KR20120033875A

KR20120033875A - 구리 결합펩타이드를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20120033875A
Application number: KR1020100095612A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 박태정; 김도균
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2010-09-30
Publication date: 2012-04-09
Also published as: KR101243379B1

Abstract

본 발명은 구리 결합펩타이드 (copper binding peptide, CBP)를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 (multi-spot) 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 기판 상에 형성된 금속 박막층, 상기 금속 박막층 상에 다중 스팟을 형성시키고, 상기 다중 스팟의 각 스팟 표면에 나노구조체를 일정한 간격으로 배열시킨 나노구조체 배열층, 상기 나노구조체 배열층 상에 형성된 구리 박막층을 포함하는 새로운 형태의 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩; 상기 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 표면에 하나 이상의 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질이 구리층 표면에 고정되어 있어 표적 바이오물질 또는 후보 표적 바이오물질과의 상호작용을 검출 및 정량화할 수 있는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩에 관한 것이다.
본 발명에 따른 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩은, 상기 바이오칩에 광원, 검출기, 분광광도계 및 컴퓨터를 포함한 광학특성 분석 시스템을 결합함으로써, DNA, 단백질 등의 다양한 바이오 물질의 상호작용을 고감도로 검출할 수 있는 비표지 광학 바이오센서로의 응용이 가능하며, 온-사이트 모니터링에도 적용 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩은 화학적인 표면 처리공정 없이 선택적으로 탐침단백질을 고정함으로써 칩 제작공정이 단순화되고 복잡한 탐침단백질 정제공정이 필요 없게 되어 생산성과 경제성에 큰 향상효과를 기대할 수 있다.

Description

구리 결합펩타이드를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 및 이의 제조방법 {Multi-spot Copper-Capped Nanostructure Array Biochip Using Copper Binding Peptide and Preparing Method Thereof}

본 발명은 구리 결합펩타이드 (copper binding peptide, CBP)를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 (multi-spot) 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 기판 상에 형성된 금속 박막층, 상기 금속 박막층 상에 다중 스팟을 형성시키고, 상기 다중 스팟의 각 스팟 표면에 나노구조체를 일정한 간격으로 배열시킨 나노구조체 배열층, 상기 나노구조체 배열층 상에 형성된 구리 박막층을 포함하는 새로운 형태의 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩; 상기 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 표면에 하나 이상의 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질이 구리층 표면에 고정되어 있어 표적 바이오물질 또는 후보 표적 바이오물질과의 상호작용을 검출 및 정량화할 수 있는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩에 관한 것이다.

지금까지 개발된 금속 나노구조체 배열 바이오칩에 적용된 금속 나노구조체는 주로 금이나 은과 같은 귀금속이 이용되었으며, 나노구조체의 합성 및 형태 제어가 가능하며 바이오물질을 쉽게 고정시킬 수 있다는 장점이 있지만, 금이나 은과 같은 금속 나노구조체는 산업적으로 적용하기에는 비싼 재료에 속한다. 이에 비해, 구리 금속 나노구조체는 나노구조체의 합성 및 형태 제어가 어렵다는 단점이 있지만 값이 싸고, 높은 전도도를 가진다는 장점이 있으며, 기존의 금속 나노구조체 뿐만 아니라 절연성 나노구조체(core)의 표면에 구리 금속(shell)을 코팅하는 core-shell 방식으로 구리 나노구조체를 제작할 수 있어 금과 은과 같은 귀금속 나노구조체를 대체할 수 있을 것으로 생각되며, 구리 나노구조체를 이용한 구리 나노구조체 배열칩에 관한 연구가 꾸준히 진행되고 있다.

