KR20120027535A - 카제인 유래 프로테아제 저해 펩타이드 - Google Patents

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에릭 챨스 레이놀스
스튜어트 제프리 대쉬퍼
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오럴 헬스 오스트레일리아 피티와이 엘티디
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Abstract

본 발명은 프로테아제 활성을 저해하는 조성물, 펩타이드, 펩티도미메틱 및 약학적 조성물 및 질환을 치료 또는 예방하기 위한 상기 조성물, 펩타이드, 펩티도미메틱 및 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 특히, 상기 질환은 치주질환일 수 있다. 상기 조성물, 펩타이드 및 펩티도미메틱은 다양한 카제인, 예를 들어 α-카제인, β-카제인 및 κ-카제인에서 유래된 것일 수 있다. 본 발명의 조성물, 펩타이드, 펩티도미메틱 및 약학적 조성물이 저해하는 프로테아제 활성은 진지페인을 포함한다.

Description

카제인 유래 프로테아제 저해 펩타이드{CASEIN DERIVED PROTEASE INHIBITORY PEPTIDES}
본 발명은 프로테아제(protease) 활성을 저해하는 화합물, 펩타이드, 펩티도미메틱(peptidomimetics) 및 약학적 조성물 및 특히, 질환을 치료 또는 예방하기 위한 상기 화합물, 펩타이드, 펩티도미메틱 및 약학적 조성물의 이용에 관한 것이다. 특히 상기 질환은 치주질환일 수 있다.
본 출원은 호주 임시 출원(provisional application)된 출원번호 2009902841에 우선권을 주장하며, 전체 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
치주질환(periodontal disease)은 세균(박테리아)이 관련된 이를 고정하는 조직의 염증성 질환이며, 주요한 대중적인 건강 문제이다. 인구의 거의 모두가 어느 정도 치주질환에 의해 영향을 받는다. 미국 구강 보건 조사(US Dental Health survey)는 1989년에 조사된 인구의 85%가 치주질환을 갖고 있다고 보고했다. 치주질환의 주요한 형태는 잇몸 모서리(gingival margin)에 비-특이적인 플라크(plaque) 축적과 결부된 치은염(gingivitis)이다. 치주질환의 더 파괴적인 형태(치근막염(periodontitis))는 특이적인 그람-음성(Gram-negative) 세균에 의한 치은하(subgingival) 감염과 결부된다. 주요한 세균성 병원체는 Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis, and Treponema denticola로 구성된 "레드 콤플렉스(red complex)"로 알려진 이 질병에 연루되었다. P. gingivalis는 만성적인 치근막염에서 주 원인론적 요인이다.
P. gingivalis의 주 독성 인자(virulence factor)는 진지페인(gingipains)으로서 총괄하여 알려진 세포외(extracellular) 시스테인(cysteine) 프로테아제로 여겨졌다. 가장 일반적인 것은 RgpA 및 RgpB(Arg-진지페인) 및 Kgp(Lys-진지페인)이다. Arg-진지페인은 Arg 잔기의 카르복실 측을 자르고 Lys-진지페인은 Lys 잔기의 카르복실 측을 자른다.
이러한 세포-결합(cell-bound) 시스테인 프로테아제는 생존 및 독성(virulence)을 위해 다른 내인성(intrinsic) 및 외인성(extrinsic) 기능뿐만 아니라 성장을 위해 펩타이드를 제공하기 위한 단백질의 분해(degradation)에 중요하다고 여겨진다. 생존 및 독성을 위한 몇몇의 이런 기능들은 숙주 조직으로의 세균 유착(bacterial adhesion), 적혈구 응집반응(hemagglutination), 및 세균성 세포-표면 및 단백질의 분비(secretory proteins) 과정일 수 있다. RgpA 및 Kgp의 촉매 도메인(catalytic domain)은 RgpB가 프로테아제 유착 복합체(complex)의 일부가 아닌 것으로 존재하는 것으로 보이는 동안 세포 표면에서 일련의 비-공유적으로 결합 서열-관련 혈구응집소(hemagglutinin)/부착소(adhesin) 도메인들과 복합체(complex)로서 결합할 수 있으며 오직 촉매 도메인으로만 이루어져 있을 수 있다.
진지페인을 저해하는 것으로 밝혀진 자연적으로 유래된(naturally derived) 및 합성된(synthetic) 몇몇의 분자들이 있어왔다. 진지페인의 자연적인 저해제들은 생리활성(bioactive) 산물의 스크리닝을 통해 밝혀져 온 반면, 몇몇의 합성된 저해제들은 프로테아제 활성 자리 및 프로테아제-저해제들의 구조에 기초하여 합성되어 왔다. 예를 들어, Arg- 및 Lys-진지페인 저해제들은 크랜베리 주스[특히 폴리페놀(polyphenols) 및 큰 분자량의 비-투석가능한(non-dialyzable) 구성 성분(구성 성분)(NDM)], 녹차 카테킨(catechin) 및 마늘에서 분리되어왔다. 이런 저해제들은 그것들이 합성물질(synthetic)이며, 생산하는데 막대한 비용이 들고, 받아들일 수 없는 맛(unacceptable taste)을 가지거나 인간에 대한 사용을 승인받지 못한 것과 같은 하나 이상의 문제로 고통받는다.
다양한 질병의 발병(pathogenesis), 특히 치주질환에 관련된 세균성 효소의 더 나은 또는 대체적인 저해제에 대한 요구가 존재한다.
명세서 내의 선행기술에 대한 참조는 이 선행기술(prior art)이 호주(Australia) 또는 어떠한 다른 관할권(jurisdiction)에서의 보통 일반적인 지식의 일부를 형성하는 것 또는 이 선행기술이 당업자에 의해 적절하게 확인되고(ascertained), 이해되고 평가(regarded)될 것이라 합리적으로 예상할 수 있는 것의 승인(acknowledgment) 또는 제안(suggestion)의 어떠한 형태가 아니며, 그렇게 받아들여지지 말아야 한다.
참조
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도 1은 합성된 αS1-카제인(11-23)(■), β-카제인(193-205)(□), β-카제인(193-209)(▧) 및 κ-카제인(109-137)(▤) 펩타이드에 대한 P. gingivalis ATCC 33277 전세포의 Arg-특이적인 단백질 가수 분해 활성이다. 분석은 2개의 분리된 세균성 배양 및 기술적으로 세 반복으로 수행되었다. 분석에서의 평균 세포 수는 4.0E+08 cfu/mL이다.
도 2는 합성된 αS1-카제인(11-23)(■), β-카제인(193-209)(▧) 및 κ-카제인(109-137)(▤) 펩타이드에 대한 P. gingivalis ATCC 33277 전세포의 Arg-특이적인 단백질 가수 분해 활성이다. 분석은 2개의 분리된 세균성 배양 및 기술적으로 세 반복으로 수행되었다. 분석에서의 평균 세포 수는 4.0E+08 cfu/mL이다.
도 3은 100 μM의 합성된 카제인-유래된 펩타이드에 대한 정제된 프로테아제 복합체 Arg- (▨) 및 Lys-특이적(■) 단백질 가수 분해 활성이다. 분석은 기술적으로 여섯 번 반복으로 수행되었다.
도 4는 κ-카제인(109-137)의 몇몇의 농도에 대한 정제된 RgpB 단백질 가수 분해 활성이다. RgpB의 농도는 0.23 μg/μL이다.
도 5는 형광 BSA 기질(DQTM BSA) 및 500 μM의 카제인 펩타이드를 이용하여 측정한 P. gingivalisATCC 33277 전세포의 Arg- 및 Lys-특이적 단백질 가수 분해 활성이다. 다른 κ-카제인들이 합성된 것들인 반면 κ-카제인(106-169)는 자연에서 유래되었다. 에러바(error bar)들은 생물학적 기술적으로 세 번 반복 및 두 번 반복하여 표준편차로 계산되었다. 모든 펩티이드들은 대조값보다 유의적으로 차이가 났다(p < 0.05). κ-카제인(117-123) 및 κ-카제인(127-137)은 서로 유의적으로 차이가 나지 않았으나(p < 0.05), 나머지 펩타이드와 유의적인 차이가 있다(p < 0.05). κ-카제인(106-169)은 κ-카제인(106-137)과 유의적으로 차이가 있으나 κ-카제인(109-137) 또는 κ-카제인(117-137)과는 아니다. κ-카제인(106-137)은 κ-카제인(117-137)을 제외한 모든 펩타이드와 유의적으로 차이가 있다. κ-카제인(109-137)은 κ-카제인(106-169)을 제외한 모든 펩티이드와 유의적으로 차이가 있다.
도 6은 1 mM 시스테인 농도에서 분석된 합성된 κ-카제인(109-137) 펩타이드와 ZnCl2에 대한 P. gingivalis ATCC 33277 전세포의 Arg-특이적인 단백질 가수 분해 활성이다. 분석은 세 분리된 세균 배양 및 네 기술적 반복으로 수행되었다.
도 7은 1 mM 시스테인 농도에서 분석된 합성된 κ-카제인(109-137) 펩타이드와 ZnCl2에 대한 P. gingivalis ATCC 33277 전세포의 Lys-특이적인 단백질 가수 분해 활성이다. 분석은 세 분리된 세균 배양 및 세 기술적 반복으로 수행되었다.
도 8은 1 mM 시스테인 농도에서 분석된 합성된 κ-카제인(109-137) 펩타이드와 ZnCl2에 대한 정제된 프로테아제 복합체 Arg- (▨) 및 Lys-특이적(■) 단백질 가수 분해 활성이다. 분석은 기술적으로 여섯 번 반복으로 수행되었다.
도 9는 1 mM 시스테인 농도에서 분석된 합성된 αS1-카제인(11-23)(■), β-카제인(193-209)(▧) 및 ZnCl2에 대한 P. gingivalis ATCC 33277 전세포의 Arg-특이적인 단백질 가수 분해 활성이다. 분석은 분리된 세균성 배양 및 기술적으로 세 반복으로 수행되었다.
도 10은 1 mM 시스테인 농도에서 분석된 합성된 αS1-카제인(11-23)(■), β-카제인(193-209)(▧) 및 ZnCl2에 대한 P. gingivalis ATCC 33277 전세포의 Lys-특이적인 단백질 가수 분해 활성이다. 분석은 분리된 세균성 배양 및 기술적으로 세 반복으로 수행되었다.
도 11은 0.15, 0.25, 및 1.0 mM 농도의 BApNA 기질과 0 M (
Figure pct00001
), 25 M (
Figure pct00002
), 50 M (
Figure pct00003
), 75 M (
Figure pct00004
), 및 100 M (
Figure pct00005
) 농도의 κ-카제인(109-137) 펩타이드에 의한 정제된 RgpB의 저해 라인위버-버크 도이다.
도 12는 κ-카제인(109-137)에 의한 RgpB에 대한 저해 상수(Ki)의 추산을 위한 이차 도이다. 각각의 포인트의 세트와 결부된 선은 각각의 데이타 세트의 선형회귀분석을 나타낸다. Ki은 회귀 선의 음의 절편으로서 추산되었다.
도 13은 κ-카제인(109-137)과 인간 세린/시스테인 단백질 가수 분해 저해제 계통 G 멤버 1 스플라이스 변이체 3(Q5UGI5), 혈장 세린 프로테아제 C1 저해제(P05155), 및 추정 세린 단백질 가수 분해 저해제(Putative serine proteinase inhibitor)(KU 족)(A3LQ30)의 BLAST 서열 얼라인먼트이다.
도 14는 β-카제인(193-209)과 인간 세린 프로테아제 저해제 카잘-타입 5 짧은 아형(Q3LX95), 인간 세린 프로테아제 저해제 카잘-타입 5(Q9NQ38), 인간 엘라핀(엘라스타제-특이적 저해제)(P19957), 및 인간 PI3 단백질(펩티다아제 저해제 3, 피부-유래(SKALP), 아형 CRA_a)(Q6FG74)의 BLAST 서열 얼라인먼트이다.
도 15는 αS1-카제인(11-23)과 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-결합 서브유닛 clpX(P50866), 세린 프로테아제(Q1NE66), 및 ATP-의존적 아연 금속단백질분해효소(metalloproteinase)(Q7VHT4)의 BLAST 서열 얼라인먼트이다.
도 16은 E = Arg- 또는 Lys-진지페인, S = BApNA 또는 GPKNA 기질, I = κ-카제인(109-137) 펩타이드 및 P = p-니트로아닐리드(nitroanilide)의 제안된 비길항적 저해제 모델이다.
도 17은 a) κ-카제인(109-137), Zn(II) 및 기질(BApNA)과의 상호작용과 관련된 RgpB 활성 자리의 잔기들. Zn(II)과 RgpB의 His211 및 Glu152, κ-카제인(109-137)의 Asp115(Asp7) 및 Glu118(Glu10) 사이의 정전기적 상호작용이 강조되었다. 펩타이드의 Ile122(Ile14)와 BApNA 기질 사이의 소수성 상호작용도 강조되었다. RgpB의 Trp284 및 Cys244는 Arg 잔기 및 기질의 아마이드 결합과 각각 상호작용을 형성한다. b) Zn(II)의 존재하에 RgpB:BApNA 복합체와 결합하는 κ-카제인(109-137) 제안된 분자 모델.
발명의 개요
본 발명에 따르면, 본 발명은 세균성 효소, 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱의 활성을 저해, 감소 또는 예방하기 위한 카제인(Casein)의 아미노산 서열 또는 그것의 단편을 포함하는 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱을 제공한다. 한 실시태양에서, 상기 효소는 세포외 프로테아제일 것이다. 특정 실시태양에서, 상기 세포외 프로테아제는 진지페인(gingipain)과 같은 시스테인 프로테아제이다. 일부 실시태양에서, 상기 프로테아제는 RgpA, RgpB 또는 Kgp이다.
일부 실시태양에서, 상기 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
Leu Pro Gln Glu Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe(서열번호 1);
Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile Val(서열번호 2);
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 3);
Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe(서열번호 4);
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 5).
