KR20120034503A

KR20120034503A - 신규한 트리코스타틴 유도체 및 이를 포함하는 항암제

Info

Publication number: KR20120034503A
Application number: KR1020100096108A
Authority: KR
Inventors: 윤여준; 박제원
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-01
Filing date: 2010-10-01
Publication date: 2012-04-12
Also published as: KR101189756B1

Abstract

본 발명은 신규한 트리코스타틴(Trichostatin) 유도체, 및 이를 포함하는 항생제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하기 화학식 1로 표시되는 트리코스타틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법, 및 이를 유효성분으로 하는 항생제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 트리코스타틴 A로부터 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)를 이용한 바이오 생전환 기술을 이용하여 제조된, 신규한 트리코스타틴 유도체는 우수한 항진균 및 항암 활성을 나타내므로, 항생제 또는 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.
[화학식 1]

Description

신규한 트리코스타틴 유도체 및 이를 포함하는 항암제{New Trichostatin analog and anti-tumor agent including this}

본 발명은 신규 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규한 트리코스타틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법, 및 이를 유효성분으로 하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

트리코스타틴 A(Trichostatin A)는 토양 박테리아인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Strpetomyces hygroscopicus)로부터 분리된 것으로서, 천연 히드록사메이트(hydroxamates) 중 하나이다(비특허문헌 1 참조). 트리코스타틴 A는 원래 항진균 항생제로 발견되었으며, 또한 광범위 스펙트럼의 후생적 활성을 가지는 히스톤 디아세틸라제 억제제(histone deacetylase inhibitors) 중 하나로 알려져, 항암제로서 잠재적인 용도가 고려되고 있다(비특허문헌 2-4 참조).

실제로, 다양한 암세포주에 있어서 히스톤 디아세틸라제의 과활성(over-activation)은 히스톤 하이포아세틸화(hypoacetylation)를 야기하며, 이에 히스톤 디아세틸라제 억제제는 히스톤 디아세틸라제를 특이적으로 표적화하여 그것들을 기능적으로 비활성하게 만든다. 여러 히스톤 디아세틸라제 억제제가 백혈병 및 고형암의 치료를 위해 임상적 시도가 있어왔으며, 일부는 승인을 받고 시장화되었다. 예를 들면, 트리코스타틴 A의 화학적 합성 유사체(mimic)로서 피부의 T 세포 리프종의 치료용으로 사용되는, 보리노스타트(vorinostat)가 있다(비특허문헌 5-6 참조).

트리코스타틴 A는 이전에 신경교종 세포(glioma cell) 및 방광암 세포(bladder cancer cell)와 같은 다양한 암세포주에 대해 항암 활성을 가하는 것으로 보고된 바 있다(비특허문헌 7-9 참조). 최근에, 트리코스타틴 A는 소세포성 폐암(small cell lung cance, SCLC) 세포주의 세포 성장 및 증식을 감소시켜 치료할 수 있다고 보고되었다(비특허문헌 10 참조). 그러므로, 암 치료에 있어서 트리코스타틴 A의 잠재성은 구조적으로 변형된 트리코스타틴 유도체에 대한 관심을 유발한다.

이를 달성하기 위해서, 다음과 같은 두가지 접근 전략이 있을 수 있다; 하나는 일반적으로 반합성 방법(semi-synthetic method)으로 불리는 천연물의 화학적 전환(chemical transformation) 접근이고, 또다른 하나는 생체촉매로서 미생물을 이용하는 생전환(biotransformation) 접근이다. 화학적 방법이 낮은 선택성, 알켄의 로듐 금속을 촉매로 하는 수소화에 의해 예시되는 낮은 에너지 효율성 및 환경 비 친화적 단점을 갖고 있는 반면에(Wilkinson’s catalyst)(비특허문헌 11 참조), 미생물 전환은 높은 선택성, 에너지 효율성, 및 환경친화적이라는 장점을 갖고 있다.