프랑스 파리VI대학의 Pileni 그룹(M.-P. Pileni et . al ., J. Phys . Chem . B, 110:7208, 2006)은 구리이온의 화학적 환원법을 이용하여 다양한 형태의 구리 나노크리스탈 (Nanocrystal)을 개발하였으며, 나노디스크 제작에 응용하였다. 미국 라이스대학의 Halas 그룹(N.J. Halas et . al ., J. Phys . Chem. B, 109:18218, 2005)은 비전착성(electroless) 도금을 위하여 우선 실리카 나노구조체의 표면에 화학결합 방법으로 구형 금 나노입자를 고정시킨 후, 비전착성 구리 도금 방법을 이용하여 구리 금속을 나노입자 표면에 코팅하여 구형 구리 나노입자를 개발하였다. 일본 큐슈대학의 Yamada 그룹(S. Yamada et . al ., Chemistry Letters, 38:326, 2009)은 이온화된 기판에 구형 금 나노입자를 고정시킨 후, 프탈로시아닌 구리 복합체(CuPc)를 스핀코팅(spin-coating) 방법으로 코팅하여 구형 구리 나노입자 배열칩을 완성하였다. 미국 노스웨스턴대 van Duyne 그룹(R.P. van Duyne et . al., Nano Letters, 7:1947, 2007)은 나노구조체 리소그래피 방법을 이용하여 기판 위에 삼각형 형태의 구리 나노구조체 배열칩을 제작하였다. 우선 기판 표면을 친수성 처리한 후, 폴리스틸렌 나노입자를 떨어뜨려 2차원 배열시켰다. 이 후 E-beam 증착기를 이용하여 구리 금속을 증착한 후, 메탄올 용액에 침전시켜 초음파 처리를 통해 폴리스틸렌 나노입자를 제거하여 삼각형 형태의 구리 나노구조체 배열칩을 완성하였다. 하지만 이런 형태의 구리 나노구조체 배열칩들은 구리 나노구조체의 제작공정의 복잡화, 제작기간의 장기화, 여러 가지 크기의 구리 나노구조체 제작의 어려움, 그리고 나노구조체의 불규칙적인 고정에 의한 재현성 확립의 어려움 등의 문제점을 가지고 있으며, 실제적으로 구리 나노구조체 배열칩이 바이오칩으로 응용된 예가 현재까지 전무한 실정이다.

본 발명자들은 LSPR 광학특성을 이용하여 다중검체 바이오물질을 하나의 칩으로 동시에 검출할 수 있는 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩을 제작하였다(대한민국 특허출원 제10-2009-00099702호). 본 발명자들에 의해 개발된 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩은 DNA을 포함하여, RNA, 펩타이드, 단백질 등의 다양한 바이오물질의 상호작용을 검출할 수 있는 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서로 응용가능하다는 장점을 가지고 있다. 한편, 탐침단백질을 바이오칩 표면에 고정시키기 위한 칩 표면의 화학적 처리 방법이 복잡하고, 이는 비특이적인 표적 바이오물질과 결합하기도 하고, 탐침단백질과의 결합력이 약할 뿐만 아니라 많은 화학물질에 영향을 받을 수 있기 때문에 다양한 탐침단백질-표적 바이오물질 간의 상호작용을 검출 및 정량화 하는데 제한이 있었으며, 탐침단백질을 바이오칩 표면에 고정하기 위해서는 높은 순도가 요구되어 복잡한 정제공정이 포함되어야 하므로 경제성이 떨어지는 면이 있었다.

한편, 구리에 선택적으로 결합하는 바이오물질로서 펩타이드 형태의 물질이 알려져 있다. 예를 들어, 치매를 유발하는 펩타이드와 프리온 단백질이 구리와 결합력이 강한 것으로 알려져 있으며(Ma, Q.F. et al., Biopolymers, 2005, 79:74, Ma, Q. et al., 2006, 27:841, Kawano, T., Int. J. Biol. Sci., 2007, 3: 57), 이러한 이론적 배경을 본 발명의 구리 증착형 바이오칩 표면에 선택적으로 결합하는 고정화 기능으로서 활용하고자 한다.

이에, 본 발명자들은 종래의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩의 문제점을 해소하고 특이적이고 안정적으로 탐침단백질을 고정할 수 있는, 경제적인 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 제공하고자 예의 노력한 결과, 신규한 CBP를 분리하여 이와 탐침단백질을 융합한 융합단백질이 위치 특이적으로 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 상에 고정되는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 제조하고, 또한 고정된 융합단백질이 표적 바이오물질과 특이적으로 결합하여 효율적으로 상호반응을 분석할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질을 이용하여 탐침단백질이 특이적이고 안정적으로 바이오칩 상에 고정되어 있는, 새로운 형태의 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 및 광학특성 분석 시스템을 이용한 표적 바이오물질 또는 후보 표적 바이오물질의 측정방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 기판(제1층) 상에 금속 박막층(제2층)을 형성시키는 단계; (b) 상기 금속 박막층(제2층) 상에 다중 스팟을 형성시키고, 상기 다중 스팟의 각 스팟 표면에 나노구조체를 일정한 간격으로 배열시켜 나노구조체 배열층(제3층)을 형성시키는 단계; (c) 상기 나노구조체 배열층(제3층) 상에 구리 박막층(제4층)을 형성시키는 단계; 및 (d) 상기 구리 박막층(제4층) 상에 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질을 고정시키는 단계를 포함하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법을 제공한다.