추가적인 실시태양에서, 상기 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 하기로 이루어진 추가적인 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
Leu Pro Gln Gly Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe(서열번호 6);
Leu Ser Pro Glu Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe(서열번호 7);
Leu Ser Ser Glu Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe(서열번호 8);
Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Leu Val(서열번호 9);
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Ile Glu(서열번호10);
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Ile Thr Glu(서열번호11);
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr(O-linked GalNAc) Pro Thr Thr Glu(서열번호12);
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr(O-linked GalNAc) Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호13);
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr(O-linked GalNAc) Glu(서열번호14);
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr(O-linked GalNAc) Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호15);
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser(P) Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호16);
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Val Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호17);
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Val Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호18);
Pro Pro Lys Lys Asp Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호19);
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Ala Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호20);
Pro Pro Lys Lys Asp Gln Asp Lys Thr Glu Val Pro Ala Ile Asn Thr Ile Ala Ser Ala Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 21);
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Ile Glu(서열번호 22);
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Ile Thr Glu(서열번호 23);
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr(O-linked GalNAc) Pro Thr Thr Glu(서열번호 24);
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr(O-linked GalNAc) Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 25);
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr(O-linked GalNAc) Glu(서열번호 26);
Thr Glu Ile Pro Thr(O-linked GalNAc) Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 27);
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser(P) Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 28);
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Val Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 29);
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Val Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 30);
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Ala Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 31), 및
Thr Glu Val Pro Ala Ile Asn Thr Ile Ala Ser Ala Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 32).
다른 실시태양에서, 상기 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 서열번호 1 내지 32에서의 보존적 치환(conservative substitution)을 포함한다. 이러한 치환은 하기에 더 설명되었다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 상기 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 길이가 적어도 13개 아미노산이다. 다른 실시태양에서, 상기 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 길이가 70개 아미노산 또는 그 이하이다. 일부 실시태양에서, 상기 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 길이가 15 내지 61개 아미노산이다. 다른 실시태양에서, 상기 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 길이가 20 내지 30개 아미노산이다.
추가적인 실시태양에서, 상기 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 인산화(phosphorylated)되거나 클리코실화(glycosylated) 되지 않는다. 다른 형태에서, 상기 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 번역-후(post-translationally) 변형되었다. 예를 들어, 상기 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 오직 인산화 또는 오직 글리코실화 또는 인산화 및 글리코실화 모두 될 수 있다. 하나 이상의 잔기가 이런 방식으로 변형될 수 있다.
특별한 실시태양에서, 상기 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되거나 필수적으로 구성된다. 이런 실시태양에서, 추가적인 아미노산 잔기처럼 서열번호 1 내지 32를 포함하는 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 하기에 기재된 분석에 따라 측정될 수 있을 때, 세균성 효소의 활성의 저해, 감소 또는 예방을 위한 활성을 보이는 한 서열번호 1 내지 32로 "필수적으로 구성"될 것이다. 마찬가지로, 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 하기에 기재된 분석에 따라 측정될 수 있을 때, 세균성 효소의 활성의 저해, 감소 또는 예방 활성을 보이는 한 서열번호 1 내지 32에 상응하는 서열보다 짧은 것 중 어느 하나로 "필수적으로 구성"된다. 상기 실시태양들은 그 다음에 전-장의 카제인 서열을 포함하지 않는다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 서열번호 1 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 그런 아미노산 서열로 필수적으로 구성된다. 몇몇의 실시태양에서, 상기 군은 서열번호 1 내지 5로 구성된다.
일부 실시태양에서, 세균성 효소, 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱의 활성을 저해, 감소 또는 예방하기 위한 나선 구조를 형성할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱이 제공되며, 이것은 세균성 효소의 활성을 비-경쟁적으로 저해, 감소 또는 예방한다.
다른 실시태양에서, 상기 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 효소가 기질과 상호작용 할 때, 효소, 기질 또는 효소 및 기질 모두에 결합하는 것과 같은 기질에서 산물 생성으로부터 효소를 저해, 감소 또는 예방한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 도움이 필요한 환자의 경구(oral cavity)내의 P. gingivalis 효소의 활성을 저해, 감소 또는 예방에 이용하기 위한 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료적 펩타이드 또는 글리코실화되고 인산화된 변이체(variant) 및 그것의 결실 및 치환 돌연변이를 제공한다. 몇몇의 실시태양에서, 서열번호 1의 상기 변이체 및 돌연변이는 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇의 실시태양에서, 서열번호 2의 상기 변이체 및 돌연변이는 서열번호 4 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇의 실시태양에서, 서열번호 3의 상기 변이체 및 돌연변이는 서열번호 5 및 서열번호 10 내지 32로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시태양에서, 세균성 효소를 저해하기 위한 본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱을 포함하는 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체가 제공된다. 몇몇의 실시태양에서, 상기 조성물은 이가 양이온(divalent cation)을 추가로 포함한다.
한 실시태양에서, 하나 이상의 질환을 치료 또는 예방하기 위해 치료가 필요한(in need) 개체에 유효량의 본 발명의 화합물, 펩타이드, 펩티도미메틱 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 한 실시태양에서, 상기 화합물, 펩타이드, 펩티도미메틱 또는 조성물은 개체의 치은(gums)에 직접적으로 투여된다. 한 실시태양에서, 상기 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 치약(toothpastes), 치분(toothpowders) 및 액상 치약(liquid dentifrices), 구강청결제(mouthwashes), 트로키(troches), 츄잉껌(chewing gums), 덴탈 페이스트(dental pastes), 잇몸 마사지 크림(gingival massage creams), 가글 알약(gargle 정제s), 유제품(dairy products) 및 다른 식품류를 포함하는 치약(dentifrice)과 같이 입에 적용가능한 조성물의 일부일 수 있다. 치료 또는 예방에 적합한 질환 또는 질병의 예는 치주질환 및 치아우식증(dental caries)을 포함한다. 진지페인의 효소 활성(enzymatic activity)에 의해 야기되거나 결부된 어떤 질병 또는 질환이 본 발명에 따른 치료 또는 예방에 적합할 것이다.
치료가 필요한 또는 치주질환 또는 치아 우식증 발전의 위험이 있는 개체는 동물이다. 몇몇의 실시태양에서, 상기 개체는 인간, 개, 고양이, 말, 양 또는 소이다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물, 펩타이드, 펩티도미메틱 또는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 치주질환을 치료 또는 완화하기 위한 방법이 제공된다.
몇몇의 실시태양에 따라, 서열번호 1 내지 5 및 서열번호 1 내지 32 아미노산 서열 및 그것에 적어도 60% 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 같이 서열번호 1 내지 5 및 그 안의 보전적 치환 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되거나 필수적으로 구성된 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱을 포함하는 조성물이 효소에 접촉하는 것을 포함하는 세균성 효소를 저해하기 위한 방법이 제공된다. 특정한 실시태양에서, 상기 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱의 아미노산 서열은 전장(full-length)의 카제인 서열을 포함하지 않는다. 이런 실시태양 중 어느 하나에 따라, 상기 세균성 효소는 포르피로모나스 긴기발리스균(Porphyromonas gingivalis)에서 유래한 진지페인과 같은 진지페인일 수 있다.
이런 실시태양 중 어느 하나에 따라, 상기 접촉 단계는 상기 조성물을 치료가 필요하거나 치주질환 또는 치아 우식증 발달의 위험이 있는 개체와 같은, 그것이 필요한 개체(인간과 같은)에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이런 실시태양 중 어느 하나에 따라, 상기 방법은 치주질환 또는 치아 우식증의 증상 치료 또는 완화에 효과적일 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 방법은 항-염증 약제, P. gingivalis 또는 P. gingivalis에 의해 발현되는 단백질에 결합하는 항체, 항생제(antibiotics) 및 항생물막 약제(antibiofilm agent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 상기 항생제는 아목시실린(amoxicillin), 독시사이클린(doxycycline) 및 메트로니다졸(metronidazole)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 항-염증 약제들은 비스테로이드성 항-염증제들Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs, NSAIDs)을 포함한다. NSAIDs의 예는 사이클로 옥시게나아제(cyclooxygenase)를 저해하는 화합물을 포함한다. NSAIDs의 특정한 예는 아스피린(aspirin), 이부프로펜(ibuprofen) 및 나프록센(naproxen)을 포함한다. 항생물막 약제의 예는 옥산텔과 같은 푸마르산 환원 효소(fumarate reductase)의 저해제이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 화합물, 펩타이드, 펩티도미메틱 또는 조성물을 치주질환 및/또는 치료를 위해 적합하다고 발견한 다른 질환의 치료 또는 예방을 위한 약(medicament) 제조에의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 유효량의 본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱을 포함하는 치주질환(및/또는 상기에서 치료를 위해 적합하다고 발견한 다른 질환)의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체를 제공한다. 상기 조성물은 추가로 항-염증 약제, P. gingivalis 또는 P. gingivalis에 의해 발현되는 단백질에 결합하는 항체, 항생제(antibiotics) 및 항생물막 약제(antibiofilm agent)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제를 포함할 수 있다. 상기 항생제는 아목시실린(amoxicillin), 독시사이클린(doxycycline) 및 메트로니다졸(metronidazole)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
몇몇 실시태양에 따라, 서열번호 1 내지 5 및 그 안의 보전적 치환, 또는 서열번호 1 내지 32 및 그것에 적어도 60% 동일한 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 같은, 세균성 효소를 저해하는 카제인 또는 그것의 단편의 아미노산 서열로 구성되거나 필수적으로 구성되는 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱을 포함하는, 개체 안의 세균성 효소를 저해하기에 효과적인 양의 약학적 조성물이 제공된다. 특정 실시태양에서, 상기 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱의 아미노산 서열은 전-장의 카제인 서열을 포함하지 않는다.
이런 실시태양 중 어느 하나에 따라, 상기 조성물은 아연(zinc)과 같은 이가 양이온 및/또는 포르피로모나스 긴기발리스균(Porphyromonas gingivalis) 또는 포르피로모나스 긴기발리스균(Porphyromonas gingivalis)에 의해 발현되는 단백질에 결합하는 항-염증 약제, 항생제, 항생물막 약제 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제를 추가로 포함할 수 있다.
이런 실시태양 중 어느 하나에 따라, 상기 조성물은 치은에 국소(topical) 투여하기 위해 만들어질 수 있고 및/또는 단위 용량(unit dosage) 형태로 제공될 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱을 유효성분으로 포함하는, 치주질환(및/또는 상기에서 치료를 위해 적합하다고 발견한 다른 질환)의 치료 또는 예방을 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 추가로 이가 양이온을 포함할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱을 주성분으로서 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 예를 들어 치주질환 및/또는 상기에서 치료를 위해 적합하다고 발견한 다른 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 조성물은 추가로 이가 양이온을 포함할 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 치주질환 및/또는 상기에서 치료를 위해 적합하다고 발견한 다른 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 조성물은 이가 양이온을 추가로 포함할 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 화합물, 펩타이드, 펩티도미메틱 또는 조성물 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 키트(kit of parts)를 제공한다.
일부 실시태양에서, 상기 이가 양이온은 Zn2 +, Ca2 +, Cu2 +, Ni2 +, Co2 +, Fe2 +, Sn2+, 및 Mn2 +로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 상기 이가 양이온은 SnF+ 및 CuF+와 같은 불소와 결부될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 이가 양이온은 Ca2+ 또는 Zn2 +이다.
일부 실시태양에서, 상기 이가 양이온 대 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱의 비율은 1.0:4.0의 범위 내와 같은, 1.0:2.0 에서 1.0:10.0의 범위 내이다.
여기서 사용되는 용어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하는(comprising)", "포함하다(comprises)" 및 "포함된(comprised)"과 같은 상기 용어의 변형은 문맥에 달리 해석되지 않는 한, 목적은 추가적인 첨가물(additives), 성분(성분s), 정수(integers) 또는 단계를 배재하지 않는데에 있다.
실시태양의 구체적인 기술
이 명세서에서 밝혀지고 정의된 본 발명이 글 또는 도에서 언급되거나 분명한 둘 또는 그 이상의 각각의 특징(features)의 모든 대체적인 조합(combination)으로 확대하는 것은 이해될 것이다. 모든 이러한 다른 조합들은 본 발명의 다양한 대체적인 측면으로 여겨진다.
프로테아제 저해 특성을 보이는 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 경구 케어 제품(oral care products), 기능성 식품(functional foods), 및 제약(pharmaceutical)에 사용될 수 있다. 본 발명은 P. gingivalis의 세포외(extracellular) 프로테아제 저해 활성으로 특징지어지는 새로운 우유 카제인 펩타이드를 확인하였다. 이런 펩타이드는 합성적으로 또는 우유 카제인의 효소에 의한 소화로 얻어짐으로써 생산될 수 있다. 상기 펩타이드는 인간, 소, 염소 및 양을 포함하는 여러 종의 우유 카제인에서 얻어질 수 있다.
소의 우유 카제인은 단백질 가수분해성 파괴(proteolytic breakdown)에 비교적 강하다고 알려진 천연단백질이다. 카제인은 소의 우유 섭취 후에 소장(small intestine)의 말단 부분(distal portion) 및 인간의 혈액에서 검출되어왔다.
이런 펩타이드는 천연 원료에서 유래될 수 있으며, 뚜렷한 맛을 갖지 않고, 아연과 같은 이가 양이온이 결합되어 사용되었을 때 그 맛을 가릴 수 있는 것을 포함하는 몇몇의 이점을 가지나, 이에 한정되지 않는다. 상기 펩타이드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
αS1-casein(11-23) - (서열번호1)
β-casein(193-209) - (서열번호2)
κ-casein(109-137) - (서열번호3)
β-casein(193-205) - (서열번호4)
κ-casein(117-137) - (서열번호5).
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열의 기능성 단편을 포함한다. 기능성 단편은 서열번호 1 내지 5에 해당하는 아미노산 서열보다 짧은 아미노산 서열이나 아직 서열번호 1 내지 5에 해당하는 아미노산 서열의 기능을 유지한다. 기능성 단편은 예를 들어 펩티드 말단 분해효소(exopeptidase)를 이용한 아미노산 서열의 단축, 또는 더 짧은 길이의 아미노산 서열을 합성, 및 그 다음에 하기의 실시예에서 보여진 방법에 의한 것처럼 어떤 프로테아제 저해 활성에 대한 테스트에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
또한 이종상동성(orthologous) 단편에 해당하는 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열의 변이체 및 서열번호 1 내지 5에서 유래된 소의 카제인 유사 단백질(paralogous proteins)이 본 발명의 범위 내이다.
만약 서열들이 유전자 중복(gene duplication) 사건에 의해 분리된다면 그 서열들은 "유사성(paralogous)"이다: 만일 생물(organism) 안의 유전자가 같은 게놈에서 두 개의 다른 위치를 차지하기 위해 중복된다면, 그 두 카피는 유사하다.
만약 서열들이 종 분화(speciation) 사건에 의해 분리된다면 그 서열들은 "이종상동성(orthologous)"이다: 종이 두 개의 분리된 종으로 갈라질 때, 그 결과의 종 내의 단일 유전자의 갈라진 카피는 이종상동성이라 한다.
