KR20120041194A

KR20120041194A - 배추과 작물의 세포질웅성불임성 판별용 마커 및 그를 이용한 판별 방법

Info

Publication number: KR20120041194A
Application number: KR1020120039148A
Authority: KR
Inventors: 신동영; 노일섭; 박종인; 이인호
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2012-04-16
Filing date: 2012-04-16
Publication date: 2012-04-30

Abstract

본 발명은 배추과 작물에서 세포질웅성불임성 여부 및 이의 유형을 판별하기 위한 마커, 상기 마커를 이용하여 배추과 작물에서 세포질웅성불임성 여부 및 그의 유형을 판별하는 방법, 및 상기 마커를 포함하는 배추과 작물에서 세포질웅성불임성 여부 및 이의 유형을 판별하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명에 의하여 세포질웅성불임성 여부를 판별하기 위한 육종의 연한을 단축시키고 육종 비용을 절감할 수 있으며 복제 불가능한 1대 잡종을 육성하여 품종을 자체적으로 보호할 수 있고, 이를 통한 수출을 통해 경제적으로 이득을 얻을 수 있다.

Description

배추과 작물의 세포질웅성불임성 판별용 마커 및 그를 이용한 판별 방법 {Markers for discriminating cytoplasmic male sterility in Brassica sp. and discriminating method using the markers}

본 발명은 배추과 작물에서 세포질웅성불임성(cytoplasmic male sterility; CMS)을 판별하기 위한 마커 및 그를 이용한 세포질웅성불임성 판별 방법, 그를 포함하는 세포질웅성불임성 판별용 키트에 관한 것이다.

생명공학 기술의 발달로 생물체의 유용한 특성을 이해하고 이용하려는 시도가 계속되고 있다. 최근 인간 유전체의 연구 및 의학 기술의 발달로 인간의 수명이 늘어났으며 이로 인하여 식량문제나 환경문제 등이 발생하였다. 이를 해결하기 위한 방편의 하나로 농업에 생명과학 기술을 접목하려는 노력이 행해지고 있다. 즉 식물 유전체 연구를 통한 분자 육종 기술의 발전으로 수확량을 늘리거나, 병 저항성 작물의 개발로 농약 사용을 감소시키는 방법 등을 통하여 환경을 보호하려는 시도가 행해지고 있다. 이러한 결과의 하나로 벼나 배추 등 주요 작물에 대한 분자 유전자 지도가 작성되었으며, 병충해에 저항성을 가지는 형질 전환 작물을 개발하거나 양파, 무, 고추 등 주요 작물에 대하여 마커를 이용한 선발법을 확립하려는 연구가 시행되고 있다.

배추과 작물은 십자화과에 속하는 서늘한 기후에서 자라는 저온성 채소로서 우리나라에서 김치의 주원료로 사용되는 매우 중요한 작물 중의 하나이다. 최근에는 일본을 비롯한 외국으로 수출하는 주된 산업의 하나로 성장하고 있으며 김치뿐 아니라 배추의 종자 수출도 확대되고 있어 그 중요성이 더욱 부각되고 있다.

식물에서 잡종강세현상을 이용한 1대 잡종 품종 육성은 오래전부터 계속되어 왔다. 1대 잡종 종자 채종방법으로는 인공교배, 자가불화합성, 자웅이주, 웅성불임성 등이 있으며 배추과 작물에는 자가불화합성이 있다는 사실이 오래전부터 알려져 왔다. 자가불화합성이란 같은 꽃이나 같은 그루의 다른 꽃 화분이 수분하여도 여러 가지 이유로 수정하지 않는 현상을 말하는데, 우리나라를 비롯하여 전 세계적으로 배추의 자가불화합성을 이용한 1대 잡종 품종이 1960년대부터 널리 보급되었다.

자가불화합성을 이용하는 경우 몇 가지 한계점이 있는데 자성배우체의 증식 문제, 환경의 영향을 쉽게 받는다는 점, 및 순수한 잡종 획득이 어렵다는 점 등이 있다. 우리나라의 배추 1대 잡종 채종 비용이 중국이나 동남아의 저개발 국가에 비하여 3배 이상 비싸기 때문에 많은 회사들이 배추의 1대 잡종 채종을 중국이나 동남아 등 다른 나라에서 행하고 있는 것이 현실이다. 또한 1대 잡종 채종을 위하여 양친 원종을 채종 대행업체나 농민에게 양도하였을 경우에 원종의 일부를 업체나 농민이 부당하게 가져다 증식하여 자기가 육성한 품종인 양 종자를 판매하는 품종복사현상이 나타나서 종자회사의 피해가 심각하다. 즉 자가불화합성을 이용한 1대 잡종 채종은 웅성불임성을 이용한 1대 잡종 채종에 비하여 시간, 노력 및 경제성 등에서 어려운 점이 많기 때문에 웅성불임을 개발하고 육종에 이용하기 위한 연구가 계속되고 있다.

웅성불임성이란 화분, 꽃밥, 수술 등의 웅성 기관에 이상이 생겨 불임이 생기는 현상으로 배추를 비롯한 여러 식물에서 이러한 현상을 보이고 있다. 웅성불임성에는 유전적 원인에 의한 것과 환경의 영향에 의한 것이 있는데, 대부분의 육종에 쓰이는 웅성 불임계통은 유전적 원인에 의한 웅성불임 계통이다. 유전적인 원인에 의한 웅성불임은 크게 3가지 유형으로 나눌 수 있는데, 핵유전자 웅성불임성(genic male sterility; GMS), 세포질 웅성불임성(cytoplasmic male sterility; CMS) 및 세포질-핵유전자 웅성불임성(cytoplasmic-genic male sterility; CGMS)으로 나뉜다.

핵유전자 웅성불임성이란 핵 내 유전자에 의해 웅성불임성이 생기는 것을 말하는데 주로 열성 유전을 하며 열성 동형인 경우에 불임성을 나타낸다. 그러므로 이를 이용하여 1대 잡종 종자를 생산하는 경우 약 50% 정도만 불임주를 얻을 수 있다. 따라서 웅성 불임계를 유지하거나 증식하기 위해서는 각 개체들을 개화 시켜서 화분의 생성 유무를 확인해야 하는 과정이 필요하기 때문에 많은 노력과 비용이 발생되는 문제가 있으며 꽃이 작아서 임성의 판별이 힘들거나 꽃이 필 때까지 긴 시간이 소용되는 작물에서는 적용하기 힘들다는 문제가 있다.

배추의 경우 재래종을 2 내지 3세대 자가수정 시키면 웅성불임개체가 가끔 나타난다. 그러나 많은 경우가 단인자 열성에 의해 지배되는 핵유전자 웅성불임성이기 때문에 후대에서 100% 웅성불임성 개체가 나올 수 없으므로 1대 잡종 채종에 이용하지 못하고 있다. 그러므로 후대에서 100% 웅성불임 개체가 얻어질 수 있는 세포질웅성불임성이 필요하다.

