KR20120053823A - Primer set of polymerase chain reaction for detecting xanthomonas albilineans and method for detecting xanthomonas albilineans using the same - Google Patents

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이영기
이세원
이용환
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Abstract

PURPOSE: A PCR primer pair for detecting Xanthomonas albilineans is provided to usefully diagnose and detect the Xanthomonas albilineans. CONSTITUTION: A PCR primer pair for detecting Xanthomonas albilineans is denoted by sequence numbers 1 and 2 or 3 and 4. A composition for detecting Xanthomonas albilineans contains the primer pair. A kit for detecting Xanthomonas albilineans contains the primer pair. A method for detecting Xanthomonas albilineans comprises: a step of isolating DNA from a sample; a step of amplifying DNA by PCR using the primer pair; and a step of detecting a PCR product by electrophoresis.

Description

사탕수수잎마름병균 검출용 ＰＣＲ 프라이머 쌍 및 이를 이용한 사탕수수잎마름병균 검출 방법{Primer set of polymerase chain reaction for detecting Xanthomonas albilineans and method for detecting Xanthomonas albilineans using the same}Primitive set of polymerase chain reaction for detecting Xanthomonas albilineans and method for detecting Xanthomonas albilineans using the same}

본 발명은 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 PCR 프라이머쌍, 이를 포함하는 사탕수수잎마름병균 검출용 PCR 조성물 및 키트에 관한 것으로 보다 상세하게는 사탕수수잎마름병균의 23S rRNA 유전자 일부 서열에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 서열번호 1(Xan23SF69) 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머(Xan23SR61) 쌍 또는 이들과 상보적인 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 이를 포함하는 사탕수수잎마름병균 검출용 조성물, 키트 및 이를 이용한 사탕수수잎마름병균 검출 방법에 관한 것이다.
The present invention is sugarcane leaf blight bacteria ( Xanthomonas albilineans ) PCR primer pairs for detection, and PCR composition and kit for detecting cane leaf blight bacteria comprising the same, more specifically, characterized in that the specific binding to 23S rRNA gene sequence of the sugar cane leaf blight bacteria A pair of primers (Xan23SR61) represented by SEQ ID NO: 1 (Xan23SF69) and SEQ ID NO: 2 or a primer pair consisting of a base sequence complementary thereto, a composition, kit for detecting cane leaf blight bacteria comprising the same, and a sugar cane leaf blight using the same It relates to a bacterium detection method.

식물 병원세균의 유전자 진단방법으로는 Dot-blot, 중합효소 연쇄반응(PCR) 등의 방법이 이용된다. 특히 PCR은 Dot-blot 방법보다 시간, 노력, 인력 등이 경제적이기 때문에 최근 널리 사용되고 있는 방법이다. PCR(중합효소 연쇄반응, polymerase chain reaction) 진단 방법은 10~20bp로 구성된 특정 DNA 단편(프라이머)을 세균의 게놈유전자(genomic DNA)에 접촉(annealing)한 후 내열성 DNA 중합효소(Taq polymerase)를 첨가하고 합성반응을 반복적으로 행하게 되면, 프라이머가 결합된 영역이 급속히 증폭하게 되며, 그 PCR 증폭산물을 아가로스 젤(agarose gel) 또는 아크릴아마이드 젤(acrylamide gel)에 전기영동하고 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 및 은 염색(silver stain)으로 DNA를 염색한 후 나타나는 DNA 밴드의 유무 혹은 형태의 차이와 같은 세균종의 DNA 다형성을 검출 진단하는 방법이다. 현재, 이러한 PCR에 의한 세균의 진단법은 인체나 동물의 세균성 질병을 진단에 주로 이용되나, 최근에는 식물 병원균을 진단할 수 있도록 PCR 진단법이 개발되어 병의 진단과 함께 수출입 농산물의 검역에 이용되고 있다. 또한, PCR 진단 방법은 다른 방법에 비해 소요되는 시간이 짧고, 진단에 소요되는 비용이 저렴하며 또한, 많은 샘플을 동시에 검정할 수 있어 경제적이다. 이에 최근에는 잔토모나스(Xanthomonas) 검출방법 중에서 유전물질인 핵산을 증폭하는 PCR 진단 방법이 가장 선호되고 있다. Dot-blot, polymerase chain reaction (PCR), etc. are used as a method for diagnosing plant pathogens. In particular, PCR is a widely used method because time, effort, and manpower are more economical than the dot-blot method. PCR (polymerase chain reaction) diagnostic method is to anneal a specific DNA fragment (primer) consisting of 10 ~ 20bp to the genomic DNA of the bacteria and then heat-resistant DNA polymerase (Taq polymerase) After repeated addition and repeated synthesis, the primer-bound region rapidly amplifies, and the PCR amplification product is electrophoresed on an agarose gel or acrylamide gel and ethidium bromide It is a method for detecting and diagnosing DNA polymorphisms of bacterial species such as the presence or absence of DNA bands and staining after DNA staining with bromide and silver stain. At present, the PCR method is mainly used for diagnosing bacterial diseases of humans or animals, but recently, PCR diagnostic methods have been developed to diagnose plant pathogens and are used for quarantine of imported and imported agricultural products. . In addition, the PCR diagnostic method is shorter in time than other methods, is inexpensive to diagnose, and is economical because many samples can be simultaneously tested. Recently, a PCR diagnostic method for amplifying a nucleic acid, which is a genetic material, is most preferred among Xanthomonas detection methods.

기존의 잔토모나스 속 미생물 중, 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae), 세균성점무늬병원균(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria), 십자화과 흑부병원균(Xanthomonas campestris pv. campestris), 감귤류 궤양병 병원균(Xanthomonas axonopodis pv. citri) 및 콩불마름병원균(Xanthomonas axonopodis pv. glycines) 등 다양한 미생물의 검출에 사용되는 개별적인 PCR 프라이머에 대한 연구는 이루어졌으나, 사탕수수잎마름병균에 대하여는 아직까지 연구된 바 없다. 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans)은 프로테오박테리아(Proteobacteria) 문, 감마 프로테오박테리아(Gamma Proteobacteria) 강(Class), Xanthomonadales 목(Order), Xanthomonadaceae 과(Family), Xanthomonas 속(Genus) 에 속하는 사탕수수 잎마름병 및 플라타너스 궤양병을 일으키는 식물병원세균이다. 본 병원세균은 국내 미 기록 병이므로, 본 병원균의 유입으로 큰 피해가 예상되어 사탕수수잎마름병균을 신속하게 진단할 수 있는 방법의 개발이 요구되는 실정이다.
Among the existing Xanthomonas microorganisms, rice leaf blight pathogen ( Xanthomonas oryzae pv. oryzae ), bacterial spot pattern pathogen ( Xanthomonas campestris pv. vesicatoria ), Cruciferous Black Pathogen ( Xanthomonas) campestris pv. campestris ), citrus ulcer pathogen ( Xanthomonas axonopodis pv. citri), and water chestnut kongbul pathogen (Xanthomonas axonopodis pv. glycines), such as research on the individual PCR primers used for the detection of various microorganisms has been made, sugar cane leaves no studies with respect to the bar to blight fungus yet. Sugarcane Bacterium ( Xanthomonas albilineans ) belongs to the Proteobacteria Gate, Gamma Proteobacteria Class, Xanthomonadales Order, Xanthomonadaceae Family, and Xanthomonas Genus It is a plant pathogen that causes sugarcane leaf blight and sycamore ulcer disease. Since this pathogen is a domestic unrecorded disease, a great damage is expected due to the influx of the pathogen, and development of a method for quickly diagnosing sugar cane leaf blight is required.

이에 본 발명의 발명자들은 사탕수수잎마름병균의 검출에 사용될 수 있는 PCR 프라이머를 설계하기 위하여 사탕수수잎마름병균에 특이적인 서열을 검색하던 중, 23S rRNA의 염기 서열이 종 보존적임을 확인하고, 23S rRNA의 일부 서열에 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍을 발명하였다. Accordingly, the inventors of the present invention, while searching for the sequence specific to the sugar cane blight bacteria to design a PCR primer that can be used for the detection of sugar cane blight bacteria, and confirmed that the base sequence of 23S rRNA species species conserved, A primer pair represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 specific for some sequences of 23S rRNA was invented.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 PCR 프라이머 쌍을 제공하는 것이다. Therefore, an object of the present invention is the sugar cane leaf bacterium represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 ( Xanthomonas albilineans ) to provide a PCR primer pair for detection.