본 발명의 범위 내의 변이체의 다른 군은 번역-후 변형(post-translational modifications)을 포함하는 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열이다. 특정한 번역-후 변형은 인산화(phosphorylation) 및 글리코실화(glycosylation)이다. 이러한 변형을 보여주기 위하여, 소의 카제인의 다수의 알려진 유전적 변이체들은 하기로 알려져 있다:
A. αS1-카제인(Casein )
1. αS1-카제인(Casein) Xa-9P(유전적 변이체- A, B, C, D, E, F, G 및 H)
2. αS1-카제인(Casein) 단편(fragments)
B. αS2-카제인(Casein)
1. αS2-카제인(Casein) Xa-15P(유전적 변이체- A, B, C, D)
2. αS2-카제인(Casein) Xa-9P(f51-207)(유전적 변이체- A, C)
3. αS2-카제인(Casein) Xa-5P(f65-203)(유전적 변이체- A, C)
C. β-Caseins
1. β-카제인 Xa-5P(유전적 변이체- A1, A2, A3, B, C, D, E, F, G, H1, H2 및 I)
2. β-카제인 Xa-1P(f29-209)(유전적 변이체- A1, A2, A3, B, C, E, F, G, H1, H2 및 I)
3. β-카제인 Xa-(f106-209) (유전적 변이체- A2, A3, B, F, G, H2)
4. β-카제인 Xa-(f108-209)(유전적 변이체- A2, B, F, G 및 H2)
5. β-카제인 Xa-4P(f1-28)(유전적 변이체s- A2, D 및 H1)
6. β-카제인 Xa-5P (f1-105)(유전적 변이체s- A1, A2, B, C, D, E, F, G, H1, H2 및 I)
7. β-카제인 Xa-5P (f1-107)(유전적 변이체- A1, A2, A3, B, C, D, E, F, G, H1, H2 및 I)
8. β-카제인 Xa-1P (f29-105)(유전적 변이체- A1, A2, B, C, E, F, G, H1, H2 및 I)
9. β-카제인 Xa-1P (f29-107)(유전적 변이체- A1, A2, A3, B, C, E, F, G, H1, H2 및 I)
D. κ-카제인
1. κ-카제인 Xa-2P(유전적 변이체- A, B, C, E, F1, F2, G1, G2, H, I 및 J)
2. κ-카제인 Xa-2P(f106-169)(유전적 변이체- A, B, E, F1, F2, G1, G2 및 J)
3. κ-카제인 Xa-2P(f117-169)(유전적 변이체- A, B, E, F1, F2, G1, G2 및 J)
aX는 유전적 변이체를 나타내며, 여기에서 유전적 변이체는 그 뒤의 괄호에 기재된 변이체들 중 어느 하나일 수 있다.
상기의 명명법은, 예를 들어, β-카제인 B-1P(f29-209) 단백질은 카제인의 β-족(family)의 일부분이고, B 유전적 변이체이며, 인산화될 수 있는 아미노산 잔기를 포함하고, β-카제인 탄백질 잔기 29 내지 잔기 209의 단편인 것과 같이, 카제인의 알려진 변이체를 기재한다. 이런 단백질 내의 아미노산은 인산화하기 쉽다고 알려졌다. 상기 명명법 및 카제인 변이체의 추가적인 기재는 Farrell et al. Nomenclature of Proteins of Cow's Milk - Sixth Revision. Journal of Dairy Science (2004)87:1641-1674에 기재된다. 그런 이유로, 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열에 해당하는 이러한 서열의 상기 단편들은 변이체들이며, 본 발명에서 밝혀진 부분을 형성한다
펩타이드의 특정한 서열보다는 프로테아제 저해 활성을 초래하는 그 펩타이드의 본성이라고 생각되기 때문에, 이른바 보존적 치환은 활성의 상당한 손실이 없는 펩타이드 서열로 만들어질 수 있다. 본 발명에 제한되지 않고, 몇몇의 실시태양에서, 본 발명의 펩타이드 또는 펩티도미메틱의 아미노산의 25%까지는 보존적으로 치환될 수 있다. 본 발명의 목적은 활성의 상당한 손실을 야기하지 않는 그런 보존적 치환을 포함하는 것에 있다. 상기에서 언급된 보존적 치환의 개념은 당업계에서 잘 숙련된 당업자에게 자명하지만, 명확성을 기하기 위하여 보존적 치환은 아래와 같이 정한다.
Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Met;
Asp, Glu, Ser;
Asn, Gln;
Ser, Thr;
Lys, Arg, His;
Phe, Tyr, Trp; 및
Pro, Nα-알칼아미노산(alkalamino acids).
당업계에서 잘 숙련된 당업자에게 자명한, 같은 족 중에 다른 것에 의한 극성(polar), (+)전하를 띄는(charged), (-)전하(charged)를 띄는 또는 지방족(aliphatic) 아미노산 중의 어떤 하나의 치환은 보존적으로 치환될 수 있다.
이러한 추가적인 실시태양의 예를 들기 위해(본 발명을 제한되지 않고), 하기의 서열이 제공된다:
αS1-카제인(11-23),
Leu Pro Gln Glu Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe(서열번호1)(Bos taurus(소))
Leu Pro Gln Gly Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe(서열번호 6)(Bubalus bubalis(물소(Domestic water buffalo)))
Leu Ser Pro Glu Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe (서열번호 7)(Capra hircus(염소))
Leu Ser Ser Glu Val Leu Asn Glu Asn Leu Leu Arg Phe (서열번호 8)(Ovis aries(양))
β-카제인(193-209),
Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile Val(서열번호2)(Bos taurus(소))
Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Leu Val(서열번호 9)(Capra hircus(염소), Ovis aries(양))
β-카제인(193-205),
Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe(서열번호4)(Bos taurus(소))
κ-카제인(109-137),
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호3)(Bos taurus(소))
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Ile Glu(서열번호 10)(Syncerus caffer nanus(붉은 물소(Forest Buffalo)))
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Ile Thr Glu(서열번호 11)(Bos indicus(인도 혹소(Zebu)))
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr(O-linked GalNAc) Pro Thr Thr Glu(서열번호 12)(Bos taurus(소))
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr(O-linked GalNAc) Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 13)(Bos taurus(소))
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr(O-linked GalNAc) Glu(서열번호 14)(Bos taurus(소))
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr(O-linked GalNAc) Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 15)(Bos taurus(소))
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser(P) Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 16)(Bos taurus(소))
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Val Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 17)(Bubalus bubalis(물소))
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Val Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 18)(Bubalus bubalis(물소))
Pro Pro Lys Lys Asp Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 19)(Oreamnos americanus(산양(Mountain goat)))
Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Ala Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 20)(Oreamnos americanus(산양))
Pro Pro Lys Lys Asp Gln Asp Lys Thr Glu Val Pro Ala Ile Asn Thr Ile Ala Ser Ala Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 21)(Capra hircus(염소), Ovis aries(양))
κ-카제인(117-137),
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호5)(Bos taurus(소))
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Ile Glu(서열번호 22)(Syncerus caffer nanus(붉은 물소))
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Ile Thr Glu(서열번호 23)(Bos indicus(인도 혹소))
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr(O-linked GalNAc) Pro Thr Thr Glu(서열번호 24)(Bos taurus(소))
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr(O-linked GalNAc) Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 25)(Bos taurus(소))
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr(O-linked GalNAc) Glu(서열번호 26)(Bos taurus(소))
Thr Glu Ile Pro Thr(O-linked GalNAc) Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 27)(Bos taurus(소))
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser(P) Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 28)(Bos taurus(소))
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Val Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu (서열번호 29)(Bubalus bubalis(물소))
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Val Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 30)(Bubalus bubalis(물소))
Thr Glu Ile Pro Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Ala Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu(서열번호 31)(Oreamnos americanus(산양))
Thr Glu Val Pro Ala Ile Asn Thr Ile Ala Ser Ala Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr Glu (서열번호 32)(Capra hircus(염소), Ovis aries(양))
(P)는 앞선 아미노산이 인산화된 것을 표기한다. 즉, Ser(P)는 세린(serine) 아미노산이 인산화된 것이다.
(O-linked GalNAc)는 앞선 아미노산이 아미노산 측쇄의 하이드록시 옥시젠에 부착된 N-아세틸갈락토사민(Acetylgalactosamine, GalNAc)을 갖는 것을 표기한다. 즉, Thr(O-linked GalNAc)는 그것의 측쇄의 하이드록시 옥시젠에 부착된 N-아세틸갈락토사민(Acetylgalactosamine, GalNAc)을 가진 트레오닌(threonine) 아미노산이다. 다른 글리칸은 이당류(disaccharides) 예를 들어 Gal(b1-3)GalNAc, 삼당류(trisaccharides) 예를 들어 NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)GalNAc 또는 Gal(b1-3)[NeuAc(a2-6)]GalNAc 및 사당류(tetrasaccharides), 예를 들어 NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)[NeuAc(a2-6)]GalNac을 포함하는 GalNAc에 부착되어 글리칸 체인 길이를 늘릴 수 있다.
또한, 본 발명은 DEPTXPTTE(여기서 X = TQ 또는 ST), QEPVX1GPVRGPX2PIIX 3I(여기서 X1 = L, N 또는 K, X2 = F, Y 또는 C 및 X3 = L, H 또는 V) 및 EVLNENLLRF로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱을 제공한다.
실시태양에서 본 발명은 서열번호 1 내지 32가 포함된 것 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 필수적으로 구성되거나 구성된 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱을 제공하나, 전-장의 카제인 서열은 포함하지 않는다.
서열번호 1 내지 32 중 어느 하나에 의해 정의된 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 결실이 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱의 프로테아제 활성의 저해, 감소 또는 예방 능력의 손실 없이 이루어질 것이라는 것이 당업계의 당업자에게 자명하다. 일부 실시태양에서, 서열번호 1 내지 32를 포함하는 펩타이드 또는 펩티도미메틱의 25%까지 결실될 수 있으나, 그 결과로 초래된 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 프로테아제 활성의 저해, 감소 또는 예방하는 능력이 유지되어야만 한다. 여기에 기재된 것들을 포함하는 실험은 하나 이상의 아미노산 결실로 인해 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나와 다른 아미노산 서열을 가진 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱이 여전히 프로테아제 활성을 저해, 감소 또는 예방하는지 측정하기 위해 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 화합물, 펩타이드, 펩티도미메틱 또는 조성물은 치주질환의 치료 또는 예방이 필요한 개체의 치은에 직접적으로 투여될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 상기 조성물은 국소적으로 투여되나, 화합물, 펩타이드, 펩티도미메틱 또는 조성물이 또한 비경구(parenterally)로, 예를 들어, 정맥 주사(injection intravenously), 복막 주사(injection intraperitoneally), 근육 주사(injection intramuscularly), 척수관 주사(injection intrathecally) 또는 피하 주사(injection subcutaneously)로 투여될 수 있는지 당업계의 당업자에 의해 평가될 수 있다.
또는, 본 발명의 상기 화합물, 펩타이드, 펩티도미메틱은 경구 투여(oral administration)(설하(sublingual) 및 볼점막 내(buccal) 포함), 폐 투여(pulmonary administration)(비강(intranasal) 및 흡입(inhalation)), 경피 투여(transdermal administration), 또는 직장 투여(rectal administration)를 위한 조성물로 만들어질 수 있다.
치료가 필요한 개체는 치주질환의 잠재적(subclinical) 또는 임상적(clinical) 증상을 보이는 개체일 수 있다. 치주질환의 잠재적 또는 임상적 징후(manifestations)는 잇몸의(gingiva) 급성 또는 만성 염증을 포함할 수 있다. 급성 염증의 전형적인 특징은 혈액에서 상처받은 조직으로의 혈장(plasma) 및 백혈구(leukocytes)의 증가된 움직임을 포함할 수 있다. 잇몸 급성 감염의 임상적인 신호는 또한 발적(rubor: redness), 열(calor: 증가된 열(increased heat)), 종양(종창(swelling)), 동통(dolor: pain), 및 기능상실(Functio laesa : loss of Function)를 포함할 수 있다. 만성 염증은 백혈구 세포(단핵구(monocytes), 대식세포(macrophages), 림프구(lymphocytes), 형질세포(plasma cells)) 침윤에 의해 특징지어질 수 있다. 조직 및 뼈의 손실이 관찰될 수 있다. 또한 치료가 필요한 개체는 치주에서 P. gingivalis 세균이 치주질환이 없는 각각에서 관찰되는 정상 범위보다 증가된 정도를 갖는 것에 의해 특징지어질 수 있다.
투여의 방법은 투여될 길항제(antagonist) 또는 조성물의 성질 및 개체의 상태의 심각성을 포함하는 여러 인자들에 의해 결정될 것이다. 투여되는 본 발명의 화합물, 펩타이드, 펩티드미메틱의 투여 빈도 및 본 발명의 화합물, 펩타이드, 펩티도미메틱의 투여량은 다른 것들 중에, 개체에서의 치주질환의 개시 또는 진행 단계에 의해 결정된 개체에 따라 달라지는 것이 자명하다. 상기 투여 빈도는 임상의에 의해 결정될 것이다.
또한, 진지페인 또는 관련된 프로테아제(예를 들어, 다른 시스테인 프로테아제)의 프로테아제 활성의 결과인 또는 그것과 관련된 어떤 질병, 질환 또는 증후군(syndrome)이 본 발명의 화합물, 펩타이드, 펩티도미메틱 또는 조성물에 의해 예방 또는 치료될 것으로 고려된다. 또한, 치주질환의 결과인 또는 그것과 관련된 다른 질병, 질환 또는 증후군(syndrome)이 또한 치료되거나 그 질병, 질환 또는 증후군 발달의 위험이 감소될 수 있다. 예를 들어, 치주질환은 사람의 심혈관계 질병(cardiovascular disease) 발달의 위험을 증가시킬 수 있다. 이 심혈관계 질병 발달의 위험 증가는 본 발명의 화합물, 펩타이드, 펩티도미메틱 또는 조성물을 치주질환에 걸린 사람에게 투여하여 감소시킬 수 있다.
'펩티도미메틱'은 본 발명의 펩타이드와 상당히 같은 구조 및/또는 기능적 특성을 가진 화학 합성 화합물이고, 후자는 여기에서 더 기재되었다. 일반적으로, 펩티도미메틱은 예를 들어, 카제인 또는 그것의 단편의 같거나 유사한 서열처럼 본 발명의 펩타이드와 같거나 유사한 구조를 갖는다. 펩티도미메틱은 대게 적어도 하나의 자연적으로 합성되지 않은 잔기를 포함한다. 펩티도미메틱 화합물의 비-천연 성분은 하나 이상의: a) 천연 아마이드 결합('펩타이드 결합')외의 잔기 연쇄군; b) 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기들 대신에 비-천연 잔기; 또는 c) 이차 구조 모방을 유도하는 잔기, 즉, 이차 구조를 유도 또는 안정시키는, 예를 들어, 베타 회전(beta turn), 감마 회전(gamma turn), 베타 병풍(beta sheet), 알파 나선 구조(alpha helix conformation), 및 등등 에 따른다.
