KR20120039459A

KR20120039459A - Ｃ１２ｏｒｆ５９ 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20120039459A
Application number: KR1020110089601A
Authority: KR
Inventors: 김세미; 이윤희
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2010-10-15
Filing date: 2011-09-05
Publication date: 2012-04-25
Also published as: US20130202560A1; KR101198714B1; US9233139B2

Abstract

본 발명은 C12orf59(chromosome 12 open reading frame 59) 유전자 또는 C12orf59 단백질, 또는 이의 단편을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 암 진단 또는 암 치료제 후보물질의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 암세포주에 C12orf59 단백질 또는 이의 단편을 과발현시킨 경우, 암세포의 침윤에 관여하는 ITGA5의 발현이 감소하여 암세포의 침윤능이 감소하였으며, 암세포주에 C12orf59 유전자의 발현을 저해한 경우, 암세포 침윤이 증가하고 암세포의 생존능이 증가하며, 다양한 세포신호전달이 활성화됨을 확인하였으며, 이를 통해 C12orf59 유전자가 종양 억제자(tumor suppressor)로서 기능을 가짐을 확인하였다. 따라서, C12orf59 유전자, 또는 C12orf59 단백질 또는 이의 단편은 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 유용하게 이용할 수 있을 뿐 아니라, 이를 이용한 암 진단 또는 암 치료제 후보물질의 스크리닝 방법에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

Ｃ１２ｏｒｆ５９ 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmacological composition containing a C12orf59 protein or a polynucleotide encoding C12orf59 for the prevention and treatment of cancer}

본 발명은 C12orf59 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

C12orf59(chromosome 12 open reading frame 59) 유전자는 인간, 침팬지, 개, 소, 쥐, 랫트, 닭 등에서 보존되어 있고, 염기서열상 2개의 아형(isoform)이 보고되어 있으며(BC131523, 183a.a.; NM_153022, 163a.a.), 아미노산 서열 분석상 막단백질로 예상되지만, 아직까지 그 기능이 명백히 밝혀지지 않았다.

WO 2010/037859 및 US 2009/0163435에서 C12orf59 유전자와 암과의 연관성이 기재되어 있으나, 이는 항암제 및 약물의 처리에 의해 변화하는 유전자 발현 조절에 대한 것으로, 현재까지 암 관련하여 C12orf59 유전자의 발현 및 기능에 대해서는 보고된 바 없다.

한편, 암은 인류의 건강을 위협하는 최대의 질병 중의 하나로서, 세포가 일련의 돌연변이 과정을 거쳐, 무제한적이고, 비조절적인 방식으로 증식하고, 불사화되어 발생하는 질병이다.

암과 관련된 다양한 생화학적 기전이 규명되고 그에 따른 치료제가 개발되어 오고 있으나, 아직까지 암에 대한 근본적인 치료방법은 제시되지 않고 있고, 이에 따라, 암과 관련된 다양한 생체내 분자를 동정하고 이를 표적으로 하는 약물을 개발하는 노력이 경주되고 있으며, 이러한 약물 중 일부를 조합하여 암 치료효과를 증진시키려는 노력 역시 시도되고 있다. 따라서 암과 관련된 표적 분자를 추가적으로 발굴하는 노력은 매우 중요한 일이라고 할 수 있다.

대장암은 전 세계적으로 연간 100만 명의 환자가 발생하고 53만 명이 사망하는 난치성 질환으로, 노령화와 식이패턴의 변화에 따라 우리나라에서도 전체 암 발생의 12.7%로 3위를 차지할 정도로 빠른 속도로 증가하고 있다. 현재 대장암에 효과적인 항암제로는 5-에프유 , 유에프티, 카페시타빈(상품명: 젤로다)과 같은 플루오로피리미딘계 약물, 이리노테칸(상품명: 갬푸토) 및 옥살리플라틴과 같은 약물이 널리 이용되고 있으며, 미국, 유럽 등 세계 7대 제약시장에서 대장암 치료제 시장은 현재 9억 달러 규모에서 2017년 78억 달러로 급성장할 전망이다. 이러한 약물의 지속적인 사용은 내성의 증가 및 부작용을 나타낼 수 있다는 문제점을 항상 지니고 있어, 새로운 치료제의 개발 및 진단에 대한 연구가 필요한 시점이다.

현재 대장암의 진단 마커로 이용되고 있는 암태아성항원(CEA)은 태아 시기에 정상적으로 만들어지는 일종의 당단백질로, 정상적으로는 태어나기 전에 이 물질의 생산이 중단되기 때문에, 성인에게서 신생아보다도 더 높은 암태아성항원(CEA)의 수치가 나타난다면 이것은 대장암이나 다른 암이 있을 가능성이 있음을 제시하나, 이 수치는 간경변증, 간질환, 알코올성 췌장염 환자나 그리고 흡연자에게서도 증가할 수 있어, 보조적으로 사용되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 암의 진단 또는 암 치료제 개발을 위한 연구의 결과로서, 암세포주에서 C12orf59 유전자의 발현을 확인하였으며, 암세포주에 C12orf59 단백질 또는 이의 단편을 과발현시킨 경우, 암세포의 침윤에 관여하는 ITGA5의 발현이 감소하여 암세포의 침윤능이 감소하는 것을 확인하였고, 대장암 세포주에 C12orf59 유전자의 발현을 저해한 경우, 세포 침윤이 증가하고 세포의 생존능이 증가하며, 다양한 세포신호전달이 활성화됨을 확인함으로써, C12orf59 유전자가 종양 억제자(tumor suppressor)로서 기능을 가짐을 증명하고, 이를 통해 C12orf59 유전자 또는 단백질을 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물, 및 이를 이용한 암 진단 또는 암 치료제 후보물질의 스크리닝 방법에 유용하게 이용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 C12orf59((chromosome 12 open reading frame 59) 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 C12orf59 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 발현 또는 활성 유도제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 C12orf59 유전자를 마커로 이용하여 암을 진단 또는 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 C12orf59 유전자 발현, 또는 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 활성 측정을 통한 암 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 C12orf59(chromosome 12 open reading frame 59) 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 C12orf59 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 발현 또는 활성 유도제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다:

1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 발현량을 측정하는 단계;

2) 단계 1)의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 발현량을 비교하는 단계; 및

3) C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 암 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다:

1) 피검 화합물 또는 조성물을 C12orf59 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 세포주에 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

3) 단계 2)의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계.

아울러, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 암 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다:

1) 피검 화합물 또는 조성물을 C12orf59 단백질 또는 이의 단편에 처리하는 단계;

2) 단계 1)의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 활성을 측정하는 단계; 및

3) 단계 2)의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 활성이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 활성과 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계.

본 발명의 C12orf59 유전자는 암세포의 침윤능을 억제하며, 세포-미부착 조건하에서 세포생존을 저해하며, C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 과발현은 암세포의 침윤을 감소시킴으로, C12orf59 유전자, 또는 단백질 또는 이의 단편은 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 유용하게 이용할 수 있을 뿐 아니라, 이를 이용한 암 치료제 후보 물질을 스크리닝하는 방법 또는 다양한 암 종의 전이 진단 또는 병기 예측을 위한 임상 마커에 유용하게 적용할 수 있다.

