KR20120026897A - 전하결합 및 생분해성 공유결합으로 동시에 연결된 고분자?ｓｉＲＮＡ 나노입자 전달체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고분자에 siRNA가 결합된 고분자-siRNA 전달체 및 그의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 고분자와 siRNA가 전하결합 및 생분해성 공유결합으로 결합된 생체 내에서 안정한 고분자-siRNA 전달체 및 그의 용도에 관한 것이다.
고분자와 siRNA가 전하결합 및 생분해성 공유결합으로 동시에 결합된 본 발명의 고분자-siRNA 전달체는, 생체 내에서 표적 부위로의 siRNA 전달 효율이 높다. 따라서, 상기 고분자-siRNA 결합체에 의하면, 비교적 낮은 농도의 투여로도 치료용 siRNA가 생체 내의 암조직 등의 표적 부위로 효율적으로 전달될 수 있으므로, 각종 질병의 치료를 위하여 광범위하게 사용될 수 있다.

Description

전하결합 및 생분해성 공유결합으로 동시에 연결된 고분자?ｓｉＲＮＡ 나노입자 전달체{NEW POLYMERIC NANO-PARTICLES FOR siRNA DELIVERY USING CHARGE INTERACTION AND COVALENT BONDING}
본 발명은 고분자에 siRNA가 결합된 고분자-siRNA 전달체 및 그의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 고분자와 siRNA가 전하결합 및 생분해성 공유결합으로 동시에 결합되어 안정한 고분자-siRNA 나노 입자 및 그의 용도에 관한 것이다.
최근, 유전자치료의 핵심기술은 강한 음전하를 띠고 있는 올리고 뉴클레오타이드를 어떻게 원하는 조직 내로 전달하느냐에 달려있다. 일반적으로, 살아있는 세포는 단백질, 또는 올리고 뉴클레오타이드 같은 거대 분자에 대한 투과성이 매우 낮다. 일부 저분자량의 물질들만이 매우 낮은 비율로 살아있는 세포의 세포막을 통과하여 세포 내부의 세포질 또는 핵으로 들어갈 수 있기 때문에 단백질 또는 올리고 뉴클레오타이드을 포함하는 거대분자를 전달할 때 제한 요인이 되고 있다. 이러한 요인을 극복하기 위한 다양한 유전자 전달체에 대한 연구 및 그 전달 방법에 대한 연구가 진행되어져 왔다. 각종 바이러스를 이용한 전달법이 그 중 하나이다. 바이러스를 이용한 전달법은 전달 효율면에 있어서는 우수하나, 바이러스 유전자에 의한 숙주의 유전자 발현 기능에 미치는 영향 및 발암 가능성으로 인하여 임상에 적용하는데에는 문제점이 있다. 따라서, 바이러스의 높은 트랙스펙션 효율을 유지하면서, 체내에서 안정적인 유전자 전달을 가능하게 하는 전달체의 개발이 요구된다.
세포에서 특정 유전자의 발현을 저해시키는데 탁월한 효과를 나타내는 것으로 'RNA 간섭(RNA interference)'(RNAi)이 유전자 치료 분야에서 각광을 받고 있다. siRNA의 높은 활성과 정밀한 유전자 선택성으로 인해 지난 20년간 연구되어 현재 치료제로 활용 중인 안티센스 올리고뉴클레오티드(ODN)를 대체할 치료제로 기대되고 있다. 이에, 현재 30개 이상의 제약회사와 생명공학 회사에서 siRNA에 기반을 둔 치료제 개발에 집중하고 있다. 특히 당뇨병, 비만, 류마티스, 파킨슨병, B, C형 간염, 에이즈 및 암과 같은 질병을 치료하기 위한 siRNA 관련 치료제를 개발하고 있거나 진행 중에 있다.