펩티도미메틱은 과학 및 특허 문헌, 예를 들어, Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY, al-Obeidi (1998) Mol . Biotechnol . 9:205-223; Hruby (1997) Curr . Opin . Chem . Biol . 1:114-119; Ostergaard (1997) Mol . Divers . 3:17-27; Ostresh (1996) Methods Enzymol . 267:220-234에 기재된 다양한 절차 및 방법론을 이용하여 합성될 수 있다.
본 발명의 상기 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 이런 조성물은 GMP 상태하에서 또는 몇몇의 실시태양에서 종래의 혼합, 용해, 과립화, 드라제-제조(dragee-making), 가루화(levigating), 유체화(emulsifying), 캡슐화(encapsulating), 포괄(entrapping) 또는 동결건조(lyophilizing) 공정으로 제조될 것이다.
약학적 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제(diluent), 첨가제(excipient) 또는 보조제(auxiliaries)를 이용하여 만들어질 것이다. 상기 성분은 펩타이드 또는 펩티도미메틱을 약학적으로 이용할 수 있는 제제로 만드는 공정을 가능하게 할 것이다.
치료를 위한 투여는 비경구(parenteral), 정맥(intravenous), 경구(oral), 피하(subcutaneous), 동맥(intraarterial), 두개(intracranial), 척수관(intrathecal), 복막(intraperitoneal), 국소(topical), 비강(intranasal) 또는 근육(intramuscular)일 수 있다.
비경구 투여를 위한 약학적 조성물은 일반적으로 살균되고 주로 등장성(isotonic)이다. Hank's 용액, Ringer's 용액 또는 생리 식염수와 같은 생리학적으로 호환가능한 버퍼 또는 아세테이트 버퍼가 이용될 수 있다. 또한, 상기 용액은 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 포함할 수 있다. 상기 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 사용 전에, 멸균 주사용 증류수(sterile pyrogen-free water)와 같은 용제에 분산되기 위해 가루 형태로 제공될 수 있다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드, 즉, 여기서 정의된 본 발명의 펩타이드 서열에 대한 "아미노산 서열 상동성 퍼센트(percent)(%)" 또는 "동일한 퍼센트(%)"는 최대 서열 상동성 퍼센트를 얻기 위하여, 필요하다면, 서열을 얼라인하고(align) 갭(gap)을 제기(introduce)한 후에, 특정한 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 즉, 본 발명의 펩타이드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 퍼센트로 정의되고, 서열 상동성의 하나로서 어떤 보존적인 치환을 고려하지 않는다.
당업자는 얼라인먼트(alignment)를 측정하기 위해 비교되는 서열의 전-장을 넘는 최대한의 얼라인먼트(alignment)을 얻기 위해 필요한 어떤 알고리즘(하기에 기재된 예를 제한되지 않고)을 포함하는 적절한 변수(parameters)를 측정할 수 있다. 아미노산 서열이 얼라인되었을 때, 주어진 아미노산 서열 B(주어진 아미노산 서열 B에 대해 어떤 아미노산 서열 상동성 퍼센트를 가진 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 대신 표현될 수 있다)에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열의 상동성 퍼센트는: 아미노산 서열 상동성=X/Y100, 여기에서 X는 서열 얼라인 프로그램 또는 알고리즘(algorithm)의 얼라인으로 A 및 B의 얼라인 동일성 수치를 매긴 아미노산 잔기의 수 및 Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수로 계산될 수 있다. 만일 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않다면, B에 대한 A의 아미노산 서열 상동성 퍼센트는 A에 대한 B의 아미노산 서열 상동성 퍼센트와 같지 않을 것이다.
상동성 퍼센트 계산에서, 특징적으로 정확히 같은 것이 세어졌다. 두 서열 사이의 상동성 퍼센트의 측정은 수치 알고리즘(mathematical algorithm)을 이용하여 달성된다. 두 서열을 비교하기 위해 활용된 수치 알고리즘의 제한되지 않은 예는 Karlin 및 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877에서 처럼 변형된 Karlin 및 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264이다. 이런 알고리즘은 Altschul et al. (1990) J. MoI. Biol. 215:403의 BLASTN 및 BLASTX 프로그램에 포함된다. 비교 목적을 위한 갭이 많은 얼라인(gapped alignments)을 얻기 위해, Gapped BLAST(BLAST 2.0에서)가 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res 25:3389에 기재된 것처럼 활용될 수 있다. 또는 PSI-Blast가 분사 간의 관계 거리를 측정하는 반복적인 검색을 수행하기 위해 이용될 수 있다. Altschul et al. (1997) supra를 참고하라. BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 활용할 때, 각각의 프로그램(예를 들어, BLASTX 및 BLASTN)의 디폴트(default) 변수(parameters)가 이용될 수 있다. 또한, 얼라인먼트는 검토에 수동으로 수행될 것이다. 서열의 비교를 위해 활용되는 수치 알고리즘의 다른 제한되지 않은 예는 ClustalW 알고리즘(Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680)이다. ClustalW는 서열을 비교하고 아미노산 또는 DNA 서열의 전체를 얼라인하여, 이와 같이 아미노산 서열 전체의 서열 보존에 대한 데이타를 제공할 수 있다. ClustalW 알고리즘은 Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)의 ALIGNX module과 같은 몇몇의 상업적으로 가능한 DNA/아미노산 분석 소프트웨어 패키지에서 이용된다. ClustalW로 아미노산 서열의 얼라인먼트 후에, 아미노산 서열 상동성 퍼센트가 평가될 수 있다. ClustalW 얼라인먼트의 분석을 위해 유용한 소프트웨어 프로그램의 제한되지 않은 예는 GENEDOCT 또는 JalView(http://www.jalview.org/)이다. GENEDOCT은 많은 단백질 사이의 아미노산(또는 DNA)의 유사성(similarity) 및 상동성의 평가를 가능하게 한다. 서열의 비교를 위해 활용되는 수치 알고리즘의 다른 제한되지 않은 예는 Myers 및 Miller (1988) CABIOS 4:11-17의 알고리즘이다. 이런 알고리즘은 GCG Wisconsin Genetics Software Package, Version 10(Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USA)의 일부인 ALIGN 프로그램(2.0 버전)에 포함시킨다. 아미노산 서열의 ㅂ비교를 위해 IGN 프로그램을 활용할 때, PAM 120 잔기 중량 표(PAM 120 weight residue table), 12의 갭 길이 패널티(gap length penalty of 12), 및 4의 갭 패널티가 이용될 수 있다.
그러나, 본 발명은 인간에 적용하고, 또한 본 발명은 수의(veterinary) 목적에 유용하다. 본 발명은 여기에 기재된 바와 같이, 소(cattle), 양, 말 및 가금류(poultry)와 같은 가축; 고양이 및 개와 같은 반려 동물; 및 동물원 동물들의 질병 또는 질환의 치료 또는 예방을 위해 유용하다.
상기-언급된 약학적 조성물을 포함하는 본 발명의 경구 조성물은 치약(toothpastes), 치분(toothpowders) 및 액상 치약(liquid dentifrices), 구강청결제(mouthwashes), 트로키(troches), 츄잉껌(chewing gums), 덴탈 페이스트(dental pastes), 잇몸 마사지 크림(gingival massage creams), 가글 알약(gargle 정제s), 유제품(dairy products) 및 다른 식품류를 포함하는 치약(dentifrice)와 같은 입에 적용될 수 있는 다양한 형태로 제조 및 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 경구 조성물은 특정 경구 조성물의 타입 및 형태에 따라 잘 알려진 성분을 추가로 포함할 수 있다.
선택적으로, 상기 조성물은 그람 음성(Gram negative) 혐기성(anaerobic) 세균에 유독하거나 성장을 저해하는 하나 이상의 항생제를 추가로 포함할 수 있다. 잠재적으로 어떤 세균 발육 저지(bacteriostatic) 또는 살균 항균제는 본 발명의 조성물에 이용될 수 있다. 적합한 항생제는 아목시실린(amoxicillin), 독시사이클린(doxycycline) 또는 메트로니다졸(metronidazole)을 포함한다.
본 발명의 어떤 형태에서, 상기 경구 조성물은 주로 구강청결제(mouthwash) 또는 린스(rinse)와 같은 액체의 성격일 수 있다. 그런 제제에서, 비히클(vehicle)은 하기에 기재된 바와 같이 일반적으로 바람직하게는 보습제(humectant)를 포함하는 물-알콜 혼합물이다. 대게, 물 대 알콜의 중량 비율은 약 1:1 내지 약 20:1이다. 이 제제 형태에서 물-알콜 혼합물의 총 량은 일반적으로 상기 제제의 중량에 대해 약 70 내지 약 99.9%의 범위이다. 상기 알콜은 일반적으로 에탄올(ethanol) 또는 이소프로판올(isopropanol)이다. 일부 실시태양에서, 상기 알콜은 에탄올이다.
본 발명의 그런 액체 및 다른 제제의 pH는 약 5 내지 약 9의 범위이며, 일반적으로 약 5.0 내지 7.0이다. 상기 pH는 산(예를 들어, 구연산(citric acid) 또는 벤조산(benzoic acid)) 또는 염기(예를 들어, 수산화나트륨(sodium hydroxide))으로 조절될 수 있거나 완충(구연산나트륨(sodium citrate), 벤조산염(benzoate), 탄산염(carbonate) 또는 중탄산염(bicarbonate), 인산수소이나트륨(disodium hydrogen phosphate), 인산이수소나트륨(sodium dihydrogen phosphate), 등으로)된다.
본 발명의 다른 바람직한 형태에서, 상기 조성물은 대게 치분(toothpowder), 치과 약(dental 정제) 또는 치약(toothpaste: dental cream) 또는 치약 겔(gel dentifrice)과 같은 고체 또는 페이스트의 성격일 수 있다. 이런 고체 또는 페이스트의 경구 제제의 비히클은 대게 치과적으로 허용되는 광택제(polishing material)를 포함한다.
치약에서, 상기 액체 비히클은 일반적으로 제제의 중량에 대해 약 10% 내지 약 80%의 범위의 양으로 물 또는 보습제를 포함할 수 있다. 글리세린(glycerine), 프로필렌 글라이콜(propylene glycol), 솔비톨(sorbitol) 및 폴리프로필렌 글라이콜(polypropylene glycol)이 적합한 보습제/담체의 예가 된다. 또한, 물의 액체 혼합물, 글리세린 및 솔비톨이 유리하다. 굴절율(refractive index)이 중요한 고려사항인 투명한 겔에서, 물의 약 2.5 내지 30% w/w, 글리세린의 0 내지 약 70% w/w 및 솔비톨의 약 20 내지 80% w/w가 일반적으로 이용된다.
일반적으로 치약, 크림 및 겔은 약 0.5 내지 약 5% w/w와 같이 약 0.1 내지 약 10의 비율로 천연 또는 합성된 점성부여제(thickener agent) 또는 겔화제(gelling agent)를 포함한다. 적합한 점성부여제는 합성된 헥토라이트(hectorite), 예를 들어, Laporte Industries Limited에서 판매하는 라포나이트(Laponite)(예를 들면, CP, SP 2002, D)와 같은 합성된 콜로이달 마그네슘 알칼리 금속규산염 복합체 클레이(colloidal magnesium alkali metal silicate complex clay)가 가능하다. 라포나이트 D는, 거의 58.00% SiO2, 25.40% MgO, 3.05% Na2O, 0.98% Li2O의 중량 및 약간의 물 및 중금속류(trace metals)이다. 그것의 참비중(true specific gravity)은 2.53이며, 8% 습도에서 1.0로 보이는 부피 밀도(bulk density)를 가진다.
다른 적합한 점성부여제는 영국 이끼(Irish moss), 아이오타 카라기닌(iota carrageenan), 껌트라가칸트(gum tragacanth), 녹말(starch), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 하이드록시에틸프로필셀룰로오스(hydroxyethylpropylcellulose), 하이드록시부틸 메틸 셀룰로오스(hydroxybutyl methyl cellulose), 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스(hydroxypropyl methyl cellulose), 하이드록시에틸 셀룰로오스(예를 들어, 나트로졸(Natrosol)로 가능한), 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨(sodium carboxymethyl cellulose), 및 잘게 빻아진 사이로이드(Syloid)와 같은 콜로이달 실리카(예를 들어. 244)를 포함한다. 또한 가용화 약제들은 프로필렌 클리콜(propylene glycol), 디프로필렌 글라이콜(dipropylene glycol) 및 헥실렌 글라이콜(hexylene glycol)과 같은 폴리올스(polyols) 보습제, 메틸 셀로솔부 및 에틸 셀로솔브와 같은 셀로솔브(cellosolves), 올리브 오일, 피마자유(castor oil) 및 바셀린(petrolatum)과 같은 직쇄에 적어도 약 12개의 탄소가 포함된 식물성 오일 및 왁스 및 아밀 아세테이트(amyl acetate), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 및 벤질 벤조산(benzyl benzoate)과 같은 에스터와 같은 것들이 포함될 수 있다.
관례적으로, 상기 경구 제제는 보통 적합하게 표시된 패키지로 팔리거나 유통되는 것이 자명하다. 이와 같이, 구강 린스 한 병은 실질적으로 구강 린스 또는 구강 청결제로서 그것을 설명 및 그것을 사용하는 방법이 있는 라벨이 있고, 치약, 크림 또는 겔은 실질적으로 치약, 겔 또는 치과 크림으로서 그것을 설명한 라벨이 있는 보통 일반적으로 알루미늄, 납 또는 플라스틱으로 내장된 압출 튜우브(collapsible tube), 또는 다른 짜내는, 펌프 또는 압력을 가하는 내용물을 계량하기 위한 디스펜서에 있다.