도 1a는 7종의 대장암 세포주에서 C12orf59의 발현을 semiquantitative PCR 기법으로 확인한 결과이다.
도 1b는 2종의 난소암 세포주와 1종의 대장암 세포주에서 C12orf59의 발현을 semiquantitative PCR 기법으로 확인한 결과이다:
SKOV-3: 난소암 세포주;
IGROV-1: 난소암 세포주; 및
SW480: 대장암 세포주.
도 2는 HEK293E, 폐암세포주 A549 및 위암세포주 AGS, KATOIII, MKN28, MKN45, NCI-N87, SNU-216, SNU-638, SNU-668, SNU-719, TMK1에서 C12orf59의 발현을 semiquantitative PCR 기법으로 확인한 결과이다.
도 3a는 Poly-C12orf59 항체를 제작하기 위한 펩타이드 에피톱(epitope)의 서열이다:
3번째 밑줄친 아미노산 서열이 다클론성(polyclonal) 항체를 제작한 펩타이드의 항원결정기.
도 3b는 상기 제조된 항체의 항원 특이적 결합능을 검증한 결과이다:
HEK293E 세포에 pcDNA-myc, pcDNA-C12orf59-isoform1-myc, pcDNA-C12orf59-isoform1, pcDNA-C12orf59-isoform2-myc, 및 pcDNA-C12orf59-isoform2 벡터로 형질전환한 형질전환 세포주의 세포 용해물(cell lysates)을 이용하여, 항체가 C12orf59 단백질을 인식하는지 확인한 결과;
화살표: C12orf59 단백질; 및
peptide: 항원 펩티드를 차단 시약으로 사용하여 항체의 항원 특이적 결합능을 확인한 결과.
도 4는 C12orf59 단백질을 암세포주에서 과발현한 후 세포내 C12orf59 단백질의 위치를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다:
왼쪽 위: 대조군으로, pcDNA-myc 벡터를 SW480 세포주에 형질전환한 세포;
왼쪽 아래 및 오른쪽: pcDNA-C12orf59-isoform1-myc 벡터가 SW480 세포주에 형질전환된 세포;
blue: DAPI;
green: C12orf59;
red: F-actin; 및
red-arrow: C12orf59의 뚜렷한 세포표면 localization example을 표시한 결과.
도 5a는 SW480 세포주에서 pcDNA-myc와 C12orf59 단백질 과발현 벡터인 pcDNA-C12orf59-isoform1-myc, pcDNA-C12orf59-isoform2-myc, 및 pcDNA-C12orf59-isoform1del-myc 벡터를 형질도입하여 C12orf59 단백질을 과발현시킨 후 암세포주의 침윤 정도를 조사한 결과이다.
도 5b는 SW480 세포주에서 C12orf59 단백질을 과발현시킨 후, 암세포주의 침윤 억제능을 확인하여 counting한 결과(*p<0.05, **p< 0.001)이다.
도 6a는 C12orf59 단백질을 SW480 세포주에서 과발현시킨 후, AP-1 cis element의 프로모터 활성 변화를 확인한 결과이다(*p<0.05).
도 6b는 C12orf59 단백질을 SW480 세포주에서 과발현시킨 후, ITGA5의 프로모터 활성 변화를 확인한 결과이다(*p<0.05).
도 7a는 HCT-15 세포주에 pcDNA-myc와 C12orf59 단백질을 과발현하는 pcDNA-C12orf59-isoform1-myc, pcDNA-C12orf59-isoform2-myc, 및 pcDNA-C12orf59isoform1del-myc 벡터를 도입하여 C12orf59 단백질의 과발현에 의한 AP-1의 활성 변화를 확인한 결과(*p<0.05)이다.
도 7b는 HCT-15 세포주에서 C12orf59 단백질을 과발현한 후, AP-1 활성인자의 활성 변화를 웨스턴 블랏 분석으로 확인한 결과이다.
도 7c는 HCT-15 세포주에서 C12orf59 단백질을 과발현한 후, AP-1 활성인자의 활성 변화를 densitometry로 나타낸 결과이다.
도 8a는 SW480 세포주에 C12orf59 siRNA 처리 후, C12orf59 유전자 억제 여부를 겔상에서 확인한 결과이다.
도 8b는 SW480 세포주에 C12orf59 siRNA 도입에 의한 세포형태 변화를 확인한 결과이다.
도 8c는 SW480 세포주에 C12orf59 siRNA 도입 후, 세포 침윤 정도를 조사한 결과(위: 대표사진; 아래: 개수 후 비교결과)이다.
도 9a는 HCT-15 세포주에 C12orf59 siRNA 도입 후 암세포의 침윤 정도 변화를 조사한 결과이다.
도 9b는 HCT-15 세포주에서 C12orf59의 발현을 억제한 후, 암세포의 침윤 정도를 분석하여 counting한 결과(*p<0.05)이다.
도 10은 SW480 세포주에 C12orf59 siRNA 도입 후, 세포 생존능을 확인한 결과이다.
도 11은 SW480 세포주에 C12orf59 siRNA 도입 후, 세포신호전달의 변화를 웨스턴 블랏 분석으로 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 C12orf59(chromosome 12 open reading frame 59) 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 C12orf59(chromosome 12 open reading frame 59) 단백질은 하기 1) 내지 3)의 아미노산 서열로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:

1) 서열번호 1 또는 2로 나타내는 아미노산 서열;

2) 서열번호 1 또는 2의 일부분으로 나타내는 아미노산 서열; 및

3) 서열번호 1 또는 2와 80% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열.

상기 암은 대장암, 위암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 단편은 서열번호 27로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명은 C12orf59 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 C12orf59(chromosome 12 open reading frame 59) 단백질 또는 이의 단편은 하기 1) 내지 3)의 아미노산 서열로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:

1) 서열번호 1 또는 2로 나타내는 아미노산 서열;

상기 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터 또는 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노 바이러스(adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, pSecTag-LK68, pLXSN-LK68, rAAV-LK68 및 pAAV-LK68로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포는 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cells), 수지상 세포(dendritic cells), 자가이식 종양세포(autologous tumor cells) 및 정착 종양세포(established tumor cells)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 C12orf59의 발현 또는 활성 유도제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장암, 폐암 및 위암 세포주에서 C12orf59 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 각 세포주로부터 전체 RNA를 분리하고, RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 대장암 세포주 중에서 Colo205, HCT-15, SW480 세포주에서 발현이 확인되었고(도 1a 및 1b 참조), 위암 세포주인 KATOIII 및 NCI-N87에서는 대장암 세포주인 SW480 세포주와 비슷한 중간 정도수준으로 발현되었고, 폐암 세포주 A549, 위암 세포주인 AGS, MKN28, MKN45에서는 비교적 높은 수준으로 발현되었으며, 위암 세포주 TMK1에서는 아주 낮은 수준으로 발현됨을 확인하였다(도 2 참조).

이를 통해, C12orf59 유전자가 다양한 암세포주에서 두 가지 형태의 isoform으로 발현되고, 세포주에 따라 발현량이 다르게 나타남을 확인하였다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, pcDNA-myc 및 제작한 C12orf59 컨스트럭트를 포함하는 pcDNA-C12orf59-isoform1-myc 벡터를 SW480 세포에 형질전환하여 과발현시키고 immunofluorescence 기법으로 C12orf59 단백질의 세포내에서의 위치를 확인한 결과, C12orf59가 암세포의 표면에 위치하는 것을 확인하였다(도 4 참조).