본 발명의 다른 목적은, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 PCR 프라이머 쌍을 제공하는 것이다. Another object of the present invention, the sugar cane leaf blight bacteria represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 ( Xanthomonas albilineans ) to provide a PCR primer pair for detection.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is a sugar cane leaf bacterium comprising a primer pair represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 ( Xanthomonas albilineans ) to provide a composition for detection.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 키트를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is a sugar cane leaf bacterium comprising a primer pair represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 ( Xanthomonas albilineans ) to provide a kit for detection.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 추출된 DNA를 상기 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출 방법을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is the step of (a) separating the DNA from the sample; (b) amplifying the DNA extracted in step (a) by PCR using a primer pair represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; And (c) sugarcane leaf blight bacteria comprising the step of confirming the amplified PCR product of step (b) by electrophoresis ( Xanthomonas albilineans ) detection method.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 PCR 프라이머쌍을 제공한다. In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention is a sugar cane leaf blight bacteria represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 ( Xanthomonas albilineans ) PCR primer pairs are provided.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 PCR 프라이머쌍을 제공한다. In order to achieve another object of the present invention the present invention is a sugarcane leaf blight bacteria represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 ( Xanthomonas albilineans ) PCR primer pairs are provided.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 조성물을 제공한다. In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a composition for detecting sugar cane leaf blight ( Xanthomonas albilineans ) comprising a primer pair represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 to provide.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 키트를 제공한다. In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a kit for detecting sugarcane leaf blight ( Xanthomonas albilineans ) comprising a primer pair represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 to provide.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 추출된 DNA를 제1항 또는 제2항의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출 방법을 제공한다.
In order to achieve another object of the present invention, the present invention comprises the steps of (a) separating the DNA from the sample; (b) amplifying the DNA extracted in step (a) by PCR using the primer pair of claim 1 or 2; And (c) sugarcane leaf blight bacteria comprising the step of confirming the amplified PCR product of step (b) by electrophoresis ( Xanthomonas albilineans ) detection method is provided.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명에서 용어 ‘프라이머’는 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 의미한다. 본 발명의 명세서에서 용어 "전방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 PCR에 의해 증폭되는 유전자의 일정 부위의 3'말단 및 5'말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.
The term 'primer' in the present invention refers to a short nucleic acid sequence which can form a base pair with a complementary template, and serves as a starting point for template strand copying. As used herein, the terms "forward primer" and "reverse primer" refer to primers that bind to the 3 'and 5' ends of a region of a gene to be amplified by PCR, respectively.

본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 PCR 프라이머 쌍에 관한 것이다. The present invention is the sugar cane leaf blight bacteria represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 ( Xanthomonas albilineans ) relates to a pair of PCR primers for detection.

본 발명의 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 PCR 프라이머 쌍은 잔토모나스 속에 속하는 다른 미생물과 비교하여 사탕수수잎마름병균에만 특이적인 서열을 가지는 것을 특징으로 한다. 잔토모나스 속에 속하는 미생물 중, 잔토모나스 pv. 캄페스트리스(X. campestris pv. campestris), 잔토모나스 액소노포디스 pv. 시트리(X. axonpodis pv. citri), 잔토모나스 액소노포디스 pv. 베르시카토리아(X. axonopodis pv. vesicatoria), 잔토모나스 오리재 pv. 오리재(X. oryzae pv. oryzae)에서 23S rRNA 유전자는 공지되어있다. 본 발명에서는 상기 공지된 23S rRNA 유전자와 사탕수수잎마름병균의 23S rRNA 유전자를 비교분석하여 사탕수수잎마름병균에만 특이적인 프라이머 쌍인 XanF69 및 XanR61을 선발하였다. 본 발명에서는 상기 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 사탕수수잎마름병균의 23S rRNA 유전자의 1,281 내지 2,320 bp 부분을 특이적으로 증폭시킬 수 있다.Sugarcane leaf blight bacterium of the present invention ( Xanthomonas albilineans ) PCR primer pairs are characterized in that they have a specific sequence only for sugar cane blight compared to other microorganisms belonging to the genus Xanthomonas. Among the microorganisms belonging to the genus Xanthomonas, xanthomonas pv. Campestris ( X. campestris pv. campestris ), Xanthomonas axonopodis pv. Li sheet (X. axonpodis pv. Citri), Pseudomonas janto liquid discharge port Sono pv. Versicattoria ( X. axonopodis pv.vesicatoria ), Xanthomonas duckwood pv. The 23S rRNA gene in ducks ( X. oryzae pv. Oryzae ) is known. In the present invention, by comparing the 23S rRNA gene of the known 23S rRNA gene and the sugar cane leaf blight bacterium, the primer pairs specific to sugar cane leaf blight bacteria XanF69 and XanR61 were selected. In the present invention, the primer pair may specifically amplify 1,281 to 2,320 bp portion of the 23S rRNA gene of sugarcane leaf blight through polymerase chain reaction (PCR).

미생물 유전자에 특이적인 중합효소 연쇄반응 프라이머의 제작에는 rRNA, 하우스키핑(house keeping) 유전자 등 다양한 유전자들이 사용되고 있으며, 특히 rRNA 유전자 중 16S rRNA와 23S rRNA는 진화에 안정적이고 같은 종 혹은 종 하위 분류군내 유전적 변이가 드물기 때문에 병원세균 진단용 중합효소 연쇄반응 프라이머로 이상적이다. 본 발명에서 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머 쌍은 사탕수수잎마름병균 게놈의 유전자 서열 중에서 종(species) 보존적인 23S rRNA의 특이적 영역을 표적으로 하였기 때문에 사탕수수잎마름병균 이외의 미생물 유전자와는 특이적인 결합을 하지 않으며, 사탕수수잎마름병균만을 특이적으로 검출할 수 있는 것에 특징이 있다. Various genes such as rRNA and house keeping genes are used for the production of polymerase chain reaction primers specific to microbial genes. Especially, 16S rRNA and 23S rRNA among the rRNA genes are stable for evolution and are in the same species or species subclass. Due to the rare genetic variation, it is ideal as a polymerase chain reaction primer for diagnosing pathogens. In the present invention, the polymerase chain reaction (PCR) primer pair targets a specific region of the species-conserved 23S rRNA in the gene sequence of the sugarcane rhombus genome genome, and thus the It does not have a specific binding, it is characterized in that can be specifically detected only sugar cane blight bacteria.

본 발명의 일 실시예에서는 유전자은행(GenBank)에 등록된 전체 염기서열이 분석된 식물 병원 미생물을 비교 분석하여 사탕수수잎마름병균에만 특이적으로 존재하는 서열을 탐색하였고,(실시예 1-1 참조) 이를 바탕으로 상기와 같이 사탕수수잎마름병원균(Xanthomonas albilineans)의 23S rRNA 유전자로부터 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 사탕수수잎마름병균에 특이적인 중합효소 연쇄반응 전방향 및 역방향 프라이머 쌍을 제작하였다. (실시예 1-2 참조) 또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2에 상보적인 서열을 가지는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 사탕수수잎마름병균 검출용 PCR 프라이머 쌍을 제공한다. 상기 본 발명의 프라이머 쌍은 사탕수수잎마름병균의 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예: 부가, 결실, 치환)될 수 있다.
In one embodiment of the present invention by comparing the phytopathogenic microorganisms analyzed the entire nucleotide sequence registered in the GenBank (GenBank) to search for the sequence that is specifically present only in sugarcane leaf blight bacteria (Example 1-1 Based on this, sugar cane leaf blight pathogen ( Xanthomonas ) as described above. albilineans ) polymerase chain reaction forward and reverse primer pairs specific for sugarcane leaf blight bacteria represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 were prepared from 23S rRNA genes. In addition, the present invention provides a PCR primer pair for detecting sugar cane leaf blight bacteria represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 having a sequence complementary to SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. . The primer pair of the present invention may be modified (eg, added, deleted, substituted) within a range that does not affect specific detection of sugarcane leaf blight bacteria.

또한 본 발명은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 사탕수수잎마름병균 검출용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 사탕수수잎마름병균 검출용 조성물은 본 발명의 프라이머 쌍을 포함하며, DNA 중합효소, dNTP 및 기타 PCR에 사용되는 조인자를 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서 검출용 조성물은 PCR 조성물을 의미하는 것이며, Tris HCl, KCl, dNTP, Taq DNA 중합효소, MgCl2, 프라이머 및 주형 DNA를 포함하였다.
In another aspect, the present invention relates to a composition for detecting sugar cane leaf blight bacteria comprising a primer pair represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. The composition for detecting sugar cane leaf bacterium of the present invention comprises the primer pair of the present invention, and may include a cofactor used for DNA polymerase, dNTP and other PCR. Detecting composition in one embodiment of the present invention means a PCR composition, and included Tris HCl, KCl, dNTP, Taq DNA polymerase, MgCl 2 , primers and template DNA.

또한 본 발명은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 사탕수수잎마름병균 검출용 키트에 관한 것이다.The present invention also relates to a kit for detecting sugarcane leaf blight bacteria comprising a primer pair represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.

상기 본 발명의 키트에는 상기 프라이머 쌍을 이용하여 사탕수수잎마름병균을 검출하는데 필요한 실험(예: PCR) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 보다 상세하게는 상기 PCR 조성물은 역전사 반응에 의해서 합성된 상보적 DNA와 본 발명에서 제공되는 PCR 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 준다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드 (dimethylsufoxide (DMSO)), Tween 20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아미이드 및 소혈청 알부민(bovine serum albumine (BSA))이 추가로 포함될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 Tris HCl 50 mM, KCl 20 mM, 핵산중합효소는 2 units, dNTP 2.0 mM, MgCl2 1.5 mM, 프라이머 20 pmol을 포함하는 PCR 조성물을 사용하였다. The kit of the present invention includes a variety of reagents, such as PCR compositions, restriction enzymes, agarose, hybridization, and the like, for experiments (eg, PCR) and for confirming the results necessary for detecting sugarcane leaf blight using the primer pairs. A buffer solution required for electrophoresis may be further included. More specifically, the PCR composition may contain an appropriate amount of DNA polymerase (eg, Thermus) in addition to the complementary DNA synthesized by reverse transcription and the PCR primer pair provided in the present invention. aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus , Thermococcus literalis or Pyrococcus heat stable DNA polymerase obtained from furiosus (Pfu), dNTP, PCR buffer and water (dH 2 O). The PCR buffer solution includes Tris-HCl, MgCl 2 , KCl, and the like. At this time, the concentration of MgCl 2 greatly affects the specificity and quantity of amplification. Generally, if an excess of the Mg 2 + increase the non-specific PCR amplification products, and reduce the yield of a PCR product if the Mg 2 + insufficient. The PCR buffer is not limited thereto, but an appropriate amount of Triton X-100, dimethylsulfoxide (DMSO), Tween 20, nonidet P40, PEG 6000, formamide and bovine serum albumin ( bovine serum albumine (BSA)) may be additionally included. In one embodiment of the present invention Tris HCl 50 mM, KCl 20 mM, nucleic acid polymerase 2 units, dNTP 2.0 mM, MgCl 2 1.5 mM, using a PCR composition comprising 20 pmol primer.