유기 계면활성제(surface-active agent)는 증가된 치료적 또는 예방 작용를 얻기 위해 본 발명의 조성물에 사용되고, 구강을 통한 활성제의 빈틈없고 완전한 분산의 달성을 돕고, 즉각적인 화장용으로 더욱 허용되는 즉석 조성물을 만들 수 있다. 상기 유기 계면 활성 제료는 자연에서 음이온(anionic), 비이온성(non-ionic), 양쪽성(ampholytic)일 수 있으며, 몇몇의 실시태양에서 활성제와 상호작용하지 않는다. 계면활성제를 조성물에 세척성(detersive) 및 거품나는(foaming) 특성을 부여하는 세척성 재료로서 이용하는 것이 일반적이다. 음이온성 계면활성제의 적합한 예는, 수소화된 코코넛 오일 지방산의 황산화된 모노글리세파이드의 나트륨 염 더 높은 지방산의 모노글리세라이드(monoglyceride) 황산염(monosulfate), 로릴 황산 나트륨(sodium lauryl sulfate), 토데실 벤젠 술폰산염 나트륨(sodium dodecyl benzene sulfonate)과 같은 알킬 아릴 술폰산염(alkyl aryl sulfonates), 더 높은 알킬술포-아세테이트(alkylsulfo-acetates), 1,2-디하이드록시 프로판 술폰산염(dihydroxy propane sulfonate)의 더 높은 지방산 에스터, 및 12 내지 16개의 탄소를 지방산에 가지고 있는 더 낮은 지방족(aliphatic) 아미노 카르복시산(aliphatic amino carboxylic acid) 화합물의 상당히 포화된 더 높은 지방족 아실 아마이드, 알킬 또는 아실 라디칼, 및 등등의 수용성 염이다. 마지막에 언급한 아마이드의 예는 N-로로일 사르코신(lauroyl sarcosine), 및 나트륨, 칼륨, 및 N-로로일, N-미리스토일(myristoyl)의 에탄올아민염(ethanolamine salt), 또는 미누 또는 유사한 더 높은 지방산 재료에서 대게 없어야하는 N-팔미토일(palmitoyl) 사르코신이다. 본 발명의 경구 조성물에서의 이런 사르코신 화합물의 이용은 이런 재료들이 구강에서 당질 파괴에 기인하는 산의 형성뿐만 아니라 산성 용액에서 치아 에나멜의 용해도의 감소를 저해하는 것에서 장기적인 현저한 효과를 보이기 때문에 특히 이롭다. 이용에 적합한 수용성 비이온 계면활성제의 예는 에틸렌 옥사이드와 다양한 반응성 수소 포함 화합물이 반응한 긴 소수성 체인(예를 들어, 약 12 내지 20 탄소 원소의 지방족 체인)을 가진 축합체(condensation products)이고, 축합체("에쏘라머(ethoxamers)")는 지방산, 지방 알콜(fatty alcohols), 지방 아마이드(fatty amides), 다가의 알콜(polyhydric alcohols)(예를 들어, 솔비탄 모토스테아레이트(sorbitan monostearate)) 및 폴리프로필렌옥사이드(polypropyleneoxide)(예를 들면, 플루오닉(Pluronic) 재료)와 고분자결합 축합체(에틸렌 옥사이드)와 같은 친수성 폴리옥시에틸렌 성분을 포함한다.
상기 계면활성제는 일반적으로 약 0.1 내지 5% 중량부의 양으로 존재한다. 상기 계면활성제가 본 발명의 활성제의 분산을 도울 수 있고 그렇게 함으로써 필요한 용해되는 보습제의 양을 줄이는 것은 주목할만하다.
미백제(whitening agents), 보존료(preservatives), 실리콘(silicones), 클로로필 화합물 및/또는 요소(urea), 인산이암모늄(diammonium phosphate), 및 그것의 혼합물과 같은 암모니아와 화합한 재료와 같이 다른 다양한 재료들이 본 발명의 구강 제제에 포함될 수 있다. 이런 보조제는 바라는 특성 및 성질에 상당한 부작용을 일으키지 않는 양으로 제제에 포함된다.
어떤 적합한 향료 또는 감미제가 또한 이용될 수 있다. 적합한 향료 구성 성분의 예는, 예를 들어, 스피아민트, 페퍼민트, 노루발풀(wintergreen), 사사프라스(sassafras), 정향(clove), 유칼립투스(eucalyptus), 마조람(marjoram), 시나몬, 레몬, 및 오렌지의 오일과 같은 향유(flavouring oils) 및 살리실산메틸(methyl salicylate)이다. 적합한 감미제는 수크로즈, 락토즈, 말토즈, 솔비톨, 자일리톨, 시클람산 나트륨(sodium cyclamate), 페릴라르틴(perillartine), AMP(아스파틸 페닐 알라닌, 메틸 에스터), 사카린, 등등을 포함한다. 적합하게, 향료 및 감미제는 각각 또는 함께 제제의 약 0.1% 내지 5% 이상으로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱은 예를 들어, 따뜻한 껌 베이스에 섞어서 또는 껌 베이스의 바깥 표면에 코팅해서 목캔디, 또는 츄잉껌 또는 다른 제품의 실례가 되는 젤루통(jelutong), 고무 라텍스(rubber latex), 비닐라이트 수지(vinylite resins), 등등에 바람직하게는 관례적인 가소제(plasticizers) 또는 연화제, 설탕 또는 다른 감미제 또는 글루코즈, 솔비톨 등등과 같은 것과 함께 포함될 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 (a) 화합물, 펩타이드, 펩티도미메틱 또는 조성물 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 키트는 그런 치료가 필요한 환자에서 치주질환의 치료 또는 예방을 위한 사용상의 주의를 추가적으로 포함한다.
경구 사용을 위한 조성물은 약학적 조성물의 제조를 위한 당업계에 자명한 방법에 따라 제조될 수 있으며, 이런 조성물은 약학적으로 훌륭하고(elegant) 구미에 맞는(palatable) 제제를 제공하기 위하여 감미제, 향료, 착색제(colouring agents) 및 보존료로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 약제를 포함할 수 있다.
정제(Tablets)는 정제의 제조를 위해 적합한 무독성의 약학적으로 허용되는 첨가제와 섞인 유효성분을 포함한다. 이런 첨가제는 예를 들어, 탄산칼슘(calcium carbonate), 탄산나트륨(sodium carbonate), 락토오즈, 인산칼슘(calcium phosphate) 또는 인산나트륨(sodium phosphate) 와 같은 비활성(inert) 희석제; 예를 들어, 옥수수 녹말과 같은 과립제(granulating agent) 및 봉해제(disintegrating agent) 또는 알긴산(alginic acid); 예를 들어 녹말, 젤라틴 또는 아카시아(acacia)와 같은 결합제, 및 예를 들어, 스테아린산마그네슘(magnesium stearate), 스테아린산(stearic acid) 또는 탈크(talc)와 같은 윤활제(lubricating agent)일 수 있다. 상기 정제는 위장관(gastrointestinal tract)에서의 분해(disintegration) 및 흡수(absorption)를 늦추기 위하여 알려진 기술에 의해 탈피될 수 있거나 입혀질(coat) 수 있고, 그렇게 함으로써 장기간에 걸친 지효성(sustained action) 제공한다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트(glyceryl monostearate) 또는 글리세릴 디스테아레이트(glyceryl distearate)와 같은 시간 지체 재료가 이용될 수 있다.
경구 사용을 위한 제형은 유효성분이, 예를 들어, 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린(kaolin)과 같은 비활성 고체 희석제와 섞인 단단한 젤라틴 캡슐 또는 유효성분이 물 또는, 예를 들어, 땅콩 기름(peanut oil), 유동 파라핀(liquid paraffin) 또는 올리브 기름과 같은 중유와 섞인 연성 젤라틴 캡슐로서 존재할 수 있다.
수성 현탁액(aqueous suspension)은 수성 현탁액의 제조에 적합한 첨가제와 섞여서 활성 물질을 포함한다. 이런 첨가제는 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈(sodium carboxymethylcellulose), 메틸셀룰로오즈(methylcellulose), 하이드로프로필 메틸셀룰로오즈(hydropropyl methylcellulose), 알긴산 나트륨(sodium alginate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 껌트라가칸트(gum tragacanth) 및 아라비아 고무(gum acacia)와 같은 현탁제; 자연발생적 인지질일 수 있는, 예를 들어, 레시틴(lecithin)과 같은 분산제 또는 습윤제(wetting agent), 또는 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트(polyoxyethylene stearate)와 같은 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합체, 또는 예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세타놀(heptadecaethyleneoxycetanol)과 같은 에틸렌 옥사이드와 긴 체인 지방족 알콜의 축합체, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitol monooleate)와 같은 헥시톨(hexitol)에서 파생된 불완전한 에스터의 축합체, 또는 예를 들어 폴리에틸렌 솔비탄 모노올레이트(polyethylene sorbitan monooleate)와 같은 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물(anhydride)의 축합체이다.
또한, 수성 현탁액은 하나 이상의 보존료, 예를 들어, 에틸, 또는 n-프로필 p-히드록시 벤조산염과 같은 벤조산염(benzoate), 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향료, 및 하나 이상의 수크로즈 또는 사카린과 같은 감미제를 포함할 수 있다.
유성 현탁액은 유효성분을, 예를 들어, 땅콩 기름(arachis oil), 올리브 오일, 참기름 또는 코코넛 오일과 같은 식물성 기름, 또는 유동 파라핀과 같은 광물성 기름(mineral oil)에 현탁하여 만들어질 수 있다. 유성 현탁액은 예를 들어, 밀랍(beeswax), 하드 파라핀(hard paraffin) 또는 세틸 알콜(cetyl alcohol)과 같은 점성부여제를 포함할 수 있다. 상기에 명시된 것과 같은 감미제, 및 향료는 구미에 맞는 경구 제제를 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 이런 조성물은 아스코르빈산(ascorbic acid)과 같은 항-산화 첨가제에 의해 보존될 수 있다.
본 발명을 더욱 자세히 설명하기 위하여, 하기의 실시예는 본 발명의 몇몇의 측면 및 실시태양을 보여주기 위해 기재되었다.
재료 및 방법
효소 절단 및 펩타이드의 정제
카제인염-HCL(Bonlac Foods, Melbourne Australia)은 50 ℃, pH 8.0에서 지속적인 스티어링(stirring)으로 최종 농도가 21.5 g/L가 되도록 증류수에(deionised water) 천천히 첨가하여 용해되었다. 카제인염이 녹으면, 카제인의 침전을 피하기 위해 온도는 37 ℃로 낮추고 pH는 1 M HCl를 천천히 첨가하여 6.3으로 맞춰졌다. 가수분해를 개시하기 위해 Rennet(90% Chymosin EC 3.4.23.4, 145 IMCU/ml, Single Strength, Chr. Hanson)가 최종 농도 1.2 IMCU/g의 카제인에 첨가되었고, 상기 용액은 37 ℃에서 1시간 동안 저어졌다. 상기 용액의 pH는 1 M HCl 및 1 M NaOH의 첨가에 의해 6.3 ± 0.2로 유지되었다. 가수분해는 최종 농도 4%가 되도록 트리클로로초산(trichloroacetic acid)의 첨가에 의해 멈춰졌고 침전된 단백질은 원심분리(5,000 g, 15 min, 4 ℃)에 의해 펠릿화되었다. 카제인마크로펩타이드(caseinomacropeptide, CMP)를 포함하는 상등액은 3000 Da cutoff 막(S10Y3, Amicon)을 이용한 정용여과(diafiltration)에 의해 농축되었다. 이 물질은 그 다음에 동결건조(lyophilized)되었다. 이 제제는 AKTA Explorer system (Amersham Pharmacia Biotech, USA)에 연결된 Superose 12 컬럼(Amersham Biosciences, USA)을 이용하여 분별되었고, 50 mM Tris-HCl pH 8.0를 이용하여 0.5 ml/min 유동 속도(0.5 ml/min)에서 용리되었다. 용리는 214 nm 및 280 nm 파장에서 모니터되었다. 분획(fraction)은 매 2분 마다 수집되었다. 모든 시료는 Christ Freeze Dryer(Osterode am Harz, Germany)에서 동결건조되었고 -70 ℃에 보관되었다. 상기 분획은 C18 컬럼을 이용한 역상 HPLC에 의해 추가로 분별되었고 90% 아세토니트릴(acetonitrile)/0.1% v/v TFA로 용리되었다. 상기 용리액은 Agilent 1100S diode array 및 다중 파장 검출기(multiple wavelength detector)(Agilent Tech., Palo Alto, California)를 이용하여 214 nm의 기본 파장으로 모니터되었다. 수집된 모든 분획은 동결건조되었고 -70 ℃에 보관되었다. 각각 분획의 유사성은 질량분석(mass spectrometric analysis)을 통해 확인되었다.
글리코실화되지 않은 κ-카제인(106-169)는 이전에 기재된(Malkoski et al., 2001) 것과 같이 키모신(chymosin) 소화(digestion)에 의해 얻어졌다. κ-카제인(106-137)은 50 mM 아세트산암모늄(ammonium acetate) pH 4.0 버퍼에 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 균주 V8(Roche, Penzberg Germany)에서 유래한 엔도프로테아제(endoprotease)-Glu-C와 함께 37 ℃(E:S; 1:200)에서 24시간 동안 용해된 글리코실화되지 않은 κ-카제인(106-169)의 가수분해에 의해 얻어졌다. 가수분해는 2M NaOH 첨가에 의한 6.0까지의 pH 증가에 의해 종료되었고 펩타이드는 분석용 (C18) RP-HPLC를 이용하여 분리되었다. 수집된 분획은 분석되었으며 펩타이드는 MS/MS 분석을 이용해 동정되었다(identified).
MALDI TOF / TOF MS
펩타이드 시료들은 MTP 384 타겟 그라운드 강철 플레이트(target ground steel plate)에서 포화된 2,5-디하이드록시벤조산(dihydroxybenzoic acid, DHB) 매트릭스(matrix)와 함께 표준 버퍼(50% 아세토나이트릴, 0.1% TFA)에서 결정화되었다(co-crystallized)(1:1 vol/vol). 시료들은 Ultraflex MALDI TOF/TOF Mass Spectrometer (Bruker, Bremen, Germany)에서 분석되었다. 분석은 Bruker Daltonics flexAnalysis 2.4 및 Bruker Daltonics BioTools 3.0 소프트웨어를 이용하여 지역 MASCOT 서버에 설치되어 있는 카제인 데이타베이스와 일치하는 단편 스펙트라(fragmentation spectra)와 함께 수행되었다.
고체상 펩타이드 합성
αS1-카제인(11-23), β-카제인(193-205), β-카제인(193-209), κ-카제인(106-137), κ-카제인(109-137), κ-카제인(117-137), κ-카제인(117-123) 및 κ-카제인(127-137) 펩타이드는 표준 Fmoc-chemistry 프로토콜(protocol)을 이용하여 LibertyTM Microwave 펩타이드 합성기(peptide synthesizer)(CEM Corporation, North Carolina)에서 제조되었다. 펩타이드 합성은 각각의 C-말단 아미노산에 결합한 왕레진(Wang resin)에서 아마이드 말단부터 진행되었다. 펩타이드는 C18 컬럼을 이용하여 역상 HPLC(reversed phase HPLC)로 정제되었다.