또한, 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, pcDNA-myc, C12orf59 발현 컨스트럭트를 포함하는 pcDNA-C12orf59-isoform1-myc, pcDNA-C12orf59-isoform2-myc, 및 pcDNA-C12orf59-isoform1del-myc 벡터를 제작하여 SW480 세포주에 형질전환하여 암세포의 침윤능을 확인한 결과, C12orf59의 과발현에 의해 침윤이 감소함을 확인하였으며(도 5a 및 5b 참조), pcDNA-myc, C12orf59 발현 컨스트럭트를 포함하는 pcDNA-C12orf59-isoform1-myc, pcDNA-C12orf59-isoform2-myc, 및 pcDNA-C12orf59-isoform1del-myc 벡터를 SW480 세포주에 형질전환 후 luciferase assay를 통해 프로모터의 활성변화를 측정한 결과, AP-1 cis element 및 ITGA5 프로모터의 활성이 C12orf59 과발현에 의해 감소함을 확인하였다(도 6a 및 6b 참조). 또한, HCT-15 세포주에 pcDNA-myc, C12orf59 발현 컨스트럭트를 포함하는 pcDNA-C12orf59-isoform1-myc, pcDNA-C12orf59-isoform2-myc, pcDNA-C12orf59-isoform1del-myc 벡터, 및, AP-1 cis-element 리포터를 형질전환 후 luciferase assay를 통해 AP-1 cis-element 프로모터의 활성을 확인한 결과, cis-element AP-1의 활성이 C12orf59 단백질에 의해 감소됨을 확인하였다(도 7a 참조). ITGA5의 promoter 영역은 AP-1 site를 포함하고 있으며, 전사인자 AP-1이 ITGA5의 발현을 유도함이 보고된바 있으므로(Corbi et al., FEBS Letters (2000) 474:201-207), 전사인자 AP-1의 활성이 감소됨으로써 ITGA5의 발현이 감소되는 것으로 유추할 수 있으며, 암세포 침윤 및 상처치유에 관여하며, 대장암세포 중 침윤능이 낮은 세포보다 침윤능이 높은 세포에 높게 발현됨이 보고된바 있는 Integrin family인 integrin a5가 암세포 이동 및 침윤능에 기여하는 것으로 유추할 수 있다. 따라서, 이를 통해, C12orf59 단백질이 대장암 세포에서 전사인자 AP-1의 활성 저해 및 integrin a5(ITGA5)의 발현 억제를 통해 암세포의 침윤능을 억제함을 확인하였다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, C12orf59 특이적 siRNA를 대장암 세포주인 SW480에 형질전환하고, 세포 내 C12orf59의 발현량과 세포 형태 변화를 확인한 결과, SW480 세포주에 C12orf59 특이적 siRNA를 도입하고 48시간 후, C12orf59의 발현이 저해됨을 확인하였고(도 8a 참조), 세포의 형태가 퍼지고 lamellipodia의 형성이 증가함을 확인하였다(도 8b 참조).

이를 통해, C12orf59 siRNA에 의해 암세포주에서 C12orf59의 발현이 저해되고, C12orf59 발현 저해로 인해, 암세포의 형태가 전형적으로 이동성이 높은 세포 모양으로 변화함을 확인하였다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, C12orf59 특이적 siRNA를 SW480 세포주에 형질전환하고 48시간 뒤 침윤능 분석 및 암세포 생존능 분석을 수행하였고, 그 결과, C12orf59의 발현 저해가 암세포의 침윤을 증가시키고(도 8c 참조), anoikis(미부착상태에서의 세포사멸)-저항성을 유도함을 확인하였다(도 10 참조).

또한, 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, C12orf59 특이적 siRNA를 HCT-15 세포주에 형질전환하고 48시간 뒤 침윤능 분석을 수행하였고, 그 결과, C12orf59의 발현 저해가 암세포의 침윤을 증가시킴을 확인하였다(도 9a 및 9b 참조).

아울러, 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, C12orf59 특이적 siRNA에 의한 암세포 신호전달 활성화를 세포 용해물을 이용한 웨스턴 블랏 분석을 통하여 확인하였고, 그 결과 C12orf59 siRNA에 의해 암세포에서 ERK1/2, p38 및 JNK의 인산화가 증가됨을 확인하였으며(도 11 참조), 이를 통해, MAPK 활성화가 C12orf59 발현 저해에 의해 유도되는 암세포의 침윤 및 세포생존에 기여했음을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편이 암세포의 침윤능을 억제함을 확인하였고, C12orf59의 발현을 억제시 암세포의 침윤능이 증가하고 세포 미부착 조건하에서 세포 생존을 저해하는 활성을 가짐을 확인하였다. 따라서 C12orf59 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 세포는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 유용하게 이용할 수 있다.

본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 경우 0.05 내지 500 mg을 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 내지 300 mg을 함유하는 것이 더욱 바람직하며, C12orf59 단백질 또는 이의 단편을 암호화는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 10³내지 10¹² IU(10 내지 10¹⁰ PFU)를 함유하는 것이 바람직하고, 10⁵ 내지 10¹⁰ IU를 함유하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포의 경우, 10³ 내지 10⁸ 개를 함유하는 것이 바람직하고, 10⁴ 내지 10⁷개를 함유하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 세포를 유효성분으로 함유하는 조성물의 유효 용량은 체중 1 ㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 10⁷ 내지 10¹¹ 바이러스 입자(10⁵ 내지 10⁹ IU)/㎏, 세포의 경우에는 10³ 내지 10⁶ 세포/㎏이고, 바람직하게는 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 10⁸ 내지 10¹⁰ 입자(10⁶ 내지 10⁸ IU)/㎏, 세포의 경우에는 10² 내지 10⁵ 세포/㎏이며, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 신경 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.

3) C12orf59 단백질 또는 이의 단편 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계.

상기 암 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법에 있어서, 단계 1)의 C12orf59의 발현량은 웨스턴 블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역 조직 화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 검출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

1) 서열번호 1 또는 2로 나타내는 아미노산 서열;

본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장암, 폐암 및 위암 세포주에서 C12orf59가 발현됨을 확인하고, SW480 세포주와 HCT-15 세포주에 C12orf59 벡터를 형질 전환시켜 과발현시킴으로써, 암세포의 침윤에 관여하는 ITGA5의 발현이 감소하여 암세포의 침윤능이 감소함을 확인하였다. 또한, SW480 세포주에 C12orf59 siRNA를 처리하여 그 발현을 저해함으로써, 암세포의 침윤능이 증가하고, 세포 미부착 조건하에서 세포 생존능이 증가할 뿐 아니라, 세포 내 신호전달 체계가 활성화됨을 확인하였으며, HCT-15 세포주에 C12orf59 siRNA를 처리하여 그 발현을 저해함으로써, 암세포의 침윤능이 증가함을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편은 암세포의 침윤능을 억제하고, 세포 미부착 조건하에서 세포 생존을 저해하는 활성을 가지며, 종양 억제자(tumor suppressor)로서 기능을 가지므로, C12orf59 단백질 또는 이의 단편은 암 진단의 정보를 제공하기 위해, 그 발현량의 변화를 측정함으로써, 암의 위험성 정도를 판단하는 단백질 검출 방법에 유용하게 사용할 수 있다.