그러나, 지금까지 트리코스타틴 A의 미생물 전환을 시도한 보고는 전무하다.

최근에, 본 발명자들은 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)에 의해, 불포화된 고리형 마크로라이드에 대한 독특하고 부위-특이적인 수소화 활성을 보고한 바 있으며, 이런 박테리아 바이오-수소화 시스템(bio-hydrogenation system)은 표적 이중 결합, 즉 하나의 인접한 탄소의 카르보닐 작용기와 또다른 인접한 탄소의 메틸기 주위에서 특이적인 구조적 꾸밈을 인지할 수 있다. (화학식 1의 음영의 직사각형으로 표시된 부분 참조).(비특허문헌 12 참조).

이에, 본 발명자들은 트리코스타틴 A에 대한 독특한 생체 촉매(biocatalyst) 실용성의 인지 및 확대를 시도하고자 연구한 결과, 트리코스타틴 A를 첨가한 배지에서 배양한 스트렙토마이세스 베네주엘래(S. venezuelae) 배양액으로부터, 이전에 특정되지 않은 2,3-디하이드로트리코스타틴 A(2,3-dihydrotrichostatin A)를 분리하였으며, 상기 2,3-디하이드로트리코스타틴 A의 구조를 분석하고, 항진균 및 항종양 활성과 같은 생리활성 잠재성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

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본 발명의 목적은 신규한 트리코스타틴 유도체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 트리코스타틴 유도체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 트리코스타틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항생제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 트리코스타틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 트리코스타틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 트리코스타틴 유도체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 트리코스타틴 유도체 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 항생제 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 트리코스타틴 유도체 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물을 제공한다.

본 발명은 미생물의 생전환 기법을 도입하여, 기존의 항진균 및 항암 활성을 가진 것으로 알려져 있는 트리코스타틴 A에 구조 내 이중결합을 치환시킨 신규한 트리코스타틴 A 유도체인 2,3-디하이드로트리코스타틴 A를 개발하였으며, 상기 2,3-디하이드로트리코스타틴 A는 기존의 트리코스타틴 A와 유사한 항진균 활성을 나타내고 2배로 우수한 항암 활성을 나타냄으로써, 상기 신규 2,3-디하이드로트리코스타틴 A를 항생제 또는 항암제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

도 1은 트리코스타틴 A가 첨가된 배지에서 스트렙토마이세스 베네주엘래(S. venezuelae)가 배양된 배양액으로부터 획득된 유기체 추출물의 HPLC-ESI-MS 크로마토그램을 나타내는 그림이다. 여기서, 트리코스타틴 A 및 2,3-디하이드로트리코스타틴 A로 표지된 피크는 분자[M+H]+ 이온 303 및 305에서 각각 선별되었다.
도 2는 트리코스타틴 A 및 이의 생전환 유도체인 2,3-디하이드로트리코스타틴 A의 ESI-MS/MS 스펙트럼을 보여주는 그림이다.
도 3은 CDCl₃에서 트리코스타틴 A 및 이의 생전환 유도체인 2,3-디하이드로트리코스타틴 A의 ¹H-NMR 스펙트럼을 보여주는 그림이다:
a: 트리코스타틴 A; 및
b: 2,3-디하이드로트리코스타틴 A.
도 4는 CDCl₃에서 트리코스타틴 A 및 이의 생전환 유도체인 2,3-디하이드로트리코스타틴 A의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 보여주는 그림이다:
a: 트리코스타틴 A; 및
b: 2,3-디하이드로트리코스타틴 A.
도 5는 트리코스타틴 A 및 이의 생전환 유도체인 2,3-디하이드로트리코스타틴 A의 사카로마이세스 세레비아제(Saccharomyces cerevisiae) 효모 종에 대한 항진균 활성을 보여주는 그림이다.
도 6은 트리코스타틴 A 및 이의 생전환 유도체인 2,3-디하이드로트리코스타틴 A의 인간 SCLC DSM53 세포주에 대한 항암 활성을 보여주는 그림이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 트리코스타틴 유도체를 제공한다.