본 발명에 따른 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩은, 기존의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩을 이용한 LSPR 기반 광학 바이오칩이 가지는 장점을 동일하게 가지고 있을 뿐만 아니라, 상기 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩에 광원, 검출기, 분광광도계 및 컴퓨터를 포함한 광학특성 분석 시스템을 결합함으로써, DNA, 단백질 등의 다양한 바이오 물질의 상호작용을 고감도로 검출할 수 있는 비표지 광학 바이오센서로의 응용이 가능하며, 온-사이트 모니터링에도 적용 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩은 화학적인 표면 처리공정 없이 선택적으로 탐침단백질을 고정함으로써 칩 제작공정이 단순화되고 복잡한 탐침단백질 정제공정이 필요 없게 되어 생산성과 경제성에 큰 향상효과를 기대할 수 있다.

도 1은 본 발명의 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제작과정 및 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 일례를 나타낸 모식도이다.
도 2는 구리 결합단백질(CBP)과 탐침단백질을 융합 발현시키기 위한 발현카세트의 유전자지도로서, 플라스미드 pET-CBP2 cassette의 유전자 지도이다.
도 3은 구리 결합단백질(CBP)과 탐침단백질인 신종플루 표면항원의 융합단백질을 발현시키기 위한 유전자지도로서, 플라스미드 pET-CBP2-H1a의 유전자 지도이다.
도 4는 본 발명의 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 이용하여 CBP와 결합된 H1N1 항원(탐침단백질)의 농도에 따른 바이오칩의 기능성을 검사한 결과이다.
도 5는 본 발명의 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩과 광학특성 분석 시스템을 이용하여 H1N1 항원-항체 반응을 검출한 결과이다.
도 6은 본 발명의 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 H1N1 항체의 농도에 따른 검출 효율을 측정한 결과이다.

본 발명은 일 관점에서, (a) 기판(제1층) 상에 금속 박막층(제2층)을 형성시키는 단계; (b) 상기 금속 박막층(제2층) 상에 다중 스팟을 형성시키고, 상기 다중 스팟의 각 스팟 표면에 나노구조체를 일정한 간격으로 배열시켜 나노구조체 배열층(제3층)을 형성시키는 단계; (c) 상기 나노구조체 배열층(제3층) 상에 구리 박막층(제4층)을 형성시키는 단계; 및 (d) 상기 구리 박막층(제4층) 상에 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질을 고정시키는 단계를 포함하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 CBP는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서는 R3 peptide와 프리온 펩타이드(prion proetein:PrP) 유래의 구리에 선택적으로 결합하는 펩타이드를 분리하였고, 각각 서열번호 1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되며 CBP1, CBP2로 명명하였다.

서열번호 1: H₂N - KTNMKHMAVNITKQHTVTTTT - COOH (CBP1)

서열번호 2: H₂N - VQSKCGSKDNIKHVPGGG - COOH (CBP2)

본 발명에 있어서, 상기 기판 (제1층)은 유리, 폴리스틸렌, Polyethylene terephthalate(PET), 폴리카보네이트, 실리콘 및 석영으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기에 열거한 종류의 기판은 편광에 대해서 이방성을 나타내지 않고, 가공성이 우수한 효과가 있다. 특히, 상기 유리, 폴리스티렌, PET 및 폴리카보네이트는 백색광에 대해서 투명한 특성을 나타내는 재료이다. 기판의 표면이 색깔을 띠게 되면 입사한 백색광이 기판 표면으로부터 반사를 하게 되고, LSPR 특성과 같은 광학특성에 영향을 미치게 된다. 따라서 입사한 백색광이 반사하지 않고 투과하는 특성을 가진 투명한 기판을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 기판 (제1층)의 두께는 0.1~20mm인 것을 특징으로 할 수 있으며, 이는 상기 각 기판에 대해 현재까지 제작되었거나 도입 가능한 기판 중에서 본 발명에 사용해도 무방한 최저 두께치와 최고 두께치를 나타내었다.