siRNA는 19개에서 23개 정도의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 이중 나선의 RNA 가닥으로, 이들과 염기서열이 상보적인 타켓 유전자의 mRNA를 표적으로 삼아 유전자 발현을 억제시킨다. 즉, 특정 유전자의 발현 대사 과정을 조절하는 mRNA를 특이적으로 분해하여, 표적 유전자의 단백질 합성을 중단시켜 질병을 치료한다. 이에, 강한 음전하를 띠는 siRNA를 생체 내로 전달하기 위해 양이온성 리포솜이나 마이셀 및 양이온성 고분자를 사용한 전달체들이 연구되고 있다. siRNA는 안정성이 낮아 생체 내에서 혈장에 대량으로 존재하는 다양한 분해 효소에 의해 단시간에 분해되며, 특히 주사에 의한 치료제의 경우, 화학적으로 안정하게 처리되지 않을 경우 더 빨리 파괴되며, siRNA가 가지는 음이온성으로 인해 같은 음전하를 띄는 세포막을 쉽게 투과하기가 어려워 결과적으로 세포내로의 전달성이 떨어지게 되어 그 치료 효율이 급격히 떨어지게 된다는 문제점이 있다. 비록 siRNA는 이중가닥으로 구성되어 있지만, RNA를 구성하는 리보스당의 결합은 DNA를 구성하는 디옥시리보스당의 결합에 비해 화학적으로 매우 불안정하여 대부분이 생체 내에서 반감기가 30분 내외로 빠르게 분해되어 버리는 것이다. 또한, 생체 내에서 siRNA를 외부 물질로 인식하여 면역체계에 부작용을 일을 킬 수 있다. 더욱이, siRNA가 원래 계획한 유전자 부위가 아닌 다른 부위의 유전자에 영향을 주어 유전자 염기서열에 cross-hybridization을 일으킬 수 있다는 문제점이 있다.
따라서, 생체 내에서 쉽게 분해되는 낮은 안정성으로 인하여 치료 효율이 급격히 떨어지는 이러한 siRNA의 단점을 극복할 수 있으면서 체내 투과가 가능하도록 음전하를 중성화 할 수 있는 전달체의 개발이 중요하다. 치료제로서의 siRNA 전달체는 체내 순환과 특정 질환 부위에 특이적인 축적성을 갖는 것이 바람직하며 체내에서 적절히 생분해 될 수 있어야 한다. 생체 유래 고분자중 하나인 글라이콜 키토산은 생체 적합성 및 생분해성과 우수한 암 특이 축적성으로 인하여 항암제 전달체로서의 우수함이 이미 알려진 바 있다. 본 연구실에서는 글라이콜 키토산에 뉴클레오타이드와 강력하게 결합하는 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine, PEI)를 첨가하여 양전하가 보충된 siRNA 전달체 (글라이콜 키토산-PEI)를 개발한 바 있다 (특허 출원: 2009-0041428). 그러나, 강한 음전하를 띠는 siRNA와 효과적인 복합체를 형성하는데 있어서 고분자가 갖는 전하만으로는 결합력이 부족하다.
한편, 저분자량 siRNA의 약한 생체내 안정성을 보완하기 위하여 고분자 전달체와의 효과적인 결합이 가능하도록 siRNA의 분자량 자체를 증가시키는 노력이 보고되고 있다. Jean-Paul Behr 그룹은 siRNA의 3’말단에 DNA 서열을 추가하여 제작한 sticky siRNA를 이용하여, siRNA의 생체 내 전달 효율이 증가함을 보고하였고 (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007. 104 (41): 16050-16055), 본 연구실은 siRNA의 5’말단에 티올 (thiol)기를 도입하여 siRNA 간의 이황화결합에 의해 크기를 증가시킨 poly-siRNA를 제작하여, 생체 내 안정성과 유전자 발현 효과가 증가됨을 특허와 논문으로 발표한 바 있다 (특허출원: 10-2009-0042273, Journal of Controlled release, 2010. 141 (3): 339-346). 그 외 안정성을 확보하기 위하여 크기를 증가시킨 폴리 siRNA를 제작하는 방법으로는 크로스링커로 이황화결합을 도입하여 다중 결합의 siRNA를 제작하는 경우 표적 유전자의 발현이 억제된다는 보고가 있다 (Nature materials, 2010. 9: 272-278).
이에, 본 발명자는 효과적인 유전자 치료제로 사용할 수 있는 siRNA의 생체 내 안정성과 표적 부위로의 전달 효율을 높이기 위하여 생체 적합성이 우수한 고분자와 siRNA를 전하결합뿐 아니라 생분해성 공유 결합으로도 연결시킨, 고분자-siRNA 전달체를 제조하였다. 상세하게는, siRNA 또는 폴리-siRNA나 다중 결합의 siRNA를 적절한 양전하를 가지면서 반응기를 포함하는 고분자와 전하결합뿐 아니라 siRNA 말단에 형성된 반응기와 공유 결합시켜 질병 세포의 특정 단백질 발현을 차단하여 다양한 질병 치료에 적용할 수 있는 신규 나노전달체인 고분자-siRNA 전달체를 개발하였다.