상기 트리코스타틴 유도체는 트리코스타틴 A로부터 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)에 의해 생전환되어 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 화학적 합성 등에 의해 제조된 것을 모두 포함한다.

상기 트리코스타틴 유도체는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 효모 종에 대하여 우수한 항진균 활성을 갖는 것이 바람직하고, 사카로마이세스 세레비아제(Saccharomyces cerevisiae) 효모 종에 대하여 우수한 항진균 활성을 갖는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 트리코스타틴 유도체는 암세포주에 대하여 우수한 항암 활성을 갖는 것이 바람직하고, 소세포성 폐암 세포주에 대하여 우수한 항암 활성을 갖는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 트리코스타틴 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 아세트산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 무기산으로는 염산, 유기산으로는 메탄설폰산을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 트리코스타틴 유도체는 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 이어서 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 신규 트리코스타틴 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로,

1) 트리코스타틴 A를 첨가한 배지에서 스트렙토마이세스 속 균주를 배양하는 단계;

2) 단계 1)에서 배양된 배양액을 유기용매로 추출하는 단계;

3) 단계 2)의 유기체 추출물을 진공 하에 농축시키는 단계; 및

4) 단계 3)의 잔여물을 유기용매로 용해시킨 후 분리하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 스트렙토마이세스 속 균주는 스트렙토마이세스 베네주엘래(S. venezuelae)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 유기용매는 에틸아세테이트(EtOAc)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 유기용매는 메탄올(MeOH)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 분리는 크로마토그래피를 이용할 수 있으며, HPLC(High-performance liquid chromatography)을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 한가지 실시태양에서는 preparative HPLC를 이용하여 유지시간(Retention time)이 35 내지 38분에서 상기 화합물을 분리할 수 있었다.

본 발명에 따른 제조방법은 화학적 합성법이 아닌 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae) 토양 미생물을 이용한 바이오 생전환 기술을 활용하여 제조하는데 그 특징이 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 트리코스타틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항생제 조성물을 제공한다.

상기 항생제는 항진균용 항생제인 것이 바람직하고, 사카로마이세스 속 진균에 대한 항생제인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한가지 실시태양에서는 본 발명에 따른 신규 트리코스타틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능함 염이 기존의 항생 활성이 알려진 트리코스타틴 A와 비교하여 사카로마이세스 세레비아제(Saccharomyces cerevisiae)에 대하여 유사한 항진균 활성을 나타내었다. 따라서 본 발명에 따른 신규 트리코스타틴 유도체는 새로운 항생제로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

아울러, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 트리코스타틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물을 제공한다.

상기 암은 히스톤 디아세틸라제가 과활성되는 백혈병 또는 고형암은 모두 포함하며, 소세포성 폐암, 유방암, 대장암, 췌장암, 난소암, 전립선암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며, 소세포성 폐암인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한가지 실시태양에서는 본 발명에 따른 신규 트리코스타틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능함 염이 기존의 항암 활성이 알려진 트리코스타틴 A와 비교하여 소세포성 폐암에 대하여 2배 이상의 우수한 항암 활성을 나타내었다. 따라서 본 발명에 따른 신규 트리코스타틴 유도체는 새로운 항암제로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 상기 화학식 1로 표시되는 트리코스타틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 트리코스타틴 유도체를 유효 성분으로 하는 약학 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.

이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1의 트리코스타틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위한 실시예를 제시한다.