또한 상기 키트에는 상기 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위하여 DNA 중합효소 및 상기 조성의 PCR 반응 완충 용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
In addition, the kit may further include a DNA polymerase and a PCR reaction buffer solution of the composition in order to easily perform the PCR reaction, and the components necessary for performing electrophoresis to confirm whether or not amplification of the PCR product It may be further included in the kit of the present invention.

또한, 본 발명은 (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 추출된 DNA를 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 사탕수수잎마름병균 검출 방법에 관한 것이다. In addition, the present invention comprises the steps of (a) separating the DNA from the sample; (b) amplifying the DNA extracted in step (a) by PCR using primer pairs of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; And (c) relates to a sugarcane leaf blight detection method comprising the step of confirming the amplified PCR product of step (b) by electrophoresis.

중합효소 연쇄반응(PCR)은 생체 내에 존재하는 적은 양의 DNA를 분리하여 주형으로 사용하고 표적 DNA 서열의 양 끝단에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 쌍을 이용하여 표적 DNA 단편만을 짧은 시간 안에 수십만 배 이상 증폭시키는 방법이다. 이와 같은 PCR을 이용하여 식물에 감염된 미생물을 신속하고 정확하게 검출할 수 있다. 본 발명에서는 사탕수수잎마름병균을 검출하기 위하여, 상기 PCR을 포함하는 검출 방법을 이용하였다. Polymerase chain reaction (PCR) is used to isolate small amounts of DNA in vivo and use it as a template, and by using primer pairs consisting of oligonucleotides complementary to both ends of the target DNA sequence, only the target DNA fragment can be hundreds of thousands of times. It is a method to amplify abnormally. Such PCR can be used to quickly and accurately detect plant-infected microorganisms. In the present invention, in order to detect sugar cane leaf blight bacteria, a detection method including the PCR was used.

이를 단계별로 살펴보면, 상기 (a) 단계에서 DNA의 분리는 상기 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans)으로부터 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.Looking at this step by step, the separation of the DNA in the step (a) can be performed according to the method commonly used in the art from the sugarcane leaf bacterium ( Xanthomonas albilineans ), using a commercially available DNA extraction kit This can be done.

(b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 사탕수수잎마름병균의 23S rRNA의 유전자를 증폭해낼 수 있다. 본 단계는 ⅰ) 변성(denaturation) 단계, ⅱ) 프라이머의 대상 핵산결합(annealing) 단계 및 ⅲ) 신장(elongation) 단계를 포함하는 사이클이 수회 반복되어 행해진다. 본 발명에서 용어 "사이클"은 표적 핵산의 1 카피 (copy)를 생성하는 과정을 의미한다. 상기 변성, 프라이머의 대상 핵산결합단계 및 신장 단계에서의 온도 및 시간 조건은 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으며 특정의 범위로 한정되지 않으나, 바람직하게는 (i) 90 내지 98℃에서 55 내지 65초간의 변성(denaturation) 과정, (ii) 55 내지 63℃에서 55 내지 60초간의 어닐링(annealing) 및 (ⅲ) 65 내지 75℃에서 180 내지 190초 신장(elongation)과정으로 이루어지는 1 사이클을 30회 반복 수행하는 단계 및 (ⅳ) 72℃에서 10분을 추가 신장 단계를 포함할 수 있다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다. In step (b), the DNA isolated in step (a) may be used as a template, and the primer pair of the present invention may be used to amplify the 23S rRNA gene of Sorghum leaf blight. This step is repeated several times, including the steps of (i) denaturation step, ii) annealing the target of the primer, and iii) elongation step. As used herein, the term "cycle" refers to the process of making one copy of a target nucleic acid. The denaturation, temperature and time conditions in the target nucleic acid binding step and extension step of the primer can be selected by a person skilled in the art suitable conditions and are not limited to a specific range, but preferably (i) 55 to 65 seconds at 90 to 98 ℃ 30 cycles of one cycle consisting of denaturation process of (ii) annealing for 55 to 60 seconds at 55 to 63 ° C. and (e) 180 to 190 seconds elongation at 65 to 75 ° C. And (iv) an additional stretching step at 72 ° C. for 10 minutes. The time and number of cycles in each step can be determined according to the conditions generally made in the art.

(c) 단계는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물을 DNA크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머 쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행하여야 한다. PCR증폭 결과는 바람직하게는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 역전사 반응, PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용한다.
Step (c) may separate the PCR product by DNA size according to methods well known in the art. Preferably, it can be confirmed by an agarose gel or a polyacrylamide gel electrophoresis or fluorescence spectrometer. In this case, in order to use the fluorescence analyzer, PCR should be performed in step (b) using a primer pair attached with a fluorescent die known in the art. PCR amplification results can be preferably confirmed by agarose gel electrophoresis. After electrophoresis, the result of electrophoresis can be analyzed by ethidium bromide staining. For methods of general reverse transcription, PCR performance and analysis of the results, methods well known in the art are used.

한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J.,Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).
Meanwhile, standard recombinant DNA and molecular cloning techniques used in the present invention are well known in the art and described in the following literature (Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, TJ, Bennan, ML and Enquist, LW, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).

본 발명은 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 PCR 프라이머 쌍에 관한 것으로 보다 상세하게는 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 PCR 프라이머 쌍, 상기 프라이머 쌍을 포함하는 사탕수수잎마름병균 검출용 조성물 및 검출용 키트 및 이를 이용한 사탕수수잎마름병균의 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 쌍은 사탕수수잎마름병균에 특이적인 유전자에 특이적인 서열을 가지므로, 사탕수수잎마름병균의 진단 및 검출에 사용될 수 있다.
The present invention relates to a pair of PCR primers for detecting Xanthomonas albilineans , and more specifically, PCR primer pairs represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, the primer pair The present invention relates to a composition for detecting sugar cane leaf blight bacterium comprising the same, and a kit for detecting the sugar cane leaf blight bacterium using the same. Since the primer pair of the present invention has a sequence specific to a gene specific for sugarcane leaf blight, it can be used for diagnosis and detection of sugarcane leaf blight.

