KR101413123B1 - Primer set for detecting Xanthomonas oryzae pv. oryzicola and method for detecting using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 벼잎줄무늬병원균의 검출용 프라이머 세트, 이를 이용한 벼잎줄무늬병원균의 검출방법, 이를 포함하는 벼잎줄무늬병원균 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 벼잎줄무늬병원균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있어 벼의 세균병의 감염 여부를 효과적으로 진단할 수 있으므로, 벼줄무늬잎마름병을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있다.The present invention relates to a primer set for detecting a pathogenic fungus of the rye leafy line, a method for detecting a pathogenic fungus of the rye leafy line using the same, and a kit for detecting a pathogenic fungus of the fungus.
By using the primer set according to the present invention, it is possible to quickly and accurately detect the pathogenic fungi of the rye leafy stripe, thereby effectively diagnosing bacterial pathogen infection in rice, and thus contributing to prevention and control of rice blast fungus blight.
Description
본 발명은 벼잎줄무늬병원균의 검출용 프라이머 세트, 이를 이용한 벼잎줄무늬병원균의 검출방법, 이를 포함하는 벼잎줄무늬병원균 검출용 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for detecting a pathogenic fungus of the rye leafy line, a method for detecting a pathogenic fungus of the rye leafy line using the same, and a kit for detecting a pathogenic fungus of the fungus.
벼에 주요 질병을 일으키는 균주로 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae) 속하는 균주들이 있으나, 그 중에서도 벼잎줄무늬병원균(Xanthomonas oryzae pv . oryzicola)과 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv . oryzae)이 널리 알려져 있다.As a strain causing major diseases in rice, Xanthomonas oryzae ), but among them, Xanthomonas oryzae pv . oryzicola ) and rice blight pathogen ( Xanthomonas oryzae pv . oryzae ) are widely known.
상기 벼잎줄무늬병원균은 초기 감염시 엽맥 사이의 유조직 상에서 발견되며 특히, 한낮에 기공이 완전히 열리는 시기에 전염성이 강한 균주이다.The above-mentioned Rice Striped Pathogen is found in the soft tissue between the veins at the time of the initial infection, and is a particularly contagious strain at the time when the pore is completely opened at the daytime.
상기 벼잎줄무늬병원균이 일단, 기공부위에서 증식하게 되면 수분이 높은 밤에는 세포 조직 밖으로 분출되거나, 건조기에는 작은 덩이로 존재하다가 물리적인 작용에 의해 관계수로 낙하하여 편모(鞭毛)에 의해 관계수를 따라 확산되게 된다. Once the pathogenic bacterium of the rye leafy stripe is proliferated in the pore region, it is ejected out of the cell tissue at high moisture at night, or is present as a small droplet in the dryer, and falls down to the related water by physical action, .
상기 벼잎줄무늬병원균은 병 발생 강도에 따라 벼 수확량에 연간 8~17%의 손실을 미치고 있고, 대만, 중국 남부, 아프리카 남서부, 인도에서 주로 발생하지만, 최근 지구 온난화와 함께 그 발생지역이 점차 북상하고 있는 추세이며, 한국 일본과 같은 벼를 재배하는 온대기후 지역도 그 위협에서 점차 가까워지고 있다. 따라서 상기 벼잎줄무늬병원균을 방제할 수 있는 방법뿐만 아니라 신속하게 동정할 수 있는 방법이 절실히 필요한 실정이다.The rice leafy stripe pathogen has a loss of 8 ~ 17% per year in rice yield depending on the severity of the disease, and occurs mainly in Taiwan, southern China, southwestern part of Africa and India. However, , And temperate regions such as rice paddies growing in Korea and Japan are gradually getting closer to the threat. Therefore, there is an urgent need for a method capable of rapidly identifying the pathogenic fungus as well as a method for controlling the fungus.