그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 설명하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 트리코스타틴 A 유도체의 제조

<1-1> 트리코스타틴 A의 생물전환

피크로마이신 폴리케타이드 합성효소(pikromycin polyketide synthase)를 암호화하는 유전자 및 데소사민(desosamine) 생합성 유전자가 모든 제거된, S. venezuelae YJ028의 재조합 돌연변이 종[Park, J. W. 등(Chem. Commun. 2008, 44, 5782-5784)에 기재된 종을 사용]을 우선, SPA(sorbitol pyroglutamic acid) 아가 플레이트[0.1% 효모 추출물, 0.1% 쇠고기 추출물, 0.2% 트립토즈(tryptose), 1.0% 글루코즈(glucose), 1.5% 아가, 및 미량의 FeSO₄]에서 분리를 위해 획선화(streak)한 다음, 2일 동안 30℃에서 배양하였다. 그런 다음, 칸막이된 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에서 30℃에서 2일 동안 50 ml의 SCM 배지[1.5% 수용성 전분(soluble starch), 2.0% 소이톤(soytone), 0.01% CaCl₂, 0.15% 효모 추출물(yeast extract), 및 1.0% MOPS]에서 배양된 배양액에 트리코스타틴 A(Sigma, St. Louis, MO)를 첨가(250 ㎍; 최종 농도 5 ㎍/mL; 100 uL의 MeOH로 용해된)한 다음, 3일 동안 더 배양하였다. 모든 실험은 적어도 세 번 독립적으로 수행하였다.

<1-2> 트리코스타틴 A 유도체의 추출 및 분리

상기 실시예 <1-1>의 전체 배양액을 250 mL의 분별깔때기에서 두 번 평균부피의 EtOAc를 이용하여 추출 및 분리한 다음, 상기 유기체 추출물을 진공 하에 농축시켰다. 건조된 잔여물을 즉시 200 uL의 MeOH로 용해시켰으며, 상기 용매의 일부를 분석에 이용하였다. 우선, Micromass Quattro micro MS에 직접 연결된 분석 역상 Nova-Pak C₁₈ 컬럼(Waters, Milford, MA; 150 × 3.9 mm, 4.0 μm)으로 구성된 Waters/Micromass Quattro micro/MS 접속기를 이용하여 분석을 수행하였다.

그 결과, YJ028 종의 여러 배치배양액으로 상기 트리코스타틴 A를 첨가함으로써, 트리코스타틴 A에 대응하는 환원된 트리코스타틴 유도체를 약 18%의 변환율로 발생하는 것을 확인하였다(도 1 참조).

그런 다음, 이런 새로운 트리코스타틴 유도체는 분취 역상 HPLC, 및 수집된 각 분획(5 mL/분획)의 연속적 ESI-MS 분석을 이용하여 크로마토그래피 분리에 의해 정제하였으며, 이들의 화학적 구조는 ¹H- 및 ¹³C-NMR 분광분석법을 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 크로마토그래피 분리는 Watchers 120 ODS-BP 컬럼(250 × 10.0 mm, 5.0 μm)으로 구성된 preparative HPLC를 이용하여 수행하였다. 또한, ¹H- 및 ¹³C-NMR 분광분석법은 다음과 같이 수행하였다. NMR 시료들은 200 uL의 CDCl₃에서 트리코스타틴 유도체를 용해시킨 후, 상기 용매에 적절한 5 mm Shigemi advanced NMR 마이크로튜브(Sigma, St. Louis, MO)에 상기 용매를 방치시킴으로써 제조하였다. ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 Varian INOVA 500 분광광도계를 이용하여 298 K에서 획득하였고, 화학적 이동은 내부 준거로서 TMS를 이용하여 ppm으로 기록되었다. 모든 NMR 데이타 산출은 Mnova Suite 5.3.2 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.

양성자 분자 이온을 나타내는 m/z 303에서 트리코스타틴 A의 MS/MS 스텍트럼은 기존에 보고된 것과 정확히 동일하게 m/z 148, 177 및 270에서 두서너개의 절편 이온들을 보여주었다(비특허문헌 13 참조). 반면에, 트리코스타틴 유도체의 MS/MS 스텍트럼은 트리코스타틴 A의 전형적인 m/z 148 및 177에서 일부 절편 이온을 보여줄 뿐만 아니라, 트리코스타틴 A로부터 생성된 m/z 270에서 생성 이온과 2 Da이 차이가 나는 m/z 272에서 특이적인 생성 이온을 보여주었다(도 2 참조). 이런 결과는 트리코스타틴 유도체에서 C2, 3 및 C4, 5에 존재하는 두 개의 이중결합 중 하나가 감소된 것을 제시하는 것이다.