Electrospray MS
RP-HPLC에서 수집된 분획들은 전자분사질량분석법(electrospray mass spectrometry) 방식으로 조작한 Esquire-LC MS/MS 시스템(Bruker Daltonics)을 이용하여 분석되었다. 시료 인젝션은 340 ㎕/h로, 질소 유속 5 L/min 및 300 ℃의 건조가스와 함께 수행되었다.
세균 균주 및 성장 상태
글리세롤 또는 냉동-건조된(freeze-dried) 포르피로모나스 긴기발리스균(Porphyromonas gingivalis) W50 및 ATCC 33277 세포의 배양액은 37 ℃의 Horse Blood Agar(HBA; Oxoid)에서 혐기적으로 배양하였다. P. gingivalis 세포들은 계대에 의해 유지되었고 오직 3 내지 7 계대만이 헤민(hemin)(5 mg/L) 및 시스테인(0.5 g/L) 및 ATCC 33277을 위해, 비타민 K3(menadione)(5 mg/L)(BHI)로 보충된 20 mL 및 200 mL의 Brain Heart Infusion broth(37 g/L)에 접종되었다. 성장은 배양액의 650 nm 파장에서 광학밀도(optical density, OD) 측정에 의해 검증되었다. 그람 균주의 배양은 오염(contamination)을 확인하기 위해 실행되었다. P. gingivalis 세포들은 대수증식기(exponential growth phase)에 원심분리(8000 g, 20 min, 4 ℃)에 의해 수확(harvest)되었고 0.5 g/L 시스테인을 포함하는 TC150 버퍼(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 8.0)로 세척(wath)되었다. 세척된 세포들은 TC150 버퍼(0.5 g/L 시스테인 함유) 2 mL에서 재부유되었고, 단백질 가수 분해(proteolytic) 분석에 즉시 사용될 수 있도록 4 ℃에 보관되었다.
P. gingivalis RgpA - Kgp 단백질 가수 분해효소 부착소 복합체( proteinase adhesin complex) 및 RgpB 의 정제
P. gingivalis W50 세포들은 늦은 대수기까지 2 L 배치 배양액에서 자랐고 RgpA-Kgp 단백질 가수 분해효소 부착소 복합체는 Triton X114 추출물에서 이전에 기재된 공정(Pathirana et al., 2006)에 기초하여 아르지닌-세파로오스 친화성 크로마토그래피(Arg-sepharose affinity chromatography)를 이용하여 정제되었다. RgpB는 P. gingivalis 균주 HG66에서 이전에 공개된 공정(Chen et al., 2002; Pike et al., 1994)을 이용하여 정제되었다.
발색 기질(chromogenic substrates )을 이용한 P. gingivalis Arg - 및 Lys -특이적 단백질 가수 분해 활성 측정
세균성 프로테아제 저해 활성은 감소된 인큐베이션 부피가 감소된 96-웰 플레이트를 이용해서 수행하기 위해 변형되고 맞춰진 P. gingivalis의 세포 Arg- 및 Lys-특이적 단백질 가수 분해 활성에 전체에 대한 발전된 분석(O'Brien-Simpson et al., 1998; O'Brien-Simpson et al., 2001)을 이용해 측정되었다. Arg- 및 Lys-특이적 단백질 가수 분해 활성은 합성된 발색 기질; N-a-benzoyl-Arg-p-nitroanilide(L-BApNA) 및 N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Lys 4-nitroanilide acetate salt(GPK-NA)(Sigma Aldrich)을 이용해 측정되었다. 2 mM Arg-BApNA 또는 GPK-NA가 포함된 Lys-특이적 반응 버퍼는 각각 30% v/v 이소프로판올(isopropanol), 0.93 mM L-시스테인, 400 mM Tris-HCl pH 8.0, 및 100 mM NaCl에 용해되었다. 상기 카제인 펩타이드는 요구되는 농도에 따라 TC150 버퍼와 희석되었다. pH 8.0의 10 mM L-시스테인 10 ㎕ 및 P. gingivalis 세포 현탁액 전부, 정제된 RgpA-Kgp 단백질 가수 분해-부착소 복합체(0.01 ㎍/㎕) 또는 정제된 RgpB(0.00116 ㎍/㎕) 각각이 최종 부피 100 ㎕로 첨가되었다. 그 다음에 시료는 Arg- 또는 Lys-특이적 반응 버퍼를 첨가하기 전, 37 ℃에서 15분 동안 인큐베이션되었다(총 부피 200 ㎕). 활성은 PerkinElmer 1420 Multilabel Counter VICTOR3TM(Waltham, MA)를 이용하여 37 ℃, pH 8.0에서 20분까지 10초 간격으로 405 nm에서의 흡광도 측정에 의해 결정되었다. 8 mM ZnCl2 용액 스탁은 증류수(deionised H2O)에서 제조되었고 동결건조된 카제인 펩타이드를 특정한 분석을 위해 요구되는 농도로 용해시키기 위하여 이용되었다. 대조 시료는 실험 시료들과 같으나 프로테아제 저해 물질, 즉 펩타이드 및/또는 아연이 없다.
인큐베이션 후에, 분석 내용들은 분석 동안 카제인 펩타이드 분해가 있었는지 측정하기 위하여 분석용 (C18) 컬럼 및 0 내지 100% 버퍼 B의 선형 그레이디언트(linear gradient)을 이용하여 RP-HPLC에 의해 분석되었다. 분리된 분획은 ESI-MS 및 MS/MS 분석에 의해 분석되었다.
형광- 표지된 ( fluorescently - labelled ) 우혈청(bovine serum albumin)으로 측정한 P. gingivalis 단백질 가수 분해 활성
세균성 프로테아제 저해 활성은 또한 이전에 공개된 공정(Grenier et al., 2002; Yoshioka et al., 2003)을 변형하여 DQTM Green BSA(Molecular Probes, Eugene, OR)를 이용해 측정된다. 대수 성장(exponential growth)(O.D650nm = 0.6)하는 동안 수확된 P. gingivalis ATCC 33277 세포들 전부는 웰당 5.6 x 109 cfu/mL로 분석에 사용되었다. 상기 분석 혼합물은 P. gingivalis 세포들(100 ㎕ culture), TC150 및 저해제(최종 부피 80 ㎕), 및 DQ BSA(20 ㎕; 200 ㎍/mL)를 포함한다. 세포에 처리된 1 mM Nα-p-토실(tosyl)-l-리신 클로로메틸케톤(lysine chloromethylketone)(TLCK)은 대조군으로서 사용되었다. TLCK는 Rgp 및 Kgp 활성 모두를 저해한다고 알려졌다(Fletcher et al., 1994, Pike et al., 1994). 상기 분석 혼합물은 형광광도계(fluorometer)(PerkinElmer 1420 Multilabel Counter VICTOR3TM)를 이용한 형광 측정(Em 535 nm, Ex 485 nm)에 앞서 37 ℃ 암실에서 2 h 동안 인큐베이션 되었다. 음성 대조군(TLCK-처리된 세포들)에서 얻어진 상기 형광 값은 모든 값에서 뺐다. 모든 분석은 달리 언급되지 않는 한 2 내지 3의 3배(triplicate) 반복 실험으로 수행되었다.
분할 저해 농도 지수( Fractional Inhibitory Concentration Index )
분할 저해 농도 지수(FIC 지수)는 둘 또는 그 이상의 저해제 또는 항균제의 상조적인(synergistically), 가산적인(additively), 또는 상반된(antagonistically) 상호작용을 나타내는 스케일(scale)이다(Berenbaum, 1978). FIC 지수는 FIC index = [(A+B)/A] + [(A +B)/B]로 계산되고, 여기서 A는 κ-카제인(109-137)의 효과를 나타내고 B는 염화 아연(Zinc Chloride)의 효과, 및 A+B는 둘의 조합에 의한 효과이다. >1의 FIC 지수는 상반되는 효과를 나타내고, FIC 지수 = 1은 가산적인 효과를, 및 >1의 FIC 지수는 상조적인 효과를 나타낸다.
저해 타입 및 저해 상수( K i )의 결정
초기 반응률(Initial reaction rates)은 0.15, 0.25, 및 1 mM의기질(BApNA) 농도에서 OD405/sec로 얻어진다. 저해제(펩타이드) 농도 범위는 0, 25, 50, 75, 및 100 μM이다. 상기 데이타는 라인위버-버크 도(Lineweaver-Burk plot)(double reciprocal)으로 그래프화되었으며 기울기(slopes)는 1차 선형 회귀(first-order linear regression)로 측정되었다. 상기 라인위버-버크 도는 Km(효소친화력) 및 Vmax(최대 반응속도) 값 및 경쟁적(competitive), 비경쟁적(noncompetitive) 및 비길항적(uncompetitive) 저해제 사이를 구별하는 효소 저해 타입을 측정하는데 사용될 수 있다(Stryer et al., 2002). 저해상수(Ki)는 저해제 농도에 대한 라인위버-버크 도의 기울기를 플로팅하여 측정된다.
분자 모델링( Molecular modelling )
FUGUE(Shi et al., 2001) 프로그램은 1034개의 단백질 족 및 얼라인된 10230개의 구조가 포함된 HOMSTRAD 단백질 데이타 베이스와 비교하여 저해제 펩타이드를 위해 가능한 구조 모티브(structural motifs)를 밝히기 위해 사용된다(Mizuguchi et al., 1998). FUGUE는 구조 프로파일 데이타 베이스를 스캔하고, 서열-구조 호환 가능성 점수를 계산하며 상동 가능성(potential homologues) 및 얼라인먼트 목록을 산출한다. 특이성(Specificity), 민감도(sensitivity) 및 순위(ranking)가 Z-점수에 따라 계산되었다. Z-점수 한계점(thresholds) 6은 99%의 특이성을 나타내며, 5는 95%의 특이성을 나타낸다. 저해제 펩타이드 모델은 SYBYL/Tripos를 이용하여 구성되었다. 저해제 펩타이드의 금속 결합 가능 자리(Potential metal binding site)는 자체 개발한 소프트웨어(in-house software)를 이용한 백본(backbone)에 관한 금속 원자 위치(positions) 및 모델 펩타이드의 C 원자 위치의 소재(locus of)에 의해 확인되었다.
결과
발색 기질을 이용한 P. gingivalis Arg - 및 Lys -특이적 단백질 가수 분해 활성의 측정
200 μM의 펩타이드 농도에서, αS1-카제인(11-23)이 전세포의 Arg- 및 Lys-특이적 단백질 가수 분해 활성의 각각 ~70% 및 ~60% 저해를 보인 반면, κ-카제인(109-137)은 전세포의 Arg- 및 Lys-특이적 단백질 가수 분해 활성의 ~90% 저해로 가장 효과적인 결과를 보였다(도 1, 도 2 및 표 1, 표 2; 명암 키(shading key)를 향한 "도면의 설명" 아래의 상기 설명문 참조). β-카제인(193-209)은 더 짧은 β-카제인 펩타이드(193-205)가 Arg-특이적 단백질 가수 분해 활성을 오직 15%를 억제한 반면, 두 Arg- 및 Lys-특이적 단백질 가수 분해 활성 전세포의 50%를 억제하였다(도 1, 도 2 및 표 1, 표 2; 명암 키(shading key)를 향한 "도면의 설명" 아래의 상기 설명문 참조). 상기 펩타이드들은 다양한 농도에서 분석되었고 단백질 가수 분해 활성 저해 %는 펩타이드 농도에 대한 용량(dose)을 입증하였다(도 1, 도 2; 명암 키(shading key)를 향한 "도면의 설명" 아래의 상기 설명문 참조). 그 뒤에, RgpA 및 Kgp를 포함하는 정제된 외막 프로테아제 복합체는 관찰된 단백질 가수 분해 저해가 전세포에 존재할 것 같은 다른 프로테아제 아티팩트(artefact)가 아님을 보장하기 위해 단백질 가수 분해 분석에 이용되었다. 따라서, 상기 펩타이드는 Arg- 및 Lys-특이적 단백질 가수 분해 활성을 억제하였으며 오직 100 μM 펩타이드로 증가한 저해 효능도 보였다(도 3, 표 1, 표 2; 명암 키(shading key)를 향한 "도면의 설명" 아래의 상기 설명문 참조).
가장 두드러진 Arg- 및 Lys-특이적 단백질 가수 분해 활성 억제를 보인 κ-카제인(109-137)은 추가로 평가되었다. 상기 펩타이드는 펩타이드의 정제된 RgpB에 대한 결합 위치를 결정하기 위해 평가되었다. RgpB 단백질 가수 분해 활성은 펩타이드가 자발적으로 프로테아제에 결합 자발적으로 결합하고 프로테아제 복합체가 아닌 것을 나타낸다(도 4, 표 1).
합성된 펩타이드의 다양한 농도에서 아르기닌-진지페인의 프로테아제 활성(%)
Arg 분석 W50 ATCC 33277 W50 복합체
농도(μM) 전세포 프로테아제
κ-카제인(109-137) 200 7% 8%
100 25% 36% 8%
50 84% 21%
20 43%
αS1-카제인(11-23) 300 38%
200 22% 39%
100 62% 47%
β-카제인(193-209) 300 50%
200 46% 50%
100 69% 21%
합성된 펩타이드의 다양한 농도에서 리신-진지페인의 프로테아제 활성(%)
Lys 분석 W50 ATCC 33277 W50 complex
농도(μM) 전세포 프로테아제
κ-카제인(109-137) 200 2% 3%
100 8% 19% 6%
50 35% 41% 39%
20 62%
αS1-카제인(11-23) 300 34%
200 43% 52%
100 64%
β-카제인(193-209) 300 49%
200 59%
100 71% 12%
저해를 위해 필수적인 잔기를 상세하게 기술하기 위하여, 일련의 펩타이드가 Lys-풍부 지역 없이 합성되었다; κ-카제인(117-123), κ-카제인(127-137) 및 κ-카제인(117-137). 이런 합성된 펩타이드들은 단백질 가수 분해 효소를 억제하기 위해 형광 BSA와 함께 전세포 분석 및 정제된 RgpA-Kgp 복합체와 발색 기질을 이용한 단백질 가수 분해 분석에서 스크리닝되었다(표 3, 표 4, 도 5). 오직 κ-카제인(117-137) 만이 더 긴 κ-카제인(109-137)과 비슷한 저해 효능을 가진 저해 활성을 보였다. 이것은 N-말단 지역에서 단백질 가수 분해 효소 억제에 대한 Lys 잔기의 중요성이 부족함을 입증했다. 정제된 κ-카제인(106-169)은 형광 BSA로 전세포 분석하였을 때, 더 짧은 κ-카제인(109-137)과 비슷한 효과를 드러냈다(도 5).