그러나 현재까지 벼잎줄무늬병원균에 대한 특이적인 살균제는 개발되지 못하고 있으며, 종래 상기 균들을 동정하고 분류하기 위한 방법들은 균의 형태학적, 생화학적, 및 생장 특성에 근거하고 있어 번거롭고 복잡하며 장시간이 소요된다는 등의 문제점들이 지적되어 왔다.However, until now, no specific fungicide against Rice Striped Pathogen has been developed, and the conventional methods for identifying and classifying the fungi are based on the morphological, biochemical, and growth characteristics of the fungus, which is cumbersome, complicated and takes a long time Have been pointed out.
한편 최근에는 병원성 균을 동정하기 위하여 유전자를 표적으로 하는 빠르면서도 보다 간편한 방법들이 점차 많이 사용되고 또 새롭게 개발되고 있는데, 상기 방법에서는 특정 유전자를 대상으로 속 특이적(genus-specific) 혹은 균종 특이적(species-specific) PCR 프라이머나 핵산 프로브 등을 이용하고 있다.In recent years, rapid and simpler methods of targeting genes to identify pathogenic bacteria have been increasingly used and being newly developed. In this method, specific genes (genus-specific or species-specific species-specific PCR primers or nucleic acid probes.
이에 따라 균종 감별의 근거를 제공할 수 있는 잔토모나스 오리재(Xanthomonas oryzae)의 계통을 분석하기 위하여 16S rRNA 또는 그 염기서열을 비교하는 방법이 사용되어 왔다. 특히 상기 방법은 16S rRNA 유전자가 종간에 매우 보존적이면서도 다양성을 가지고 있다는 사실에 근거하지만, 16S rRNA 유전자는 일부 종 간의 염기서열 유사성을 가지고 있기 때문에 균종 감별에 어느 정도의 한계점을 가지고 있다는 문제점이 있다.In this study, we used Xanthomonas oryzae ) has been used to analyze 16S rRNA or its sequence. In particular, although the above method is based on the fact that the 16S rRNA gene is highly conserved among species and has diversity, the 16S rRNA gene has a problem in that it has some limitations in the discrimination of the species because it has the nucleotide sequence similarity of some species .
따라서 상기와 같은 문제점을 해결하여 벼잎줄무늬병의 예찰과 방제에 우선적으로 요구되는 상기 병원균을 정확히 동정하고 진단하는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.Therefore, there is a desperate need to develop a method for accurately identifying and diagnosing the pathogen, which is required for predicting and controlling the rye leafy stripe disease, by solving the above problems.
따라서 본 발명은 벼잎줄무늬병원균을 정확히 동정하고 진단하기 위하여, PCR용 프라이머 세트, 상기 프라미어 세트를 이용한 벼잎줄무늬병원균의 검출 방법 및 상기 프라미어 세트를 포함하는 검출 키트를 제공하고자 한다.Accordingly, the present invention provides a primer set for PCR, a method for detecting a pathogenic bacterium of the rye leaf strip using the primer set, and a detection kit including the primer set, in order to accurately identify and diagnose the pathogenic bacterium of the rye leafy stripe.
본 발명은 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 벼잎줄무늬병원균 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set for detecting a rye leafy stripe pathogen comprising a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 식물체 검체로부터 추출한 DNA를 PCR 증폭하여 증폭산물의 존재여부를 확인하는 단계를 포함하는 벼잎줄무늬병원균의 검출 방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method for detecting a pathogenic bacterium of the rye-leafy line comprising the step of PCR-amplifying DNA extracted from a plant sample using the primer set to confirm the presence or absence of an amplification product.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 벼잎줄무늬병원균 검출용 조성물에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a composition for detecting a rye-striped pathogen comprising the primer set.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 벼잎줄무늬병원균 검출용 키트에 관한 것이다.Further, the present invention relates to a kit for detecting a rye-striped pathogen comprising the primer set.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 벼잎줄무늬병원균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있어 벼의 세균병의 감염 여부를 효과적으로 진단할 수 있으므로, 벼잎줄무늬마름병을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있다.By using the primer set according to the present invention, it is possible to quickly and accurately detect the pathogenic fungi of the rye leafy stripe, thereby effectively diagnosing the bacterial pathogen infection of the rice, thereby contributing to prevention and control of the ryegrass foliage blight.
