KR20120043369A

KR20120043369A - 초유로부터 분리한 공액리놀레산 생산 균주 및 그 용도

Info

Publication number: KR20120043369A
Application number: KR1020100104645A
Authority: KR
Inventors: 권태호; 유강열; 이보영; 문은경; 김주; 김종욱; 신홍식
Original assignee: 재단법인 전주생물소재연구소; (주)케비젠
Priority date: 2010-10-26
Filing date: 2010-10-26
Publication date: 2012-05-04
Also published as: KR101191893B1

Abstract

본 발명은 초유로부터 분리한 공액리놀레산(Conjugated Linoleic acid)을 생산하는 균주에 관한 것으로, 엔테로코커스 패칼리스 JBMI Ca009 (Enterococcus faecalis JBMI Ca009) 균주를 제공한다. 본 발명의 균주는 공액리놀레산 생산 능력이 우수하며, 산이나 담즙, 열 등에 강한 내성을 지닌 반면, 반코마이신 항생물질에 대해 내성을 가지지 않는다. 본 발명의 균주는 유제품, 분말 및 캡슐제 형태로 제조되어, 식품, 음료, 동물사료, 기능성 식품 및 의약품으로 사용될 수 있다.

Description

초유로부터 분리한 공액리놀레산 생산 균주 및 그 용도{Strain capable of producing conjugated linoleic acid isolated from colostrum and uses thereof}

본 발명은 공액리놀레산(Conjugated Linoleic acid; CLA)을 생산하는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 균주, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 공액리놀레산 생산용 미생물 제제, 기능성 식품, 동물 사료용 조성물과 의약품, 및 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 공액리놀레산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

초유는 포유류에게서 출산 후 3일 이내에 나오는 유즙이다. 초유는 신생아에게 초기 급성 면역 체계의 형성을 도움으로써 신생아의 기회감염 위험을 방어하며, 성장물질을 제공하고 소화관 및 기타 조직의 면역체계를 성숙시킨다. 초유는 성숙유와는 전혀 다른 영양 및 면역 성분을 나타내며, 면역글로불린(immunoglobulin) 및 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokines), 뉴클레오시드(nucleosides), 올리고당(osaccharides), 항균제(antimicrobials), 면역조절인자(immune-regulating factor) 등이 풍부하다.

공액리놀레산은 필수지방산인 리놀레산(linoleic acid: cis-9, cis-12-octadecadienoic acid, LA)의 위치 및 기하 이성체를 총칭하는 것으로, 반추동물의 젖이나 근육에서 미량으로 발견되는 천연 지방산 성분이다.

CLA는 여러 이성체 중 주로 cis-9, trans-11 및 trans-10, cis-12 리놀레산 배열에 공역화 이중결합을 가지는 것을 말하며 특히 cis-9 및 trans-11 부위의 공역화 이중결합으로 인해 인체에 유용한 생리활성을 나타내어 활성형(active form)으로 인정된다.

LA의 이성체의 존재는 오래전부터 알려져 왔으나 CLA가 7,12-디메틸벤즈안트라센(7,12-dimethylbenz(a)antracence)에 의해 유발된 마우스(mouse)의 피부암 발생(skin carcinogenesis)을 억제한다는 사실이 보고 (Ha YL et al. 1987. Carcinogenesis 8: 1881-1887)되면서 새로운 항암성분으로 주목받기 시작하였고, 그 이후 체지방 감소 (PARK YK et al., 1997 Lipids 32: 853-858), 항 당뇨병 효과 (McCarty MF 2000. Medical hypotheses 55: 187-188), 성장촉진 (Chin SF 1992. Journal of food composition and analysis 5: 185-197), 면역증강 (Cook ME et al., 1993. Poultry science 72: 1301-1315), 항산화, 콜레스테롤 조절 및 골밀도 증가 등의 생리적 효과와 연관이 있는 것으로 밝혀져 주목을 받고 있는 생리 활성 물질이다.