세포질 웅성불임성은 세포질 요인에 의해 미토콘드리아가 정상적인 기능을 수행하지 못하여 비정상적인 화분을 생성함으로써 자가수정 능력을 갖지 못하는 현상을 말한다. 세포질 웅성불임성은 모계유전이므로 어느 가임계를 교배하더라도 100% 불임주가 나오기 때문에 웅성 불임계의 유지가 쉽고 품종을 자체적으로 보호할 수 있으며, 잎이나 줄기와 같이 영양기관을 이용하는 작물에 적용하기 편리한 특성이 있다. 그러므로 잡종종자 생산에 세포질 웅성불임성을 이용하려는 시도가 계속되고 있으며 이를 위하여 식물체의 세포질 웅성불임성에 대한 분자 수준의 연구가 진행되어 왔다.

그 결과 세포질 웅성불임성을 일으키는 세포질 요인이 많이 밝혀졌다. 현재 십자화가 작물에서 세포질 웅성불임성을 가지는 계통으로 배추속에서는 폴리마(Polima), 오구라(Ogura), 나푸스(Napus), 아난드(Anand), SNU3, 사코 등이 알려져 있고, 무 속(Raphanus sp.)에서는 오구라(Ogura), 코세나(Kosena) 등이 알려져 있다. 이들 계통들은 모두 세포질 내의 미토콘드리아 유전자의 구조적 변형 또는 새로운 오픈 리딩 프레임(Open reading frame; ORF)의 생성으로 인하여 세포질 웅성불임성을 일으키는 것으로 보고되었다.

한편, 인도 국립 유채 및 겨자 연구 센터의 연구팀은 인도 겨자에서 나타나는 세포질웅성불임성 시스템의 분석을 수행하였으며 그 결과를 'Plant Breeding'에 게재하였다. 화기 특성을 기본으로 세포질웅성불임성 시스템들을 분류한 결과 시이포리아(Siifolia), 투어네포르티(tournefortii), 트라키스토마(trachystoma) 세포질웅성불임성 계통은 좁은 꽃잎을 가지나 모리칸디아(moricandia), 오구라(ogura), 옥시리나(oxyrrhina) 계통은 넓은 꽃잎을 가지는 등 육안으로 관찰이 가능한 것으로 나타났다. 또한 옥시리나의 경우는 수술이 암술보다 길고, 모리칸디아의 경우는 수술과 암술의 길이가 같으며, 오구라, 시이포리아, 투어네포르티, 트라키스토마 계통의 경우는 수술이 암술보다 짧은 것으로 구분되었다. 이들은 저마다의 개화 개시나 초장, 최초 분지, 장각 당 종자수, 종자 생산량, 기름 및 단백질 함량 등이 유지친의 특성과 동등하였으나, 일반적으로 화기 노화와 성숙은 각각의 유지친 계통들에 비해서 웅성불임 계통들이 다소 더 빨리 나타나는 경향이 있다고 설명하였다.

중국의 Huazhong 대학 유채육종연구센터의 연구팀은 유채에서 핵유전자 웅성불임성 유전자에 연관된 증폭단편길이다형성(amplified fragment length polymorphism; AFLP) 마커를 개발한 연구 결과를 'Plant Breeding'지 8월호에 발표했다. 중국의 유채 생산량 증가에 있어서, 잡종 품종에 의한 종자 생산에 적용되는 잡종강세 효과의 상업적 이용은 대단히 중요한 요건으로 인식되고 있는데, 여기에는 잡종 종자 생산을 위한 체계적인 시스템이 요구된다. 9012AB라는 유채 계통은 열성 상위 유전자적 웅성불임성(recessive epistatic genic male sterility, REGMS)인 두 가지 타입의 계통인데, 이 불임성이 두 쌍의 열성 중복 불임 유전자들(recessive duplicate sterile genes)인 ms1과 ms2가 한 쌍의 열성 상위 저해 유전자(recessive epistatic inhibitor gene)인 rf 유전자와 상호작용을 함으로써 조절된다고 알려져 있으며, rf 유전자좌에서의 동형접합형은 동형접합체인 ms1ms1ms2ms2 식물체에서의 열성 웅성불임성의 발현을 저해하는 것으로 알려져 있다. 연구진은 B.napus 웅성불임성 계통 9012AB의 웅성불임/가임 유전자좌 중 하나에 연관된 마커를 개발하기 위해 본 연구를 진행하게 되었고, 동형접합의 두가지 타입 계통인 9012AB에서 웅성 불임성 식물체로부터 DNA pool BS(Sterile Bulk)를, 가임성 식물체로부터 DNA pool BF(Fertile Bulk)를 준비하여 증폭단편길이다형성 분석을 수행했다. 총 256 조합의 프라이머가 사용되었고, 그 결과 한 개의 열성 웅성 불임 유전자(ms)에 매우 밀접하게 연관된 7개의 마커가 확인되었는데, 그들 중 여섯 개의 마커들이 시험 집단내의 목적 유전자와 동일한 분리를 보였으며, 나머지 한 개의 마커는 4.3cM 정도의 거리로 떨어져 있음이 확인되었다. 연구진은 이와 같은 연구를 통해 확보된 마커들이 중국의 유채 생산에 있어서 특히 잡종 종자 생산을 위한 열성 핵유전자 웅성불임성의 활용을 더욱 고무시킬 것이라고 설명하였다.

중국 저장 대학 채소과학원 세포분자생물학 연구팀은 배추의 웅성불임성에 관여하는 BcMF15 유전자의 특성을 연구한 결과를 'Molecular Biologyh Reports'지 최신호에 게재했다. 자가불화합성의 문제점을 극복할 수 있는 방법 중 하나인 웅성불임성의 요인으로, 정상 웅성 배우체 혹은 화분모세포의 형성과 발달에 관여하는 몇가지 주요 기전과 성숙한 화분이 주두까지 이동하는 과정, 그리고 발아와 화분관 신장 과정 등이 관여하는 것으로 알려지고 있다. 이러한 웅성 배우체의 재분화 발달 과정에 있어서 주요 현상들은 잘 알려져 있는 반면, 그 과정의 분자적 기전은 아직까지도 명확하게 밝혀진 바가 적다. 또한 배추에서의 화분 발달 과정에는 매우 많은 유전자들이 관여하는 것으로 알려져 그 이해가 쉽지 않은 문제가 있다. 그동안 상기 연구팀은 정상 배추와 돌연변이 배추와의 주요 유전자 발현 양상을 비교 분석한 기존의 연구를 통해 화분 발달에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 유추되는 CYP86MF, BcMF2, BcMF3와 같은 몇 가지 유전자를 보고한 바 있다. 이러한 유전자들은 호르몬 조절, 신호전달, 물질대사, 세포벽, 전사조절인자 등과 관련이 있는 것으로 확인된 바 있었다. 본 연구를 통해서 상기 연구팀은 정상 배추 품종과 화분모세포 세포질분열 돌연변이(male meiotic cytokinesis; MMC) 배추에서의 전사체 프로파일을 기초로 cDNA-증폭단편길이다형성 분석을 수행하였다. 그 결과, 화분모세포 세포질분열 돌연변이 배추에서 여러 다양한 유전자들의 발현 변화를 확인할 수 있었으며, 정상 배추의 화아에만 특이적으로 축적되어있는 전사체 단편을 동정하여 전체 cDNA와 DNA를 증폭시켰다. 그리고, BcMF15(GenBank accession number EF600901)로 명명된 이 유전자에 대한 생물정보학적 분석을 통해 이 유전자가 103 아미노산으로 이루어진 단백질을 코딩하는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 지방 운송 단백질 유사 유전자(lipid transfer protein-like gene)와 88%의 상동성을 갖는다. 또한, N-종결부위에 신호전달 펩타이드를 갖는 막 단백질을 코딩할 가능성도 유추되어지는데, 화분 발달에 관여하는 중요한 몇가지 단백질들에 존재하는 AAI 도메인, 신호전달 펩타이드 도메인, 막내재 도메인(transmembrane domain), vWF 도메인, ZnF_C4 도메인 및 Tryp_alpha_amyl 도메인의 여섯 가지 도메인이 존재한다. RT-PCR을 통한 유전자 발현 양상을 분석해본 결과, BcMF15 유전자는 가임계통에서만 특이적으로 발현하는 것으로 확인되었으며, 이것으로 이 유전자가 웅성불임성에 관여함을 알 수 있었다. 십자화과에서의 원연관계 분석 결과는 BcMF15 유전자가 진화 과정에서 상당히 보존적임을 말해주고 있으며, 상기 연구팀은 이러한 결과들을 바탕으로 BcMF15 유전자가 식물 소포자 세포 발달 과정에서 막이동과 신호전달에 있어서 매우 중요한 분자임을 확인할 수 있었다고 설명하고 있다.