도 1은 벼잎줄무늬병원균으로부터 Putative membrane protein 유전자의 BLASTN search의 결과이다.
도 2는 pathovar-specific XOC163F/R 프라이머 세트를 사용하여 벼잎줄무늬병원균으로부터 Putative membrane protein 유전자의 PCR증폭에 관한 것이다(Lane M, Size marker (1Kb plus DNA ladder; Gibco BRL TM); 표 1에 Lanes 1-35가 기재됨. Lane 36, 증류수).
도 3은 도 1에서 사용한 프라이머 세트를 이용하여 벼잎줄무늬병원균에 감염된 벼 잎 일부를 멸균수에 침지 후 침지한 물로부터 특이 DNA단편의 검출여부를 real-time PCR로 조사한 결과이다.Figure 1 shows the result of the BLASTN search of the putative membrane protein gene from the rye leafy stripe pathogen.
Figure 2 shows the PCR amplification of the putative membrane protein gene from the Rape Striped Pathogen using a pathovar-specific XOC163F / R primer set (Lane M, Size marker (1Kb plus DNA ladder; Gibco BRL TM ) -35, Lane 36, distilled water).
FIG. 3 is a result of real-time PCR to detect the detection of a specific DNA fragment from water immersed in sterilized water after part of rice leaves infected with a pathogenic fungus of rice leaf stripes using the primer set used in FIG.
본 발명은 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 벼잎줄무늬병원균(Xanthomonas oryzae pv . oryzicola) 검출용 프라이머 세트를 제공한다.The present invention relates to a method for screening for Xanthomonas spp. Comprising a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 oryzae pv . oryzicola ) detection primer set.
서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머는 각각 벼잎줄무늬병원균의 163bp 크기의 핵산 단편을 증폭시키기 위한 정방향(XOC163F) 및 역방향(XOC163R) 프라이머이다.The primers having the nucleic acid sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 are forward (XOC163F) and reverse (XOC163R) primers, respectively, for amplifying a 163 bp nucleic acid fragment of the rye leafy pathogen.
본 발명에 있어서 “프라이머”란 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기증을 하는 짧은 핵산서열을 의미한다.In the present invention, "primer" means a short nucleic acid sequence which can form a base pair with a complementary template and donates as a starting point for template strand radiation.
본 발명자들은 본 발명의 실시예에서 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 blastn 및 blastx 프로그램을 이용하여 벼잎줄무늬병원균을 특이적으로 검출할 수 있는 핵산 서열정보를 탐색하고, 상기 특이 핵산 서열을 검출할 수 있는 프라이머를 제작하였다. 제작한 프라이머 세트를 이용하여 일반 PCR 및 Real-tim PCR 증폭 반응을 수행한 결과, 본 발명에 따른 프라이머 세트가 벼잎줄무늬병원균만(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.The inventors of the present invention have investigated nucleic acid sequence information capable of specifically detecting a rice bark stripe pathogen using GenBank and blastn and blastx programs of NCBI (National Center for Biotechnology Information) A primer that can be detected was prepared. As a result of performing general PCR and real-tim PCR amplification reaction using the prepared primer set, it was confirmed that the primer set according to the present invention can specifically detect only Rice Stripe Pathogen ( Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola ) .
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 벼잎줄무늬병원균을 특이적으로 검출할 수 있으므로, 이를 이용하면 진단하고자 하는 식물체 검체인 벼의 세균병의 감염 여부를 효과적으로 진단할 수 있다.The use of the primer set according to the present invention can specifically detect the pathogenic fungi of the rye leaf, and thus it is possible to effectively diagnose the infection of bacterial diseases of rice plants, which is a specimen of the plant to be diagnosed.