1) 서열번호 1 또는 2로 나타내는 아미노산 서열;

본 발명의 구체적인 실시예에서, 암세포주에서 C12orf59가 발현됨을 확인하고, SW480 세포주와 HCT-15 세포주에 C12orf59 단백질 또는 이의 단편을 발현시킬 수 있는 벡터를 형질 전환시켜 과발현시킴으로써, 암세포의 침윤에 관여하는 ITGA5의 발현이 감소하여 암세포의 침윤능이 감소함을 확인하였다. 또한, SW480 세포주에 C12orf59 siRNA를 처리하여 그 발현을 저해함으로써, 암세포의 침윤능이 증가하고, 세포 미부착 조건하에서 세포 생존능이 증가할 뿐 아니라, 세포 내 신호전달 체계가 활성화됨을 확인하였으며, HCT-15 세포주에 C12orf59 siRNA를 처리하여 그 발현을 저해함으로써, 암세포의 침윤능이 증가함을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편은 암세포의 침윤능을 억제하고, 세포 미부착 조건하에서 세포 생존을 저해하는 활성을 가지며, 종양 억제자(tumor suppressor)로서 기능을 가지므로, C12orf59 단백질 또는 이의 단편을 암 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법에 유용하게 사용할 수 있다.

1) 서열번호 1 또는 2로 나타내는 아미노산 서열;

본 발명의 구체적인 실시예에서, 암세포주에서 C12orf59가 발현됨을 확인하고, SW480 세포주와 HCT-15 세포주에 C12orf59 단백질 또는 이의 단편을 발현할 수 있는 벡터를 형질 전환시켜 과발현시킴으로써, 암세포의 침윤에 관여하는 ITGA5의 발현이 감소하여 암세포의 침윤능이 감소함을 확인하였다. 또한, SW480 세포주에 C12orf59 siRNA를 처리하여 그 발현을 저해함으로써, 암세포의 침윤능이 증가하고, 세포 미부착 조건하에서 세포 생존능이 증가할 뿐 아니라, 세포 내 신호전달 체계가 활성화됨을 확인하였으며, HCT-15 세포주에 C12orf59 siRNA를 처리하여 그 발현을 저해함으로써, 암세포의 침윤능이 증가함을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 C12orf59는 암세포의 침윤능을 억제하고, 세포 미부착 조건하에서 세포 생존을 저해하는 활성을 가지며, 종양 억제자(tumor suppressor)로서 기능을 가지므로, C12orf59 단백질 또는 이의 단편은 암 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 암세포주 배양

WiDr, Caco-2 세포주는 10% FBS(fetal bovine serum: GIBCO, USA), 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), L-글루타민(L-glutamine), 소디움 피루베이트(sodium pyruvate), 비필수 아미노산(nonessential amino acids)이 포함된 MEM(minimal essential medium: GIBCO, USA) 배지에서 배양하였다.

HCT116, HT29, Colo205, SW480, SW620, HCT15, SK-OV-3, IGROV-1 세포주는 10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신, L-글루타민, 소디움 피루베이트가 포함된 RPMI1640(GIBCO, USA) 배지에서 배양하였다. HEK293E(Human Embryonic Kidney 293E) 세포주는 10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신, L-글루타민, 소디움 피루베이트, 글루코오스가 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle Medium: GIBCO, USA) 배지에서 배양하였다.

폐암 세포주 A549 및 위암세포주 AGS, KATOIII, MKN28, MKN45, NCI-N87, SNU-216, SNU-638, SNU-668, SNU-719, TMK1을 10% FBS, 페니실린-스트렙토마이신, L-글루타민, 소디움 피루베이트가 포함된 RPMI1640(GIBCO, USA) 배지에서 배양하였다.

MKN28, MKN45, SNU-216, SNU-638, SNU-668, SNU-719 세포주는 한국세포주은행(서울)에서 제공받았고, TMK1은 화순전남대병원 박영규교수로부터 제공받았으며, 다른 세포주는 모두 ATCC에서 제공받았으며, 모든 세포주는 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

< 실시예 2> 암세포주에서 C12orf59 유전자 발현 확인

암세포주에서 C12orf59 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 상기 <실시예 1>의 조건으로 배양한 다양한 세포주로부터 Trizol(Invitrogen)을 이용하여 전체 RNA를 분리하고, 이를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, RT-PCR 반응은 하기의 그림과 같은 방법으로 수행되었고, 이때 이용한 프라이머 서열은 정방향 프라이머: 5'- cagccctgctgtatttcatcc -3'(서열번호 3) 및 역방향 프라이머: 5'- ggccaaacaccgactgcag -3'(서열번호 4)이며, Bioneer사의 cDNA 합성 pre-mix kit(cat. K-2046)를 사용하여, 1 ug RNA로부터 cDNA를 합성하였다.

한편, PCR 반응의 내부 대조군으로, 베타-액틴(beta-actin)을 사용하였고, 이때 이용한 프라이머는 정방향 프라이머: 5'-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3'(서열번호 5) 및 역방향 프라이머: 5'-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3'(서열번호 6)이었으며, 결과로 얻어진 PCR 산물은 2% 아가로즈 겔 또는 5%, 8% 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하여 발현 유무를 확인하였다.

그 결과, C12orf59 유전자의 아형(isoform)의 종류에 따라, 297bp(isoform1(183a.a)의 경우) 및 253bp(isoform2(163a.a)의 경우) 크기의 DNA 절편이 증폭되었으며, 대장암 세포주 중에서 Colo205(아주 낮은 수준), HCT-15(높은 수준), SW480(중간 정도 수준)에서 발현이 확인되었으며(도 1a 및 1b), 모두 183a.a. 아형이 상대적으로 뚜렷하게 발현되었다.

또한, 위암 세포주인 KATOIII 및 NCI-N87에서는 대장암 세포주인 SW480 세포주와 비슷한 중간 정도수준으로 발현되었고, 폐암 세포주 A549, 위암 세포주인 AGS, MKN28, MKN45에서는 비교적 높은 수준으로 발현되었으며, 위암 세포주 TMK1에서는 아주 낮은 수준으로 발현됨을 확인하였다(도 2). 특히, 폐암 세포주 A549, 위암 세포주인 MKN45 및 NCI-N87에서는 163a.a. 아형의 발현이 상대적으로 높음을 확인하였다.

이를 통해, C12orf59 유전자가 다양한 암세포주에서 두 가지 형태의 아형으로 발현되고, 세포주에 따라 발현량이 다르게 나타남을 확인하였다.

< 실시예 3> C12orf59 발현 벡터 제작

암세포주에서 C12orf59의 발현에 의한 효과를 알아보기 위해 C12orf59 유전자가 삽입된 여러 형태의 벡터를 제작하였다.

구체적으로, pcDNA3.1-myc his A vector(Invitrogen) 서열에서 myc 바로 뒤에 오는 아미노산을 위치선택적 돌연변이(site-directed mutagenesis)방법(QuikChange II site-directed mutagenesis kit, Stratagene)을 이용하여 종결 서열(stop codon)로 바꾼 다음, 그 벡터를 하기 [표 1]의 프라이머 서열을 이용하여 하기 [표 2]에 기재된 조건으로 PCR 반응을 수행한 후, XhoI/HindIII 제한효소를 이용하여C12orf59의 아형아형rm) 2종류(UniProtKB/Swiss-Prot기준; Q4KMG9-1(183a.a isoform 1), Q4KMG9-2(163a.a isoform 2)) 및 183a.a isoform 1에서 세포질 도메인(cytoplasmic domain)이 제거된 1 ~ 66번까지의 아미노산인 66a.a form을 서브클로닝(subcloning)하였다. 또한 벡터내에 존재하는 myc 단백질을 발현하지 않는 형태의 C12orf59 단백질을 발현하기 위해 C12orf59의 isoform인 183a.a isoform 1, 163a.a isoform 2, 및 66a.a form 바로 뒤에 종결 서열을 넣어 서브클로닝(subcloning)하였다.