도 1은 본 발명의 사탕수수잎마름병균에 특이적인 프라이머 쌍을 이용한 PCR 분석을 통하여 사탕수수잎마름병균을 검출하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 사탕수수잎마름병균 검출용 PCR 프라이머 쌍의 표적 영역인 23S rRNA에서의 위치도이다.
도 3은 본 발명의 PCR 프라이머 쌍의 사탕수수잎마름병균에 대한 특이성을 나타내는 것으로, 각 레인의 미생물은 다음과 같다. M : size marker (1Kb), 1: 잔토모나스 알빌리니언스 (X. albilineans ICMP 196), 2: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 인카내 (Xanthomonas campestris pv. incanaei , CFBP 2527), 3: 잔토모나스 알팔패 subsp. 알팔패(X. alfalfae subsp. alfalfae , ICMP 5718), 4: 잔토모나스 알팔패 subsp. 시트로멜로니스 (X. alfalfae subsp. citromelonis , ICMP 15808), 5: 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 세레벤시스 (X. arboricola pv. celebennsis , CFBP 3523), 6:잔토모나스 아르보리콜라 pv. 코릴리나 (X. arboricola pv. corylina , CFBP 1159), 7:잔토모나스 아르보리콜라 pv. 프리가리애 (X. arboricola pv. fragariae , CFBP 6771), 8: 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 저글란디스 (X. arboricola pv. juglandis , LMG 747), 9: 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 포인세티콜라 (X. arboricola pv. poinsettiicola , ICMP 6274), 10: 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 포퓰리 (X. arboricola pv. populi , CFBP 3123), 11: 잔토모나스 아르보리콜라 ov. 프루니 (X. arboricola pv. pruni , ICMP 51), 12: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 액소노포디스 (X. axonopodis pv. axonopodis , LMG 982), 13: 잔토모나스 pv. 액소토포디스 바우히니애 (X. axonopodis pv. bauhiniae , ICMP 5720), 14: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 베고니애 (X. axonopodis pv. begoniae , CFBP 2524), 15: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 카자니 (X. axonopodis pv. cajani , LMG 558), 16 : 잔토모나스 액소노포디스 pv. 카사배 (X. axonopodis pv. cassavae, LMG 8049), 17 : 잔토모나스 액소노포디스 pv. 카시애 (X. axonopodis pv. cassiae , LMG 675), 18: 잔토모나스 액소노포디스 클리토리애 (X. axonopodis pv. clitoriae , LMG 9045), 19: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 코라카내 (X. axonopodis pv. coracanae , LMG 686), 20: 잔토모나스 액소노포디스 시아몹시디스 (X. axonopodis pv. cyamopsidis , LMG 686), 21: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 데스모디 (X. axonopodis pv. desmodii , LMG 692), 22: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 데스모디강게시티 (X. axonopodis pv. desmodiigangetici, LMG 693), 23: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 데스모디락시플로리 (X. axonopodis pv. desmodiilaxiflori, LMG 9046), 24: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 데스모디로턴디폴리 (X. axonopodis pv. desmodiirotundifolii, LMG 694), 25: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 디에펜바치애 (X. axonopodis pv. dieffenbachiae , LMG 695), 26: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 에리트리내 (X. axonopodis pv. erythrinae , LMG 698), 27: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 글리시네스 (X. axonopodis pv. glycines , ICMP 5732), 28: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 레스페데재 (X. axonopodis pv. lespedezae , LMG 757), 29: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 마니호티스 (X. axonopodis pv. manihotis , ICMP 5741), 30: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 나카태코르코리 (X. axonopodis pv. nakataecorchori , LMG 786), 31: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 파테리 (X. axonopodis pv. patelii , LMG 811), 32: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 패서리 (X. axonopodis pv. phaseoli , ICMP 5834), 33: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 필란티 (X. axonopodis pv. phyllanthi , LMG 844), 34: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 피살리디콜라 (X. axonopodis pv. physalidicola , LMG 845), 35: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 포인세티콜라 (X. axonopodis pv. poinsettiicola , LMG 849), 36: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 린코시애 (X. axonopodis pv. rhynchosiae , LMG 8021), 37: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 리치니 (X. axonopodis pv. ricini , LMG 861), 38: 잔토모나스 액소노포디스 세스바니애 (X. axonopodis pv. sesbaniae , ICMP 367), 39: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 타마린디 (X. axonopodis pv. tamarindi , LMG 955), 40: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 바스큘라룸 (X. axonopodis pv. vascularum , CFBP 5823), 41: 잔토모나스 pv. 비내라디아태 (X. axonopodis pv. vignaeradiatae , LMG 936), 42: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 비니콜라 (X. axonopodis pv. vignicola , LMG 8752), 43: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 비티안스 (X. axonopodis pv . vitians, CFBP 2538), 44: 잔토모나스 브로미 (X. bromi , LMG 947), 45: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 에버란스 (X. campestris pv . aberrans , CFBP 6865), 46: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 아므로라시애 (X. campestris pv . armoracieae , CFBP 3838), 47: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 바바래 (X. campestris pv . barbarae, CFBP 5825), 48: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스 (X. campestris pv . campestris , ICMP 13), 49: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 피시 (X. campestris pv . fici , LMG 701), 50: 잔토모나스 파퓰리 (X. populi , CFBP 1817), 51: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 모리 (X. campestris pv . mori , ICMP 13199), 52: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 니그로마큘란스 (X. campestris pv . nigromaculans , LMG 787), 53: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 파울리니애 (X. campestris pv . paulliniae , CFBP 5862), 54: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 라파니 (X. campestris pv . raphani , ICMP 1404), 55: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 세사미 (X. campestris pv . sesami , ICMP 621), 56: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 비티콜라 (X. campestris pv . viticola , ICMP 3867), 57: 잔토모나스 카사배 (X. cassavae , LMG 673), 58: 잔토모나스 시트리 supsp. 시트리 (X. citri subsp . citri , ICMP15804), 59: 잔토모나스 시트리 subsp. 말바세애럼 (X. citri subsp . malvaceaerum , ICMP 217), 60: 잔토모나스 코디애 (X. codiaei , CFBP 4690), 61: 잔토모나스 큐커비태 (X. cucurbitae , ICMP 2299), 62: 잔토모나스 시나래 (X. cynarae , CFBP 4188), 63: 잔토모나스 유베시카토리아 (X. euvesicatoria, ICMP 109), 64: 잔토모나스 프라가리애 (X. fragariae , CFBP 2157), 65: 잔토모나스 푸스칸스 pv. 푸스칸스 (X. fuscans pv . fuscans , ICMP 239), 66: 잔토모나스 푸스칸스 subsp. 오란티폴리 (X. fuscans subsp . aurantifolii , ICMP15806), 67: 잔토모나스 가드너리 (X. gardneri , NCPPB 881), 68: 잔토모나스 호르토럼 pv. 카로태 (X. hortorum pv . carotae , CFBP 4997), 69: 잔토모나스 호르토럼 pv. 헤데래 (X. hortorum pv . hederae , CFBP 4925), 70: 잔토모나스 호르토럼 pv. 펠라고니 (X. hortorum pv . pelargonii , CFBP 2533), 71: 잔토모나스 호르토럼 pv. 타락사시 (X. hortorum pv . taraxaci , CFBP 410), 72: 잔토모나스 호르토럼 pv. 비티안스 (X. hortorum pv . vitians , LMG 938), 73: 잔토모나스 히야신티 (X. hyacinthi , LMG 739), 74: 잔토모나스 멜로니스 (X. melonis , CFBP 4644), 75: 잔토모나스 오리재 pv. 오리재 (X. oryzae pv . oryzae, ICMP 3125), 76: 잔토모나스 오리재 pv. 오리지콜라 (X. oryzae pv . oryzicola , LMG 797), 77: 잔토모나스 퍼포란스 (X. perforans , NCPPB 4321), 78: 잔토모나스 피시 (X. pisi , ICMP 570), 79: 잔토모나스 사카리 (X. sacchari , CFBP 4641), 80: 잔토모나스 테이콜라 (X. theicola , CFBP 4691), 81: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 아르헤나테리 (X. translucens pv . arrhenatheri , CFBP 2056), 82: 잔토모나스 트랜스루센스 세리얼리스 (X. translucens pv . cerealis , CFBP 2541), 83: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 그라미니스 (X. translucens pv . graminis , CFBP 2053), 84: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 플레이 (X. translucens pv . phlei , CFBP 2062), 85: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 플레이프라텐시스 (X. translucens pv . phleipratensis , ICMP 5744), 86: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 포애 (X. translucens pv . poae , CFBP 2057), 87: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 세칼리스 (X. translucens pv . secalis , CFBP 2539), 88: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 트랜스루센스 (X. translucens pv . translucens , CFBP 2054), 89: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 언덜로사 (X. translucens pv . undulosa , ICMP 5755), 90: 잔토모나스 바시콜라 pv. 홀시콜라 (X. vasicola pv . holcicola , CFBP 2543), 91: 잔토모나스 베시카토리아 (X. vesicatoria , CFBP 2537).Figure 1 shows the process of detecting sugar cane leaf bacteria through PCR analysis using a primer pair specific to sugar cane leaf blight bacteria of the present invention.
Figure 2 is a position diagram in the 23S rRNA target region of the PCR primer pair for sugarcane leaf blight bacteria detection of the present invention.
Figure 3 shows the specificity for sugarcane leaf blight bacteria of the PCR primer pair of the present invention, the microorganism of each lane is as follows. M: size marker (1Kb), 1: Xanthomonas albilians ( X. albilineans ICMP 196), 2: Xanthomonas Campestris pv. Inca ( Xanthomonas campestris pv. incanaei , CFBP 2527), 3: xanthomonas alfalfa subsp. Alfalfa ( X. alfalfae subsp.alfalfae , ICMP 5718), 4: Xanthomonas alfalfa subsp. Citromelonis ( X. alfalfae subsp. Citromelonis , ICMP 15808), 5: Xanthomonas arboricola pv. X. arboricola pv.celebennsis , CFBP 3523, 6: Xanthomonas arboricola pv. Corylina ( X. arboricola pv. Corylina , CFBP 1159), 7: Xanthomonas arboricola pv. Free kids point (X. arboricola pv fragariae, CFBP 6771 .), 8: janto Monastir ahreubo Ricola pv. Jugglandis ( X. arboricola pv. Juglandis , LMG 747), 9: Xanthomonas arboricola pv. Shetty point cola (X. arboricola pv poinsettiicola, ICMP 6274 .), 10: janto Pseudomonas ahreubo Ricola pv. Four pyulri (X. arboricola pv populi, CFBP 3123 .), 11: janto Pseudomonas ahreubo Ricola ov. Pruni ( X. arboricola pv. Pruni , ICMP 51), 12: Xanthomonas axonopodis pv. Axonopodis ( X. axonopodis pv. axonopodis , LMG 982), 13: xanthomonas pv. Axotopodis bauhinia ( X. axonopodis pv. Bauhiniae , ICMP 5720), 14: Xanthomonas axonopodis pv. Begonia ( X. axonopodis pv. Begoniae , CFBP 2524), 15: Xanthomonas axonopodis pv. Kazani ( X. axonopodis pv.cajani , LMG 558), 16: Xanthomonas axonopodis pv. Casabae (X. axonopodis pv. cassavae, LMG 8049), 17: Xanthomonas axonopodis pv. X. axonopodis pv. Cassiae , LMG 675, 18: X. axonopodis pv. Clitoriae , LMG 9045 ), 19: Xanthomonas axonopodis pv. Cora kanae (. X. axonopodis pv coracanae, LMG 686), 20: janto Pseudomonas liquid discharge port Sono cyano heavily disk (X. axonopodis pv cyamopsidis, LMG 686 .), 21: janto Pseudomonas liquid discharge port Sono pv. Desmody ( X. axonopodis pv. Desmodii , LMG 692), 22: Xanthomonas axonopodis pv. Desmodigogecity ( X. axonopodis pv. Desmodiigangetici, LMG 693), 23: Xanthomonas axonopodis pv. Desmodilacxiflori ( X. axonopodis pv. Desmodiilaxiflori, LMG 9046), 24: Xanthomonas axonopodis pv. Desmodi rotondipoli ( X. axonopodis pv. Desmodiirotundifolii, LMG 694), 25: Xanthomonas axonopodis pv. Dieter pen dedicate her (X. axonopodis pv dieffenbachiae, LMG 695 .), 26: janto Monastir solution Sono Pho display pv. Erie tree within (. X. axonopodis pv erythrinae, LMG 698), 27: janto Pseudomonas liquid discharge port Sono pv. Sines glycidyl (X. axonopodis pv glycines, ICMP 5732 .), 28: janto Pseudomonas liquid discharge port Sono pv. Lespedejae ( X. axonopodis pv.lespedezae , LMG 757), 29: Xanthomonas axonopodis pv. Maniotis ( X. axonopodis pv. Manihotis , ICMP 5741), 30: Xanthomonas axonopodis pv. Nakatacorcory ( X. axonopodis pv.nakataecorchori , LMG 786), 31: Xanthomonas axonopodis pv. Pateri ( X. axonopodis pv. Patelii , LMG 811), 32: Xanthomonas axonopodis pv. L Frost (X. axonopodis pv. Phaseoli, ICMP 5834), 33: Xanthomonas axonopodis pv. Pilanti ( X. axonopodis pv. Phyllanthi , LMG 844), 34: Xanthomonas axonopodis pv. Fisalidicola ( X. axonopodis pv.physalidicola , LMG 845), 35: Xanthomonas axonopodis pv. Sethi points Cola (X. axonopodis pv poinsettiicola, LMG 849 .), 36: janto Monastir solution Sono Pho display pv. Linkoping City kids (X. axonopodis pv rhynchosiae, LMG 8021 .), 37: janto Monastir solution Sono Pho display pv. Reach your (. X. axonopodis pv ricini, LMG 861), 38: janto Monastir solution Sonora Po Ke Bani disabled access (. X. axonopodis pv sesbaniae, ICMP 367), 39: janto Monastir solution Sono Pho display pv. Tamarindi ( X. axonopodis pv. Tamarindi , LMG 955), 40: Xanthomonas axonopodis pv. Bath particulate rarum (X. axonopodis pv vascularum, CFBP 5823 .), 41: janto Pseudomonas pv. Nonnadiadia ( X. axonopodis pv.vignaeradiatae , LMG 936), 42: Xanthomonas axonopodis pv. Vinicola ( X. axonopodis pv. Vignicola , LMG 8752), 43: Xanthomonas axonopodis pv. Vitians ( X. axonopodis pv . vitians, CFBP 2538), 44: Xanthomonas bromi ( X. bromi , LMG 947), 45: Xanthomonas campestris pv. Everance ( X. campestris pv . aberrans , CFBP 6865), 46: Xanthomonas campestris pv. A. gorassia ( X. campestris pv . Armoracieae , CFBP 3838), 47: Xanthomonas campestris pv. Creeper ( X. campestris pv . barbarae, CFBP 5825), 48: Xanthomonas campestris pv. Campestris ( X. campestris pv . campestris , ICMP 13), 49: Xanthomonas Campestris pv. Fish ( X. campestris pv . fici , LMG 701), 50: Xanthomonas Populi ( X. populi , CFBP 1817), 51: Xanthomonas campestris pv. Mori ( X. campestris pv . mori , ICMP 13199), 52: Xanthomonas Campestris pv. Nigromaculans ( X. campestris pv . nigromaculans , LMG 787), 53: Xanthomonas campestris pv. Paulinea ( X. campestris pv . paulliniae , CFBP 5862), 54: Xanthomonas Campestris pv. Raphani ( X. campestris pv . raphani , ICMP 1404), 55: Xanthomonas Campestris pv. Sesami ( X. campestris pv . Sesami , ICMP 621), 56: Xanthomonas campestris pv. Viticola ( X. campestris pv . viticola , ICMP 3867), 57: Xanthomonas casabae ( X. cassavae , LMG 673), 58: Xanthomonas citri supsp. Citri ( X. citri subsp . Citri , ICMP15804), 59: xanthomonas citri subsp. Malvase Arum ( X. citri subsp . malvaceaerum , ICMP 217), 60: X. codiaei , CFBP 4690, 61: X. cucurbitae ( ICMP 2299), 62: Xanthomonas cinarae ( X. cynarae , CFBP 4188 ), 63: X. euvesicatoria ( ICMP 109), 64: X. fragariae ( CFBP 2157), 65: Xanthomonas fuscanns pv. Fucans ( X. fuscans pv . fuscans , ICMP 239), 66: Xanthomonas Fuscans subsp. Orantipoli ( X. fuscans subsp . Aurantifolii , ICMP15806), 67: Xanthomonas gardneri ( X. gardneri , NCPPB 881), 68: xanthomonas hortorum pv. Carotene ( X. hortorum pv . carotae , CFBP 4997), 69: Xanthomonas Hortorum pv. Hederae ( X. hortorum pv . Hederae , CFBP 4925), 70: Xanthomonas hortorum pv. Pelargoni ( X. hortorum pv . pelargonii , CFBP 2533), 71: xanthomonas hortorum pv. Fallen City ( X. hortorum pv . taraxaci , CFBP 410), 72: xanthomonas hortorum pv. Vitians ( X. hortorum pv . vitians , LMG 938), 73: X. hyacinthi ( LMG 739), 74: X. melonis , CFBP 4644, 75: Xanthomonas duckling pv. Duck ( X. oryzae pv . oryzae, ICMP 3125), 76: xanthomonas duckwood pv. Original Cola ( X. oryzae pv . oryzicola , LMG 797), 77: Xanthomonas perforans ( X. perforans , NCPPB 4321), 78: Xanthomonas fish ( X. pisi , ICMP 570), 79: Xanthomonas sakari ( X. sacchari , CFBP 4641), 80: Xanthomonas teicola ( X. theicola , CFBP 4691), 81: Xanthomonas translucense pv. Arhenateri ( X. translucens pv . arrhenatheri , CFBP 2056), 82: Xanthomonas translucens serialis ( X. translucens pv . cerealis , CFBP 2541), 83: Xanthomonas translucense pv. Gras mini bus (X. translucens pv graminis, CFBP 2053 .), 84: janto Monastir trans Lou sense pv. Play ( X. translucens pv . phlei , CFBP 2062), 85: Xanthomonas translucense pv. Playpratensis ( X. translucens pv . phleipratensis , ICMP 5744 ), 86: Xanthomonas translucens pv. Vesicle ( X. translucens pv . poae , CFBP 2057), 87: xanthomonas translucense pv. Sepalis ( X. translucens pv . secalis , CFBP 2539), 88: xanthomonas translucence pv. Translucens (X. translucens pv . translucens , CFBP 2054), 89: xanthomonas translucens pv. Underlosa ( X. translucens pv . Undulosa , ICMP 5755), 90: xanthomonas vacisco pv. Whole Cola ( X. vasicola pv . holcicola , CFBP 2543), 91: X. vesicatoria ( CFBP 2537).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