본 발명은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, siRNA의 생체 내 안정성을 높이고 siRNA의 전달 효율을 높일 수 있는 신규한 siRNA 전달체 또는 상기 siRNA 전달체를 포함하는 약물 조성물을 제공하는데 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 전하결합과 생분해성 공유결합으로 동시에 고분자와 siRNA를 결합시킨 siRNA 전달체를 제공한다.
또한, 본 발명은 고분자-siRNA 전달체를 함유하는 것을 특징으로 하는 약물 조성물을 제공한다.
본 발명에 의한 siRNA 전달체는 전하결합과 생분해성 공유결합으로 동시에 고분자와 siRNA가 결합되어 있으므로, siRNA가 표적 질병의 세포 또는 조직에 안정적으로 전달될 수 있다. 따라서, 표적 부위에 선택적으로 siRNA가 축적되어 특정 질병 단백질의 발현을 차단할 수 있으므로 유용하다.
본 발명에 의한 siRNA 전달체는 암, 기타의 질병 모델에 적용할 수 있으므로, 향후 광범위한 질병 치료를 위한 치료제로 사용될 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 아민을 가진 글라이콜 키토산 (glycol chitosan)에 크로스 링커를 사용하여 -SH (thiol group)을 도입하여 티올화 글라이콜 키토산 (Thiolated Glycol Chitosan ;TGC)을 제조하는 모식도를 나타내는 것이다.
도 2는 실시예 2에서 양쪽 말단 그룹이 -SH (thiol group)인 폴리-siRNA와 티올화 글리콜 키토산 (TGC)을 반응시켜 이황화결합 및 전기적 결합에 의한 복합체를 형성하는 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 2의 폴리-siRNA 와 글라이콜 키토산 또는 티올기 도입 정도가 다른 TGC 와의 복합체 형성 여부를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 2의 도 2과 같은 방법으로 제조된 폴리-siRNA-TGC 간의 결합 여부를 확인하기 위하여 DTT(dithiothreitol)를 처리하고 전기 영동한 것을 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 3에서 제조한 폴리-siRNA와 TGC (TGC2, TGC3, 5:1 무게비율) 로 제조된 복합체 나노 입자에 의한 세포에서의 유전자 발현 억제효과 결과를 사진으로 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 4와 같은 방법으로 근적외선 형광물질 (Cy 5.5)로 수식된 폴리-siRNA를 이용하여 제조된 폴리-siRNA-TGC 복합체의 마우스의 조직 축적능과 시간에 따른 체내 순환능을 나타내는 것이다.
도 7은 실시예 5의 방법으로 폴리-siRNA-TGC복합체의 마우스 암조직에 대한 유전자 발현 억제능에 대한 실험 결과이다. 폴리-siRNA-TGC복합체에 의한 모델 타겟 단백질인 RFP의 발현이 현저히 감소한 것을 보여주는 그림이다.
이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 siRNA를 생체 내에서 효율적으로 전달하기 위하여 고분자와 siRNA를 결합하여 제조한 siRNA 전달체를 제공하되, 상기 siRNA 전달체는 고분자와 siRNA가 전하결합 및 생분해성 공유결합으로 동시에 결합된 것이 특징이다.
본 발명에 의한 siRNA 전달체는 고분자와 다양한 형태의 siRNA가 결합하여 제조되는 것으로, 상기 결합은 전하결합 및 생분해성 공유 결합에 의한 것으로 그 구조는 하기와 같이 나타낼 수 있다.