본 발명에 있어서, 상기 금속 박막층 (제2층)으로는 SAM(Self-assembly monolayer)막을 형성시켜 나노구조체를 고정할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 사용 가능한 금속의 종류로서는 금(Au), 은(Ag), 동(Cu), 알루미늄(Al), 백금(Pt), 니켈(Ni), 아연(Zn) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택하여 사용하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 나노구조체로는 LSPR 특성과 같은 광학특성에 영향을 미치지 않는 유전체로 이루어진 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 사용 가능한 나노구조체의 종류로서는 나노입자(nano-particle), 나노도트(nano-dot), 나노아일랜드(nano-island), 나노로드(nano-rod) 및 나노와이어(nano-wire) 등으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 유전체 나노구조체의 직경은 10-200nm인 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직한 것은 100nm이다. 유전체 나노구조체의 직경이 10nm 이하이면 LSPR 광학특성이 발생하지 않으며, 유전체 나노구조체의 직경이 200nm이상이면 플라즈몬 현상에 의해 여기되는 LSPR 광학특성의 측정이 불가능하다. 또한, 사용하는 나노구조체의 직경에 따라서 LSPR 광학밴드의 파장영역이 달라질 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 제3층의 나노구조체 배열층을 금속 박막층 (제2층)에 다중 스팟 형태로 형성시키기 위해서는 다공성 마스크를 이용하여 수행하는 것이 가능하다. 상기 다공성 마스크는 금속 박막층에 협착되어 마스크 표면에 형성된 다공 안으로만 나노구조체를 일정한 간격으로 배열되도록 하며, 금속 박막층 표면에 다중 스팟 형태를 형성시킨다. 본 발명에 있어서 사용 가능한 다공성 마스크는 고무평판, 실리콘평판 및 이들의 혼합물 등으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 다공성 마스크는 상기 평판의 표면에 펀칭기 등을 이용하여 다공을 형성시킴으로서 완성된다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 다공성 마스크의 다공수는 1~300개인 것을 특징으로 할 수 있으며, 이는 상기 각 다공성 마스크에 대해 현재까지 제작되었거나 도입 가능한 다공성 마스크 중에서 본 발명에 사용해도 무방한 다공수의 최저치와 최고치를 나타내었다.

본 발명에 있어서, 상기 나노구조체 배열층 (제3층)을 금속 박막층 (제2층)에 일정한 간격으로 배열시키기 위해서, 상기 금속 박막층을 카르복실기로 개질하고, 나노구조체 표면을 아민기로 개질한 다음 공유결합시키는 것이 바람직하다. 상기 금속 박막층을 카르복실기로 개질하는 방법으로는 4,4’-dithiodibutylic acid(DDA)를 이용하여 카르복실기를 가지는 SAM막을 형성시키는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 아울러, 상기 나노구조체 표면을 아민기로 개질하는 방법으로는 상기 나노구조체 표면을 3-aminopropyltriethoxy silan (γ-APTES)를 이용하여 아민기로 개질시키는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 금속 박막층 (제2층) 및 구리 박막층 (제4층)의 박막 형성은 스파터법, 증착법, 이온 플레이팅법, 전기도금법, 무전기도금법 등에 의해 수행하는 것이 가능하다. 금속 박막층 및 구리 박막층의 두께는 나노구조체 배열층 (제3층)의 나노구조체의 모양, 크기, 배열 상태에 따라 임의로 결정할 수 있다. 예를 들어, 100nm의 실리콘 구형 나노입자의 경우, 금속 박막층의 두께는 30nm?50nm이며, 구리 박막층의 두께는 20nm?40nm로 제작하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 구리 박막층의 두께에 따라 LSPR 광학특성에 의해 발생하는 LSPR 광학밴드 피크의 흡광도 강도가 달라지는 특성을 나타낸다. 따라서, 구리 박막층의 두께에 따라 다양한 흡광도 영역에서 반응할 수 있는 새로운 형태의 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 구리 박막층 표면에 선택적으로 결합하는 구리결합단백질 (CBP)를 이용하여, 구리 박막층에 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질이 고정된 형태의 바이오리셉터를 제공하는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 바이오칩을 제공할 수 있다.