<< 실시예Example 1>  1>

사탕수수잎마름병균Sugar cane leaf blight (( XanthomonasXanthomonas albilineansalbilineans )) 검출용 For detection 프라이머primer 쌍의 설계 Pair design

<1-1>특이적 염기서열의 정보 탐색<1-1> Information search of specific sequencing

사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans)에 특이적인 염기가 존재하는 핵산을 선발하기 위하여 PCR 프라이머 개발에 많이 사용되는 rRNA 및 하우스키핑 유전자 중, 사탕수수잎마름병균 게놈 서열 중에서 진화에 안정적이고 같은 종 혹은 하위 분류군 중 변이가 드물어 종 보존적이고 병원 세균 진단용 PCR 프라이머로 이상적인 23S rRNA 영역을 표적으로 하였다. 본 발명에서는 유전자은행(GenBank)에 등록된 전체 염기서열이 분석된 식물병원세균인 잔토모나스 pv. 캄페스트리스(X. campestris pv. campestris), 잔토모나스 액소노포디스 pv. 시트리(X. axonpodis pv. citri), 잔토모나스 액소노포디스 pv. 베르시카토리아(X. axonopodis pv. vesicatoria), 잔토모나스 오리재 pv. 오리재(X. oryzae pv. oryzae)과 잔토모나스 알빌리이언스 23S rRNA 유전자를 BioEdit 프로그램 (Version7.0.9.0)에 설치되어 있는 ClustalW 다중정열 프로그램을 이용하여 비교 분석하였다. Among the rRNA and housekeeping genes that are frequently used in PCR primer development to select nucleic acids with bases specific for Xanthomonas albilineans, they are stable in evolution and among the same species or Mutations in the subclass were rare, targeting the 23S rRNA region ideal for species conservation and PCR primers for the diagnosis of hospital bacteria. In the present invention, the phytopathogen bacterium xanthomonas pv. Kam paste-less (X. campestris pv. Campestris), Pseudomonas janto liquid discharge port Sono pv. Li sheet (X. axonpodis pv. Citri), Pseudomonas janto liquid discharge port Sono pv. Versicattoria ( X. axonopodis pv.vesicatoria ), Xanthomonas duckwood pv. Duck ( X. oryzae pv. Oryzae ) and Xanthomonas albilis 23S rRNA genes were compared and analyzed using the ClustalW multiple alignment program installed in the BioEdit program (Version7.0.9.0).

그 결과, 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans)의 23S rRNA의 염기 서열 중, 일부 서열이 상기 미생물에만 특이적으로 존재함을 확인 하였고, 상기 염기 서열의 위치를 도 3에 나타내었다.
As a result, it was confirmed that some of the sequences of the 23S rRNA of Xanthomonas albilineans were specifically present only in the microorganism, and the positions of the sequences are shown in FIG. 3.