또한, 형광 기질, DQTM Green BSA는 P. gingivalis 전세포 단백질 가수 분해 활성에 대한 카제인 펩타이드의 저해 활성을 측정하기 위해 사용된다. 펩타이드의 첨가에 앞서, 상기 분석은 웰당 세포 수 및 인큐베이션 시간에 대해 최적화되었다. 웰당 109 개의 세포의 2h 인큐베이션 기간은 분석을 위해 이런 조건하에 선형인 단백질 가수 분해율로써 선별되었다. 글루코실화되지 않은 κ-카제인(106-169) 펩타이드는 카제인에서 유래되었고, 500 μM 펩타이드 농도에서의 분석에서 BSA에 대해 단백질 가수 분해 활성을 60% 저해하였다. 더 짧은 합성 단편 κ-카제인(106-137)은 500 μM 펩타이드 농도의 형광 분석에서 ~37% 저해한 반면, 200 μM 농도의 발색 분석에서 Arg- 및 Lys-프로테아제 활성에 적은 효과를 가졌다(표 4 및 도 5).
발색 기질(BApNA 및 GPK-NA)을 이용하여 측정한 다양한 농도의 합성된 κ-카제인 펩타이드와 P. gingivalis 균주 ATCC 33277의 전세포 유래 Arg- 및 Lys-특이적 단백질 가수 분해 효소의 활성
농도 ( mM ) Arg -특이적 활성(유닛/10 11 세포) (%) Lys -특이적 활성(유닛/10 11 세포) (%)
대조군 0 17.99 ± 1.11 100% 4.41 ± 1.07 100%
κ-카제인(109-137) 50 12.66 ± 2.83 a,b 70% 1.69 ± 0.64 a 41%
100 6.89 ± 2.51 a 38% 0.76 ± 0.30 a 19%
200 1.48 ± 1.18 a 8% 0.10 ± 0.06 a 3%
κ-카제인(117-123) 200 20.04 ± 1.72 e 111% n/d -
500 16.10 ± 0.57 c,d 90% n/d -
1000 16.52 ± 3.26 c,d 92% n/d -
κ-카제인(127-137) 200 18.26 ± 1.78 d,e 102% n/d -
500 17.39 ± 0.33 c,d 97% n/d -
1000 14.83 ± 1.19 a,b,c 82% n/d -
*측정되지 않음
a 대조군 보다 유의미한 차이(p<0.05)
b,c,d,e 다른 값보다 유의미한 차이(p <0.05) 들은 표시되지 않았다.
발색 기질(BApNA 및 GPK-NA)을 이용하여 측정한 다양한 농도의 합성된 κ-카제인 펩타이드와 P. gingivalis W50의 정제된 RgpA-Kgp 단백질 가수 분해 효소 부착소 복합체의 활성
농도( mM ) Arg -특이적 활성(유닛/ mg ) (%) Lys -특이적 활성(유닛/ mg ) (%)
대조군 0 4.13 ± 1.11 d 100% 4.67 ± 1.01 100%
κ-카제인(109-137) 20 1.80 ± 0.06 a,c 43% 2.90 ± 0.55 a 62%
50 0.87 ± 0.38 a,b 21% 1.80 ± 0.91 a 39%
100 0.33 ± 0.28 a,b 8% 0.28 ± 0.18 a,b 6%
κ-카제인(117-137) 50 1.95 ± 0.38 a,c 46% 1.34 ± 0.25 a,c 29%
100 0.41 ± 0.11 a,b 10% 0.98 ± 0.053 a,c 21%
200 0.33 ± 0.02 a,b 8% 0.41 ± 0.014 a,b 9%
κ-카제인(117-123) 200 3.68 ± 1.69 d 89% 4.62 ± 0.51 99%
κ-카제인(127-137) 200 4.49 ± 2.05 d 109% 3.86 ± 0.09 a,d 83%
κ-카제인(106-137) 200 3.51 ± 1.77 d 85% 4.15 ± 0.64 a,d 89%
*측정되지 않음
a 대조군 보다 유의미한 차이(p<0.05)
b,c,d 다른 값보다 유의미한 차이(p <0.05) 들은 표시되지 않았다.
보조-저해제( Co - inhibitor )로서의 염화아연 ( Zinc Chloride )
ZnCl2는 벤즈아미딘(benzamidine) 및 클로르헥시딘(chlorhexidine)과 같은 여러 프로테아제 저해제의 저해 효능을 증가시키는 것으로 보여온 잠재적인 보조-저해제이다. 아연의 보조-저해제로서의 효능을 조사하기 위하여, 전세포 Arg- 및 Lys-특이적 프로테아제 분석이 1:4의 비율의 펩타이드[κ-casein(109-137)/ β-casein(193-209)/ αS1-casein(11-23)] 및 염화아연과 함께 수행되었다.
400 μM의 ZnCl2에서 30 % 저해하는 것을 보인 반면, 100 μM에서, κ-카제인(109-137)은 전세포 Arg-특이적 단백질 가수 분해 활성을 60%로 저해하였다. 그러나, κ-카제인(109-137) 및 ZnCl2이 1:4의 비율로 결합되었을 때, 저해는 90%까지 증가하였다(도 6). 또한 상기 펩타이드 아연 혼합물은 정제된 프로테아제 복합체와 분석되었을 때, Arg-특이적 단백질 가수 분해 활성의 증가된 저해를 보였다(도 8; 명암 키(shading key)를 향한 "도면의 설명" 아래의 상기 설명문 참조). κ-카제인(109-137)과 Lys-특이적 프로테아제 분석에서 유사한 결과가 관찰되었다: ZnCl2의 첨가는 각각 분석하였을 때 저해 효능을 펩타이드 효능에 비교하여 90%까지 증가시켰다(도 7). FIC 지표에 기초하여, Zn2 +의 효과가 상조적이다(표 5).
κ-카제인(109-137) 펩타이드와 Zn(II)의 유무에 의한 진지페인의 억제 상조를 평가하기 위한 분할 저해 상수 지수들(fractional inhibitory constant indices).
효소 ATCC33277 a 와의 활성
저해제 없음 k- 카제인 (109-137)(100 μM) Zinc ( II )(400 μM) k- 카제인 + Zinc(II)(100:400 μM) FIC 지수 b
Arg - 진지페인 18.1 + 5.69 6.92 ± 2.51 12.1 ± 3.32 1.95 ± 1.29 0.44
Lys - 진지페인 4.4 ± 1.07 0.76 ± 0.30 2.2 ± 1.31 0.31 ± 0.18 0.54
a 활성 ± 표준편차
b 분할 저해 농도 지수
ZnCl2 400 μM가 50 % 저해한 반면, β-카제인(193-209) 100 μM가 Arg-특이적 단백질 가수 분해 활성을 30%로 저해하였다. 1:4의 비율로 결합되었을 때, 상기 단백질 가수 분해 저해는 70%까지 증가하였다(도 9; 명암 키(shading key)를 향한 "도면의 설명" 아래의 상기 설명문 참조). Lys-특이적 프로테아제 분석에서, β-카제인(193-209): ZnCl2 혼합물의 저해 효능은 각각 분석했을 때의 저해제들의 효능에 비해 90%까지 증가하였다(도 10; 명암 키(shading key)를 향한 "도면의 설명" 아래의 상기 설명문 참조). β-카제인(193-209) 및 ZnCl2의 FIC 값은 저해가 상조적임을 나타낸다(표 6).
β-카제인(193-209) 펩타이드와 Zn(II) 유무에 따른 진지페인 저해의 상조를 평가하기 위한 분할 저해 상수 지수 지수들.
효소 ATCC33277 a 와의 활성
저해제 없음 β- 카제인 (193-209)(100 μM) 아연( II )(400 μM) β- 카제인 + 아연( II )(100:400 μM) FIC 지수 b
Arg - 진지페인 29.23 + 0.06 20.03 ± 2.51 14.83 ± 4.60 7.23 ± 2.63 0.849
Lys - 진지페인 4.28 ± 0.88 3.03 ± 1.20 1.65 ± 0.22 0.52 ± 0.1 0.487
a 활성 ± 표준편차
b 분할 저해 농도 지수
ZnCl2 400 μM가 50 %의 Arg-특이적 단백질 가수 분해 활성을 저해한 반면, αS1-카제인(11-23) 100 μM가 Arg-특이적 단백질 가수 분해 활성을 40%로 억제했다. 단백질 가수 분해 저해는 저해제들이 1:4의 비율로 결합되었을 때, 70%로 증가하였다(도 9; 명암 키(shading key)를 향한 "도면의 설명" 아래의 상기 설명문 참조). Lys-특이적 프로테아제 분석에서, 상기 저해제 혼합물은 저해 효능을 85%까지 증가시켰다(도 10; 명암 키(shading key)를 향한 "도면의 설명" 아래의 상기 설명문 참조). 그에 반해서, αS1-카제인(11-23) 및 ZnCl2에 대해 계산된 FIC 값은 두 저해제의 혼합물이 상조적(synergistic)이지 않으나 가산적(additive)임을 나타낸다(표 7).
αS1-카제인(11-23) 펩타이드와 Zn(II)의 유무에 따른 진지페인 저해의 상조를 평가하기 위한 분할 저해 상수 지수.
효소 ATCC33277 a 와의 활성
저해제 없음 α S1 - 카제인 (11-23)(100 μM) 아연( II )(400 μM) α S1 - 카제인 + 아연( II )(100:400 μM) FIC 지수 b
Arg - 진지페인 29.23 + 0.06 18.00 ± 3.53 14.83 ± 4.60 8.89 ± 0.29 1.095
Lys - 진지페인 4.28 ± 0.88 2.73 ± 0.60 1.65 ± 0.22 1.18 ± 0.1 1.147
a 활성 ± 표준편차
b 분할 저해 농도 지수
저해 상수( K i ) 및 저해의 메카니즘 확인
효소반응속도론(enzyme kinetics) 분석이 κ-카제인(109-137) 펩타이드의 저해 상수 및 메카니즘을 확인하기 위하여 정제된 RgpB와 함께 수행되었다. 상기 생성된 라인위버-버크 도는 κ-카제인(109-137)에 의한 비길항적 저해를 나타낸다(도 11; 명암 키(shading key)를 향한 "도면의 설명" 아래의 상기 설명문 참조). 비길항적 저해의 경우에, 상기 Ki 값은 억제 50%를 위해 요구되는 저해제 농도의 값(IC50)과 같다. 상기 Ki 값은 ES 복합체로의 저해제의 결합에 대한 해리상수(dissociation constant)를 의미하며, 이 경우에 그 값은 40.2 μM이다(도 12).
카제인 - 유래된 펩타이드의 BLAST 검색 및 서열 얼라인먼트
상기 αS1-카제인(11-23) 서열은 ATP- 및 기질-결합 ClpX 및 ClpA 프로테아제 아단위(subunit)(샤페론-유사 프로테아제)와의 서열 유사성을 보여준다(도 15). ATP- 및 기질-결합 ClpX 및 ClpA는 각각 ClpXP, ClpAP라고 불리는 미생물(microorganism)에서 스트레스 반응에 중요한, ATP-의존적 세린 프로테아제 복합체의 아단위이다. 황색포도상구균에서(Staphylococcus aureus), ClpXP는 삼투압 스트레스(osmotic stress), 산화 스트레스(oxidative stress) 및 저온(cold)에서의 생존을 위해 중요한 역할을 한다. P. gingivalis에서, ClpXP의 결핍은 산화 스트레스 관용(tolerance)에 효과가 없었으나, 숙주 상피세포의 침투(invasion), 내열성(thermo-tolerance) 및 생물막(biofilm) 형성에 중요하다고 여겨진다. ClpAP 및 ClpXP은 동일한 활성을 가지지 않으나 유사하다. 또한, 상기 카제인 서열은 P. gingivalis에서 생물막 형성에서 중요한 역할을 하는 ATP-의존적 아연 금속단백질분해효소(metalloprotease) FtsH 1과 유사성을 보였다. 상기 카제인 서열은 알려진 프로테아제 저해제와 어떤 유사성도 보이지 않았다.
β-카제인(193-209)은 소수의 프로테아제 저해제와 서열 유사성을 보인다(도 14). 상기 세린 프로테아제 저해제 카잘-타입 5 또는 LEKTI(림프-상피성 카잘-타입-관련된 저해제)(Lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor)는 몇몇의 대조적인 저해제 유닛을 포함하는 세린 프로테아제 저해제이다. 상기 저해제는 점막상피(mucous epithelia)의 항-염증 및/또는 항균성의(antimicrobial) 보호를 위해 중요하게 생각되며 트립신(trypsin) 1, 카텝신(cathepsin) G, 플라스민(plasmin), 서브틸리신(subtilisin)-A 및 엘라스타제(elastase)-2를 억제하는 것으로 보여져왔다. 엘라핀(Elafin) 또는 또 하나의 명칭 SKALP(Skin-derived antileukoprotease)는 엘라스타제, 아르기닐 펩티다아제(arginyl peptidase), 단백질 가수 분해 효소 3, 및 미엘로블라스틴(myeloblastin)도 저해하나 트립신, α-키모트립신(chymotrypsin), 카텝신 G 및 플라스민은 저해하지 않는 세린 프로테아제 저해제이다. 그것은 세린 프로테아제 저해제로 주로 작용하나 또한 항-염증 기능과 관련되어 있다. 또한, 그것은 비록 그것의 프로테아제 저해 기능에 비의존적이기는 하나, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza ), 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae), 아스페르질루스푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항균성 및 항진균성 특성을 보인다.
BLAST 조사는 κ-카제인(109-137)의 소수의 프로테아제 저해제에 대한 서열 유사성을 드러냈다(도 13). 그들 중에, 혈장 프로테아제(plasma protease) C1 저해제(Q5UGI5 및 P05155) 또는 세르핀(Serpin) G1은 혈관투과성(vascular permeability) 및 염증의 억제의 조절에서 잠재적으로 결정적이라고 믿어진다; 저해 인자 XIIa 및 혈장칼리크레인(plasma kallikrein)(혈장 칼리크레인-키닌 시스템의 프로테아제), C1r 또는 C1s 프로테아제(보체계(complement system)), 혈장 및 조직 플라스미노겐 활성화인자(plasminogen activator)(섬유소용해계(fibrinolytic system)) 및 인자 XI 및 트롬빈(thrombin)(혈액응고계(coagulation system)).