따라서 본 발명은 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 식물체 검체로부터 추출한 DNA를 PCR 증폭하여 증폭산물의 존재여부를 확인하는 단계를 포함하는 벼잎줄무늬병원균의 검출 방법을 제공한다.Therefore, the present invention relates to a method for amplifying a gene product comprising a step of PCR-amplifying a DNA extracted from a plant sample using a primer set consisting of a primer having a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2, A method for detecting pathogens is provided.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 식물체 검체로부터 추출한 DNA를 PCR 증폭시킨 결과 벼잎줄무늬병원균에 특이적인 핵산 증폭산물이 존재하면, 해당 식물체 검체는 벼의 세균병에 감염된 것으로 진단할 수 있다.PCR amplification of DNA extracted from a plant sample using the primer set according to the present invention can be used to diagnose that the plant specimen is infected with a bacterium of rice when the nucleic acid amplification product specific to the rye leafy stripe pathogen is present.
본 발명에 있어서 “식물체 검체”란 벼잎줄무늬병원균의 감염 여부를 확인하고자 하는 대상 식물체를 의미하며, 예를 들어 벼일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the term " plant sample " means a target plant to be inspected for infection with a pathogenic fungus such as rice bran, for example, rice, but is not limited thereto.
식물체 검체로부터 DNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이는 당업자가 적절히 선택 가능하다.The method of extracting DNA from a plant sample can be carried out by a conventional method known in the art, which is appropriately selected by a person skilled in the art.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 PCR 증폭은 통상적인 PCR 증폭 반응을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 PCR 증폭 반응(conventional PCR) 또는 리얼타임 PCR 증폭 반응(real-time PCR)을 이용할 수 있고, 리얼타임 PCR 증폭 반응을 이용하는 경우 실시간으로 정량적인 분석이 가능하다. 컨벤셔널 PCR 증폭 반응은 특정 DNA를 증폭한 후에 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계를 추가로 수행하여야 하는 통상의 PCR 증폭 반응을 의미하며, 상기 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계는 전기영동 등을 통하여 증폭된 DNA 산시물의 크기를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다. 구체적인 PCR 증폭 방법은 당업자에 의해 적절히 선택되어 수행될 수 있다.In one embodiment of the invention, the PCR amplification can utilize conventional PCR amplification reactions, preferably using conventional PCR or real-time PCR amplification , Real-time quantitative analysis is possible using real-time PCR amplification reactions. Conventional PCR amplification reaction refers to a conventional PCR amplification reaction in which a step of amplifying a specific DNA and then confirming whether or not a specific DNA is amplified is further performed, and the step of confirming amplification of the specific DNA is performed by electrophoresis And then measuring the size of the amplified DNA fragments. Specific PCR amplification methods can be suitably selected and carried out by those skilled in the art.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 벼잎줄무늬병원균 검출용 조성물에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a composition for detecting a rye-striped pathogen comprising the primer set.
상기 본 발명의 조성물에는 상기 프라이머 세트를 이용하여 벼잎줄무늬병원균을 검출하는데 필요한 실험과정(예: PCR, 서던 블럿 등) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 반응 혼합물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및/또는 건기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.In the composition of the present invention, various reagents necessary for the confirmation of the results (for example, PCR, Southern blot, etc.) and the results necessary for detecting the rye-striped pathogen using the above primer set, such as PCR reaction mixture, restriction enzyme, Buffer, and buffer solution necessary for rosin, hybridization and / or dry seasoning.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 핵산서열 및 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 벼잎줄무늬병원균 검출용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for detecting a rye-striped pathogen comprising a primer set consisting of a primer having a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2.
본 발명에 따른 검출용 키트는 상기 프라이머 세트 외에도 시료 내에서 벼잎줄무늬병원균을 검출하기 위해 필요한 반응완충용액, 중합효소, dNTP, 안정화제 및 모든 생물학적 또는 화학적 시약, 사용설명서 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트의 다른 구성은 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.
The detection kit according to the present invention may include, in addition to the primer set, a reaction buffer solution, a polymerase, a dNTP, a stabilizer, and any biological or chemical reagents, instructions for use, etc. necessary for detecting a rye leafy pathogen in a sample. Other configurations of such kits may be suitably selected by those skilled in the art.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.