<1-2>특이 서열 증폭을 위한 <1-2> for specific sequence amplification 프라이머primer 쌍의 제작 Pair making

상기 1-1에서 특이성이 확인된 23S rRNA 유전자를 이용하여 하기와 같이사탕수수잎마름병균에 특이적인 중합효소연쇄반응의 전방향 및 역방향 프라이머쌍을 제조하였다. 이는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 AE008922(X. campestris pv. campestris)의 23S rRNA 유전자 번호에 대응하는 사탕수수잎마름병균 23S rRNA 유전자 서열의 전방향 프라이머 1,339 내지 1,362 bp (5‘-GCGTGGTATCAGTGACTTCGTCTC-3’, 24 mer, Xan23SF69)와 2,375 내지 2,354 bp 역상보적염기서열(Antisense reverse sequence) (5‘-CGTACAAGCAGTAGGAGCTCGT-3‘, 22 mer, Xan23SR61)로 하기 표 1과 같은 염기서열로 나타낼 수 있다. Using the 23S rRNA gene confirmed in the specificity in 1-1 to prepare a forward and reverse primer pair of the polymerase chain reaction specific to sugarcane leaf blight as follows. This sugarcane leaves corresponding to the 23S rRNA gene of the number AE008922 (X. campestris pv. Campestris) registered in GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) of the (National Center for Biotechnology Information) NCBI Forward primer 1,339 to 1,362 bp (5'-GCGTGGTATCAGTGACTTCGTCTC-3 ', 24 mer, Xan23SF69) and 2,375 to 2,354 bp Antisense reverse sequence (5'-CGTACAAGCAGTAGGAGCTCGT) ', 22 mer, Xan23SR61) may be represented by the base sequence shown in Table 1 below.

서열번호SEQ ID NO: 프라이머 primer 염기서열Sequence 위치location 1One Xan23SF69Xan23SF69 5‘-GCGTGGTATCAGTGACTTCGTCTC-3’5'-GCGTGGTATCAGTGACTTCGTCTC-3 ' 1,339~1,362 bp1,339 ~ 1,362 bp 22 Xan23SR61Xan23SR61 5‘-CGTACAAGCAGTAGGAGCTCGT-3‘5’-CGTACAAGCAGTAGGAGCTCGT-3 ’ 2,375~2,354 bp2,375-2,354 bp