그 결과, pcDNA-myc his A 벡터내에, C12orf59 발현 컨스트럭트를 포함하는 pcDNA-C12orf59-isoform1-myc, pcDNA-C12orf59-isoform1del-myc, pcDNA-C12orf59-isoform1, pcDNA-C12orf59-isoform2-myc, 및 pcDNA-C12orf59-isoform2 재조합 벡터를 제작하였다.

< 실시예 4> 인테그린 알파 5 프로모터-리포터( Integrin α 5 promoter -reporter) 컨스트럭트 제작

프로모터 리포터 분석(Promoter reporter assay)을 위해, 인테그린 알파 5 프로모터-리포터(Integrin α 5 promoter-reporter) 컨스트럭트를 제작하였다.

구체적으로, 대장암 세포주 SW480의 게놈 DNA(genomic DNA)에서 프라이머 5'-CCGCTCGAGGAGCTGAAGGTTGGGTCC-3'(서열번호 25) 및 5'-CCGCTCGAGCCGTCTGTTCCCGGC-3'(서열번호 26)를 이용하여 인간 인테그린 알파 5 프로모터 부위(region)를 증폭하기 위한 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 수행 후 얻어진 증폭 산물인 인테그린 알파 5 프로모터 부위를 제한효소 XhoI으로 절단하고 pGL3 basic 벡터(Promega, Southampton, UK)에 삽입하여 인테그린 알파 5 프로모터-리포터 컨스트럭트를 제작하였다.

< 실시예 5> Poly - C12orf59 항체 제작 및 효과 확인

발현된 C12orf59를 검출하기 위해 C12orf59에 특이적인 항체를 영인 프런티어에 주문 제작하였다.

구체적으로, 항체 제작 가능성이 높은 3가지 항원결정기(epitope) 중 1종의 펩티드(도 3a의 3번째 밑줄 친 아미노산 서열)로 토끼에 면역반응을 유도함으로써(immunize), 다클론성 항체(polyclonal antibody)를 주문 제작하였으며(영인 프런티어)(도 3a), 제작된 항체의 검증을 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다.

구체적으로, HEK293E 세포에 상기 <실시예 3>에서 제작한 pcDNA-myc, pcDNA-C12orf59-isoform1-myc, pcDNA-C12orf59-isoform1, pcDNA-C12orf59-isoform2-myc, 및 pcDNA-C12orf59-isoform2 벡터를 PEI 시약(reagent)으로 도입하고 48시간 후에, 세포를 RIPA buffer(10 mM Tris, pH7.2, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1 mM sodium orthovanadate, 50 mM NaF, 1 mM PMSF, complete protease inhibitor)으로 용해시키고 세포로부터 얻어진 용해물 내의 단백질을 정량하였다. 정량한 세포 용해물 30 ug을 SDS 시료 버퍼와 혼합하여 가열하였고, 18% SDS-PAGE 겔에 전기영동 하였다. 전기영동으로 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 이동시키고, 5% 스킴 밀크(skim milk)로 차단하였다. 이후, 상기 제작된 항체를 1:2000으로 희석하여 1차 항체를 반응시킨 다음, 홀스레디쉬 퍼올시데이즈(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체(Bio-rad, USA)와 반응시켰다. 이후, ECL 키트(ECL Plus, Amersham, USA)를 제조사의 방법대로 처리하여, 항체의 항원에 대한 친화력을 분석하였다.

그 결과, 2마리의 토끼로부터 얻은 항체 2종(Rabbit 1번, Rabbit 2번)이 모두 C12orf59 단백질이 발현된 세포 용해물로부터 C12orf59 단백질을 뚜렷하게 인식함을 확인하였다(도 3b, 왼쪽 패널, 화살표). 또한, 이러한 밴드가, 항체 제작에 사용했던 항원 펩티드의 차단 시약(blocking reagent)을 이용하여 차단했을 경우에는, 확인되었던 밴드가 사라지는 것을 확인 함으로써(도 3b, 오른쪽 패널), 이 밴드가 C12orf59 단백질-특이적인 것임을 확인하였으며, 이를 통해 주문하여 제작한 항체가 C12orf59 단백질을 특이적으로 인식하는 C12orf59 항체임을 확인하였다.

< 실험예 1> 암세포주에서 C12orf59 의 과발현에 의한 효과 확인

<1-1> 암세포주에서 C12orf59 의 위치 확인

암세포주에서 C12orf59의 세포내 위치를 확인하기 위하여 대장암 세포주 SW480에 pcDNA-myc 및 pcDNA-C12orf59-isoform1-myc 벡터를 전기천공 기법(microporation)(Neon Transfection system, Invitrogen)으로 형질전환하였다.

구체적으로, SW480 세포를 수확한 뒤, PBS로 세척하고, R buffer(Neon Transfection system, Invitrogen)로 3×10⁵cell/10 ul의 농도로 재부유한 뒤, pcDNA-myc 및 pcDNA-C12orf59-isoform1-myc 벡터 DNA를 첨가하고 전기천공 기기(Neon Transfection system, Invitrogen)를 이용하여 형질전환 하였다. 이후, 커버 슬립(cover slips)에 세포를 부착시키고, 48시간 뒤에 부착된 세포를 PBS에 녹인 3.7% 파라포름알데하이드로 고정한 다음, PBS로 3번 세척하고 0.3% Triton-X-100으로 침투시킨 후, 다시 3번 세척하였으며, 세포를 10% 정상 염소 혈청(normal Goat serum)으로 차단시킨 후, C12orf59 항체(1:500으로 희석, 영인프론티어)와 반응시키고, 형광이 결합된 2차 항체(Vector lab, USA)와 반응시켰다. 또한, F-액틴(actin)과 핵을 염색하여 공초점 현미경으로 확인하였다.

그 결과, C12orf59 단백질이 세포 표면에 존재하는 것을 확인하였으며(도 4), C12orf59의 아미노산 서열상 막관통 도메인(transmembrane domain)이 존재함으로써 C12orf59 단백질이 세포표면에 위치할 수 있음을 확인하였다.

<1-2> 암세포주에서 C12orf59 과발현에 의한 침윤능 변화

암세포주에서 C12orf59 과발현에 의한 침윤능력의 변화를 분석하기 위하여 대장암 세포주 SW480에 pcDNA-myc, pcDNA-C12orf59-isoform1-myc, pcDNA-C12orf59-isoform2-myc, 및 pcDNA-C12orf59-isoform1del-myc 벡터를 형질전환하여 48시간 뒤 침윤 분석(invasion assay)을 수행하였다.