1차종인 배추의 경우 1979년 Williams가 무의 오구라 세포질웅성불임성을 여러 경로를 통해 배추에 옮겨온 오구라 세포질웅성불임성을 발표한 바 있다. Ohkawa는 뉴질랜드의 야생순무(B. campestris ssp. rapifera)와 일본배추(B. campestris)를 교잡한 후대에서 배추의 세포질 웅성불임성을 획득하였다. 미국 코넬대학의 Earl 등은 세포융합으로 저온에서도 황화현상이 나타나지 않는 브로콜리의 오구라 세포질웅성불임성 계통을 육성하였고, 이를 배추와 다시 세포융합하여 저온에서도 역시 황화현상이 나타나지 않는 배추의 오구라 세포질 웅성불임성 계통을 육성하였다. Vetmy는 유채의 폴리마 세포질웅성불임성에 배추의 5개 품종을 여교잡하여 배추의 폴리마 세포질웅성불임성 계통을 육성하였다. 일본의 Hirata는 배추류의 소송채에 양배추의 루비볼을 기내에서 접목하고 키메라 식물을 얻었는데 이 식물에 소송채를 교잡한 후대에서 세포질웅성불임성을 발견하였다.

또한 아직 유전기작이 명확히 밝혀지지는 않았으나 배추와 팍초이에서 새로운 웅성불임성이 발견되어 있으며, 이들의 일부를 이용한 1대 잡종 조합능이 현재 검정되고 있는데 잡종강세현상이 유지친과 동일하게 나타나고 있다. 만약 이의 유전기작이 세포질웅성불임성으로 밝혀진다면 배추 1대 잡종 채종에 있어 산업적, 경제적으로 큰 업적이 될 것이며, 비록 핵유전자 웅성불임성으로 밝혀진다 하여도 그 유전자와 관련된 마커를 개발한다면 1대 잡종 채종에 이용할 수 있을 것이다.

배추과 작물을 포함한 식용 작물에서 식물체의 세포질웅성가임과 세포질웅성불임을 올바르게 판단하는 것은 육종 시스템에 있어 매우 중요하다. 즉 세포질웅성불임성 관련 미토콘드리아 및 엽록체의 게놈구조를 밝히고 유전기작을 해석하며 마커를 개발하는 것은 국내 품종 뿐 아니라 해외 수출용 품종 개발에 있어 매우 중요한 일일 것이다.

이에 본 발명자들은 복제 불가능한 1대 잡종을 육성하여 품종을 보호하고 종자를 수출하여 산업적, 경제적 효과를 거두기 위하여 세포질웅성불임성 종류별로 특이적인 마커를 개발하고자 하였다. 그 결과 배추에서 세포질웅성불임성과 웅성가임의 구분 특이적인 마커 및 세포질웅성불임성 종류별로 특이적인 마커를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 하나의 목적은 기존의 자가불화합성이나 핵유전자 웅성불임성을 이용하여 일대 잡종 종자를 생산하는 경우 나타나는 문제점인 100% 웅성불임개체를 얻을 수 없고 품종복사가 성행하는 문제, 웅성불임여부를 판별하기까지 많은 시간과 비용이 발생하는 문제 및 작물의 종류에 따라 적용여부가 달라진다는 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 배추과 작물에서 세포질웅성불임성과 웅성가임을 구분하기 위한 특이적 마커와 세포질웅성불임성 종류별로 특이적인 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 배추과 작물에서 상기 마커를 이용하여 세포질웅성불임성을 판별하거나 세포질웅성불임성을 종류별로 판별하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 배추과 작물에서 상기 마커를 이용하여 세포질웅성불임 여부를 판별하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 배추과 작물에서 세포질웅성불임성을 판별하기 위한 마커를 제공한다.

본 발명자들은 배추과 작물에서 세포질웅성불임성 종류별 특이적인 마커를 개발하기 위하여 배추과 작물에서 세포질웅성불임성을 나타내는 식물, 바람직하게는 배추의 세포질웅성불임성 및 웅성가임성 유전자 56종을 국내 대학, 연구소 및 종묘회사로부터 수집하였다. 이들 수집된 유전자들을 판별하기 위하여 미토콘드리아 영역 내 유전자로부터 50여종의 프라이머를 제작하고, 배추과 작물로부터 추출한 DNA를 중합효소연쇄반응시켜 증폭시킨 후 전기영동으로 그 크기를 비교하였다. 그 결과, 상기 제작된 프라이머 중에서 본 발명의 특정 프라이머만이 배추과 작물에서 세포질웅성불임성 및 웅성가임성을 구분하거나 세포질웅성불임성 유전자형을 특이적으로 구분하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 구체적으로 서열번호 1 내지 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 중에서 어느 하나 이상 선택되는 배추과 작물의 세포질웅성불임성 판별용 마커를 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 배추과 작물의 세포질웅성불임성 판별용 마커를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 세포질웅성불임 또는 세포질웅성불임성은 세포질 내의 미토콘드리아가 유전적 요인에 의해 정상적인 기능을 수행하지 못하여 비정상적인 화분을 생성함으로써 자가수정 능력을 갖지 못하는 현상을 말한다. 따라서 세포질웅성불임성의 배추과 작물은 모계유전에 의하여 어느 가임계를 교배하더라도 100% 불임주가 생성되고 이로부터 유지친의 특성과 동등한 특성을 가지는 종자를 생성할 수 있다. 이와 반대로 세포질웅성가임 또는 세포질웅성가임성(이하에서는, 편의상 웅성가임 또는 웅성가임성이라 함)은 세포질 내의 미토콘드리아가 정상적인 기능을 수행하여 정상적인 화분을 생성하고 자가수정 능력을 갖는 현상을 말하는데, 이러한 웅성가임성 배추과 작물은 유지친의 특성과 다른 특성을 가지는 종자가 생산되어 종자 산업에서 바람직하지 않다.

