정상 마우스. 그리고 당뇨가 걸린 마우스를 선택하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이 엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포를 이식받은 마우스의 경우, 포도당에 대한 반응성이 정상쥐와 유사한 프로파일을 확인하였다(도 17).
<
실시예
8> 췌장 소도세포를 이식받은 신장의 조직 검사
엑센딘-4 유전자가 도입된 췌장소도세포를 이식한 실험동물과 대조군의 엑센딘-4 유전자를 도입하지 않은 췌장소도세포를 이식한 실험동물의 신장을 적출한 후 신장과 이식한 췌장소도세포의 면역 조직 검사를 실시하였다. 적출한 신장을 4% 포르말린(formalin) 용액으로 고정시키고, 파라핀(parafin)에 조직 시료를 담근 후 마이크로 톰(microtome)을 이용하여 4 um의 두께로 잘라서 슬라이드 글래스(Slide glass)에 올려놓았다. 그리고 만들어진 시료를 자일렌(Xylene) 용액에 담가 파라핀을 제거하고 HE 염색을 실시하였다. 그리고, 적출한 신장과 이식된 췌장 소도의 인슐린 및 엑센딘-4 단백질의 분비 여부를 면역 염색법을 통하여 확인하였다.
그 결과, 도 18 및 도 19에 나타낸 바와 같이 30일이 지나도 지속적으로 엑센딘-4의 분비가 나오는 것을 확인하였고, 인슐린의 분비도 지속적으로 나오는 것을 확인하였다(도 18 및 도 19).
<110> Seoul national university R and DB foundation
<120> Secretion signal peptide linked Exendin-4 gene transduced
pancreatic islet transplantation for treatment of diabetes
<130> 10p-08-21
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> secretion signal peptide sequence
<400> 1
atgaagatca tcctgtggct gtgtgtgttc ggcctgttcc tggccaccct gttccccatc 60
agctggcaga tgcccgtgga gtccggcctg tcctccgagg actccgccag ctccgagagc 120
ttcgccg 127
<210> 2
<211> 135
<212> DNA
<213> Heloderma suspectum
<400> 2
atgcggggac ggcggcatgg tgaaggaaca tttaccagtg acttgtcaaa acagatggaa 60
gaggaggcag tgcggttatt tattgagtgg cttaagaacg gaggaccaag tagcggggca 120
cctccgccat cgtga 135
Claims (9)
- 분비신호펩타이드(secretion signal peptide)를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4(Exendin-4)를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 도입한 췌장소도세포.
- 제 1항에 있어서, 상기 분비신호펩타이드는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 췌장소도세포.
- 제 1항에 있어서, 상기 엑센딘-4 유전자는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 췌장소도세포.
- 제 1항에 있어서, 상기 벡터는 렌티 바이러스(Lentivirus) 벡터, 레트로 바이러스(Retrovirus) 벡터, 아데노 바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노-어소시에티드 바이러스(Adenovirus) 벡터 및 비바이러스성 벡터(Non-viral vector)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 췌장소도세포.
- 제 1항에 있어서 상기 바이러스 벡터는 렌티 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 췌장소도세포.
- 1) 분비신호펩타이드(secretion signal peptide)를 암호화하는 유전자 및 엑센딘-4(Exendin-4)를 암호화하는 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 및
2) 단계 1)의 벡터를 췌장소도세포에 형질전환시키는 단계를 포함하는 인슐린 분비능이 향상되고 포도당에 대한 감도가 증가된 췌장소도세포의 제조방법.
- 제 6항에 있어서, 상기 벡터는 렌티 바이러스(Lentivirus) 벡터, 레트로 바이러스(Retrovirus) 벡터, 아데노 바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노-어소시에티드 바이러스(Adenovirus) 벡터 및 비바이러스성 벡터(Non-viral vector)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 췌장소도세포의 제조방법.
- 제 1항의 췌장소도세포를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 조성물.
- 제 1항의 췌장소도세포를 당뇨병에 걸린 개체의 췌장에 이식하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100116824A KR101259074B1 (ko) | 2010-11-23 | 2010-11-23 | 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4를 도입한 췌장소도세포 및 이를 이용한 당뇨병 치료방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100116824A KR101259074B1 (ko) | 2010-11-23 | 2010-11-23 | 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4를 도입한 췌장소도세포 및 이를 이용한 당뇨병 치료방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20120055216A true KR20120055216A (ko) | 2012-05-31 |
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ID=46270826
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020100116824A KR101259074B1 (ko) | 2010-11-23 | 2010-11-23 | 분비신호펩타이드가 연결된 엑센딘-4를 도입한 췌장소도세포 및 이를 이용한 당뇨병 치료방법 |
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Family Cites Families (3)
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|---|---|---|---|---|
| KR100660473B1 (ko) * | 2004-04-02 | 2006-12-22 | 학교법인연세대학교 | 췌장 선방세포로부터 이행분화된 췌장 전구세포주 |
| AU2007278994B2 (en) * | 2006-07-24 | 2013-08-15 | Biorexis Pharmaceutical Corporation | Exendin fusion proteins |
| CN101952415B (zh) * | 2007-07-31 | 2017-06-27 | 生命扫描有限公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
-
2010
- 2010-11-23 KR KR1020100116824A patent/KR101259074B1/ko not_active IP Right Cessation
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