<< 실시예Example >>
1. One. BacterialBacterial strainstrain 과 배양 조건And culture conditions
본 실험에 사용된 Xanthomonas oryzae pv. oryzicola를 포함한 기타 미생물은 벨기에의 the Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (BCCMTM)와 Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea (KACC) 그리고 National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB)에서 분양 받았으며, 이들의 출처는 표 1에 정리하였다. Xanthomonas 균주들은 PSA배지(Peptone: 1%, Sucrose: 1%, Sodium glutamate: 0.1%, Agar: 1.5% : 1L)에서 배양하였다.The Xanthomonas oryzae pv. Other microorganisms, including oryzicola, were sold in the Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms (BCCM TM ), Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea (KACC) and National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB) The sources are summarized in Table 1. Xanthomonas The strains were cultured in PSA medium (Peptone: 1%, Sucrose: 1%, Sodium glutamate: 0.1%, Agar: 1.5%: 1 L).
(LMG, The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCMTM), Belgium; NCPPB, National Collection of Plant Pathogenic Bacteria; KACC, Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea;
(LMG, The Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM TM ), Belgium; NCPPB, National Collection of Plant Pathogenic Bacteria; KACC, Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea;
2. 2. TotalTotal DNADNA 의 추출Extraction of
배양된 균주의 총 DNA는 CTAB 방법으로 추출하였으며, 다른 미생물의 총 DNA는 Qiagen(Hilden, Germany)사의 genomic DNA 추출 키트(Genomic-tips)을 이용하여 추출하였다.
The total DNA of the cultured strains was extracted by CTAB method, and the total DNA of other microorganisms was extracted using genomic-tips kit of Qiagen (Hilden, Germany).
3. 특이 염기서열 정보 탐색을 위한 3. For searching specific sequence information blastnblastn 프로그램 이용 분석 Analysis of program use
Xanthomonas oryzae pv. oryzicola를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트의 제작을 위해 J. Craig Venter Institute (JCVI)의 Genbank(http://www.jcvi.org/)에 등록된 Xanthomonas oryzae pv. oryzicola 유전체 정보 (등록번호: JCVI Locus: XOCORF_3857) 유전체 정보 중 Putative membrane protein 유전자를 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하고 primer를 제작하였다(도 1참조).
Xanthomonas oryzae pv. oryzicola Specifically Xanthomonas < / RTI > oryzae < RTI ID = 0.0 > (http://www.jcvi.org/) registered at the J. Craig Venter Institute (JCVI) pv. oryzicola genome information (registration number: JCVI Locus: XOCORF_3857) Putative membrane protein The genes were confirmed by blastn and blastx programs of National Center for Biotechnology Information (NCBI) and primers were prepared (see Fig. 1).
4. 특이 4. Specific 프라이머primer 제작 making
Xanthomonas oryzae pv. oryzicola 에서 163bp 크기의 단편을 증폭하는 XOC163F 프라이머와 XOC163R 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같다. Xanthomonas oryzae pv. A set of XOC163F primer and XOC163R primer amplifying a 163 bp fragment was prepared from oryzicola. The sequence of the primer is as follows.
XOC163F 프라이머: 5'-GTGT TGAC CCGC GCCC TGTT CTG-3' 19mer(서열번호 1)XC163F primer: 5'-GTGT TGAC CCGC GCCC TGTT CTG-3 '19mer (SEQ ID NO: 1)
XOC163R 프라이머: 5'-CGAC GACG ACGG CAAG TGAG TGAC-3' 20mer(서열번호 2)XOC163R primer: 5'-CGAC GACG ACGG CAAG TGAG TGAC-3 '20mer (SEQ ID NO: 2)
상기 프라이머는 GenBank등록된 각각의 Putative membrane protein gene의 서열정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인 후 제작되었다.
The primers were prepared by confirming the specificity of each putative membrane protein gene sequence registered with GenBank through blastn program.