이러한 특성으로 인해 공액리놀레산은 기능성 식품 및 의약품의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있는데, 주로 동물성 식품에 함유되어 있으며, 특히 반추동물에 많이 존재하는 것으로 알려져 있다. 쇠고기의 CLA 함량은 2.9?4.3 ㎎ CLA/fat이며, 어린양에서는 5.6 ㎎ CLA/fat이고, 해산물에서는 0.3?0.6 ㎎ CLA/fat의 소량이 존재하며, 유제품에서의 함량은 우유의 경우 5.5 ㎎ CLA/fat, 그리고 치즈에서는 3?7 ㎎ CLA/fat의 양이 확인된다. 인간의 하루 CLA 섭취량은 채식 위주인 동양인의 경우에는 0.1 g/day이고, 육식을 많이 하는 서양인의 경우는 0.4 g/day로 예상되고 있다.

현재까지 CLA의 대량 생산을 위해 여러 가지 방법이 개발되어 왔다. 기존의 방법은 요소부가법, 분자증류법, HPLC 방법 등 CLA를 LA로부터 화학적으로 합성하는 방법들이 있으며, LA를 CLA로 전환시킬 수 있는 활성을 지닌 미생물이 다수 분리된 바 있다. 그러나, 화학적 합성법들은 고가의 장비를 필요로 하거나, 공정에 너무 많은 시간이 소요되는 등의 문제가 많다. 또한 이들 방법은 단일 종류의 CLA 뿐 아니라 다양한 종류의 이성체들을 함께 생성하기 때문에, 기존의 화학적 방법으로 단일 종류의 CLA 이성체만을 생산하는 것은 매우 비효율적이다.

따라서 CLA를 가장 효율적으로 생산할 수 있는 방법은 CLA를 생성할 수 있는 미생물로부터 CLA를 생산, 분리하는 것이다. CLA를 생성하는 것으로 알려진 대표적인 미생물은 락토바실러스(Lactobacillus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 부티리비브리오 피브리솔벤스(Butyrivibrio fibrisolvens) 등의 장내 미생물이며, 많은 국가에서 이들은 가축에게 투여하는 생균제(probiotics), 사료 등의 기능성 식품이나 의약품의 유효성분으로 유용하게 사용되고 있다. 그런데, 국내에서는 최근에야 홍화씨유를 원재료로 한 CLA가 건강기능식품의 기능성 원료로 인정되었다.

따라서 CLA를 식품 및 의약품의 유효성분으로 사용하려면 미생물로부터 CLA를 분리하여 첨가하는 방법보다는, CLA를 생성할 수 있는 미생물의 균체(菌體) 자체를 직접 첨가하여 CLA를 간접적으로 생성하도록 하는 방법을 사용해야 한다.

CLA 생성 미생물이 식품 또는 의약품의 유효성분으로 사용될 수 있기 위해서는, 제조된 제품의 유통기간 중에 미생물이 제품 제조시와 비슷하게 높은 비율로 잔존해야 하며, 사람 등 동물의 체내로 섭취된 후에는 장(腸) 내에서 높은 생존율과 활성을 지녀야 한다.

따라서, 우수한 CLA 생산 능력과 함께, 동물의 체내에서 높은 생존력과 활성을 나타내며, 균체 자체를 식품 및 의약품의 유효성분으로 직접 첨가할 수 있는 균주에 대한 발명은 여전히 과제로 남아있다.

본 발명은 초유로부터 분리한, 공액리놀레산(Conjugated Linoleic acid) 생산능력이 우수한 프로바이오틱스 균주인 엔테로코커스 패칼리스 JBMI Ca009 (Enterococcus faecalis JBMI Ca009) 균주와, 상기 균주를 이용한 유제품, 식품, 음료, 동물사료, 기능성 식품 및 의약품과 그 조성물, 분말 또는 캡슐제 형태로 제조된 생균제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 공액리놀레산(Conjugated Linoleic acid)을 생산하는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 공액리놀레산 생산용 미생물 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 기능성 식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 동물 사료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 의약품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 공액리놀레산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 미생물로부터 생산되는 공액리놀레산은 시스-9와 트랜스-11의 입체구조를 포함하는데, 이들은 기존에 공지된 바와 같이 다양한 생리활성을 가지는 이성체이므로, 이들 구조물을 포함하는 지방산과 아실글리세롤은 각종 동물성 유래의 유제품, 식물 유래의 원료물질에 의한 유제품, 발효식품 및 건강성 기능성식품과 생균제(probiotics) 등의 개발에 광범위하게 이용될 수 있다.