본 발명은, 또 다른 관점에서, 상기 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법은 (a) 상기 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩과 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질을 포함하는 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 광학특성 분석 시스템을 이용하여 광학특성 변화를 분석하여, 상기 탐침단백질과 표적 바이오물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 상호작용을 검출 및 정량하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

구체적으로, 상기 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 표면에 입사광을 수직방향으로 조사하고, 상기 입사광에 대해 바이오칩 표면에서 반사된 반사광의 국소 표면 플라즈몬 공명 (localized surface plasmon resonance, LSPR) 광학특성을 광원, 검출기, 분광광도계 및 컴퓨터를 포함하는 LSPR 광학특성 분석 시스템을 이용해서 측정한다. 또한, 상기 광학특성을 측정하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용하는 방법이라면, 이에 국한되지 않고 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 표적 바이오물질 또는 후보 표적바이오 물질은 탐침단백질과 상호작용이 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 사용 가능한 표적 바이오물질 또는 후보 표적바이오 물질의 종류로서는 항원, 항체, 리간드(ligand), RNA, DNA, PNA 및 합텐(hapten)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질을 포함하는 시료는 표적 바이오물질 또는 후보 표적 바이오물질을 포함하는 용액으로, 혈액, 타액, 오줌, 코피, 눈물, 배설물, 조직추출액 및 배양액으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.

본 발명에 따른 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩은 각각의 다중 스팟에 하나 이상의 탐침단백질을 고정화하는 것이 가능하므로, 다중검체 검출용 비표지 광학 바이오센서로 응용하는 것이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제작

슬라이드 유리기판 (도 1(a)) 표면(75㎜×25㎜×1㎜)에 진공 증착장치(신우엠에스티, 대한민국)를 이용하여 크롬과 금을 각각 진공증착하여 금속 박막층을 적층하였다 (도 1(b)). 구체적으로, 중간 금속 박막층으로 크롬은 5nm의 두께로 증착시키고, 금속 박막층으로 금의 두께는 40㎚로 제어 가능하였다. 다음에 금 박막층 표면에 다공성 마스크를 흡착시킨 후, 각각의 다공성 안에 1mM 4,4’-dithiodibutylic acid(DDA)를 이용해서 SAM막을 형성하였다. 다음에 각각의 다공성 안에 400mM EDC를 첨가하고, 당 표면에 도입된 카르복실기의 활성화를 수행한 후, 3-aminopropyltriethoxysilane(γ-APTES)으로 표면 수식을 수행한 직경 100㎚의 실리카 나노구조체를 금 박막층 표면에 공유결합을 이용하여 배열시켰다 (도 1(c)). 다음에 직경 100㎚의 실리카 나노구조체가 배열된 나노구조체 배열층 표면에 구리 박막(30㎚)을 진공증착하여, 도 1(d)에 나타난 바와 같이, 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 제조하였다.

LSPR 광학특성 분석 시스템을 이용한 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 표면의 LSPR 광학특성 분석

LSPR 광학특성 분석 시스템은 텅스텐-할로겐 광원(파장 360㎚?2000㎚, Ocean Optics, Inc., 미국), 검출기(파장 300㎚?1100㎚, Ocean Optics, Inc., 미국), 검출기로 검출된 광을 분광하는 분광광도계(파장 200㎚?1100㎚, Ocean Optics, Inc., 미국)와 분광광도계에서 얻어진 결과를 처리하는 분광광도계 분석처리 프로그램(Ocean Optics, Inc., 미국)으로 구성된다. 이때, 상기 텅스텐-할로겐 광원과 검출기는 하나의 광원 프로브에 구비되어 있다. LSPR 광학특성 분석 시스템을 이용한 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 표면의 LSPR 광학특성 분석은 텅스텐-할로겐 광원으로부터 방출되는 입사광을 수직방향으로 바이오칩 표면에 입사시킨 후, 반사되는 반사광을 검출기를 통해서 검출하고, 분광광도계를 거쳐 분광된 반사광을 분광광도계 분석처리 프로그램을 통하여 분석하여, 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 LSPR 광학특성을 측정하였다.

구리 결합펩타이드 CBP ( copper binding peptide )의 분리

알츠하이머를 발생시키는 것으로 알려져 있는 tau protein (Ma, Q.F. et al., Biopolymers, 2005, 79:74), R3 peptide (Ma, Q. et al., 2006, 27:841), 그리고 프리온(prion protein; PrP)에 기반에 구리결합펩타이드의 절편(Kawano, T., Int. J. Biol. Sci., 2007, 3: 57)의 경우 copper binding 특성이 있는 것으로 알려져 있다. 이 중 본 발명에서는 R3 peptide(서열번호 1)과 PrP 기반 펩타이드의 절편(서열번호 2)을 이용하여 구리기판 위에 결합시키는 방법을 도입하고자 하였다. 그리고 이들로부터 유래되는 단백질을 각각 CBP1(서열번호 1)과 CBP2(서열번호 2)로 명명하였으며 이들을 구리 결합단백질로 하고 바이오센서로 응용이 가능한 형태의 단백질과 융합하여 응용하고자 하였다.