트리코스타틴 A 및 이의 유도체 2,3-디하이드로코스타틴 A의 NMR 분광 데이타(500 MHz, CDCl₃)

	2,3-디하이드로트리코스타틴 A		트리코스타틴 A
위치	δ _C, mult	δ _H, mult	δ _C	δ _H
1	172.2, C	-	166.1	-
2	029.8, CH₂	2.26, t	117.5	5.27
		2.22, ddd
3	036.2, CH₂	2.20, m	145.0	7.41
		2.17, ddd
4	134.1, C	-	132.8	-
5	133.6, CH	5.47, d	140.1	5.68
6	040.9, CH	3.83, dq	40.8	3.84
7	199.6, C	-	199.4	-
8	123.7, C	-	123.8	-
9, 13	130.8, CH	7.78, d	130.8	7.78
10, 12	110.8, CH	6.82, d	110.8	6.83
11	153.6, C	-	153.6	-
14	16.0, CH₃	1.82, s	12.6	2.21
15	17.7, CH₃	0.94, d	17.8	0.93
16	39.9, CH₃	3.05, s	39.9	3.05

트리코스타틴 A 및 그의 환원된 유도체의 ¹H-NMR 분광 데이타의 비교를 통해, 상기 유도체에서 관찰되는 가장 명백한 변화는, 트리코스타틴 A에서 올레핀 프로톤(olefinic proton)(H-2,3)에 대한 전형적인 5.27 및 7.41 ppm의 신호의 결핍이었다. 모 화합물(parent compound)의 C-2 및 C-3 신호(각각 117.5 및 145.0 ppm에서 29.8 및 36.2 ppm)의 업필드 이동(upfield shift)은 상기 ¹H-NMR 데이타를 통해 확인된 차이를 지지하는 것이며, 이는 상기 생전환 유도체가 C-2,3 이중 결합이 감소되었음을 입증하는 것이다(도 3 참조). 이런 결과는 2,3-디하이드로트리코스타틴A(2,3-dihydrotrichostatin A)가 다양한 고리 마크로라이드들 뿐만 아니라 불포화 직쇄 유사 하이드록사메이트(hydroxamate)에 대한 생체경화(biohydrogenation)를 위한 부위 선택적인 활성(regio-selective activity)을 포함하는, S. venezuelae에 의한 생전환이 되는 것을 보여주는 것이다(비특허문헌 12 참조).

< 실시예 2> 트리코스타틴 A 유도체의 항진균 활성 확인

트리코스타틴 A 유도체의 항진균 활성을 알아보기 위해, ATCC(American Type Culture Collection)(Manassas, VA)로부터 획득한 사카로마이세스 세레비아제(Saccharomyces cerevisiae) ATCC 9763을 이용하여 항진균 활성을 확인하였다.

구체적으로, 사카로마이세스 세레비아제(Saccharomyces cerevisiae) ATCC 9763을 30℃에서 Antibiotic 19(Difco, BD Biosciences, San Jose, CA)에서 배양 및 유지시켰다. 그런 다음, 트리코스타틴 A 및 이에 대응하는 2,3-디하이드로트리코스타틴 A를 사카로마이세스 세레비아제에 처리하였다. 임상 및 실험 표준화 기관(Clinical and Laboratory Standard Institute; CLSI)에 의해 권장되는 미량희석법(microdilution method)을 이용하여, 사카로마이세스 세레비아제에 대한 항균 활성을 측정하였다(비특허문헌 16 참조). 이런 하이드록삼산(hydroxamic acids)의 연속적인 2배 희석은 최종 농도가 12.5-200 ㎍/mL가 되도록 DMSO를 이용하여 수행하였고, DMSO의 부분 표본(최종 0.1%)은 음성 대조군으로 사용하였다. 사카로마이세스 세레비아제의 성장은 Labsystems Bioscreen C 리더기를 이용하여 600 nm에서 모니터하였으며, 시험 미생물의 성장을 억제하는 broth 배지에서 희석된 하이드록사메이트(hydroxamate)의 최저 농도는 MIC를 이용하여 결정하였다. 모든 분석은 세번 수행하였다.