상기 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 중의 어느 하나 이상의 프라이머, 바람직하게는 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트, 또는 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트에 의하여 배추과 작물에서 세포질웅성불임성과 웅성가임을 현저하게 판별할 수 있다. 본원에서 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 편의상 BramsA로 명명하며, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 편의상 BramsB1로 명명하며, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 편의상 BramsB2로 명명한다.

또한, 상기 서열번호 7 내지 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 중의 어느 하나 이상의 프라이머, 바람직하게는 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트, 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트에 의하여 배추과 작물에서 세포질웅성불임성과 웅성가임을 현저하게 판별할 수 있으며, 특히 세포질웅성불임성의 유형 중 폴리마(polima) 유형의 세포질웅성불임성을 현저하게 판별할 수 있다. 본원에서 상기 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 편의상 BramsE로 명명하며, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 편의상 BramsF로 명명하며, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 편의상 BramsH2로 명명한다.

또한, 상기 서열번호 13 및/또는 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머, 바람직하게는 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트에 의하여 배추과 작물에서 세포질웅성불임성과 웅성가임을 현저하게 판별할 수 있으며, 특히 세포질웅성불임성의 유형 중 유사 오구라(ogura like) 유형의 세포질웅성불임성을 현저하게 판별할 수 있다. 본원에서 상기 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 편의상 BramsC로 명명한다.

또한, 상기 서열번호 15 및/또는 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머, 바람직하게는 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트에 의하여 배추과 작물에서 세포질웅성불임성과 웅성가임을 현저하게 판별할 수 있으며, 특히 세포질웅성불임성의 유형 중 SNU3 유형의 세포질웅성불임성을 현저하게 판별할 수 있다. 본원에서 상기 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 편의상 BramsK2로 명명한다.

상기 SNU3 유형의 세포질웅성불임성은 배추과 작물의 엽록체 matK 유전자에서 염기서열의 다형성을 많이 보이는 부분으로 본 발명자들에 의하여 발견되고 대한민국 특허출원 제10-2009-0133575호로 출원되었다. 따라서 상기 특허출원은 본 발명의 일부분으로서 인용 및 참조될 것이다.

또한, 상기 서열번호 17 및/또는 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머, 바람직하게는 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트에 의하여 배추과 작물에서 세포질웅성불임성과 웅성가임을 현저하게 판별할 수 있으며, 특히 세포질웅성불임성의 유형 중 사코(Saco) 유형의 세포질웅성불임성을 현저하게 판별할 수 있다. 본원에서 상기 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 편의상 BramsH1으로 명명한다.

본 발명의 상기 마커에 의하여 배추과 작물에서 세포질웅성불임성 또는 세포질웅성가임성인지 여부를 판별할 수 있으며, 또한 세포질웅성불임성인 경우 어떠한 유형의 세포질웅성불임성인지 판별할 수 있으므로 배추과 작물의 육종 산업에 매우 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

다른 하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 상기 마커를 이용하여 배추과 작물에서 세포질웅성불임성 여부를 판별하기 위한 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 배추과 작물로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 상기 프라이머를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 전기영동에 의해 확인한 후 분석하는 단계를 포함하는 배추과 작물의 세포질웅성불임성 판별 방법을 제공한다.

본 발명에서, 배추과 작물은 세포질웅성불임성 또는 웅성가임성 유전자를 보유하고 있는 배추과에 속하는 작물로서, 이로 제한하는 것은 아니지만, 배추, 갓, 무, 배무채, 양배추, 브로콜리, 유채 등을 포함한다.

본 발명에서, 배추과 작물로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 식물로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 사용함으로써 실시할 수 있다. 하나의 구체적 예로서, 배추과 작물의 종자를 파종하고 출아한 후 어린 식물체의 잎 또는 줄기로부터 게놈 DNA를 채취하고 분리한다.

본 발명에서 배추과 작물 세포질웅성불임성을 판별하기 위하여 사용하는 마커는 본 발명자에 의하여 개발된 마커이다. 구체적으로, 본 발명의 마커는 서열번호 1 내지 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함한다. 보다 바람직하게는 상기 마커는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함한다.

본 발명의 배추과 작물의 세포질웅성불임성 판별 방법에서 게놈 DNA의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적인 PCR 수행 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 구체적으로, PCR 반응은 당업계에서 PCR 반응에 필요하다고 알려진 여러 성분을 포함하는 PCR 반응액을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 PCR 반응액은 분석하고자 하는 배추과 작물로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커, 적당량의 DNA 중합효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충용액(buffer) 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 함유할 수 있다.

상기 증폭된 산물은 전기영동에 의해 확인한다. 본 발명에서 전기영동시 사용하는 겔은 통상적으로 전기영동에서 사용할 수 있는 겔을 사용할 수 있다. 이의 예로는, 아가로스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔이 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver straining) 등에 의하여 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 이러한 일반적인 전기영동 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 배추과 작물의 세포질웅성불임성 판별 방법에서, 상기 증폭된 산물을 전기영동으로 확인한 후, 조합된 밴드들의 분석을 통하여 배추과 작물의 세포질웅성불임성 또는 웅성가임성을 구분할 수 있고, 세포질웅성불임성인 경우 그 유형, 즉 폴리마 유형, 유사 오구라 유형, SNU3 유형, 및 사코 유형을 구분할 수 있다. 하나의 구체적 실시에서, 본 발명자들은 국내외 수집한 배추과 작물의 약 64종을 대상으로 세포질웅성불임성 여부 및 이의 유형을 확인하였다. 그 결과, 하기 표 1 및 2에서 볼 수 있듯이, 다수의 종에서 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 BramsC 마커를 이용하여 중합효소연쇄반응 한 경우 439bp의 DNA 밴드가 나타났다. 이로부터 다수의 세포질웅성불임성이 유사 오구라 유형 세포질웅성불임성임을 알 수 있다(실시예 8 참조).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 상기 프라이머 세트 중 하나 이상을 포함하는 배추과 작물의 세포질웅성불임성 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 상기 키트는 본 발명의 상기 프라이머 세트 이외에 상술한 DNA 중합 효소 및 PCR 완충용액(buffer)을 더 포함할 수 있다. 이외에도 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있도록 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 상기 키트에 추가로 포함될 수 있다.

본 발명에 의하여 세포질웅성불임성 여부를 판별하기 위한 육종의 연한을 단축시키고 육종 비용을 절감할 수 있으며 복제 불가능한 1대 잡종을 육성하여 품종을 자체적으로 보호할 수 있고, 이를 통한 수출을 통해 경제적으로 이득을 얻을 수 있다. 또한 이를 판별하기 위한 키트를 제공함으로써 따로 프라이머를 제작하고 확인하는 번거로움, 기타 실험 재료를 구입하려는 수고, 기타 실험 재료를 제조하는 노력 및 시간을 덜 수 있으며 확인하려는 세포질웅성불임성 종류에 따라 손쉽게 특이적 세포질웅성불임성 여부를 확인할 수 있다.