서열번호 1: H₂N - KTNMKHMAVNITKQHTVTTTT - COOH (CBP1)

서열번호 2: H₂N - VQSKCGSKDNIKHVPGGG - COOH (CBP2)

CBP 와 탐침단백질의 융합단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝

실시예 3에서 분리한 신규 구리 결합단백질인 CBP2 (서열번호 2)와 탐침단백질을 융합발현시키기 위한 유전자를 재조합 대장균에 클로닝하기 위하여, 주형 DNA 없이 서열번호 3 및 4의 프라이머만을 이용하여 PCR을 수행하여 CBP2의 유전자 산물을 수득하였다. 클로닝을 위해 제한효소 NdeI의 절단위치가 서열번호 3의 프라이머에, 그리고 서열번호 4의 프라이머에는 제한효소 SalI의 절단위치가 삽입되어 플라스미드 pET-CBP2 cassette을 완성하였다 (도 2). 구리 결합단백질인 CBP2 (서열번호 2)와 신종플루 H1N1 독감의 표면항원인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HG)의 친수성 도메인(이하 'H1a'라 함)의 융합단백질을 발현시키는 유전자를 재조합 대장균에 클로닝하기 위하여, 주형 DNA 없이 서열번호 3 및 4의 프라이머만을 이용하여 PCR을 수행하여 CBP2-H1a의 유전자 산물을 수득하였다. H1a의 유전자 서열은 독감을 일으키는 인플루엔자 바이러스 중에서 한국형 H1N1 신종플루 바이러스 유전자 서열을 택하여 HG(NCBI Genbank No. GQ131023, EU798778, EU798779)중에서 그 일부인 454-479번째의 16개 아미노산(서열번호 5)을 코딩하는 유전자로서 E. coli에서의 codon usage(Miller, J. H., A short corse in bacterial genetics. 1992)를 활용한 새로운 염기서열(서열번호 6)을 작성하여 얻을 수 있었다. 클로닝을 위해 제한효소 HindIII의 절단위치가 서열번호 7의 프라이머에, 그리고 서열번호 8의 프라이머에는 제한효소 XhoI의 절단위치가 삽입되어 플라스미드 pET-CBP2-H1a 유전자를 획득하였다 (도 3).

서열번호 3:

5'- AGATATACATATGGTGCAGAGCAAATGTGGTAGCAAAGATAACATCAAA -3' (프라이머 1)

서열번호 4:

5'- CCGGTCGACACCACCGCCCGGCACGTGTTTGATGTTATCTTTGCT -3' (프라이머 2)

서열번호 5: H₂N - YHDSNVKNLYEKVRSQ - COOH (H1a)

서열번호 6: 5'- TATCACGATAGCAACGTTAAAAACCTGTATGAAAAAGTGCGTAGCCAG -3'

서열번호 7: 5'- GACAAGCTTTATCACGATAGCAACGTTAAAAACCTGTATGAA -3' (프라이머 3)

서열번호 8:

5'- CCGCTCGAGCTGGCTACGCACTTTTTCATACAGGTTTTTAAC -3' (프라이머 4)

PCR 조건은 첫 번째 변성(denaturation)은 94℃에서 5분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성은 94℃에서 30초간, 교잡(annealing)은 56℃에서 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 30초간 수행하였으며 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장하였다.

상기 PCR에 의해 수득된 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 각각 약 80 bp (CBP2)와 160 bp (CBP2-H1a 융합) 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 CBP2의 경우 제한효소 NdeI과 SalI, CBP2-H1a의 경우 HindIII과 XhoI으로 절단한 다음, 상기 DNA 절편을 NdeI과 XhoI 제한효소로 절단한 플라스미드 pET-22b(+) (Novagen, Darmstadt, Germany)에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pET-CBP2-H1a를 제작하였다.

상기 제작된 pET-CBP2-H1a를 열충격(heat shock)방법을 이용하여 대장균 BL21(DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany)에 도입하여 엠피실린(ampicillin, 100 ㎎/L)이 첨가된 LB 평판배지(이스트 추출물, 5 g/L; 트립톤, 10 g/L; NaCl, 10 g/L)에서 선별하여 재조합 대장균 BL21(DE3)/pET-CBP2-H1a를 제조하였다. 도 2는 상기 제작된 플라스미드 pET-CBP2 cassette의 유전자 지도를 나타낸 것이며 도 3은 상기 제작된 플라스미드 pET-CBP2-H1a의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

본 실시예에서는 H1a의 N-말단에 CBP 단백질인 CBP2를 결합하는 형태를 사용하였으나, 본 발명의 요지상 C-말단에 CBP 단백질이 결합하는 형태를 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있음은 이 분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 자명한 사항이다.