구체적으로, 침윤분석을 위해 24-웰 트렌스웰 플레이트(8 ㎛ pore size; Costar,미국)의 다공성 막을 무혈청(serum free) 배지로 희석된 250 ㎍/㎖ 농도의 100 ㎕ 마트리젤(BD Biosciences, 미국)로 코팅하였고, 실온에서 1시간 동안 방치하여 고형화시켰다. 이동(Migration) 및 침윤(Invasion) 실험을 위해 트렌스웰 플레이트의 하층은 20 ㎍/㎖ 농도의 콜라겐 타입 I(Sigma) 100 ㎕를 이용하여 코팅하였다. 상기 24-웰 트렌스웰 플레이트의 상층 챔버에 무혈청 배지에서 상기 <실험예 1-1>의 전기천공기법(microporation)으로 pcDNA-myc, pcDNA-C12orf59-isoform1-myc, pcDNA-C12orf59-isoform2-myc, 및 pcDNA-C12orf59-isoform1del-myc 벡터를 형질전환한 각 2.5×10⁴, 3×10⁴개의 형질전환 세포를 분주하였고, 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양하면서 상층 챔버에서 하층 챔버로 이동하도록 하였다. 전이되지 않은 세포는 상층 챔버의 표면에서 제거하였다. 하층 챔버로 전이된 세포는 PBS에 녹인 3.7% 파라포름알데하이드로 고정하였고, 2% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 여분의 크리스탈 바이올렛 용액을 증류수로 세척한 뒤, 선택 면적(×100)의 사진을 찍었고, 이동 및 전이한 세포 수는 5개의 선택 면적에서 계수하였다. 실험은 동일한 조건으로 듀플리케이트하여 얻어진 대표 결과로 나타내었다. 데이터 값은 ×200 배율당(HPF) 전이세포±표준편차의 수를 반영하였다.

그 결과, SW480 세포주에 pcDNA-myc, pcDNA-C12orf59-isoform1-myc, pcDNA-C12orf59-isoform2-myc, 및 pcDNA-C12orf59-isoform1del-myc 벡터를 도입한 형질전환 세포주에서 대조군인 pcDNA-myc 벡터를 도입한 세포주에 비해, C12orf59 단백질 또는 이의 단편이 발현되는 경우, 암세포의 침윤이 감소함을 확인하였고(도 5a 및5b), 이를 통해 C12orf59가 암세포의 침윤 감소에 효과적임을 확인하였다.

<1-3> 암세포주에서 C12orf59 과발현에 의한 인테그린의 발현 억제

인테그린 알파 5(ITGA5)의 프로모터 영역은 AP-1 site를 포함하고 있으며, 전사인자 AP-1이 ITGA5의 발현을 유도함이 보고된바 있으므로, 전사인자 AP-1의 활성이 감소됨으로써 ITGA5의 발현이 감소되는 것으로 유추할 수 있으며, 암세포 침윤 및 상처치유에 관여하며, 대장암세포 중 침윤능이 낮은 세포보다 침윤능이 높은 세포에 높게 발현됨이 보고되었으며, 인테그린 알파 5가 암세포 이동 및 침윤능에 기여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 암 세포주에서 C12orf59 과발현에 의한 침윤 능력 감소가 암세포 이동 및 침윤능에 기여하는 것으로 알려진 인테그린 알파 5에 의한 것인지 확인하였다.

이를 위해, 대장암 세포주 SW480에 C12orf59 과발현 벡터와 리포터 벡터인 인테그린 알파 5 프로모터-리포터(Integrin α 5 promoter-reporter, ITGA5 promoter-reporter) 및 AP-1 cis element(AP-1 cis-Reporting system, Stratagene) 리포터 벡터를 함께 발현시켜 luciferase assay을 통해 각 프로모터의 활성변화를 확인하였다.

구체적으로, 2.5×10⁵개의 SW480 세포를 6-웰 플레이트에 분주한 후, 24시간 후에 상기 <실시예 4>에서 제조된 2 ug의 리포터 플라스미드 DNA와 1.8 ug의 pcDNA-myc, pcDNA-C12orf59-isoform1-myc, pcDNA-C12orf59-isoform2-myc, 및 pcDNA-C12orf59-isoform1del-myc 벡터를, Lipofectamine2000 reagent(invitrogen)로 함께 형질전환시켰다. 형질전환 48시간 후, luciferase activity를 Dual-luciferase reporter assay system(Promega)로 측정하였으며, 형질전환 효율은 0.2 ug의 Renila luciferase 벡터 pRL-TK(Promega)를 함께 형질전환하여 측정한 Renilla luciferase activity 측정값을 이용하여 확인하였다.

그 결과, C12orf59 단백질과 AP-1 cis element 및 ITGA5 프로모터가 함께 도입된 세포주에서, AP-1 cis element 및 ITGA5 프로모터의 활성이 C12orf59 과발현에 의해 감소하였으며, 그 중 pcDNA-C12orf59-isoform1del-myc 벡터에 의한 효과가 가장 우수함을 확인하였다(도 6a 및 6b).

또한, 대장암 세포주인 HCT-15에 pcDNA-myc, pcDNA-C12orf59-isoform1-myc, pcDNA-C12orf59-isoform2-myc, pcDNA-C12orf59-isoform1del-myc 및 AP-1 cis element(AP-1 cis-Reporting system, Stratagene) 리포터 벡터를 Lipofectamine 2000 시약을 통해 상기와 동일한 방법으로 형질전환한 지 48시간 후, luciferase assay을 통해 AP-1 cis-element 프로모터의 활성을 확인하였다.

그 결과, HCT-15 세포주에서도 C12orf59의 발현에 의해 전사인자 AP-1의 활성이 감소한 것을 확인하였으며(도 7a), AP-1의 주요 구성요소인 c-jun의 인산화 정도가 감소한 것을 확인하였다(도 7b 및 7c).

이를 통해, 암 세포주에서 C12orf59에 의한 침윤 억제는 전사인자 AP-1의 활성저해 및 integrin α 5의 발현저해를 통해 이루어졌음을 확인하였다.

< 실험예 2> 암세포주에서 C12orf59 의 발현 억제 효과

<2-1> 암세포주에서 C12orf59 의 발현 억제에 의한 세포의 형태학적 변화

암세포주에서 C12orf59의 발현을 억제하고 세포의 형태학적 변화를 확인하기 위하여, C12orf59 특이적 siRNA를 대장암 세포주인 SW480에 전기천공기법을 이용하여 형질전환하고, 세포 내 C12orf59의 발현량 변화 및 세포 형태 변화를 확인하였다.

구체적으로, SW480 세포를 수확한 뒤, PBS로 세척하고, R buffer에 3×10⁵세포/12 ul의 농도로 재현탁한 뒤, 40 uM siRNA 2 ul를 첨가하고 전기천공 기기(Neon Transfection system, Invitrogen)를 이용하여 형질전환하였으며, 이후 그 발현 저해를 RT-PCR로 확인하였다. 이때, 사용한 C12orf59-특이적 siRNA는 Dharmacon 社에서 구입하였으며(4종의 mixture), 그 표적 서열 4종은 하기와 같다:

5'-GGG UAC AUC UCU GGU AUA U-3'(서열번호 7),

5'-UCA CAU CUC UGC AGU CGG U-3'(서열번호 8),

5'-GAA UAG UUG ACU CUU GGA A-3'(서열번호 9), 및

5'-GGU UCU UAC UCU UCG UUC A-3'(서열번호 10).

또한, 세포의 형태는 C12orf59 siRNA를 형질전환하고 48시간 후, 세포모양을 관찰하고, 올림푸스 현미경을 이용하여 100 X 배율에서 사진을 찍어 비교 분석하였다.

그 결과, SW480 세포주에 C12orf59-특이적 siRNA(Dharmacon)을 도입하고 48시간 후, RT-PCR을 통해 C12orf59의 발현이 저해됨을 확인하였고(도 8a), 세포 형태 변화를 관찰하여 C12orf59 발현 저해로 인해 세포 퍼짐 및 lamellipodia의 형성이 증가함을 확인하였다(도 8b).