본 발명의 균주는 배양액 혹은 반응액에 분비하면서, 동시에 상당량의 공액리놀레산을 균체 내 축적할 수 있는 특성을 지니므로 생균제뿐 아니라 사균체(死菌體) 형태로도 식?의약품 첨가가 가능하다.

도 1은 초유에서 분리한 본 발명의 균주 콜로니 사진을 보여준다.
도 2는 본 발명의 균주들이 생성하는 지방산을 확인하기 위한 표준 지방산 흡광도측정을 보여준다.
도 3은 본 발명의 균주의 16S rRNA 서열을 보여준다.
도 4는 본 발명의 균주들이 생성하는 지방산을 확인하기 위한 표준 지방산 GC-FID 분석을 보여준다.
도 5는 본 발명의 균주들이 가지는 내산성을 확인한 결과를 보여준다.
도 6은 본 발명의 균주들이 가지는 내담즙성을 확인한 결과를 보여준다.
도 7은 본 발명의 균주들이 가지는 내열성을 확인한 결과를 보여준다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 공액리놀레산(Conjugated Linoleic acid)을 생산하는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 균주를 제공한다.

상기 균주는 인간 초유를 L-시스테인(L-cystein)이 첨가된 Lactobacilli MRS 한천배지에서 혐기적 조건에서 배양하여 분리, 선발하였다. 상기 균주는 내산성, 내담즙성, 내열성 중 하나 이상의 특성을 가지며, 항생제 내성이 없는 것을 특징으로 한다. 상기 항생제는 바람직하게는 반코마이신이나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 균주는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) JBMI Ca009(수탁번호 KACC91590P)이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 공액리놀레산 생산용 미생물 제제를 제공한다. 상기 균주는 바람직하게는 엔테로코커스 패칼리스이며, 더욱 바람직하게는 엔테로코커스 패칼리스 JBMI Ca009이다. 상기 배양액에는 L-시스테인이 첨가된 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 기능성 식품을 제공한다. 상기 균주는 바람직하게는 엔테로코커스 패칼리스이며, 더욱 바람직하게는 엔테로코커스 패칼리스 JBMI Ca009이다. 상기 배양액에는 L-시스테인이 첨가된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 기능성 식품은 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산(folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민 류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 기능성 식품 중, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 동물 사료용 조성물을 제공한다. 상기 균주는 바람직하게는 엔테로코커스 패칼리스이며, 더욱 바람직하게는 엔테로코커스 패칼리스 JBMI Ca009이다. 상기 배양액에는 L-시스테인이 첨가된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 사료용 조성물은 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 의약품을 제공한다. 상기 의약품은 공액리놀레산을 함유하고 있으므로 공액리놀레산에 이해 조절되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 의약품은 항암, 항동맥경화, 항당뇨, 항산화, 체지방 감소, 면역증강, 콜레스테롤 조절 및 면역증강 등의 효과를 가질 수 있다. 상기 균주는 바람직하게는 엔테로코커스 패칼리스이며, 더욱 바람직하게는 엔테로코커스 패칼리스 JBMI Ca009이다. 상기 배양액에는 L-시스테인이 첨가된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 의약품의 투여량 또는 섭취량은 60?130 uM(Cancer Epidemiol. Biol. Prev. 2000. 9:689-696), 그리고 기능성 식품의 투여량 또는 섭취량은 3.4?6 g/day(J. Nutr. 2000. 130:2943-2948)인 것이 바람직하나, 필요에 따라 가감할 수 있다. 본 발명의 의약품은 섭취량에 관계없이 체내에 안전하게 흡수된다. 투여량 또는 섭취량은 의약품에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 의약품은 인체에 투약하는 경우, 화학적으로 합성된 CLA 함유 식품 및 의약품에 비해 부작용의 우려가 없다.