CBP 와 탐침단백질의 융합단백질 발현

실시예 4에서 제작한, 강력하고 유도 가능한 T7 프로모터를 가지고 있는 재조합 플라스미드 pET-CBP2-H1a로 형질전환된 대장균 BL1(DE3)을 배양하여 CBP2-H1a 융합단백질을 발현하였다.

T7 프로모터는 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)에 의해서 유전자 발현이 유도되며 pET-CBP2-H1a로 형질전환된 대장균 BL1(DE3)의 경우, 형질전환된 재조합 대장균을 LB 액체배지 200 mL가 담긴 500 mL 플라스크에 접종하여 37℃에서 배양하였다. pET-CBP2-H1a 재조합 플라스미드의 유전자 발현유도는 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(OD)가 0.4일 때 1 mM의 IPTG를 첨가하여 줌으로써 유도하였다.

유도발현 후 4시간 후에 전체 배양액을 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 100 mL TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0)로 한번 씻은 후에 다시 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) 100 mL 용액에 현탁하여 4℃에서 초음파 분쇄기(Branson Ultrasonics Co., Danbury, CT, 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄한 용액을 4℃에서 6000 rpm으로 30분 원심분리하여 불용성 단백질을 버리고 0.2 μm 여과기로 여과하여 CBP2-H1a 융합단백질을 함유하는 수용성 단백질분획을 수득하였다. 상기 단백질은 브래드포드 방법(Bradford, M. et al., Anal . Biochem., 72:248, 1976)을 이용하여 정량하였다.

CBP 와 결합된 H1N1 항원 ( 탐침단백질 )의 농도에 따른 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 기능성 검사

실시예 1에서 제작된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 표면에 탐침단백질로서 H1N1 항원을 고정시키기 위하여 실시예 5에서 CBP와 H1N1 항원을 결합하여 발현된 융합단백질을 농도별로 고정시켜 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 기능성 검사를 하였다.

먼저 CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질은 3차증류수(DDW) 버퍼를 이용하여 1 pg/mL, 10 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL 및 1 μg/mL의 농도로 조절한 후, 1시간 이상 반응시켜 CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질의 고정화를 유도하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질의 농도에 따라 LSPR 광학특성 피크의 wavelength shift가 선형적으로 증가하는 것으로 융합단백질이 바이오칩 표면에 고정된 것을 확인할 수 있었으며, 100 pg/mL의 고감도 분석이 가능하였다.

또한, CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질을 증류수(DDW) 버퍼를 이용하여 1 pg/mL, 10 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL 및 1 μg/mL의 농도로 조절한 후, 다중 스팟 금 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 표면에 1시간 이상 반응시켜 CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질의 고정화를 유도하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질의 농도에 따라 LSPR 광학특성 피크의 wavelength shift의 변화가 없으며, 융합단백질이 바이오칩 표면에 고정화되지 않은 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 기능성 검사를 통하여 CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질이 구리 표면에만 고정된다는 것을 알 수 있었다.

CBP 를 이용하여 H1N1 항원이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 H1N1 항체 검출

실시예 6에서 제작된 CBP를 이용하여 H1N1 항원이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 표면에 표적 바이오물질로서 100 ng/mL의 H1N1 항체를 주입한 후, 1시간 이상 반응시켜 H1N1 항원-항체 반응을 광학특성 분석 시스템을 이용하여 검출하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 상기 CBP를 이용하여 H1N1 항원이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 이용하여 H1N1 항원-항체 반응 검출이 가능하다는 것을 확인하였다.