<2-2> 암세포주에서 C12orf59 발현 억제에 의한 침윤능 변화

암세포주에서 C12orf59의 발현 억제에 의한 암세포 침윤능력의 변화를 분석하기 위하여, C12orf59-특이적 siRNA(Dharmacon) 및 대조군 siRNA(센스 가닥 5'-CUU ACG CUG AGU ACU UCG ATT-3'(서열번호 11), 안티-센스 가닥 5'-UCG AAG UAC UCA GCG UAA GTT-3'(서열번호 12), 삼천리제약)를 SW480 세포주에 형질전환(transfection)하고, 48시간 뒤 침윤 분석(invasion assay)을 수행하였다.

구체적으로, 24-웰 트렌스웰 플레이트(8 ㎛ pore size; Costar, 미국)의 다공성 막을 무혈청(serum free) 배지로 희석된 250 ㎍/㎖ 농도의 100 ㎕ 마트리젤(BD Biosciences, 미국)로 코팅하였고, 실온에서 1시간 동안 방치하여 고형화시켰다. 트렌스웰 플레이트의 하층은 화학유인물(chemoattractant)로서 20 ㎍/㎖ 농도의 콜라겐 타입 I(Sigma) 100 ㎕를 이용하여 코팅하였다. 무혈청 배지에서 재현탁한 3×10⁴ 개의 SW480 세포를 상층 챔버(chamber)에 분주하였고, 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 배양하면서 상층 챔버에서 하층 챔버로 이동하도록 하였다. 전이되지 않은 세포는 상층 챔버의 표면에서 제거하였고, 하층 챔버로 전이한 세포는 PBS에 녹인 3.7% 파라포름알데하이드로 고정한 다음, 2% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 여분의 크리스탈 바이올렛 용액을 증류수로 세척한 다음, 선택 면적(×200)의 사진을 찍고, 전이한 세포 수는 5개의 선택 면적에서 계수하였다. 실험은 동일한 조건에서 듀플리케이트하여 수행하였고, 최소 2회 이상 반복한 수 대표결과를 나타내었으며, 데이터 값은 ×200 배율당(HPF) 전이세포±표준편차의 수를 반영하였다.

그 결과, C12orf59의 발현 저해로 인해 암세포의 침윤이 증가함을 확인하였고(도 8c), 이를 통해 암세포주에서 C12orf59 발현이 억제됨으로써, 암세포의 형태변화가 일어나고, 세포 이동성이 증가되며, 결과적으로 암세포의 침윤능을 증가시킴을 확인하였다.

또한, 대장암 세포주인 HCT-15에도 C12orf59-특이적 siRNA(삼천리제약)을 microporation기법으로 도입하고 48시간 후, 콜라겐 및 마트리젤이 코팅된 트랜스웰을 이용한 실험을 통해, C12orf59의 발현이 억제됨으로 인해 HCT-15 세포주에서 침윤이 증가함을 확인하였다(도 9a 및 9b).

<2-3> 암세포주에서 C12orf59 발현 억제에 의한 암세포 생존능 변화 확인

C12orf59 siRNA에 의한 발현 저해가 암세포의 생존능에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, anchorage 비의존적인 조건(세포 미부착 조건)에서 세포생존율을 측정하였다.

구체적으로, 96-웰 플레이트에 12 mg/ml의 poly-HEMA(Sigma) 100 ul을 넣고 하루 동안 clean bench에 방치한 후 건조시킨 다음, 다음날 1회 더 코팅하고, Poly-HEMA가 코팅된 플레이트에 siRNA를 형질전환시킨 다음, 48시간 지난 후, 세포를 1×10⁴개로 희석하여, 웰당 100 ul씩 플레이팅하였다. 이때, 무혈청 배지를 사용하였고, 72시간 후에 각 웰에 10 ul의 CCK-8 시약(Dojindo cat. CK04-13)을 넣고 3시간 동안 반응시켜 발색반응을 유도하고, OD450 nm에서 그 흡광도를 측정하여 세포 생존 정도를 확인하였다.

그 결과, 암세포에 대조군 siRNA를 처리했을 때에 비해, C12orf59 siRNA를 처리하여 그 발현을 저해함으로써, 암세포의 생존이 증가함을 확인하였고(도 10), 이를 통해 C12orf59의 발현 억제가 anoikis(미부착상태에서의 세포사멸)-저항성을 유도함을 확인하였다.

<2-4> 암세포주에서 C12orf59 발현 억제에 의한 신호전달 활성화의 확인

암세포주에서 C12orf59 siRNA에 의한 세포신호전달 체계의 활성화 정도를 확인하기 위하여, 대장암 세포주인 SW480 세포주에 C12orf59 특이적 siRNA를 도입하고 48시간 경과 후 얻어진 세포 용해물을 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.

구체적으로, 세포는 RIPA 완충용액(10 mM Tris, pH7.2, 150 mM NaCl, 1% deoxycholate, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1 mM sodium orthovanadate, 50 mM NaF, 1 mM PMSF, complete protease inhibitor)으로 파쇄하고, 세포 용해물은 상업적으로 이용가능한 변형된 Bradford 분석(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 이용하여 정량하였다. 이후, 얻어진 세포 용해물 30 ug을 SDS 시료 버퍼와 혼합하여 가열한 다음, 8% SDS-PAGE 겔에 전기영동하였다. 전기영동을 통해 SDS-PAGE 상에서 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 이동시키고, 5% 스킴 밀크 (skim milk)로 블락킹(blocking)하였다. 이후, 항-beta-actin 항체(1:1000 희석: Santa Cruz), 항-인산화-ERK1/2 항체, 항-ERK1/2 항체, 항-인산화-p38 항체, 항-p38 항체, 항-인산화-JNK 항체, 항-JNK 항체(1:1000, Cell signaling technology)를 1차 항체로 하여 반응시킨 다음, 홀스레디쉬 퍼올시데이즈(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반응시키고, ECL 키트(ECL Plus, Amersham, USA)를 제조사의 방법대로 처리하여 발색 반응을 유도하였다.

그 결과, C12orf59의 발현저해에 의해, ERK1/2, p38 및 JNK의 인산화가 증가되었음을 확인하였고(도 11), 이를 통해, MAPK 활성화가 C12orf59 발현 저해에 의해 유도되는 암세포의 침윤 및 세포생존에 기여했음을 확인하였다.

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

C12orf59 단백질 또는 이의 단편 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

C12orf59 단백질 또는 이의 단편 100

옥수수전분 100

유 당 100

스테아린산 마그네슘 2

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

C12orf59 단백질 또는 이의 단편 100

옥수수전분 100

유 당 100

스테아린산 마그네슘 2

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

5. 주사제의 제조

C12orf59 단백질 또는 이의 단편 10 /

묽은 염산 BP pH 7.6로 될 때까지

주이용 염화나트륨 BP 최대 1

적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 C12orf59 단백질을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