트리코스타틴 A 및 이의 유도체 2,3-디하이드로트리코스타틴 A의 MIC 비교

	트리코스타틴 A	2,3-디하이드로트리코스타틴 A
MIC (/mL)	50.0	50.0

그 결과, 본 발명의 2,3-디하이드로트리코스타틴 A은 트리코스타틴 A와 유사하게 우수한 항균 활성을 나타내었다. 이는 트리코스타틴 A에서 C2,3-이중결합의 결핍이 항진균 활성에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있다(표 2 및 도 5 참조).

< 실시예 3> 트리코스타틴 A 유도체의 항암 활성 확인

트리코스타틴 A 유도체의 항암 활성을 알아보기 위해, ATCC(American Type Culture Collection)(Manassas, VA)로부터 획득한 인간 SCLC DSM53 세포주를 이용하여 항암 활성을 확인하였다.

구체적으로, 인간 SCLC DSM53 세포주는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)(Sigma), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)(Invitrogen)이 첨가된 Waymouth’s MB752/1 배지(Invitrogen, San Diego, CA)에서 배양하였다(비특허문헌 10 참조). 상기 세포주는 37℃, 5% CO₂의 습한 대기에서 배양하였다. 그런 다음, 트리코스타틴 A 및 이에 대응하는 2,3-디하이드로코스타틴A를 각각 처리한 후, DMS53 세포의 증식을 MTT[3,4-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 분석을 이용하여 측정하였다(비특허문헌 10 참조). 요약하면, DMS53 세포를 트립신 처리한 후 24-웰 플레이트에 접종한 후 밤새 방치하였다. 이런 하이드록삼산(hydroxamic acids)의 연속적인 2배 희석은 최종 농도가 3.1-200 nM이 되도록 DMSO를 이용하여 수행하였고, DMSO의 부분 표본은 음성 대조군으로 사용하였다. 처리 2일 후, 배지를 제거한 후 MTT를 포함하는 배지로 대체한 다음, 2시간 더 배양한 후, 흡광도 540 nm에서 모니터하였다. IC₅₀은 DMS53 세포의 성장이 어떤 하이드록사메이트도 처리하지 않은 배지에서 성장한 대조군 세포주에 비교하여 50% 억제된 경우에 트리코스타틴 A 및 2,3-디하이드로트리코스타틴A의 최저 농도로 정의된다. 모든 분석은 세번 수행하였다.

트리코스타틴 A 및 이의 유도체 2,3-디하이드로코스타틴 A의 IC₅₀ 비교

	트리코스타틴 A	2,3-디하이드로트리코스타틴 A
IC₅₀ (nM)	25.0	25.0

그 결과, 트리코스타틴 A는 IC₅₀ ~ 25.0 nM을 나타내는 반면, 2,3-디하이드로트리코스타틴 A는 IC₅₀ ~ 12.5 nM을 나타내었다. 즉, 2,3-디하이드로코스타틴 A는 트리코스타틴 A에 비해 인간 SCLC DMS53 세포에 대한 항암 활성이 2배 증가한 것을 나타내었다. 이는 트리코스타틴 A에서 C2,3-이중결합의 결핍이 항암 활성을 증가시키는 것을 알 수 있다(표 3 및 도 6 참조).