CBP 를 이용하여 H1N1 항원이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 이용한 H1N1 항체의 농도에 따른 기능성 검사

상기 실시예 7과 마찬가지로 실시예 6에 의해 제작된 CBP를 이용하여 H1N1 항원이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 이용하여 H1N1 항체의 농도에 따른 검출 효율을 측정하였다. H1N1 항체의 농도는 1 fg/mL?100 ng/mL의 범위에서 측정되었다. CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질은 1μg/mL 농도로 바이오칩 표면에 고정시켰으며, 1시간 이상 H1N1 항원과 H1N1 항체를 반응시켜 결합을 유도하였다. 도 6에 나타낸 실험 결과와 같이, H1N1 항체는 1 pg/mL라는 고감도 분석이 가능하다는 것이 확인되었으며, 1 fg/mL?100 ng/mL의 범위내에서 직선 관계에 있었다. 따라서 본 발명의 CBP를 이용하여 H1N1 항원이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩은 저농도의 정량분석이 가능하다는 것을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Multi-spot Copper-Capped Nanostructure Array Biochip Using Copper Binding Peptide and Preparing Method Thereof <130> P10-B247 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Thr Asn Met Lys His Met Ala Val Asn Ile Thr Lys Gln His Thr 1 5 10 15 Val Thr Thr Thr Thr 20 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly 1 5 10 15 Gly Gly <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agatatacat atggtgcaga gcaaatgtgg tagcaaagat aacatcaaa 49 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccggtcgaca ccaccgcccg gcacgtgttt gatgttatct ttgct 45 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> H1N1 swine influenza virus <400> 5 Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln 1 5 10 15 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1a <400> 6 tatcacgata gcaacgttaa aaacctgtat gaaaaagtgc gtagccag 48 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gacaagcttt atcacgatag caacgttaaa aacctgtatg aa 42 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ccgctcgagc tggctacgca ctttttcata caggttttta ac 42

Claims

다음 단계를 포함하는 CBP(copper binding peptide)를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법:
(a) 기판(제1층) 상에 금속 박막층(제2층)을 형성시키는 단계;
(b) 상기 금속 박막층(제2층) 상에 다중 스팟을 형성시키고, 상기 다중 스팟의 각 스팟 표면에 나노구조체를 일정한 간격으로 배열시켜 나노구조체 배열층(제3층)을 형성시키는 단계;
(c) 상기 나노구조체 배열층(제3층) 상에 구리 박막층(제4층)을 형성시키는 단계; 및
(d) 상기 구리 박막층(제4층) 상에 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질을 고정시키는 단계.
제1항에 있어서, 상기 CBP는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드인 것을 특징으로 하는 CBP(copper binding peptide)를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 기판은 유리, 폴리스틸렌, PET(polyethylene terephthalate), 폴리카보네이트, 실리콘 및 석영으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 기판의 두께는 0.1~20mm인 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
제1항에 있어서, 금속 박막층은 금(Au), 은(Ag), 동(Cu), 알루미늄(Al), 백금(Pt), 니켈(Ni), 아연(Zn) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 나노구조체는 나노입자(nano-particle), 나노도트(nano-dot), 나노아일랜드(nano-island), 나노로드(nano-rod) 및 나노와이어(nano-wire)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 나노구조체 배열층을 금속 박막층 상에 일정한 간격으로 배열시키기 위해서, 상기 금속 박막층의 표면을 카르복실기로 개질하고, 상기 나노구조체 표면은 아민기로 개질시킨 다음, 상기 카르복실기로 개질된 금속 박막층과 아민기로 개질된 나노구조체 표면을 공유결합시키는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
제1항에 있어서, 금속 박막층 및 구리 박막층의 형성은 스파터법, 증착법, 이온 플레이팅법, 전기도금법 및 무전기도금법으로 구성된 군에서 선택되는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
제1항에 있어서, 구리 박막층의 두께에 따라 LSPR 광학특성에 의해 발생하는 LSPR 광학밴드 피크의 흡광도 강도가 달라지는 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 다중 스팟은 다공성 마스크를 금속 박막층(제2층)에 고정하여 형성시키는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 다공성 마스크는 고무평판, 실리콘평판 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 다공성 마스크의 다공수는 1-300개인 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 금속박막층(제2층) 상의 다중 스팟 각 표면에 일정한 간격으로 배열된 나노구조체 배열층(제3층) 상에 구리 박막층(제4층)이 형성되어 있고, 상기 구리 박막층(제4층) 상에 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질이 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩.
제13항의 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법.
제14항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법:
(a) 제13항의 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩과 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질을 포함하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 광학특성 분석 시스템을 이용하여 광학특성 변화를 분석하여, 탐침단백질과 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 상호작용을 검출 및 정량하는 단계.
제14항에 있어서, 상기 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질은 항원, 항체, 리간드(ligand), RNA, DNA, PNA 및 합텐(hapten)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법.
제15항에 있어서, 상기 시료는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질을 포함하는 용액으로, 혈액, 타액, 오줌, 코피, 눈물, 배설물, 조직추출액 및 배양액으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법.