<< 실시예Example 2> 2>

시료의 제조Preparation of Sample

상기 실시예 1에서 제조된 프라이머를 이용하여 사탕수수잎마름병균을 검출하기 위한 중합효소연쇄반응에 사용될 시료를 준비하였다. 실험에 사용된 세균은 26종 및 종 하위 분류군의 91개의 잔토모나스 속 병원 세균인 1: 잔토모나스 알빌리니언스 (X. albilineans ICMP 196), 2: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 인카내 (Xanthomonas campestris pv. incanaei, CFBP 2527), 3: 잔토모나스 알팔패 subsp. 알팔패(X. alfalfae subsp. alfalfae, ICMP 5718), 4: 잔토모나스 알팔패 subsp. 시트로멜로니스 (X. alfalfae subsp. citromelonis, ICMP 15808), 5: 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 세레벤시스 (X. arboricola pv. celebennsis, CFBP 3523), 6:잔토모나스 아르보리콜라 pv. 코릴리나 (X. arboricola pv. corylina, CFBP 1159), 7:잔토모나스 아르보리콜라 pv. 프리가리애 (X. arboricola pv. fragariae, CFBP 6771), 8: 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 저글란디스 (X. arboricola pv. juglandis, LMG 747), 9: 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 포인세티콜라 (X. arboricola pv. poinsettiicola, ICMP 6274), 10: 잔토모나스 아르보리콜라 pv. 포퓰리 (X. arboricola pv. populi, CFBP 3123), 11: 잔토모나스 아르보리콜라 ov. 프루니 (X. arboricola pv. pruni, ICMP 51), 12: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 액소노포디스 (X. axonopodis pv. axonopodis, LMG 982), 13: 잔토모나스 pv. 액소토포디스 바우히니애 (X. axonopodis pv. bauhiniae, ICMP 5720), 14: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 베고니애 (X. axonopodis pv. begoniae, CFBP 2524), 15: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 카자니 (X. axonopodis pv. cajani, LMG 558), 16 : 잔토모나스 액소노포디스 pv. 카사배 (X. axonopodis pv. cassavae , LMG 8049), 17 : 잔토모나스 액소노포디스 pv. 카시애 (X. axonopodis pv. cassiae , LMG 675), 18: 잔토모나스 액소노포디스 클리토리애 (X. axonopodis pv. clitoriae , LMG 9045), 19: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 코라카내 (X. axonopodis pv. coracanae , LMG 686), 20: 잔토모나스 액소노포디스 시아몹시디스 (X. axonopodis pv. cyamopsidis , LMG 686), 21: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 데스모디 (X. axonopodis pv. desmodii , LMG 692), 22: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 데스모디강게시티 (X. axonopodis pv. desmodiigangetici , LMG 693), 23: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 데스모디락시플로리 (X. axonopodis pv. desmodiilaxiflori , LMG 9046), 24: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 데스모디로턴디폴리 (X. axonopodis pv. desmodiirotundifolii , LMG 694), 25: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 디에펜바치애 (X. axonopodis pv. dieffenbachiae , LMG 695), 26: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 에리트리내 (X. axonopodis pv. erythrinae , LMG 698), 27: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 글리시네스 (X. axonopodis pv. glycines , ICMP 5732), 28: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 레스페데재 (X. axonopodis pv. lespedezae , LMG 757), 29: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 마니호티스 (X. axonopodis pv. manihotis, ICMP 5741), 30: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 나카태코르코리 (X. axonopodis pv. nakataecorchori, LMG 786), 31: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 파테리 (X. axonopodis pv. patelii , LMG 811), 32: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 패서리 (X. axonopodis pv. phaseoli , ICMP 5834), 33: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 필란티 (X. axonopodis pv. phyllanthi , LMG 844), 34: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 피살리디콜라 (X. axonopodis pv. physalidicola , LMG 845), 35: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 포인세티콜라 (X. axonopodis pv. poinsettiicola , LMG 849), 36: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 린코시애 (X. axonopodis pv. rhynchosiae , LMG 8021), 37: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 리치니 (X. axonopodis pv. ricini , LMG 861), 38: 잔토모나스 액소노포디스 세스바니애 (X. axonopodis pv. sesbaniae, ICMP 367), 39: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 타마린디 (X. axonopodis pv. tamarindi , LMG 955), 40: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 바스큘라룸 (X. axonopodis pv. vascularum , CFBP 5823), 41: 잔토모나스 pv. 비내라디아태 (X. axonopodis pv. vignaeradiatae , LMG 936), 42: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 비니콜라 (X. axonopodis pv. vignicola , LMG 8752), 43: 잔토모나스 액소노포디스 pv. 비티안스 (X. axonopodis pv . vitians , CFBP 2538), 44: 잔토모나스 브로미 (X. bromi , LMG 947), 45: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 에버란스 (X. campestris pv . aberrans , CFBP 6865), 46: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 아므로라시애 (X. campestris pv . armoracieae , CFBP 3838), 47: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 바바래 (X. campestris pv . barbarae , CFBP 5825), 48: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스 (X. campestris pv . campestris , ICMP 13), 49: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 피시 (X. campestris pv . fici , LMG 701), 50: 잔토모나스 파퓰리 (X. populi , CFBP 1817), 51: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 모리 (X. campestris pv . mori , ICMP 13199), 52: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 니그로마큘란스 (X. campestris pv . nigromaculans , LMG 787), 53: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 파울리니애 (X. campestris pv . paulliniae , CFBP 5862), 54: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 라파니 (X. campestris pv . raphani , ICMP 1404), 55: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 세사미 (X. campestris pv . sesami, ICMP 621), 56: 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 비티콜라 (X. campestris pv . viticola , ICMP 3867), 57: 잔토모나스 카사배 (X. cassavae , LMG 673), 58: 잔토모나스 시트리 supsp. 시트리 (X. citri subsp. citri , ICMP15804), 59: 잔토모나스 시트리 subsp. 말바세애럼 (X. citri subsp. malvaceaerum , ICMP 217), 60: 잔토모나스 코디애 (X. codiaei , CFBP 4690), 61: 잔토모나스 큐커비태 (X. cucurbitae , ICMP 2299), 62: 잔토모나스 시나래 (X. cynarae , CFBP 4188), 63: 잔토모나스 유베시카토리아 (X. euvesicatoria , ICMP 109), 64: 잔토모나스 프라가리애 (X. fragariae , CFBP 2157), 65: 잔토모나스 푸스칸스 pv. 푸스칸스 (X. fuscans pv . fuscans , ICMP 239), 66: 잔토모나스 푸스칸스 subsp. 아우란티폴리 (X. fuscans subsp . aurantifolii , ICMP15806), 67: 잔토모나스 가드너리 (X. gardneri , NCPPB 881), 68: 잔토모나스 호르토럼 pv. 카로태 (X. hortorum pv . carotae , CFBP 4997), 69: 잔토모나스 호르토럼 pv. 헤데래 (X. hortorum pv . hederae , CFBP 4925), 70: 잔토모나스 호르토럼 pv. 펠라고니 (X. hortorum pv . pelargonii , CFBP 2533), 71: 잔토모나스 호르토럼 pv. 타락사시 (X. hortorum pv . taraxaci , CFBP 410), 72: 잔토모나스 호르토럼 pv. 비티안스 (X. hortorum pv. vitians , LMG 938), 73: 잔토모나스 히야신티 (X. hyacinthi , LMG 739), 74: 잔토모나스 멜로니스 (X. melonis , CFBP 4644), 75: 잔토모나스 오리재 pv. 오리재 (X. oryzae pv . oryzae , ICMP 3125), 76: 잔토모나스 오리재 pv. 오리재 (X. oryzae pv . oryzicola , LMG 797), 77: 잔토모나스 퍼포란스 (X. perforans, NCPPB 4321), 78: 잔토모나스 피시 (X. pisi , ICMP 570), 79: 잔토모나스 사카리 (X. sacchari, CFBP 4641), 80: 잔토모나스 테이콜라 (X. theicola , CFBP 4691), 81: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 아르헤나테리 (X. translucens pv . arrhenatheri , CFBP 2056), 82: 잔토모나스 트랜스루센스 세리얼리스 (X. translucens pv . cerealis , CFBP 2541), 83: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 그라미니스 (X. translucens pv . graminis , CFBP 2053), 84: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 플레이 (X. translucens pv . phlei , CFBP 2062), 85: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 플레이프라텐시스 (X. translucens pv . phleipratensis , ICMP 5744), 86: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 포애 (X. translucens pv. poae , CFBP 2057), 87: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 세칼리스 (X. translucens pv . secalis , CFBP 2539), 88: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 트랜스루센스 (X. translucens pv . translucens , CFBP 2054), 89: 잔토모나스 트랜스루센스 pv. 언덜로사 (X. translucens pv . undulosa , ICMP 5755), 90: 잔토모나스 바시콜라 pv. 홀시콜라 (X. vasicola pv . holcicola , CFBP 2543), 91: 잔토모나스 베시카토리아 (X. vesicatoria , CFBP 2537)이다. Using a primer prepared in Example 1 was prepared a sample to be used in the polymerase chain reaction for detecting sugar cane leaf blight bacteria. Bacteria used in the experiment were 1: Xanthomonas albilinians ( X. albilineans ICMP 196), 2: Xanthomonas campestris pv. Incana ( Xanthomonas campestris pv.incanaei, CFBP 2527), 3: xanthomonas alfalfa subsp. Alfalfa ( X. alfalfae subsp.alfalfae, ICMP 5718), 4: Xanthomonas alfalfa subsp. Citromelonis ( X. alfalfae subsp. Citromelonis, ICMP 15808), 5: xanthomonas arboricola pv. X. arboricola pv.celebennsis, CFBP 3523, 6: Xanthomonas arboricola pv. Corylina ( X. arboricola pv. Corylina, CFBP 1159), 7: Xanthomonas arboricola pv. Frigaria ( X. arboricola pv.fragariae , CFBP 6771), 8: Xanthomonas arboricola pv. Jugglandis ( X. arboricola pv. Juglandis, LMG 747), 9: Xanthomonas arboricola pv. Poinseticola ( X. arboricola pv.poinsettiicola , ICMP 6274), 10: xanthomonas arboricola pv. Populi ( X. arboricola pv.populi , CFBP 3123), 11: Xanthomonas arboricola ov. Pruni ( X. arboricola pv. Pruni, ICMP 51), 12: Xanthomonas axonopodis pv. Axonopodis ( X. axonopodis pv. Axonopodis, LMG 982), 13: xanthomonas pv. Axotopodis bauhinia ( X. axonopodis pv. Bauhiniae , ICMP 5720), 14: Xanthomonas axonopodis pv. Begonia ( X. axonopodis pv. Begoniae, CFBP 2524), 15: Xanthomonas axonopodis pv. Kazani ( X. axonopodis pv.cajani, LMG 558), 16: Xanthomonas axonopodis pv. Casabae (X. axonopodis pv. cassavae , LMG 8049), 17: Xanthomonas axonopodis pv. X. axonopodis pv. Cassiae , LMG 675, 18: X. axonopodis pv. Clitoriae , LMG 9045 ), 19: Xanthomonas axonopodis pv. Coracanae ( X. axonopodis pv.coracanae , LMG 686), 20: Xanthomonas axonopodis siamoxidis ( X. axonopodis pv. Cyamopsidis , LMG 686), 21: Xanthomonas axonopodis pv. Desmody ( X. axonopodis pv. Desmodii , LMG 692), 22: Xanthomonas axonopodis pv. Desmodigogecity ( X. axonopodis pv. Desmodiigangetici , LMG 693), 23: Xanthomonas axonopodis pv. Desmodilacciflori ( X. axonopodis pv.desmodiilaxiflori , LMG 9046), 24: Xanthomonas axonopodis pv. Desmodi rotondipoli ( X. axonopodis pv. Desmodiirotundifolii , LMG 694), 25: Xanthomonas axonopodis pv. Dieter pen dedicate her (X. axonopodis pv dieffenbachiae, LMG 695 .), 26: janto Monastir solution Sono Pho display pv. Erie tree within (. X. axonopodis pv erythrinae, LMG 698), 27: janto Pseudomonas liquid discharge port Sono pv. Sines glycidyl (X. axonopodis pv glycines, ICMP 5732 .), 28: janto Pseudomonas liquid discharge port Sono pv. Lespedejae ( X. axonopodis pv.lespedezae , LMG 757), 29: Xanthomonas axonopodis pv. Maniotis ( X. axonopodis pv. Manihotis, ICMP 5741), 30: Xanthomonas axonopodis pv. Nakatacorcory ( X. axonopodis pv.nakataecorchori, LMG 786), 31: Xanthomonas axonopodis pv. Pateri ( X. axonopodis pv. Patelii , LMG 811), 32: Xanthomonas axonopodis pv. L Frost (X. axonopodis pv. Phaseoli, ICMP 5834), 33: Xanthomonas axonopodis pv. Pilanti ( X. axonopodis pv. Phyllanthi , LMG 844), 34: Xanthomonas axonopodis pv. Fisalidicola ( X. axonopodis pv.physalidicola , LMG 845), 35: Xanthomonas axonopodis pv. Sethi points Cola (X. axonopodis pv poinsettiicola, LMG 849 .), 36: janto Monastir solution Sono Pho display pv. Linkoping City kids (X. axonopodis pv rhynchosiae, LMG 8021 .), 37: janto Monastir solution Sono Pho display pv. Richini ( X. axonopodis pv.ricini , LMG 861), 38: X. axonopodis pv.sesbaniae , ICMP 367, 39: Xanthomonas axonopodis pv. Tamarindi ( X. axonopodis pv. Tamarindi , LMG 955), 40: Xanthomonas axonopodis pv. Bath particulate rarum (X. axonopodis pv vascularum, CFBP 5823 .), 41: janto Pseudomonas pv. Nonnadiadia ( X. axonopodis pv.vignaeradiatae , LMG 936), 42: Xanthomonas axonopodis pv. Vinicola ( X. axonopodis pv. Vignicola , LMG 8752), 43: Xanthomonas axonopodis pv. Vitians ( X. axonopodis pv . vitians , CFBP 2538), 44: X. bromi , LMG 947), 45: Xanthomonas campestris pv. Everance ( X. campestris pv . aberrans , CFBP 6865), 46: Xanthomonas campestris pv. Amadorasiea ( X. campestris pv . armoracieae , CFBP 3838), 47: Xanthomonas Campestris pv. Creeper ( X. campestris pv . barbarae , CFBP 5825), 48: Xanthomonas campestris pv. Campestris ( X. campestris pv . campestris , ICMP 13), 49: Xanthomonas Campestris pv. Fish ( X. campestris pv . fici , LMG 701), 50: Xanthomonas Populi ( X. populi , CFBP 1817), 51: Xanthomonas campestris pv. Mori ( X. campestris pv . mori , ICMP 13199), 52: Xanthomonas Campestris pv. Nigromaculans ( X. campestris pv . nigromaculans , LMG 787), 53: Xanthomonas campestris pv. Paulinea ( X. campestris pv . paulliniae , CFBP 5862), 54: Xanthomonas Campestris pv. Raphani ( X. campestris pv . Raphani , ICMP 1404), 55: Xanthomonas campestris pv. Sesame ( X. campestris pv . sesami, ICMP 621), 56: Xanthomonas Campestris pv. Viticola ( X. campestris pv . viticola , ICMP 3867), 57: Xanthomonas casabae ( X. cassavae , LMG 673), 58: Xanthomonas citri supsp. Citri ( X. citri subsp. Citri , ICMP15804), 59: Xanthomonas citri subsp. X. citri subsp. Malvaceaerum ( ICMP 217), 60: X. codiaei , CFBP 4690, 61: X. cucurbitae ( ICMP 2299), 62: Xanthomonas Cinarae ( X. cynarae , CFBP 4188), 63: X. euvesicatoria ( ICMP 109), 64: X. fragariae ( CFBP 2157), 65: Xanthomonas fuskans pv . Fucans ( X. fuscans pv . fuscans , ICMP 239), 66: Xanthomonas Fuscans subsp. Aurantipoli ( X. fuscans subsp . aurantifolii , ICMP15806), 67: Xanthomonas gardneri ( X. gardneri , NCPPB 881), 68: Xanthomonas hortorum pv. Carotene ( X. hortorum pv . carotae , CFBP 4997), 69: Xanthomonas Hortorum pv. Hedera ( X. hortorum pv . hederae , CFBP 4925), 70: xanthomonas hortorum pv. Pelargoni ( X. hortorum pv . pelargonii , CFBP 2533), 71: xanthomonas hortorum pv. Fallen City ( X. hortorum pv . taraxaci , CFBP 410), 72: xanthomonas hortorum pv. Vitians ( X. hortorum pv. Vitians , LMG 938), 73: X. hyacinthi ( LMG 739), 74: X. melonis , CFBP 4644, 75: Xanthomonas duck pv. Duck ( X. oryzae pv . oryzae , ICMP 3125), 76: Xanthomonas duckwood pv. Duck ( X. oryzae pv . oryzicola , LMG 797), 77: X. perforans ( NCPPB 4321), 78: X. pisi ( ICMP 570), 79: Xanthomonas sakari ( X. sacchari, CFBP 4641), 80: Xanthomonas teicola ( X. theicola , CFBP 4691), 81: Xanthomonas translucense pv. Arhenateri ( X. translucens pv . arrhenatheri , CFBP 2056), 82: Xanthomonas translucens serialis ( X. translucens pv . cerealis , CFBP 2541), 83: Xanthomonas translucense pv. Graminis ( X. translucens pv . graminis , CFBP 2053), 84: xanthomonas translucense pv. Plei ( X. translucens pv . Phlei , CFBP 2062), 85: Xanthomonas translucens pv. Playpratensis ( X. translucens pv . Phleipratensis , ICMP 5744 ), 86: Xanthomonas translucence pv. Pore ( X. translucens pv. Poae , CFBP 2057), 87: Xanthomonas translucens pv. Sepalis ( X. translucens pv . secalis , CFBP 2539), 88: xanthomonas translucence pv. Translucens (X. translucens pv . translucens , CFBP 2054), 89: xanthomonas translucens pv. Underrosa ( X. translucens pv . undulosa , ICMP 5755), 90: Xanthomonas Bashicola pv. Whole Cola ( X. vasicola pv . holcicola , CFBP 2543), 91: X. vesicatoria ( CFBP 2537).