5. 5. PCRPCR 증폭 반응 Amplification reaction
163bp 크기의 단편을 증폭하는 XOC163F (5'-GTGT TGAC CCGC GCCC TGTT CTG-3') (서열번호 1: 23mer) 와 XOC163R (5'-CGAC GACG ACGG CAAG TGAG TGAC-3') (서열번호 2: 24mer) 프라이머는 JCVI의 Genbank(http://www.jcvi.org/)에 등록된 (JCVI Locus: XOCORF_3857) Putative membrane protein 유전자의 서열정보를 NCBI의 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인 후 제작되었다. (5'-GTGT TGAC CCGC GCCC TGTT CTG-3 ') (SEQ ID NO: 1: 23mer) and XOC163R (5'-CGAC GACG ACGG CAAG TGAG TGAC- 24 mer) primers were constructed after confirming the specificity of the putative membrane protein gene sequence information (JCVI Locus: XOCORF_3857) registered in GenBank (http://www.jcvi.org/) of JCVI through the blastn and blastx programs of NCBI .
PCR 증폭 반응은 PTC-200TM thermocycler(MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 Tris-HCl 20 mM, KCl 100 mM, 50% Glycerol, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween20, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM PMSF, dNTP는 각각 0.2mM, primer는 각각 20pM, Taq polymerase 2unit(SolGent, Deajeon, Repulic of Korea)을 함유하는 PCR 혼합액으로 총 50㎕의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 몇몇 미생물의 genomic DNA 양은 약 50ng이었다. 반응은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃ 60초, 67℃ 30초, 72℃ 60초로 35회 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응한다. 증폭반응 후 10㎕의 PCR 산물을 1.5%농도의 아가로스 젤(agarose gel)에서 전기영동한 후 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 착색시켜 UV transilluminator에서 확인하였다(도 2 참조).
PCR amplification reaction was carried out using a PTC-200 TM thermocycler (MJ research , Watertown, mass), each reaction is Tris-
6. 감염 식물체 6. Infected plants RealReal -- timetime PCRPCR 증폭 반응 Amplification reaction
이병 종자로부터의 real-time PCR 진단 감도를 측정하기 위하여 이병된 벼 잎 일부(약 1cm x 1cm)를 30-40분간 1.0ml 멸균수에 담근 뒤 2ul 샘플 침지액을 취한 다음 real-time PCR을 실시하였다. Real-time PCR 증폭 반응은 CFX96 real-time PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR® Premix Ex Taq™, primer는 각각 5pM을 함유하는 SYBR green PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 몇몇 미생물의 genomic DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 67℃ 30초로 45회 반복시킨 후 65℃에서부터 0.5℃씩 간격으로 10초간 반응 후 증가시키면서 95℃까지 반응시키면서 melting 커브와 melting 피크를 실시하였다. 그 결과 도 3에 나타난 바와 같이 이병된 잎에서 각각의 특이 커브와 피크를 각각 확인하였다. In order to measure the real-time PCR diagnostic sensitivity from the seeds, a part of the rice leaf (about 1 cm x 1 cm) was soaked in 1.0 ml of sterilized water for 30-40 minutes, Respectively. Real-time PCR amplification reaction CFX96 real-time PCR system was performed using (Bio-Rad laboratories, Inc., USA), each reaction is SYBR ® Premix Ex Taq ™, primer is SYBR green PCR containing each 5pM Mixed solution in an amount of 20 쨉 l in total. The amount of genomic DNA of some microorganisms added to the PCR mixture was about 5 ng. The reaction was repeated for 45 seconds at 95 ° C for 5 seconds and at 67 ° C for 30 seconds, followed by reaction at 65 ° C from 0.5 ° C for 10 seconds, followed by a melting curve and a melting peak while increasing the reaction to 95 ° C . As a result, as shown in Fig. 3, specific curves and peaks of each of the individual leaves were confirmed.