도 1은 세포질웅성불임성과 웅성가임을 구분하기 위해 미토콘드리아 영역에서 합성한 BramsA를 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 후 아가로즈 겔에서 확인한 결과를 나타낸 것이다. M은 100bp DNA ladder, 레인1은 웅성가임1, 레인2는 SNU2 세포질웅성불임성, 레인3은 SNU1 세포질웅성불임성, 레인4는 SNU3 세포질웅성불임성, 레인5는 오구라 세포질웅성불임성, 레인6은 사코 세포질웅성불임성, 레인7은 웅성가임2를 나타낸다.
도 2는 세포질웅성불임성과 웅성가임을 구분하기 위해 미토콘드리아 영역에서 합성한 BramsB1을 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 후 아가로즈 겔에서 확인한 결과를 나타낸 것이다. M은 100bp DNA ladder, 레인1은 웅성가임1, 레인2는 SNU2 세포질웅성불임성, 레인3은 SNU1 세포질웅성불임성, 레인4는 SNU3 세포질웅성불임성, 레인5는 오구라 세포질웅성불임성, 레인6은 사코 세포질웅성불임성, 레인7은 웅성가임2를 나타낸다.
도 3은 세포질웅성불임성과 웅성가임을 구분하기 위해 미토콘드리아 영역에서 합성한 BramsB2를 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 후 아가로즈 겔에서 확인한 결과를 나타낸 것이다. M은 100bp DNA ladder, 레인1은 웅성가임1, 레인2는 SNU2 세포질웅성불임성, 레인3은 SNU1 세포질웅성불임성, 레인4는 SNU3 세포질웅성불임성, 레인5는 오구라 세포질웅성불임성, 레인6은 사코 세포질웅성불임성, 레인7은 웅성가임2를 나타낸다.
도 4는 BramsA를 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과 나온 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 BramsB1을 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과 나온 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 나타낸다.
도 6은 BramsB2를 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과 나온 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 나타낸다.
도 7은 폴리마 유형 세포질웅성불임성을 판별하기 위해 미토콘드리아 영역에서 합성한 BramsE를 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 후 아가로즈 겔에서 확인한 결과를 나타낸 것이다. M은 100bp DNA ladder, 레인1은 웅성가임1, 레인2는 SNU2 세포질웅성불임성, 레인3은 SNU1 세포질웅성불임성, 레인4는 SNU3 세포질웅성불임성, 레인5는 오구라 세포질웅성불임성, 레인6은 사코 세포질웅성불임성, 레인7은 웅성가임2를 나타낸다.
도 8은 폴리마 유형 세포질웅성불임성을 판별하기 위해 미토콘드리아 영역에서 합성한 BramsF를 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 후 아가로즈 겔에서 확인한 결과를 나타낸 것이다. M은 100bp DNA ladder, 레인1은 웅성가임1, 레인2는 SNU2 세포질웅성불임성, 레인3은 SNU1 세포질웅성불임성, 레인4는 SNU3 세포질웅성불임성, 레인5는 오구라 세포질웅성불임성, 레인6은 사코 세포질웅성불임성, 레인7은 웅성가임2를 나타낸다.
도 9는 폴리마 유형 세포질웅성불임성을 판별하기 위해 미토콘드리아 영역에서 합성한 BramsH2를 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 후 아가로즈 겔에서 확인한 결과를 나타낸 것이다. M은 100bp DNA ladder, 레인1은 웅성가임1, 레인2는 SNU2 세포질웅성불임성, 레인3은 SNU1 세포질웅성불임성, 레인4는 SNU3 세포질웅성불임성, 레인5는 오구라 세포질웅성불임성, 레인6은 사코 세포질웅성불임성, 레인7은 웅성가임2를 나타낸다.
도 10은 BramsE를 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과 나온 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 나타낸다.
도 11은 BramsF를 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과 나온 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 나타낸다.
도 12는 BramsH2를 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과 나온 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 나타낸다.
도 13은 유사 오구라 유형 세포질웅성불임성을 판별하기 위해 미토콘드리아 영역에서 합성한 BramsC를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 후 아가로스 겔에서 확인한 결과를 나타낸 것이다. M은 100bp DNA ladder, 레인1은 웅성가임1, 레인2는 SNU2 세포질웅성불임성, 레인3은 SNU1 세포질웅성불임성, 레인4는 SNU3 세포질웅성불임성, 레인5는 오구라 세포질웅성불임성, 레인6은 사코 세포질웅성불임성, 레인7은 웅성가임2를 나타낸다.
도 14는 BramsC를 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과 나온 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 나타낸다.
도 15는 사코 세포질웅성불임성을 판별하기 위해 미토콘드리아 영역에서 합성한 마커 BramsH1을 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 후 아가로스 겔에서 확인한 결과를 나타낸 것이다. M은 100bp DNA ladder, 레인1은 웅성가임1, 레인2는 SNU2 세포질웅성불임성, 레인3은 SNU1 세포질웅성불임성, 레인4는 SNU3 세포질웅성불임성, 레인5는 오구라 세포질웅성불임성, 레인6은 사코 세포질웅성불임성, 레인7은 웅성가임2를 나타낸다.
도 16은 BramsH1을 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과 나온 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 나타낸다.
도 17은 배추 엽록체 matK(maturase K) 유전자의 염기서열 분석 및 아미노산 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 SNU3 세포질웅성불임성을 판별하기 위해 엽록체 영역에서 합성한 BramsK2를 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 후 아가로스 겔에서 확인한 결과를 나타낸 것이다. M은 100bp DNA ladder, 레인1은 웅성가임1, 레인2는 SNU2 세포질웅성불임성, 레인3은 SNU1 세포질웅성불임성, 레인4는 SNU3 세포질웅성불임성, 레인5는 오구라 세포질웅성불임성, 레인6은 사코 세포질웅성불임성을 나타낸다.
도 19는 BramsK2를 프라이머로 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과 나온 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 나타낸다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상을 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 식물재료 및 DNA 추출

1-1. 식물재료의 수집

본 발명자들은 배추과 작물에서 세포질웅성불임성(CMS) 종류별 특이적인 마커를 개발하기 위하여 세포질웅성불임성(CMS) 종류별 배추과 작물을 국내 대학, 연구소 및 종묘회사에서 총 64종 수집하였다.