200 μM 농도에서, κ-카제인(109-137)은 전세포 분석에서 Arg-특이적 단백질 가수 분해 활성에 대해 ~93%의 저해 및 Lys-특이적 단백질 가수 분해 활성에 대해 98%의 저해를 보였다. 또한 상기 펩타이드는 정제된 RgpB 프로테아제를 200 μM 농도에서 80% 이상 저해하였다(표 1 및 표 2). 이러한 결과는 아르기닐(arginyl) 잔기에서와 달리 3 리실(lysyl) 잔기를 가진 펩타이드에서 특히 두드러졌으며, 따라서, RgpB 프로테아제에 의해 잘리지 않을 것이다.
β-카제인(193-209)이 ~40 내지 50%의 Arg- 및 Lys-특이적 단백질 가수 분해 활성 저해를 보인 반면, αs1-카제인(11-23)은 전세포 프로테아제 활성을 ~60%로 저해하였다. 상기 결과는 또한 정제된 프로테아제 복합체에 대해 향상된 프로테아제 저해기능을 보인다. 그러나, β-카제인(193-205)은 조금 더 긴 펩타이드와 비교하여 진지페인들에 대해 강력하지 않았다. 이것은 펩타이드의 여분의 잔기(extra residues) 또는 길이가 펩타이드의 저해 기능에서 중요한 역할을 하는 것을 나타내는 것처럼 보인다.
ZnCl2는 벤즈아미딘(benzamidine) 및 클로르헥시딘(chlorhexidine)과 같은 몇몇의 프로테아제 저해제의 저해 효능을 증가시키는 것을 보여준 강력한 보조-저해제이다. 아연 비율에 따라 다른 펩타이드의 효과는 두 저해제들 사이에 상조적인 효과가 있는지 측정하기 위하여 조사되었다. FIC 지수는 상조를 계산하기 위해 사용되었다. 저해제의 결합이 가산적일 때, 상기 FIC 지수는 1과 같을 것이다. 상기 저해제들이 길항적일 때, 더 많은 저해제들이 같은 효과를 내기 위하여 요구되며, 상기의 합은 1보다 많을 것이고, 상조적인 효과 때문에, 두 저해제의 결합시 각각 따로인 것보다 더욱 효과적이고 1보다 적은 합을 가질 것이다. 전세포 Arg- 및 Lys-특이적 프로테아제 분석 결과에서 계산된 FIC 지수에 기초하여, α-카제인(11-23) ZnCl2 혼합물은 가산적(additive)인 반면 상기 κ-카제인(109-137) ZnCl2 및 β-카제인(193-209) ZnCl2 혼합물은 상조적(synergistic)이다(표 5, 6 및 7).
진지페인 활성 반응속도론의 라인위버-버크 분석은 경쟁적(competitive), 비경쟁적(noncompetitive) 및 비길항적(uncompetitive) 저해제 사이를 구별하여 효소 저해 타입 결정을 가능하게 한다. 경쟁적 저해제는 저해하지 않은 효소와 같은 y-절편(intercept)을 갖으나(Vmax 가 같다), 각각의 저해제 농도에 따라 다른 기울기 및 x-절편을 갖는다(다른 Km). 비경쟁적 저해는 저해하지 않은 효소와 같은 x-절편의 도를 산출하나(K m 같음), 다른 기울기 및 y-절편을 갖는다(감소된 Vmax). 비길항적 저해제는 y- 및 x-축 모두에서 다른 절편을 야기하나 같은 기울기를 산출한다. 효소반응속도론 분석 및 라인위버-버크의 도에 기초하여, 상기 κ-카제인(109-137) 펩타이드는 비길항적 저해제이다. 작용의 이론 또는 메카니즘에 얽매이지 않고, 비길항적 저해제는 상기 펩타이드가 오직 산물 형성을 방지하는 효소-기질 복합체에만 결합한다는 것을 의미할 수 있다. Km 및 Vmax 값 모두가 감소한다. 기질의 결합은 효소에서 배좌(conformational)의 변화를 유도한다고 믿어진다. 새로운 배좌는 저해제의 결합을 가능하게 한다(도 16). 효소 및 효소-기질 복합체 모두에 결합할 수 있는 비-경쟁적 저해제와, Vmax를 감소시키나(저해제가 촉매작용을 방해한다) Km 값이 변하지 않는(효소에의 기질 친화력에 영향을 미치지 않는다)것이 다르다.
펩타이드의 상수 저해는 40.2 μM이며, 비길항적 저해제의 경우, Ki 값은 IC50 값과 같다. RgpB의 다른 저해제들의 Ki 값과의 비교는 이 펩타이드 저해제가 비슷한 Ki 값을 가지며, RgpB에 대해 3 μM의 IC50를 갖는 비길항적 저해제인 클로르헥시딘(2.62 x10-4 M) 및 독시사이클린과 유사한 RgpB Ki 값을 공유하는 RgpB의 보통의 저해제임을 보여준다.
BLAST 조사는 ATP- 및 기질-결합 ClpX 및 ClpA 프로테아제 아단위(샤페론-유사 프로테아제) 및 P. gingivalis에서 생물막 형성에서 중요한 역할을 하는 ATP-의존적 아연 금속단백질분해효소(metalloprotease) FtsH 1에 대한 αS1-카제인(11-23)의 서열 유사성을 보여준다. β-카제인(193-209) 서열은 세린 프로테아제 저해제 카잘-타입 5 또는 LEKTI(림프-상피성 카잘-타입-관련된 저해제)(Lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor), 및 엘라핀(elafin)과 같은 소수의 프로테아제 저해제에 대한 서열 유사성을 입증한다. 이런 세린 프로테아제 저해제들은 또한 그것의 프로테아제 저해 기능 비의존적으로 항균성 기능을 보인다. κ-카제인(109-137)은 소수의 프로테아제 저해제에 대해 부분적인 서열 유사성을 보인다. 그들 중에 하나는 혈장 프로테아제 C1 저해제(Q5UGI5 및 P05155) 또는 세르핀 G1이다.
Fugue 프로그램은 HOMSTRAD 단백질 데이타 베이스와 비교하여 펩타이드의 가능한 구조 모티브를 확인하기 위하여 사용되었다. κ-카제인(109-137)에 대하여 α-나선 구조에 대해 90%의 신뢰도를 나타내는 Z-점수(score) 3.87가 얻어졌다. κ-카제인(109-137)에 대해 상기 가능한 구조 모티브는 α-나선 스패닝(spanning) 잔기들 109-126, 턴, 및 다른 α-나선 스패닝 잔기들 129-137을 포함한다. 이런 모티브에 근거하여, κ-카제인(109-137) 펩타이드의 모델이 SYBYL 소프트웨어를 이용하여 구성되었다. RgpB을 저해하는 κ-카제인(109-137)의 모델은 RgpB(PDB 1cvr)의 결정구조(crystal structure) 및 강력한 금속 결합 자리와 κ-카제인(109-137)의 제안된 구조에 기초하여 발달되었다. 도 17(a)는 펩타이드 저해제 κ-카제인(109-137), Zn(II) 및 합성된 기질(BApNA)과 상호작용하는 것과 관련된 RgpB 활성 자리의 잔기를 강조한 제안된 모델을 보여준다. 이 모델은 Zn(II)과 RgpB의 His211 및 Glu152 잔기 및 κ-카제인(109-137)의 Asp115 및 Glu118 잔기 사이의 정전기적 상호작용(electrostatic interactions)을 강조한다. κ-카제인(109-137)의 Ile122 잔기는 기질 BApNA와 소수성 상호작용을 형성한다. 또한, RgpB의 Trp284 and Cys244 잔기는 BApNA 기질의 Arg 잔기 및 아마이드 결합과 각각 상호작용한다. 도 17(b)는 Zn(II) 존재 하의 효소-기질 복합체(RgpB-BApNA)에 결합하는 κ-카제인(109-137)의 제안된 분자 모델을 보여준다. 이 모델은 합성된 저해제의 실험적 증거와 일치한다.
조성물 및 제형
치료 또는 예방을 겨냥한 본 발명의 구현된 측면의 조성물을 설명하기 위하여, 하기의 샘플 제형들이 제공되었다.
하기는 치약 제형의 예이다.
성분 % w/w
제2인산칼슘(Dicalcium phosphate dihydrate) 50.0
글리세롤 20.0
카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨 1.0
라우로일유산소다(Sodium lauryl sulphate) 1.5
소듐라우로일사코시네이트(Sodium lauroyl sarcosinate) 0.5
향료 1.0
사카린 나트륨(Sodium saccharin) 0.1
글루콘산클로르헥시딘(Chlorhexidine gluconate) 0.01
덱스트라나아제(Dextranase) 0.01
본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱 0.2
증류수 balance
하기는 추가적인 치약 제형의 예이다.
성분 % w/w
제2인산칼슘(Dicalcium phosphate dihydrate) 50.0
솔비톨 10.0
글리세롤 10.0
나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스 1.0
라우로일 디에탄올아마이드(Lauroyl diethanolamide) 1.0
수크로스 모노라우레이트(Sucrose monolaurate) 2.0
향료 1.0
사카린 나트륨(Sodium saccharin) 0.1
일불소인산나트륨(Sodium monofluorophosphate) 0.3
글루콘산클로르헥시딘(Chlorhexidine gluconate) 0.01
덱스트라나아제(Dextranase) 0.01
본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱 0.1
증류수 balance
하기는 치약 제형의 추가적인 예이다.
성분 % w/w
솔비톨 22.0
영국 이끼(Irish moss) 1.0
수산화 나트륨(Sodium Hydroxide)(50%) 1.0
Gantrez 19.0
증류수(deionised) 2.69
일불소인산나트륨(Sodium monofluorophosphate) 0.76
사카린 나트륨(Sodium saccharin) 0.3
파이로인산(Pyrophosphate) 2.0
알루미나 수화물(Hydrated alumina) 48.0
향유 0.95
본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱 0.3
라우로일유산소다(Sodium lauryl sulphate) 2.004
하기는 액상 치약 제형의 예이다.
성분 % w/w
폴리아크릴산나트륨(Sodium polyacrylate) 50.0
솔비톨 10.0
글리세롤 20.0
향료 1.0
사카린 나트륨(Sodium saccharin) 0.1
일불소인산나트륨(Sodium monofluorophosphate) 0.3
글루콘산클로르헥시딘(Chlorhexidine gluconate) 0.01
에탄올 3.0
본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱 0.2
리놀레산(Linolic acid) 0.05
증류수 balance
하기는 구강청결제 제형의 예이다.
성분 % w/w
에탄올 20.0
향료 1.0
사카린 나트륨(Sodium saccharin) 0.1
일불소인산나트륨(Sodium monofluorophosphate) 0.3
글루콘산클로르헥시딘(Chlorhexidine gluconate) 0.01
라우로일 디에탄올아마이드(Lauroyl diethanolamide) 0.3
본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱 0.2
증류수 balance
하기는 구강청결제 제형의 추가적인 제형이다.
성분 % w/w
Gantrez？ S-97 2.5
글리세린 10.0
향유 0.4
일불소인산나트륨(Sodium monofluorophosphate) 0.05
글루콘산클로르헥시딘(Chlorhexidine gluconate) 0.01
라우로일 디에탄올아마이드(Lauroyl diethanolamide) 0.2
본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱 0.3
증류수 balance
하기는 목캔디 제형의 예이다.
성분 % w/w
설탕 75-80
옥수수 시럽 1-20
향유 1-2
NaF 0.01-0.05
본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱 0.3
Mg 스테아레이트(stearate) 1-5
증류수 balance
하기는 잇몸 마사지 크림 제형의 예이다.
성분 % w/w
백색 바셀린(White petrolatum) 8.0
프로필렌 글라이콜(propylene glycol) 4.0
스테아릴 알콜(Stearyl alcohol) 8.0
폴리에틸렌 글라이콜(Polyethylene Glycol) 4000 25.0
폴리에틸렌 글라이콜(Polyethylene Glycol) 400 37.0
수크로스 모노스테아레이트 0.5
글루콘산클로르헥시딘(Chlorhexidine gluconate) 0.1
본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱 0.3
증류수 balance
하기는 치주 겔 제형의 예이다.
성분 % w/w
플루오닉(Pluronic) F127(from BASF) 20.0
스테아릴 알콜 8.0
본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱 3.0
콜로이드 이산화규소(Colloidal silicon dioxide)(Aerosil？ 200™과 같은) 1.0
글루콘산클로르헥시딘(Chlorhexidine gluconate) 0.1
증류수 balance
하기는 츄잉껌 제형의 예이다.
성분 % w/w
껌 베이스 30.0
탄산칼슘 2.0
솔비톨 결정(Crystalline) 53.0
글리세린 0.5
향유 0.1
본 발명의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱 0.3
증류수 balance
본 발명이 여기에 자세히 설명되는 동안, 상기 실시예는 오직 목적을 나타내기 위한 것임을 이해해야 할 것이다. 본 발명의 실시태양의 분자 생물학, 치과 치료, 및 관련된 과목의 당업계의 숙련된 당업자에게 명백한 다른 변형은 본 발명의 범위 내에 목적이 있다.

Claims (16)

  1. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5 및 그 안의 보존적 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 세균성 효소의 활성을 저해, 감소 또는 예방하기 위한 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 5인 것을 특징으로 하는 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱.
  4. 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나와 적어도 60% 동일한 아미노산 서열로 구성되는 세균성 효소의 활성을 저해, 감소 또는 예방하기 위한 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균성 효소는 진지페인(gingipain)인 것을 특징으로 하는 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 진지페인은 포르피로모나스 긴기발리스균(Porphyromonas gingivalis)에서 유래한 것을 특징으로 하는 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱.
  7. 카제인 또는 그것의 단편의 아미노산 서열을 포함하는 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 세균성 효소를 저해하기 위한 약학적 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5 및 그 안의 보존적 치환의 하나 또는 그 이상으로 필수적으로 이루어진 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 이가 양이온(divalent cation)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 이가 양이온은 아연인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 치주질환의 치료에 이용하기 위한 약학적 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 이가 양이온을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 이가 양이온은 아연인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱의 치주질환 치료를 위한 약제의 제조용 용도.
  15. 치료가 필요한 개체에 유효량의 제 1항 내지 제 6항의 화합물, 펩타이드, 펩티도미메틱을 투여하는 것을 포함하는 치주질환의 예방 또는 치료 방법.
  16. 서열번호 1 내지 32 및 그 안의 보존적 치환 중 어느 하나로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 화합물, 펩타이드 또는 펩티도미메틱을 포함하는 조성물을 효소에 접촉하는 것을 포함하는 세균성 효소 저해 방법.
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