A-B (A: 고분자, B: 다양한 형태의 siRNA)
상기에서, A는 전하와 작용기를 가지는 고분자이다. 구체적으로는, 생체 적합성을 갖는 모든 고분자가 사용될 수 있으며, 특히 질병 조직에 축적 효율이 높고 약물전달체로 사용되는 생체고분자인 키토산 (chitosan), 글라이콜 키토산 (glycol chitosan), 프로타민 (protamine), 폴리 라이신 (polylysine), 폴리 아르기닌 (polyarginine), 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine), 덱스트란(dextran), 히알루론산(hyaluronic acid), 알부민(albumin) 또는 이들의 화학적 유도체들 중에서 양전하와 작용기를 동시에 가질 수 있는 것들이면 제한없이 사용할 수 있다. 합성 고분자로서는 PEI (Polyethylenimine), PLGA (poly lactic glycolic acid) 그리고 폴리-L-라이신 (poly-L-lysine) 등을 사용할 수 있으나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기에서, B는 다양한 형태의 siRNA로서 단량체 siRNA 또는 고분자 siRNA (폴리 siRNA, 다량체 siRNA)일 수 있다. 좋기로는, 상기 siRNA는 15내지 30개의 뉴클레오타이드 단량체 siRNA 또는 그의 중합체인 100 내지 400 뉴클레오타이드로 구성된 다량체 siRNA일 수 있다. 상기 siRNA의 가닥은 분자량 10,000 내지 1,000,000 사이에서 선택되는 것이 바람직하다. 상기 siRNA의 서열은 치료 목적의 VEGF (vascular endothelial growth factor), NF-kB, 열 충격 단백질 (heat shock protein), 열 충격 인자 (heat shock factor) 등의 서열을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 하기 실시 예에서는 siRNA의 전달 효능을 형광으로 확인하기 위하여 RFP (Red fluorescence protein)에 대한 siRNA 염기 서열을 사용하였다.
상기 A와 B는 전하결합과 생분해성 공유결합에 의하여 연결된다. 상기 전하결합은, 음전하를 띄는 siRNA와 양전하를 띄는 고분자간의 전하결합이다. 양친성 고분자 나노 입자의 외부에 물리적으로 siRNA를 결합하는 방법은, 화학적 결합의 최대 적하량이 10% 정도로 제한되어 있는 것에 비하여 최대 적하량이 95%로 월등이 높아서 화학적 결합시의 한계를 극복하여 약물 함유량을 대폭 늘릴 수 있다.
상기 생분해성 결합은 이황화 결합(disulfide bond), 에스테르 결합, 안하이드라이드(anhydride) 결합, 히드라존(hydrazone) 결합, 효소 특이적 펩티드 결합 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 생분해성 결합은 특정 생체 환경 하에서 분해가 가능하다. 생체 환경 내에서 여러 가지 효소 및 산도 등에 의하여 생분해 되는 본 발명의 siRNA와 고분자간의 생분해성 결합은, 생체 내의 특정 효소 등에 의하여 분해되는 경우, siRNA와 고분자 간의 분해로 인하여 분리되어 나온 siRNA에 의한 타겟 유전자 발현의 억제를 가능하게 한다. 예컨대, 생분해성 공유 결합을 위한 작용기로서 siRNA의 말단과 고분자 말단에 티올기가 도입되는 경우, siRNA와 고분자는 이황화 결합이라는 생분해성 결합을 형성하게 되는데, 생체 내에 상기 이황화 결합을 갖는 siRNA와 고분자 나노 입자가 도입되는 경우, 생체 내에 존재하는 글루타치온 (GSH)에 의하여 siRNA가 환원되어 분리되어 나올 수 있다. 특히, 암 세포에서는 글루타치온 (GSH)의 농도가 증가된다는 보고를 고려할 때, 본 발명의 고분자-siRNA 나노 입자 전달체의 이황화 결합 등의 생분해성 결합이 암 조직 중에서도 효과적으로 생분해되어 siRNA를 표적 부위로 효과적으로 전달시킬 수 있음을 알 수 있다.
고분자와 siRNA의 결합이 전하결합만으로 이루어지는 경우에는, 결합력이 강하지 않아 siRNA와 결합하여 사용할 수 있는 고분자의 범위가 제한된다. 또한, 생체 내에서 불안정하여 목적한 곳에 도달하기 전에 분리되는 문제가 있었다. 그러나 본 발명의 siRNA 전달체는 고분자와 siRNA가 전하결합뿐 아니라 화학적인 생분해성 공유결합에 의하여도 결합되므로, 생체 적합성이 더욱 향상되며 siRNA를 안정적으로 표적 부위로 전달할 수 있어 더욱 우수하다.
본 발명의 A (고분자)와 B (siRNA)의 결합에 의한 본 발명의 siRNA 전달체의 제조는 하기 방법에 의할 수 있다.