1-2. DNA 추출

상기 수집된 세포질웅성불임성(CMS) 모본들의 DNA 추출은 QIAGEN(미국)사의 DNeasy Plant Mini Kit을 이용하여 수행하였다. 상기 모본들의 엽조직에서 표본을 0.1g 계량하여 2ml 튜브에 넣은 후, 이 튜브를 액체 질소에 반 정도 담근 후 막대를 이용하여 가루가 될 때까지 분쇄하였다. 분쇄된 식물 잎이 들어 있는 2ml 튜브에 Buffer AP1을 400㎕ 넣은 후 RNaseA를 4㎕ 넣고 5번 정도 vortex하였다. 그 후 65℃의 워터 배쓰(water bath)에서 10분간 두는데, 이 때 3분 간격으로 상기 튜브를 위아래로 뒤집어 내용물이 잘 섞이게 하였다. 그 후 Buffer AP2를 130㎕ 넣고 섞어준 후 5분간 얼음에 둔 후 14,000rpm의 속도로 5분간 원심분리기를 돌렸다. 원심분리기를 돌린 후 상층의 맑은 부분을 QIAshredder Mini spin column의 2㎖ 튜브에 넣고 14,000rpm의 속도로 2분간 원심분리기를 돌렸다. 원심분리기를 돌린 후 QIAshredder Mini spin column의 윗부분을 버리고 걸러진 액을 새로운 2㎖ 튜브에 넣고 Buffer AP3/E를 걸러진 액의 부피의 1.5배 중량으로 넣은 후 부드럽게 피펫팅하여 섞어주었다. 그 후 DNeasy Mini spin column에 650㎕를 넣고 8,000rpm의 속도로 1분간 원심분리기를 돌린 후 밑부분의 용액을 버렸다. 그 후 상기 과정에서 튜브에 650㎕넣고 남은 용액을 다시 DNeasy Mini spin column에 넣었다. 8,000rpm의 속도로 1분간 원심 분리한 후 밑부분의 용액을 버리고 새로운 2㎖ collection tube에 끼워 넣은 후 Buffer AW를 500㎕넣고, 8,000rpm의 속도로 1분간 원심분리 하였다. Collection tube를 분리한 후 밑부분의 용액을 버리고 다시 Buffer AW를 500㎕ 넣고 14,000rpm의 속도로 2분간 원심분리 하였다. 윗부분의 용액을 새로운 1.5㎖ 튜브에 넣고 Buffer AE for elution을 100㎕ 넣고 실온에 5분간 방치한 후, 8,000rpm의 속도로 1분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 다시 Buffer AE for elution을 100㎕ 넣고 6분간 실온에 방치 후 8,000rpm의 속도로 1분간 원심분리기를 돌렸다. 원심분리가 끝나면 윗부분의 용액을 버리고 뚜껑을 닫은 후 냉장고에 보관하였다.

실시예 2: 중합효소연쇄반응 수행

2-1. 프라이머 제작

세포질웅성불임성(CMS)과 웅성가임(MF)을 구분하거나 세포질웅성불임성(CMS)종류별 구분 마커를 개발하기 위하여 미토콘드리아 및 엽록체 영역에서 특이적 부분을 찾기 위하여 기존에 발표되어 있는 유전자를 NCBI에서 검색하였다. 유전자의 전체 염기서열을 수집하기 위해 Entrez program을 사용하였다. 검색방법으로는 유전자명 orf220, orf222, orf224, atpA, orf305/324, orf138, orf256, matK 를 검색어로 선정하였다. 수집된 각각의 유전자 가운데, 배추속 식물인 배추 등의 염기서열을 선발, 염기서열의 다형성을 많이 보이는 부분을 BLAST program으로 찾은 뒤 이들 염기서열의 특징적인 프라이머를 합성하였다.

2-2. 중합효소연쇄반응 수행

상기 실시예 1-2에서 추출한 DNA를 증폭시키기 위하여 중합효소연쇄반응 방법을 사용하였으며 Perkin-elmer사의 PE-9700을 이용하여 실험을 수행하였다. 상기 실험은 94℃에서 2분간 초기 변성(pre-denaturation)시킨 후, 94℃에서 1분간 단일가닥으로 변성(denaturation)시키고, 50℃에서 1분간 결합시킨(annealing) 후 72℃에서 2분간 35회 연장(extension)을 수행하였다. 후기 연장(Post-extension)은 72℃에서 2분간 수행하였다. 중합효소 연쇄반응을 위한 반응용액은 10x reaction buffer(500mM KCl, 100mM Tris-HCl, PH 8.3, 15mM MgCl₂) 2.5㎕, 2.5mM dNTP 2㎕, Genomic DNA 50ng, 100pM 프라이머 0.1㎕, 0.5unit Taq 폴리머라제 0.25㎕ 및 멸균수를 이용하여 총 부피가 25㎕이 되도록 조성하였다.

2-3. DNA 확인

상기 실시예 2-2의 중합효소연쇄반응을 이용하여 증폭시킨 DNA를 확인하기 위하여 1.3% 아가로스 겔을 사용하였다. 250ml 삼각 플라스크에 6.5g의 아가로스를 넣은 후 TAE(Tris Acetate EDTA) buffer 50ml을 넣고 잘 섞어주었다. 전자렌지에 1분간 돌려 아가로스를 잘 녹인 후 60℃ 정도가 되도록 식혀주었다. 10mg/ml의 EtBr(ethidium bromide)을 2.5㎕ 넣어 최종 농도가 0.5㎍/ml이 되도록 하였다. 플라스크의 내용물을 잘 섞어준 후 주형에 넣고 콤(comb)을 끼워 굳혔다. 전기영동 장치에 1X TAE를 넣은 후 굳힌 겔을 넣고 콤을 제거하였다. 제일 왼쪽 웰(well)에 100bp DNA ladder를 2.5㎕ 로딩하고 다른 샘플들의 경우는 로딩 다이(loading dye) 2㎕와 DNA 10㎕을 잘 섞어준 후 각 웰에 10㎕씩 로딩하였다. 파워 서플라이를 이용하여 100V에서 20분간 전기영동한 후 자외선 조사기(UV transilluminator)를 이용하여 확인하였다.

2-4. DNA 염기서열의 분석

염기서열의 분석을 위해 중합효소연쇄반응 후 아가로스 겔을 이용하여 중합효소연쇄반응 산물을 확인한 다음, 특이적인 마커로 선발된 각 유전자의 중합효소연쇄반응 산물을 정제한 후 pGEM-T Easy 벡터(Promega, USA)를 사용하여 결합시켰다. 결합 산물은 E. coli DH5α에 형질전환시켰으며, IPTG와 X-gal을 포함한 LB 아가 배지에 배양하였다. 플라스미드(Plasmid) 추출은 Plamid Miniprep Kit(TaKaRa, Japan)를 사용하였으며, 염기서열은 솔젠트사에 의뢰하여 분석하였으며, MacDNAsis (Hitachi software, Calif, USA)와 BLASTN 프로그램(NCBI)을 이용하여 결정하였다.

실시예 3: 세포질웅성불임성과 웅성가임의 구분 특이적 마커 개발

상기 실시예 2-1에서 제작된 프라이머로 상기 실시예 1-1에서 수집한 배추과 작물인 배추 세포질웅성불임성(CMS) 및 웅성가임(MF)을 증폭시켜 비교한 결과, 세포질웅성불임성이 웅성가임과 확연하게 구별되는 프라이머를 선택하여 이를 BramsA, BramsB1, 및 BramsB2로 명명하였다.