(i) 상기 세균을 트립티케이즈 소이 고체 배양기(Trypticase Soy Agar, TSA)에서 분리한 후, 살균수를 사용하여 현탁액(OD600 =0.1)으로 만들어 2㎕ 사용하거나 (ⅱ) 분리된 세균에서 퀴아진핵산분리장치(Qiagen Genomic DNA purification kit)로 핵산을 분리하여 20ng 사용하거나, (ⅲ) 감염이 의심되는 식물부위에서 병든 부위를 살균수 0.5 mL에 넣어 마쇄한 후, 마쇄액을 에펜돌 튜브에 넣고 가열하여 사용하였다. (i) The bacteria were isolated in Trypticase Soy Agar (TSA), and then made into a suspension (OD 600 = 0.1) using sterilized water and used in 2 l or (ii) 20 ng of nucleic acid is isolated using a Qiagen Genomic DNA purification kit, or (i) crushed the affected area in 0.5 mL of sterile water at the plant site suspected of being infected, and then ground. It was used after heating.

또한, 상기 세균의 중합효소 연쇄반응을 위한 조성물을 제조하였다. 조성물은 Tris HCl 50mM, KCl 20mM, Taq DNA중합효소 2units, dNTP 2.0mM, MgCl2 1.5mM 및 상기 실시예 1에서 제조된 프라이머 각각 20pmol를 포함하여 총 50㎕로 제조하였다. 본 조성물의 성분 및 함량은 하기 표 2와 같다.
In addition, to prepare a composition for the polymerase chain reaction of the bacteria. The composition was prepared in a total of 50 μl, including Tris HCl 50 mM, KCl 20 mM, Taq DNA polymerase 2 units, dNTP 2.0 mM, MgCl 2 1.5 mM and 20 pmol each of the primers prepared in Example 1 above. The components and contents of the composition are shown in Table 2 below.

조성물 내 성분Components in the Composition 농도density Tris HCl(pH 8.3)Tris HCl (pH 8.3) 10 mM10 mM KClKCl 50 mM50 mM dNTPdNTP 0.2 mM0.2 mM Taq DNA 중합효소Taq DNA Polymerase 2 U2 U MgCl2 MgCl 2 1.5 mM1.5 mM 프라이머primer 20 pmol20 pmol DNADNA 20 ng20 ng

<< 실시예Example 3> 3>

중합효소 연쇄반응의 수행Performing Polymerase Chain Reaction

상기 본 발명의 Xan23SF69 및 Xan23SR61 프라이머 쌍의 사탕수수잎마름병균에 대한 특이성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1의 프라이머 쌍 및 상기 실시예 2의 사탕수수잎마름병균 및 잔토모나스 속 미생물 시료 및 조성물을 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다.In order to confirm the specificity for the sugarcane leaf blight bacteria of the Xan23SF69 and Xan23SR61 primer pair of the present invention, the primer pair of Example 1 and the sugarcane leaf blight bacteria of Example 2 and the microorganisms of the genus Xanthomonas Polymerase chain reaction (PCR) was performed.

PCR은 상기 실시예 1의 세균의 핵산 20ng를 첨가하여 수행하였으며, (ⅰ) 95℃에서 60초간 변성(denaturation), (ⅱ) 58℃에서 60초간 프라이머와 대상핵산 결합과정(annealing) 및 (ⅲ) 72℃에서 180초 동안 신장(elongation)하는 과정으로 이루어지는 1 사이클을 30회 반복하여 수행하는 단계 및 (ⅳ) 72℃에서 10분간 추가로 신장하는 단계를 포함하여 수행하였다. PCR was performed by adding 20 ng of the nucleic acid of the bacterium of Example 1, (i) denaturation at 95 ° C. for 60 seconds, (ii) annealing primers and target nucleic acids at 58 ° C. for 60 seconds, and (iii). 1) 30 cycles of one cycle consisting of a process of elongation at 72 ° C. for 180 seconds, and (iii) further elongation at 72 ° C. for 10 minutes.

또한 상기 PCR 산물을 확인하기 위하여 상기 PCR 종료 후 반응액 5㎕을 1.5％ NuSieve:GTG 아가로스 겔 상에 로딩하여 70V 전압으로 전기영동 하였다. 전기 영동한 아가로스 겔을 EtBr로 염색한 후, UV 광선투사기(trans-illuminator)로 조사하여 PCR 산물의 밴드 유무와 그 크기를 확인하였다. In addition, to confirm the PCR product, 5 μl of the reaction solution was loaded on a 1.5% NuSieve: GTG agarose gel after the completion of the PCR, followed by electrophoresis at 70V. The electrophoretic agarose gel was stained with EtBr, and then irradiated with a UV trans-illuminator to confirm the presence or absence of bands and sizes of PCR products.

그 결과, 도 3에서 보듯이, 사탕수수잎마름병균에 대해서만 밴드가 나타났고, 나머지 잔토모나스 속 미생물에서는 밴드가 나타나지 않았다. 이는 본 발명의 프라이머 쌍이 사탕수수잎마름병균의 23S rRNA만을 특이적으로 증폭한다는 결과이며, 다른 잔토모나스 속 미생물에는 특이성이 없음을 나타내는 것이다.
As a result, as shown in Figure 3, the band appeared only for sugar cane blight bacteria, the band did not appear in the remaining Xanthomonas microorganisms. This result shows that the primer pair of the present invention specifically amplifies only 23S rRNA of Sorghum leaf blight bacteria, indicating that there is no specificity in other Xanthomonas microorganisms.

본 발명은 사탕수수잎마름병균 검출용 PCR 프라이머 쌍에 관한 것으로 보다 상세하게는 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 PCR 프라이머 쌍, 상기 프라이머 쌍을 포함하는 사탕수수잎마름병균 검출용 조성물 및 검출용 키트 및 상기 프라이머 쌍을 이용한 사탕수수잎마름병균의 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 쌍은 사탕수수잎마름병균에 특이적인 유전자에 특이적인 서열을 가지므로, 사탕수수잎마름병균의 진단 및 검출에 사용될 수 있다.
The present invention relates to a pair of PCR primers for detecting sugarcane leaf blight bacteria, and more specifically, PCR primer pairs represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and sugarcane comprising the primer pair. The present invention relates to a composition for detecting leaf blight bacteria, a kit for detection and a method for detecting sugarcane leaf blight bacteria using the primer pair. Since the primer pair of the present invention has a sequence specific to a gene specific for sugarcane leaf blight, it can be used for diagnosis and detection of sugarcane leaf blight.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT:RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer set of polymerase chain reaction for detecting Xanthomonas albilineans and method for detecting Xanthomonas albilineans using the same <130> NP10-0049 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Xanthomonas albilineans <400> 1 gcgtggtatc agtgacttcg tctc 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Xanthomonas albilineans <400> 2 cgtacaagca gtaggagctc gt 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Xanthomonas albilineans <400> 3 cgcaccatag tcactgaagc agag 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Xanthomonas albilineans <400> 4 gcatgttcgt catcctcgag ca 22 <110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer set of polymerase chain reaction for detecting Xanthomonas          albilineans and method for detecting Xanthomonas albilineans          using the same <130> NP10-0049 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Xanthomonas albilineans <400> 1 gcgtggtatc agtgacttcg tctc 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Xanthomonas albilineans <400> 2 cgtacaagca gtaggagctc gt 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Xanthomonas albilineans <400> 3 cgcaccatag tcactgaagc agag 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Xanthomonas albilineans <400> 4 gcatgttcgt catcctcgag ca 22

Claims (5)

서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 PCR 프라이머 쌍.
PCR primer pair for detecting Xanthomonas albilineans represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 PCR 프라이머 쌍.
PCR primer pairs for detecting Xanthomonas albilineans represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
제1항 또는 제2항의 프라이머 쌍을 포함하는 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 조성물.
Sugarcane leaf blight ( Xanthomonas albilineans ) composition comprising a primer pair of claim 1 or claim 2.
제1항 또는 제2항의 프라이머 쌍을 포함하는 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas albilineans) 검출용 키트.
Sugarcane leaf blight bacteria comprising the primer pair of claim 1 or 2 ( Xanthomonas albilineans ) kit for detection.
(a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 추출된 DNA를 제1항 또는 제2항의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR로 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계의 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계로 이루어진 사탕수수잎마름병균(Xanthomonas abilineans) 검출 방법. (a) isolating DNA from the sample;
(b) amplifying the DNA extracted in step (a) by PCR using the primer pair of claim 1 or 2; And
(C) sugarcane leaf blight bacterium consisting of confirming the amplified PCR product of step (b) by electrophoresis ( Xanthomonas abilineans ) detection method.
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