(a) 양전하를 갖는 고분자에 생분해성 공유결합을 위한 작용기를 도입시키는 단계,
(b) siRNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에 작용기를 도입하거나 활성화시키는 단계, 및
(c) 상기 (a) 단계에서 제조한 고분자와 상기 (b) 단계에서 제조한 siRNA를 전하결합 및 생분해성 공유결합을 통해 안정적으로 고분자와 siRNA를 결합하여 나노입자를 제조하는 단계.
상기 방법은, 결합 방식에 따라 단계들이 동시에 이루어져도 무방하다. 상기 방법으로 제조된 고분자 나노입자는 수용액 상에서 효율적으로 여러 형태의 siRNA와 복합체를 이루어 나노 크기의 자기조립체 (self-assemblｙ)를 형성할 수 있으며, 특정 질병 부위에 선택적으로 축적된다 (예 : 신생혈관 표적형 EPR, 암 류마티즘 염증성 질환). 상기와 같이 제조된 본 발명에 의한 고분자-siRNA 전달체의 크기는 좋기로는, 10 내지 2000 nm일 수 있고, 분자량은 103 내지 107 Da일 수 잇다.
한편, 본 발명의 siRNA 전달체는 약제학적 조성물의 유효 성분으로 사용될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 고분자-siRNA 전달체를 유효량 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 투여를 위해서 본 발명에 의한 고분자-siRNA 전달체 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립가능 하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있다.
또한, 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 이와 같은 임상투여를 위해 본 발명의 약제학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다.
실시예 1. 친수성 고분자인 글라이콜 키토산에 티올(thiol) 기 도입
글라이콜 키토산은 생체 독성이 없고, 암 조직에 효율적으로 축적되지만 그 자체로는 양전하가 약하여 siRNA와 효율적인 전하결합이 불가능하다. 따라서 이중기능(heterobifunctional) 연결체 (cross linker)인 sulfo-LC-SPDP를 이용하여 아민기가 피리딜디티올기로 활성화된 (pyridyldithiol-activated) 글라이콜 키토산 유도체를 형성하였다.
30mg의 글라이콜 키토산(glycol chitosnan, 분자량 250kDa)을 pH7.4인 인산염 버퍼 (phosphate buffer) 10ml에 녹인 후 각각 1, 2, 5 mg의 sulfo-LC-SPDP (분자량 527.57 Da, 글라이콜 키토산의 아민 그룹 대비 2, 5, 10%) 와 실온에서 하루 동안 반응하였다. 그 후 DTT(dithiothreitol)을 4, 9, 18 mg씩 각각 첨가하고 3시간 반응시킨 후에 1M HCl 용액으로 각 용액의 pH를 3 내지 4로 낮춰주었다. 그 후 cut-off가 12,000 Da인 투석막을 이용하여 24시간 동안 투석하여 반응하지 않은 sulfo-LC-SPDP와 DTT를 제거한 후 동결건조하였다 (도 1).
실시예 2. 티올기를 가진 고분자 올리고 뉴클레오타이드와 글라이콜 키토산 고분자의 접합
티올기를 가진 고분자 폴리-siRNA는 안정성과 음전하의 양이 증가하였고 이를 티올이 도입된 친수성 고분자 글라이콜 키토산 (TGC)에 전하결합과 이황화결합을 동시에 사용하여 복합체를 형성시킨다.
50ug의 poly-siRNA (10 mM HEPES, 1 mM EDTA, pH 8.0)와 250ug 의 티올 그룹을 가진 글라이콜 키토산 고분자 (TGC)를 100uL 의 HEPES 버퍼 (10mM, 1mM EDTA, pH8.0) 에 녹여 혼합한 뒤 한 시간 동안 37도에서 반응시킴으로써 안정된 복합체를 형성한다 (도 2). 도 3에서는 폴리-siRNA 와 작용기를 도입하지 않은 순수한 글라이콜 키토산만으로는 결합이 형성되지 않으며, 폴리-siRNA 와 TGC 간의 복합체 형성시, TGC의 -SH기 치환 정도(2%: TGC1, 5%: TGC2, 그리고 10 %: TGC3)에 따른 폴리-siRNA와의 복합체 형성 여부를 나타낸 것이다. 폴리-siRNA 와 TGC를 여러 가지 무게비로 섞고 1시간 동안 37도에서 반응시킨 뒤 8% 아크릴아미드 겔에서 150V로 전기영동 35분간 실시하였다. 이후, 사이버-골드 (syber-gold) 염색하여 젤도큐멘트 장비를 이용하여 복합체 형성과 반응하지 않은 여분의 폴리-siRNA를 확인하였다. 또한 복합체를 만든 뒤, 이것이 이황화결합에 의한 것임을 확인하기 위하여 DTT 를 37도에서 3시간 처리하고 위와 같이 전기영동 함으로써 단분자량의 siRNA로 환원됨을 확인하였다 (도 4).