상기 BramsA를 프라이머로 이용하여 웅성가임1(MF1), 웅성가임2(MF2), SNU1 세포질웅성불임성, SNU2 세포질웅성불임성, SNU3 세포질웅성불임성, 오구라 세포질웅성불임성 및 사코 세포질웅성불임성 DNA에 대하여 상기의 방법으로 중합효소연쇄반응을 수행한 후 1.3% 아가로스 겔에서 전기영동으로 분리 후 자외선 조사기를 사용하여 확인한 결과를 도 1에 나타내었다. 실험 결과 웅성가임1과 웅성가임2에서는 343bp의 산물이 증폭되었으며 세포질웅성불임성(SNU1 세포질웅성불임성, SNU2 세포질웅성불임성, SNU3 세포질웅성불임성, 오구라 세포질웅성불임성 및 사코 세포질웅성불임성)에서는 704bp의 산물이 증폭되어 세포질웅성불임성과 웅성가임을 구분할 수 있었다. 상기 중합효소연쇄반응 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 BramsB1을 프라이머로 이용하여 웅성가임1(MF1), 웅성가임2(MF2), SNU1 세포질웅성불임성, SNU2 세포질웅성불임성, SNU3 세포질웅성불임성, 오구라 세포질웅성불임성 및 사코 세포질웅성불임성 DNA에 대하여 상기의 방법으로 중합효소연쇄반응을 수행한 후 1.3% 아가로스 겔에서 전기영동으로 분리 후 자외선 조사기를 사용하여 확인한 결과를 도 2에 나타내었다. 실험 결과 웅성가임1과 웅성가임2에서는 411bp의 산물이 증폭되었으며 세포질웅성불임성(SNU1 세포질웅성불임성, SNU2 세포질웅성불임성, SNU3 세포질웅성불임성, 오구라 세포질웅성불임성 및 사코 세포질웅성불임성)에서는 468bp의 산물이 증폭되어 세포질웅성불임성과 웅성가임을 구분할 수 있었다. 상기 중합효소연쇄반응 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 도 5에 나타내었다.

상기 BramsB2를 프라이머로 이용하여 웅성가임1(MF1), 웅성가임2(MF2), SNU1 세포질웅성불임성, SNU2 세포질웅성불임성, SNU3 세포질웅성불임성, 오구라 세포질웅성불임성 및 사코 세포질웅성불임성 DNA에 대하여 상기의 방법으로 중합효소연쇄반응을 수행한 후 1.3% 아가로스 겔에서 전기영동으로 분리 후 자외선 조사기를 사용하여 확인한 결과를 도 3에 나타내었다. 실험 결과 세포질웅성불임성(SNU1 세포질웅성불임성, SNU2 세포질웅성불임성, SNU3 세포질웅성불임성, 오구라 세포질웅성불임성 및 사코 세포질웅성불임성)에서 402bp의 산물이 증폭되어 세포질웅성불임성과 웅성가임을 구분할 수 있었다. 상기 중합효소연쇄반응 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 도 6에 나타내었다.

실시예 4: 폴리마 유형 세포질웅성불임성 구분 특이적 마커 개발

상기 실시예 2-1에서 제작된 프라이머로 상기 실시예 1-1에서 수집한 배추과 작물인 배추 세포질웅성불임성(CMS) 및 웅성가임(MF)을 증폭시켜 비교한 결과, 폴리마 유형 세포질웅성불임성이 확연하게 구별되는 프라이머를 선택하여 이를 BramsE, BramsF, 및 BramsH2로 명명하였다.

상기 BramsE를 프라이머로 이용하여 웅성가임1(MF1), 웅성가임2(MF2), SNU1 세포질웅성불임성, SNU2 세포질웅성불임성, SNU3 세포질웅성불임성, 오구라 세포질웅성불임성 및 사코 세포질웅성불임성 DNA에 대하여 상기의 방법으로 중합효소연쇄반응을 수행한 후 1.3% 아가로스 겔에서 전기영동으로 분리 후 자외선 조사기를 사용하여 확인한 결과를 도 7에 나타내었다. 실험 결과 폴리마 유형 세포질웅성불임성인 SNU1 세포질웅성불임성 및 SNU2 세포질웅성불임성에서 각각 478bp의 산물이 증폭되어 폴리마 유형 세포질웅성불임성을 구분할 수 있었다. 상기 중합효소연쇄반응 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과는 도 10에 나타내었으며 SNU1 세포질웅성불임성과 SNU2 세포질웅성불임성은 100%의 상동성을 가졌다.

상기 BramsF를 프라이머로 이용하여 웅성가임1(MF1), 웅성가임2(MF2), SNU1 세포질웅성불임성, SNU2 세포질웅성불임성, SNU3 세포질웅성불임성, 오구라 세포질웅성불임성 및 사코 세포질웅성불임성 DNA에 대하여 상기의 방법으로 중합효소연쇄반응을 수행한 후 1.3% 아가로스 겔에서 전기영동으로 분리 후 자외선 조사기를 사용하여 확인한 결과를 도8에 나타내었다. 실험 결과 폴리마 유형 세포질웅성불임성인 SNU1 세포질웅성불임성 및 SNU2 세포질웅성불임성에서 각각 646bp의 산물이 증폭되어 폴리마 유형 세포질웅성불임성을 구분할 수 있었다. 상기 중합효소연쇄반응 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 도 11에 나타내었으며 SNU1 세포질웅성불임성과 SNU2 세포질웅성불임성은 100%의 상동성을 가졌다.

상기 BramsH2를 프라이머로 이용하여 웅성가임1(MF1), 웅성가임2(MF2), SNU1 세포질웅성불임성, SNU2 세포질웅성불임성, SNU3 세포질웅성불임성, 오구라 세포질웅성불임성 및 사코 세포질웅성불임성 DNA에 대하여 상기의 방법으로 중합효소연쇄반응을 수행한 후 1.3% 아가로스 겔에서 전기영동으로 분리 후 자외선 조사기를 사용하여 확인한 결과를 도 9에 나타내었다. 실험 결과 폴리마 유형 세포질웅성불임성인 SNU1 세포질웅성불임성 및 SNU2 세포질웅성불임성에서 각각 455bp의 산물이 증폭되어 폴리마 유형 세포질웅성불임성을 구분할 수 있었다. 상기 중합효소연쇄반응 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과는 도 12에 나타내었으며 SNU1 세포질웅성불임성과 SNU2 세포질웅성불임성은 100%의 상동성을 가졌다.

실시예 5: 유사 오구라 유형 세포질웅성불임성의 구분 특이적 마커 개발 및 중합효소연쇄반응 산물의 염기서열 분석

상기 실시예 2-1에서 제작된 프라이머로 상기 실시예 1-1에서 수집한 배추과 작물인 배추 세포질웅성불임성(CMS) 및 웅성가임(MF)을 증폭시켜 비교한 결과, 유사 오구라 유형 세포질웅성불임성이 확연하게 구별되는 프라이머를 선택하여 이를 BramsC로 명명하였다.

상기 BramsC를 프라이머로 이용하여 웅성가임1(MF1), 웅성가임2(MF2), SNU1 세포질웅성불임성, SNU2 세포질웅성불임성, SNU3 세포질웅성불임성, 오구라 세포질웅성불임성 및 사코 세포질웅성불임성 DNA에 대하여 상기의 방법으로 중합효소연쇄반응을 수행한 후 1.3% 아가로스 겔에서 전기영동으로 분리 후 자외선 조사기를 사용하여 확인한 결과를 도 13에 나타내었다. 실험 결과 유사 오구라 유형 세포질웅성불임성인 SNU3 세포질웅성불임성, 오구라 세포질웅성불임성 및 사코 세포질웅성불임성에서 각각 439bp의 산물이 증폭되어 유사 오구라 유형 세포질웅성불임성을 구분할 수 있었다. 상기 중합효소연쇄반응 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 도 14에 나타내었으며 SNU3 세포질웅성불임성, 오구라 세포질웅성불임성 및 사코 세포질웅성불임성은 100%의 상동성을 가졌다.