본 발명의 식품 또는 의약품은 상기 유효성분 이외에도 약제학적 또는 식품에서 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제제화할 수 있다. 약제학적 또는 식품에서 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로, 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라, 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 의약품의 제제 형태는 과립제, 산제, 과립제, 피복정, 정제, 캡슐제, 탕제, 엑기스제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 캡슐제는 피복물질(coating material)과, 피복되는 내부의 핵물질(core material)로 이루어진다. 본 발명의 캡슐제에서 핵물질은 본 발명의 균주와 리놀레산을 함께 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 캡슐제에서 핵물질을 둘러싸는 피복물질은 흡수성, 분산성, 점착성이 우수한 수용성 다당류를 사용한다.

본 발명에서 사용가능한 수용성 다당류는 전분, 한천, 카라기난, 알긴산, 알긴산나트륨(sodium alginate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetacrylate), 소맥단백, 대두단백을 비롯하여, 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 하이드록시프로필셀룰로오스(hydroxylpropylcellulose), 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 (hydroxyl-propylmethylcellulose) 등의 셀룰로오스 유도체, 잔탄검(xanthan gum), 아라비아검(arabic gum), 로커스트콩검(locust bean gum), 구아검(guar gum), 타마린드검(tamarind gum), 타라검(Tara gum), 카라야검(karaya gum), 트라가칸검(tragacanth gum), 가티검(ghatti gum) 등의 검류, 그리고 젤란(gellan), 잔탄(xanthan), 펙틴(LM, HM type), 덱스트란(dextran), 글루칸(glucan), 글루코만난(glucomannan), 아라비노갈락탄(arabino galactan), 퍼셀레란(furcelleran), 풀루란(pullulan), 글루코사민(glucosamine), 젤라틴(gelatin), 카제인(casein) 중 선택된 하나 이상이 될 수 있다.

본 발명의 캡슐제 제조시 코팅물질의 양은 용도 및 목적에 따라 그 양을 적절하게 가감할 수 있으며, 핵을 기준으로 하여 일반적으로 사용되는 범위인 1~80 중량% 범위의 양으로 사용하는 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 캡슐제는 필요에 따라 유화제, 보호제 및 가소제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 캡슐제의 제조 방법은 통상적으로 사용되는 캡슐화 방법 중 적절한 방법을 택하여 사용할 수 있다. 본 발명의 캡슐제를 포함하는 조성물은 구체적으로 유제품(우유, 두유, 가공우유), 발효유(액상 요구르트, 호상 요구르트), 발효성식품(김치류, 장류), 가축용 사료, 건강보조식품 등이 될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 공액리놀레산을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 균주는 바람직하게는 엔테로코커스 패칼리스이며, 더욱 바람직하게는 엔테로코커스 패칼리스 JBMI Ca009이다. 상기 배양에는 배양액에 L-시스테인이 첨가된 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 본 발명을 위한 CLA 생산 기능을 갖는 유산균 검색

1) 본 발명의 유산균 분리

본 발명의 유산균을 분리하기 위해 건강한 20대 초반 여성의 초유로부터 유산균을 분리하였다.

CLA를 생성하는 유산균을 분리하기 위해 균질화된 초유 1㎖를 취하여 0.85 % 염화나트륨(sodium chloride)이 첨가된 멸균한 생리 식염수를 이용하여 십진 희석법으로 희석 후 L-시스테인(L-cystein, Sigma)이 0.05% 첨가된 유산균(Lactobacilli MRS, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 한천배지(1.5% 아가, w/v)에 200 μL씩 골고루 도말하였다. 장내 유산균의 성장에 적합한 조건으로 맞춰주기 위해 혐기적 조건은 Gas Pack pouch를 사용하고 통성 혐기적 조건은 파라필름으로 감싼 후 37℃ 배양기에서 48시간 배양하여 CLA 생산 후보 유산균의 독립 콜로니 59종을 분리하였다. 그 결과 도 1과 같은 콜로니를 형성하였고, 혐기적 조건과 통성 혐기적 조건에서 각각 유산균을 분리하였다. 분리된 혐기적 유산균 48종과 통성 혐기적 유산균 11종을 선발하였다.