도 3은 본 발명의 프라이머 XOC163F와 XOC163R을 사용하여, Xanthomonas oryzae pv. oryzicola에 대하여 real-time PCR 기법을 실시한 후 사진으로, 1 레인은 벼잎줄무늬병원균genomic DNA, 2 레인은 벼잎줄무늬병원균cell suspension, 3 ~ 8 레인은 벼잎줄무늬병원균에 이병된 샘플이며, 9 레인은 벼잎줄무늬병원균에 이병되지 않은 샘플이며, 10 레인은 증류수만 넣은 네가티브 컨트롤이다. 여기에서 보면, 레인 1 ~ 8에서는 각각의 벼잎줄무늬병원균에 해당하는 증폭이 있고, 레인 9 ~ 10에서는 증폭이 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
Fig. 3 is a graph showing the results of Xanthomonas oryzae pv. The results of the real-time PCR method for oryzicola are shown in the photographs. 1 lane is the genomic DNA of the rye leaf stripe pathogen , 2 lane is the rye leaf stripe pathogen cell suspension, 3 ~ 8 lane is the sample attached to the rye leaf stripe pathogen, The sample is uninvolved in the striated pathogen, and the 10 lane is a negative control containing only distilled water. From this, it can be seen that there is amplification corresponding to each of the rye leafy stripe pathogens in
7. 분석 결과7. Analysis Results
(1) 분석 균주별 PCR 증폭 반응(1) PCR amplification reaction by analysis strain
도2에서 알 수 있는 바와 같이, 벼잎줄무늬병원균에서만 163bp 크기의 핵산 단편이 특이적으로 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 또한 도3에서와 같이, 벼잎줄무늬병원균genomic DNA, Cell suspension, 벼잎줄무늬병원균에 감염된 잎에서만 핵산 단편이 특이적으로 증폭된 것을 확인할 수 있었다.As can be seen from FIG. 2, it was confirmed that a nucleic acid fragment of 163 bp in size was specifically amplified only in the ribbed stripe pathogen. Also, as shown in FIG. 3, it was confirmed that the nucleic acid fragment was specifically amplified only in the leaves infected with the genomic DNA, the cell suspension, and the leafy stripe pathogen.
따라서, XOC163F/R 프라이머는 벼잎줄무늬병원균의 특이 DNA 단편만을 증폭시킬 수 있으므로, 벼잎줄무늬병원균의 감염여부 진단을 위한 PCR프라이머로 이용이 가능하다는 것을 알 수 있으며, Putative membrane protein gene의 특이 DNA 단편으로부터 제작된 프라이머 세트는 벼잎줄무늬병원균을 특이적으로 검출할 수 있음이 확인되었다.Therefore, it can be seen that the XOC163F / R primer can amplify only a specific DNA fragment of the rib line-streak pathogen, so that it can be used as a PCR primer for the diagnosis of infection of the rice leaf-striped pathogens. From the specific DNA fragment of the putative membrane protein gene It was confirmed that the prepared primer set can specifically detect the pathogenic fungi of the rye leafy stripe.
<110> Foundation of Agri. Tech. Commercialization & Transfer <120> Primer set for detecting Xanthomonas oryzae pv. oryzicola and method for detecting using the same <130> p120296 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XOC163F primer <400> 1 gtgttgaccc gcgccctgtt ctg 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XOC163R primer <400> 2 cgacgacgac ggcaagtgag tgac 24 <110> Foundation of Agri. Tech. Commercialization & Transfer <120> Primer set for detecting Xanthomonas oryzae pv. oryzicola and method for detecting using the same <130> p120296 <160> 2 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XOC163F primer <400> 1 gtgttgaccc gcgccctgtt ctg 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XOC163R primer <400> 2 cgacgacgac ggcaagtgag tgac 24
Claims (5)
A primer set for detecting a rye leafy pathogen (Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola) comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2.
Comprising the step of PCR-amplifying a DNA extracted from a plant sample using a primer set consisting of a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 to confirm the presence or absence of an amplification product . Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola ).
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