6. 환의 제조

C12orf59 단백질 또는 이의 단편 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

7. 과립의 제조

C12orf59 단백질 또는 이의 단편 150

대두 추출물 50

포도당 200

전분 600

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100을 첨가하여 60에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편은 암세포의 침윤 및 생존능을 효과적으로 저해시키므로, C12orf59 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 유용하게 이용할 수 있을 뿐 아니라, C12orf59는 암의 진단 및 치료제 후보물질의 스크리닝을 위한 방법에 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Pharmacological composition containing a C12orf59 protein or a polynucleotide encoding C12orf59 for the prevention and treatment of cancer <130> 11p-06-53 <150> 10-2010-0100845 <151> 2010-10-15 <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Val Arg Val His Val Val Ala Ala Ser Ala Leu Leu Tyr Phe 1 5 10 15 Ile Leu Leu Ser Gly Thr Arg Cys Glu Glu Asn Cys Gly Asn Pro Glu 20 25 30 His Cys Leu Thr Thr Asp Trp Val His Leu Trp Tyr Ile Trp Leu Leu 35 40 45 Val Val Ile Gly Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Leu Thr Ser Leu Cys 50 55 60 Phe Arg Cys Cys Cys Leu Ser Arg Gln Gln Asn Gly Glu Asp Gly Gly 65 70 75 80 Pro Pro Pro Cys Glu Val Thr Val Ile Ala Phe Asp His Asp Ser Thr 85 90 95 Leu Gln Ser Thr Ile Thr Ser Leu Gln Ser Val Phe Gly Pro Ala Ala 100 105 110 Arg Arg Ile Leu Ala Val Ala His Ser His Ser Ser Leu Gly Gln Leu 115 120 125 Pro Ser Ser Leu Asp Thr Leu Pro Gly Tyr Glu Glu Ala Leu His Met 130 135 140 Ser Arg Phe Thr Val Ala Met Cys Gly Gln Lys Ala Pro Asp Leu Pro 145 150 155 160 Pro Val Pro Glu Glu Lys Gln Leu Pro Pro Thr Glu Lys Glu Ser Thr 165 170 175 Arg Ile Val Asp Ser Trp Asn 180 <210> 2 <211> 163 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Trp Arg Pro Gln Pro Cys Cys Ile Ser Ser Cys Cys Leu Thr 1 5 10 15 Thr Asp Trp Val His Leu Trp Tyr Ile Trp Leu Leu Val Val Ile Gly 20 25 30 Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Leu Thr Ser Leu Cys Phe Arg Cys Cys 35 40 45 Cys Leu Ser Arg Gln Gln Asn Gly Glu Asp Gly Gly Pro Pro Pro Cys 50 55 60 Glu Val Thr Val Ile Ala Phe Asp His Asp Ser Thr Leu Gln Ser Thr 65 70 75 80 Ile Thr Ser Leu Gln Ser Val Phe Gly Pro Ala Ala Arg Arg Ile Leu 85 90 95 Ala Val Ala His Ser His Ser Ser Leu Gly Gln Leu Pro Ser Ser Leu 100 105 110 Asp Thr Leu Pro Gly Tyr Glu Glu Ala Leu His Met Ser Arg Phe Thr 115 120 125 Val Ala Met Cys Gly Gln Lys Ala Pro Asp Leu Pro Pro Val Pro Glu 130 135 140 Glu Lys Gln Leu Pro Pro Thr Glu Lys Glu Ser Thr Arg Ile Val Asp 145 150 155 160 Ser Trp Asn <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C12orf59 forward primer <400> 3 cagccctgct gtatttcatc c 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C12orf59 reverse primer <400> 4 ggccaaacac cgactgcag 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 5 gctcgtcgtc gacaacggct c 21 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer <400> 6 caaacatgat ctgggtcatc ttctc 25 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C12orf59 specific siRNA <400> 7 ggguacaucu cugguauau 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C12orf59 specific siRNA <400> 8 ucacaucucu gcagucggu 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C12orf59 specific siRNA <400> 9 gaauaguuga cucuuggaa 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C12orf59 specific siRNA <400> 10 gguucuuacu cuucguuca 19 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control siRNA <220> <223> control siRNA-sense <400> 11 cuuacgcuga guacuucgat t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control siRNA antisense <220> <223> control siRNA <400> 12 ucgaaguacu cagcguaagt t 21 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA-myc forward primer <400> 13 ctcagaagag gatctgtaaa gcgccgtcga ccatc 35 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA-myc reverse primer <400> 14 gatggtcgac ggcgctttac agatcctctt ctgag 35 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA-C12orf59-isoform1-myc forward primer <400> 15 aacatctcga ggccgccatg ggagtccgag ttcat 35 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA-C12orf59-isoform1-myc reverse primer <400> 16 aattcaagct tgttccaaga gtcaactatt cg 32 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA-C12orf59-isoform1del-myc forward primer <400> 17 aacatctcga ggccgccatg ggagtccgag ttcat 35 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA-C12orf59-isoform1del-myc reverse primer <400> 18 aattcaagct tgcggaagca cagggac 27 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA-C12orf59-isoform1 forward primer <400> 19 aacatctcga ggccgccatg ggagtccgag ttcat 35 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA-C12orf59-isoform1 reverse primer <400> 20 aattcaagct ttcagttcca agagtcaact attcg 35 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA-C12orf59-isoform2-myc forward primer <400> 21 aacatctcga ggccgccatg tcgtggcggc ctc 33 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA-C12orf59isoform2-myc reverse primer <400> 22 aattcaagct tgttccaaga gtcaactatt cg 32 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA-C12orf59isoform2 forward primer <400> 23 aacatctcga ggccgccatg tcgtggcggc ctc 33 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA-C12orf59isoform2 reverse primer <400> 24 aattcaagct ttcagttcca agagtcaact attcg 35 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human integrin a5 promoter-forward primer <400> 25 ccgctcgagg agctgaaggt tgggtcc 27 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human integrin a5 promoter-reverse primer <400> 26 ccgctcgagc cgtctgttcc cggc 24 <210> 27 <211> 66 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Gly Val Arg Val His Val Val Ala Ala Ser Ala Leu Leu Tyr Phe 1 5 10 15 Ile Leu Leu Ser Gly Thr Arg Cys Glu Glu Asn Cys Gly Asn Pro Glu 20 25 30 His Cys Leu Thr Thr Asp Trp Val His Leu Trp Tyr Ile Trp Leu Leu 35 40 45 Val Val Ile Gly Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Leu Thr Ser Leu Cys 50 55 60 Phe Arg 65

Claims

C12orf59(chromosome 12 open reading frame 59) 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
C12orf59(chromosome 12 open reading frame 59) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 C12orf59(chromosome 12 open reading frame 59) 단백질 또는 이의 단편은 하기 1) 내지 3)의 아미노산 서열로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물:
1) 서열번호 1 또는 2로 나타내는 아미노산 서열;
2) 서열번호 1 또는 2의 일부분으로 나타내는 아미노산 서열; 및
3) 서열번호 1 또는 2와 80% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단편은 서열번호 27로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 암은 대장암, 위암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 세포는 조혈 줄기세포, 수지상 세포, 자가이식 종양세포(autologous tumor cells) 및 정착 종양세포(established tumor cells)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 발현량을 측정하는 단계;
2) 단계 1)의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 발현량을 비교하는 단계; 및
3) C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
제 9항에 있어서, 단계 1)의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 발현량은 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 검출하는 것을 특징으로 하는 단백질 검출 방법.
1) 피검 화합물 또는 조성물을 C12orf59 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
1) 피검 화합물 또는 조성물을 C12orf59 단백질 또는 이의 단편에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 활성을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 활성이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 C12orf59 단백질 또는 이의 단편의 활성과 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
제 9항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C12orf59(chromosome 12 open reading frame 59) 단백질 또는 이의 단편은 하기 1) 내지 3)의 아미노산 서열로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법:
1) 서열번호 1 또는 2로 나타내는 아미노산 서열;
2) 서열번호 1 또는 2의 일부분으로 나타내는 아미노산 서열; 및
3) 서열번호 1 또는 2와 80% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열.
제 9항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단편은 서열번호 27로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 대장암, 위암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.