2) 16S rRNA 염기서열 분석을 이용한 동정

본 발명의 CLA 생산 후보 유산균을 분자생물학적 방법으로 16S rRNA 염기서열 분석을 이용하여 동정을 수행하였다.

DNA 분리는 배양된 균체에서 Wizard Genomic DNA Prep. kit(GeneAll Biotechnology, Korea)를 사용하여 염색체 DNA를 분리하였으며, 16S rDNA를 증폭시키기 위하여 정방향 프라이머(27F) : (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3': 서열번호 2)와 역방향 프라이머(1492R) : (5'-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3' 서열번호 3)를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였다. PCR 반응산물을 2% 아가로즈겔에 전기영동을 실시하여 확인하였으며, 유전자 배열결정성을 좋게 하기 위하여 GeneAllR Gel SV kit(GeneAll Biotechnology, Korea)를 사용하여 정제한 후 서열분석에 사용하였다. DNA의 서열분석은 자동 염기서열 분석기(ABI 3130)를 이용하여 증폭된 PCR 산물들의 염기서열을 박테리아의 16S rRNA 27F, 1492R 프라이머를 이용하여 분석하였다. DNA 염기서열의 상동성 분석은 NCBI BLASTN 온라인 프로그램 (http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast/)을 이용하여 수행하였으며 엔테로코커스 패칼리스와 100% 상동성을 나타내었다.

실시예 2: 본 발명의 CLA 생산 유산균 선별

본 발명을 위해 리노레익산(LA)이 첨가된 배지에서 성장하는 유산균 59종을 1차적으로 선발하고 이들 유산균 중 CLA 생산 능력이 우수한 균을 선별하였다.

각 균주는 MRS 고체배지에서 2회 계대배양 후 10㎖ 시험관에 독립 콜로니를 접종하여 전배양 하고, 전배양액은 0.05 % (w/v) LA가 첨가된 MRS 액체배지 100 ㎖에 110⁹ CFU/㎖ 수준으로 1/100 (v/v) 접종 후 37℃ 배양기에서 48시간 배양하였다.

배양액은 7000g으로 10분간 원심분리한 후 상등액과 균체를 분리, 각각의 상등액을 회수하여 2 배의 2-프로판올(2-propanol)과 1.5 배의 헥산(Hexane)으로 추출한 후 233 nm에서 흡광도를 측정하여 CLA 생성량을 분석하였다.

본 발명의 균주들이 생성하는 지방산을 확인하기 위한 표준 지방산 흡광도를 측정하여(도 2), 그에 따른 CLA 표준검량곡선에 의해 CLA 생성 능력이 우수한 JBMI Ca009를 선별하였으며, 본 발명의 균주의 16S rRNA 염기서열은 도 3과 같다(서열번호 1).

실시예 3: 가스크로마토그래피를 이용한 CLA 생산 확인

본 실험에서는 흡광도 233nm에서 CLA 생성량이 확인된 유산균을 가스크로마토그래피를 이용하여 재확인하였다.

GC 분석을 위해 각 균주는 LA(500 ㎍/㎖)가 포함된 배지에서 48시간 동안 배양한 후 원심분리하였다. 배양액은 상등액과 균체를 분리, 각각의 상등액을 회수하여 2 배의 2-프로판올(2-propanol)을 첨가하여 격렬히 혼합한 후, 여기에 1.5 배의 헥산(Hexane)을 가하여 3분 동안 흔들어 주면서 혼합, 추출하였다.