결론적으로, 본 발명은 신규 트리코스타틴 유도체 및/또는 동족체를 생산하기 위해 일반적으로 사용되는 총- 또는 반-합성법 대신에, 미생물에 의한 바이오 생전환 기술을 이용하여 트리코스타틴 A 유도체를 생성한 최초의 보고이다. 또한, 스트렙토마이세스 베네주엘래 (S. venezueale)의 부위 특이적 생체경화 활성이 불포화 링 마크로라이드에 한정되는 것이 아니라 직쇄 유사 하이드록사메이트에 적용한 최초의 보고이다. 그러므로, 스캐폴드 개조 접근 중 하나로서, 이런 스트렙토마이세스 베네주엘래 생전환 시스템은 신규한 및/또는 증진된 치료 자원의 개발에 도움이 될 수 있음을 알 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 2,3-디하이드로트리코스타틴 A는 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 제제예 1> 정제(직접 가압)

활성성분 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 14.1 ㎎, 크로스포비돈 USNF 0.8 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.1 ㎎을 혼합하고 가압하여 정제로 제조하였다.

< 제제예 2> 정제(습식 조립)

활성성분 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 16.0 ㎎과 녹말 4.0 ㎎을 섞었다. 폴리솔베이트 80 0.3 ㎎을 순수한 물에 녹인 후 이 용액의 적당량을 첨가한 다음, 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후 콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 2.0 ㎎과 섞었다. 미립을 가압하여 정제로 제조하였다.

< 제제예 3> 분말과 캡슐제

활성성분 5.0 ㎎을 체로 친 후에, 락토스 14.8 ㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎와 함께 혼합하였다. 상기 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.

< 제제예 4> 주사제

활성성분으로서 100 mg을 함유시키고, 그 밖에도 만니톨 180 mg, Na₂HPO₄12H₂O 26 mg 및 증류수 2974 mg를 함유시켜 주사제를 제조하였다.

본 발명은 미생물 수소화 활성의 확대가능성을 보임으로써 보다 다양한 항암제 또는 항생제 개발에 유용하게 이용할 수 있으며, 스캐폴드 개조 전략 중 하나로서 생체전환 기술 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 트리코스타틴(Trichostatin) 유도체:
[화학식 1]
제 1항에 있어서,
트리코스타틴 A로부터 스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)에 의해 생전환되어 제조된 것을 특징으로 하는 트리코스타틴 유도체.
제 1항에 있어서,
사카로마이세스 세레비아제(Saccharomyces cerevisiae)에 대하여 항진균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 트리코스타틴 유도체.
제 1항에 있어서,
소세포성 폐암(small cell lung cance, SCLC)에 대하여 항암 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 트리코스타틴 유도체.
1) 트리코스타틴 A(Trichostatin A)를 첨가한 배지에서 스트렙토마이세스 속 균주를 배양하는 단계;
2) 단계 1)에서 배양된 배양액을 유기용매로 추출하는 단계;
3) 단계 2)의 유기체 추출물을 진공 하에 농축시키는 단계; 및
4) 단계 3)의 잔여물을 유기용매로 용해시킨 후 분리하는 단계를 포함하는, 제 1항의 트리코스타틴 유도체의 제조 방법.
제 5항에 있어서,
상기 단계 1)의 스트렙토마이세스 속 균주는 스트렙토마이세스 베네주엘래(S. venezuelae)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서,
상기 단계 2)의 유기용매는 에틸아세테이트(EtOAc)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서,
상기 단계 4)의 유기용매는 메탄올(MeOH)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서,
상기 단계 4)의 분리는 크로마토그래피를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서,
상기 단계 4)의 분리는 HPLC 유지시간(Retention time)이 35 내지 38분에서 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항의 트리코스타틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항생제 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 조성물은 사카로마이세스 세레비아제(Saccharomyces cerevisiae)에 대하여 항진균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항생제 조성물.
제 1항의 트리코스타틴 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물.
제 13항에 있어서, 상기 암은 소세포성 폐암, 유방암, 대장암, 췌장암, 난소암, 전립선암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항암제 조성물.