실시예 6: 사코 세포질웅성불임성의 구분 특이적 마커 개발 및 중합효소연쇄반응 산물의 염기서열 분석

상기 실시예 2-1에서 제작된 프라이머로 상기 실시예 1-1에서 수집한 배추과 작물인 배추 세포질웅성불임성(CMS) 및 웅성가임(MF)을 증폭시켜 비교한 결과, 사코 세포질웅성불임성이 확연하게 구별되는 프라이머를 선택하여 이를 BramsH1으로 명명하였다.

*상기 BramsH1를 프라이머로 이용하여 웅성가임1(MF1), 웅성가임2(MF2), SNU1 세포질웅성불임성, SNU2 세포질웅성불임성, SNU3 세포질웅성불임성, 오구라 세포질웅성불임성 및 사코 세포질웅성불임성 DNA에 대하여 상기의 방법으로 중합효소연쇄반응을 수행한 후 1.3% 아가로스 겔에서 전기영동으로 분리 후 자외선 조사기를 이용하여 확인한 결과를 도 15에 나타내었다. 실험 결과 사코 세포질웅성불임성을 제외한 웅성가임1, 웅성가임2, SNU1 세포질웅성불임성, SNU2 세포질웅성불임성, SNU3 세포질웅성불임성 및 오구라 세포질웅성불임성에서 각각 448bp의 산물이 증폭되었고 사코 세포질웅성불임성에서는 중합효소연쇄반응 산물이 증폭되지 않아서 사코 세포질웅성불임성을 구분할 수 있었다. 상기 중합효소연쇄반응 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 도 16에 나타내었으며 웅성가임1, 웅성가임2, SNU1 세포질웅성불임성, SNU2 세포질웅성불임성, SNU3 세포질웅성불임성 및 오구라 세포질웅성불임성은 100%의 상동성을 가졌다.

실시예 7: matK 유전자의 게놈해석, SNU3 세포질웅성불임성의 구분 특이적 마커 개발 및 중합효소연쇄반응 산물의 염기서열 분석

7-1. 배추 엽록체 matK ( maturase K) 유전자의 염기서열 및 아미노산 분석

엽록체 DNA 염기 서열을 활용(DQ231548, Brassica rapa subsp. pekinensis chloroplast sequence, 153,482bp)하여 matK 유전자의 염기서열 및 아미노산을 분석하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다.

7-2. Brams K2 마커 개발 및 중합효소연쇄반응 산물의 염기서열 분석

상기 실시예 2-1에서 제작된 프라이머로 상기 실시예 1-1에서 수집한 배추과 작물인 배추 세포질웅성불임성(CMS) 및 웅성가임(MF)을 증폭시켜 비교한 결과, SNU3 세포질웅성불임성이 확연하게 구별되는 프라이머를 선택하여 이를 BramsK2로 명명하였다.

상기 BramsK2를 프라이머로 이용하여 웅성가임1(MF1), SNU1 세포질웅성불임성, SNU2 세포질웅성불임성, SNU3 세포질웅성불임성, 오구라 세포질웅성불임성 및 사코 세포질웅성불임성 DNA에 대하여 상기의 방법으로 중합효소연쇄반응을 수행한 후 1.3% 아가로스 겔에서 전기영동으로 분리 후 자외선 조사기를 이용하여 확인한 결과를 도 18에 나타내었다. 실험 결과 SNU3 세포질웅성불임성에서 891bp의 산물이 증폭되어 SNU3 세포질웅성불임성을 구분할 수 있었다. 상기 중합효소연쇄반응 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과를 도 19에 나타내었다.

실시예 8: 세포질웅성불임성 마커 검정 및 웅성불임 개체의 스크리닝

세포질웅성불임성과 웅성가임의 구분 특이적 마커인 BramsA, BramsB1 및 BramsB2, 폴리마 유형 세포질웅성불임성 특이적 마커인 BramsE, BramsF 및 BramsH2, 유사 오구라 유형 세포질웅성불임성 특이적 마커인 BramsC, 사코 세포질웅성불임성 특이적 마커인 BramsH1 및 SNU3 세포질웅성불임성 특이적 마커인 BramsK2를 이용하여 국내외 수집종을 대상으로 개발된 마커를 검정하였다. 대조구로 웅성가임을 2개 사용하였으며 상기 마커들을 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 후 1.3% 아가로스 겔에서 전기영동으로 분리 후 자외선 조사기를 사용하여 확인한 결과를 표 1 및 2에 나타내었다.

표 1 및 2에서 살펴보듯이 다수의 수집종에서 BramsC 마커를 이용하여 중합효소연쇄반응 한 경우 439bp의 DNA 밴드가 나타났으며, 그 결과 다수의 세포질웅성불임성이 유사 오구라 유형 세포질웅성불임성인 것으로 나타났다.

<110> Industry-academy Cooperation Corps. of Sunchon National University <120> Markers for discriminating cytoplasmic male sterility in Brassica sp. and discriminating method using the markers <130> PA100019 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsA1 forward primer <400> 1 gaagaagatt ctcattccag ct 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsA1 reverse primer <400> 2 gaattcagag gcaaggagga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsB1 forward primer <400> 3 gggggagcac ttccttctac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsB1 reverse primer <400> 4 atcaaggcca gccattacct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsB2 forward primer <400> 5 aggaagcgct attctgacca 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsB2 reverse primer <400> 6 gcctcgagac tacctcgatt t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsE forward primer <400> 7 tggagtactt gggatcagca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsE reverse primer <400> 8 aggcttcgaa tctcccactt 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsF forward primer <400> 9 tgcctcaact ggataaattc ac 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsF reverse primer <400> 10 ttcgttcacc ttggctctct 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsH2 forward primer <400> 11 aatacgccta tgccccctac 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsH2 reverse primer <400> 12 gcttagtgct cacaacgggt a 21 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsC forward primer <400> 13 ccgcttttct tcagcatata aa 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsC reverse primer <400> 14 tttctcggtc cattttccac 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsK2 forward primer <400> 15 ctcagtaatc ttagtcttac tg 22 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsK2 reverse primer <400> 16 atttccggcg cttttagggt tgttc 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsH1 forward primer <400> 17 aaggacgacg tacccatgat 20 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BramsH1 reverse primer <400> 18 aaaggccact ttccga 16

Claims

폴리마 유형 세포질웅성불임성을 판별하기 위한 프라이머 세트로서, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 BramsE 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 BramsF 프라이머 세트, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 BramsH2 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 배추과 작물의 세포질웅성불임성 판별용 마커.
제1항에 있어서, 상기 배추과 작물은 배추, 양배추, 갓, 브로콜리, 유채 또는 순무인 배추과 작물의 세포질웅성불임성 판별용 마커.
제1항의 프라이머 세트로 이루어진 군에서 하나 이상 선택한 프라이머 세트를 포함하는 배추과 작물의 세포질웅성불임성 판별용 키트.