본 발명에서 각각의 시료에 함유된 CLA 함량은 불꽃이온화검출기(FID dector)가 장착된 가스크로마토그래피(Hewlett Packard 5890 Series Ⅱ GC)를 사용하였고, 컬럼(HP FFAP capillary column)의 길이 30 m, 내경 0.25 μm, 필름 두께 0.25 μm의 모세관 컬럼을 사용하였다. 컬럼을 GC에 장착한 후 GC의 오븐온도는 210℃, 검출기의 온도는 270℃로 하였고, 주입부(injector)의 온도는 250℃로 하였다. 운반용 기체는 헬륨(1㎖/min)을 사용하였으며 1 ㎖/min의 유속으로 용출시켰고, 분해비 (split ratio)는 50:1로 하였다. 시료 주입량은 2 ㎕이고 각 피크의 면적은 기기에 연결된 적분계(3395, Hewlett Packard)를 이용하여 구하였다.

CLA의 동정은 표준 물질의 머무름 시간과 비교하여 확인하였으며, CLA의 함량은 표준 물질의 면적과 CLA의 면적비에 의해 분석시료로 사용하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

실시예 4: 엔테로코커스 패칼리스 ( Enterococcus faecalis ) JBMI - Ca009 의 내산 성, 내담즙성 , 내열성, 장 점막 점착성 및 항생제 내성 실험

본 실험에서는 본 발명의 균주가 내산성 및 내담즙성이 강하며, 장 점막 점착성이 우수하면서도 항생제 내성이 없는 프로바이오틱으로서 기능을 할 수 있는지 확인하였다.

1) 내산성 실험

내산성 시험은 산성 pH에 대한 내성을 실험하였다. 산성 pH에 대한 내성은 식염수(saline)를 염산(HCl)으로 pH2.5로 조정한 산성 용액을 사용하였다. L-시스테인이 첨가된 MRS broth에서 37℃, 24시간 배양한 균주를 원심분리(10,000 rpm, 5min)하여 회수한 다음 산성 용액 및 MRS broth를 각각 첨가하여 현탁한 후 37℃, 200 rpm, 2시간을 진탕배양 하였다. 이후 생균수를 측정하여 산성 용액 내성을 아무것도 처리하지 않은 균주인 대조군과 비교하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 그 결과 JBMI Ca009는 단순 산성 용액에는 내산성을 지닌 것으로 나타났다. 산성 용액 처리 후 생존율은 JBMI Ca009는 53.5%로 나타났으며, 비교적 우수한 내산성을 나타내었다.

2) 내담즙성 실험

내담즙성 시험은 담즙(bile)을 0%, 0.5%, 5% 농도별로 MRS broth에 각각 첨가하여 멸균 후 인공 담즙으로 사용하였다. L-시스테인이 첨가된 MRS broth에서 37℃, 24시간 배양한 균주를 원심분리(10,000 rpm, 5min)하여 회수한 다음 인공 담즙을 각각 첨가하여 현탁한 후 37℃, 24시간 배양하였다. 배양 후 생균수를 측정하여 아무것도 처리하지 않은 균주인 대조군과 인공 담즙에 대한 내성을 비교하였고, 그 결과는 도 6에 표시하였다. 결과는 JBMI Ca009는 담즙산 0.5% 용액에서는 81.0%, 담즙산 5% 용액에서는 80.7%의 생존율을 나타냈다. 본 발명의 균주는 담즙산에 대한 내성은 우수하다고 판단하였다.

3) 내열성 실험

L-시스테인이 첨가된 MRS broth를 이용하여 37℃, 24시간 배양하여 1X10⁹ CFU/㎖이 되도록 배양한 후 1㎖의 균주를 원심분리(10,000 rpm, 5min)하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체는 새로운 MRS broth 동량에 현탁하여 80℃, 5분 동안 heating block에서 가열하고 잔열을 없애기 위해 바로 얼음으로 냉각시켰다. 열처리한 균액 1 ㎖을 L-시스테인이 첨가된 MRS 아가(agar)에 도말하여 37℃, 24시간 동안 배양하고 콜로니 존재 여부를 확인하였다. 대조군으로서 열처리하지 않은 균주의 생균수를 확인하여 열처리 전후 차이를 비교하여 도 7에 나타내었다. 본 균주 JBMI Ca009는 40.2%의 생존율을 보였다. 1.0×10⁹ CFU/㎖의 균주가 일반적인 음료의 살균 조건인 80℃, 5분의 열처리에서 40% 이상의 생존율을 나타내었다. 이는 열처리나 기타 가공과정 중에 발생할 수 있는 열에 대한 내성을 가질 수 있음을 나타내는 것으로 상업적으로 유용하게 쓰일 수 있음을 의미한다.

4) 장 점막 점착성 실험

장 점막에 대한 점착성은 결장 점액(colon mucin)을 이용하여 실험하였다. 결장 점액을 제조하기 위해서 실험쥐(SD-rat)의 대장 내벽을 적출한 후 PBS로 3회 세척하였다. 내벽은 슬라이드 글라스로 긁어 점막층을 회수하였고, 회수한 점막층은 클로로포름:메탄올(Chloroform:methanol)=2:1(v/v)에 현탁한 후 원심분리(1,500xg, 10min, 4℃)하여 탈지하여 2회 반복하였다. 디에틸 에테르(diethyl ether)로 재차 탈지하였으며 2회 반복하였다. 탈지 점막층은 6M 구아니딘-HCl(guanidine-HCl) 용액을 가하여 37℃, 4시간, 200rpm으로 반응시켜 점액을 추출하고 상기조건으로 원심분리하여 상층액만 취했다. 상층액은 PBS로 4℃, 24시간 동안 투석한 후 동결건조하였다(colonic mucin: CM). 배양한 유산균은 균체를 회수하여 2M 구아니딘-HCl에 상기 조건으로 반응시켜 균체 표면 단백질을 추출하였다. 원심분리하여 상층액을 얻어 PBS로 4℃, 24시간 동안 투석한 후 동결건조 하였다(bacterial protein: BP). BP를 2 mg/㎖로 용해하고, N-히드록시숙신이미도비오틴(N-hydroxysuccinimidobiotin)을 80 μg/㎖이 되도록 첨가하여 상온 암실에서 2시간 동안 방치하였다. 이후 반응용액을 PBS로 4℃, 24시간 동안 투석하여 비오틴이 부착된 BP(iotinylated BP: BBP)를 제조하였다. 제조한 BBP는 소혈청알부민을 표준물질로 하여 Micro BCA protein assay kit로 단백질 함량을 측정하였다. 미세적정판(Microtiter plate)의 각 웰(well)에 RM 용액(50 μg/㎖ in sodium carbonate/bicarbonte buffer, pH9.6) 50 ㎕를 분주하고, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 플레이트(plate) 표면에 점액을 부착시켰다. 플레이트를 PBST(PBS-0.05% Tween20)로 3회 세척한 후, 차단액(blocking buffer: 1% BSA in PBST) 100 ㎕를 분주하고 상온에서 2시간 동안 방치하였다. PBST로 4회 세척한 후 BBP 용액 50 ㎕를 분주하여 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 각 웰(well)을 PBST로 3회 세척한 후 1,000배 희석한 스트렙타비딘(streptavidin) HRP 50 ㎕씩 넣어 상온에서 1시간 동안 방치했다. PBST로 7회 세척한 후 TMB 기질액(substrate solution) 100 ㎕씩 넣고 상온에서 10분 방치하여 발색시키고, 3% H₃PO₄ 용액 50 ㎕를 넣어 반응을 정지시켰다. 발색 정도는 미세적정판(Microtiter plate) reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결합친화력(binding affinity)은 450nm에서의 흡광도이며, 상대 결합친화력(relative binding affinity)은 흡광도와 처리한 유산균 단백질 농도를 곱한 비율이며 결과는 표 1과 같다. PC로서 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG KCTC 5033과 비교했을 때, 3배 이상의 높은 점착성을 보였다.

장 점막 부착성 평가

	결합친화력(binding affinity) (O.D. at 450nm)	상대 결합친화력(Relative binding affinity)
JBMI Ca009	1.464 ± 0.023	0.095 ± 0.002
PC	0.738 ± 0.031	0.030 ± 0.001

5) 항생제 내성

0.05% L-시스테인이 첨가된 MRS 한천 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에 반코마이신(vancomycin)을 저농도에서 고농도까지 처리하여 OD₆₀₀ 0.3까지 배양한 유용 균주를 접종하였다. 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하여 유용 균주의 성장 유무를 관찰하여 반코마이신 감수성 검사를 실시하였다. 대조구는 항생제를 처리하지 않은 JBMI Ca009이며, 본 결과는 표 2에 나타내었다. 본 균주는 반코마이신에 내성을 나타내지 않아 엔테로코커스(Enterococcus )속 균주의 상업적 활용에 용이할 것으로 사료된다.

반코마이신(vancomycin)에 대한 내성 평가

	대조구	반코마이신(vancomycin)
	대조구	1 μg/㎖	10 μg/㎖	25 μg/㎖	32 μg/㎖	50 μg/㎖	100 μg/㎖
JBMI Ca009	+	+	-	-	-	-	-

농업생명공학연구원

KACC91590

20101012

<110> JEONJU BIOMATERIALS INSTITUTE; CHEBIGEN INC. <120> Strain capable of producing conjugated linoleic acid isolated from colostrum and uses thereof <130> PN10210 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1118 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 1 gggaggggcc taatctgcag tcgacgcttc tttcctccga gtgcttgcac tcaattggaa 60 agaggagtgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaaccta cccatcagag ggggataaca 120 cttggaaaca ggtgctaata ccgcataaca gtttatgccg catggcataa gagtgaaagg 180 cgctttcggg tgtcgctgat ggatggaccc gcggtgcatt agctagttgg tgaggtaacg 240 gctcaccaag gccacgatgc atagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga 300 gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttcggcaat ggacgaaagt 360 ctgaccgagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga tcgtaaaact ctgttgttag 420 agaagaacaa ggacgttagt aactgaacgt cccctgacgg tatctaacca gaaagccacg 480 gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttatt 540 gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg 600 gggagggtca ttggaaactg ggagacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccatgtg 660 tagcggtgaa atgcgtagat atatggagga acaccagtgg cgaaggcggc tctctggtct 720 gtaactgacg ctgaggctcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780 cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgttg gagggtttcc gcccttcagt gctgcagcaa 840 acgcattaag cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac 900 gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg gtttaattcg aagcaacgcg aagaaccctt 960 accaggtctt gacatccttt gaccactcta gagatagagc ttttcccttc ggggacaaag 1020 tgacagggtg gtgcatggtt tgtcgtcagc ctcgtgttcg gtgaagaatg tttggggtta 1080 aagtccccgc aaacggaggc ggcaacccct tatttggt 1118 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 3 tacggttacc ttgttacgac tt 22

Claims

공액리놀레산(Conjugated Linoleic acid)을 생산하는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 균주.
제1항에 있어서, 엔테로코커스 패칼리스 JBMI Ca009(수탁번호 KACC91590P)인것을 특징으로 하는 엔테로코커스 패칼리스 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 인간 초유에서 분리된 것을 특징으로 하는 엔테로코커스 패칼리스 균주.
제1항에 있어서, 내산성, 내담즙성, 내열성 중 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 엔테로코커스 패칼리스 균주.
제1항에 있어서, 항생제 내성이 없는 것을 특징으로 하는 엔테로코커스 패칼리스 균주.
제1항의 엔테로코커스 패칼리스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 공액리놀레산 생산용 미생물 제제.
제1항의 엔테로코커스 패칼리스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 기능성 식품.
제1항의 엔테로코커스 패칼리스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 동물 사료용 조성물.
제1항의 엔테로코커스 패칼리스 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 의약품.
제1항의 엔테로코커스 패칼리스 균주를 배양하는 단계를 포함하는 공액리놀레산을 생산하는 방법.