실시예 3. 세포 실험으로 티올기가 도입된 글라이콜 키토산 고분자와 고분자 올리고 뉴클레오타이드( poly-siRNA )의 복합체 전달에 의한 유전자 발현 억제효과 검증
폴리-siRNA와 TGC (TGC2, TGC3, 5:1 무게비율)로 제조된 복합체 나노입자를 siRNA 농도 50nM가 되도록 대조군(Control, Mono-siRNA/LF, 폴리-siRNA/LF)와 함께 RFP가 발현되는 흑색종 세포주인 RFP-B16/F10 (1.2*105/dish)세포에 처리하여 24시간 후에 RFP발현 억제 효능을 형광현미경 영상으로 획득하였다. 본 실험에서는 적색 형광 단백질 (Red Fluorescent Protein; RFP)에 대한 siRNA를 제작하여 사용하였으며, 대조군으로 사용한 모노-siRNA/LF, 폴리-siRNA/LF 의 LF는 In vitrogen 사의 LipofectamineTM 2000 을 표기한 것이다(도 5). TGC에 의한 폴리-siRNA전달이 RFP 유전자 발현 억제에 효율적임을 확인하였다.
실시예 4. 티올기가 도입된 글라이콜 키토산 고분자와 고분자 올리고 뉴클레오타이드( poly - siRNA ) 복합체의 마우스 조직내 분포 및 암표적성 검증
근적외선 형광물질 (Cy 5.5)로 수식된 폴리-siRNA를 이용하여 만든 폴리-siRNA-TGC 복합체를 SCC7 암세포가 이식된 마우스에 꼬리 정맥으로 주사한 뒤 시간별로 비침습적 광학영상을 통해 마우스 체내에서의 물질의 순환을 관찰하였다. 전달체 TGC 없이 주사된 폴리-siRNA나 폴리-siRNA-PEI 복합체에 비하여 TGC 와 복합체를 이룬 Cy5.5 표지 폴리-siRNA의 경우 암조직에 특이적으로 축적됨을 확인하였으며 특히 TGC3 와 복합체를 만든 실험군에서 가장 암표적성과 체내 보존성이 우수함을 확인하였다 (도 6).
실시예 5. 동물 실험으로 티올기가 도입된 글라이콜 키토산 고분자와 고분자 올리고 뉴클레오타이드( poly-siRNA )의 복합체 전달에 의한 유전자 발현 억제효과 검증
누드 마우스에 1 x 106개의 RFP-B16/F10 흑색종 세포주를 등쪽 허리 아래부위로 주사하여 동물 암모델을 만들고, 광학장비를 통하여 마우스에서 RFP 형광이 검출될 때부터 폴리-siRNA-TGC3 복합체를 2일 간격으로 2회(day 0과 day 2) 꼬리정맥으로 주사하여 혈관을 통하여 전달된 폴리-siRNA에 의한 암조직중의 RFP 발현 효과를 비교하였다. 도 7은 폴리-siRNA-TGC3 복합체를 주사한 경우 암 조직의 RFP의 발현이 현저히 감소한 것을 보여주는 그림이다. 또한 6일째에 암 조직을 적출하여 암 조직 중의 전체 RNA를 추출하여 역전사효소-중합법 (Reverse Transcrition polymerase chain reaction)으로 조직중의 RFP의 발현양을 비교하였을 때 폴리-siRNA-TGC3를 주사한 마우스의 조직에서의 효율적인 RFP 발현 감소를 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명을 통하여 전하결합과 동시에 생분해성 결합으로 연결되어 제조된 고분자-siRNA 나노입자 형태를 갖는 새로운 제형의 siRNA 전달체는, 수용액 상에서 나노입자를 이루고 siRNA를 생체 내에서 안정적으로 표적 부위로 전달할 수 있으므로 siRNA에 의한 치료 효율을 향상시킬 수 있다.
따라서, 본 발명에 의한 고분자-siRNA 전달체는 다양한 암 및 질병 모델에 적용할 수 있다는 장점이 있다.

Claims (13)

  1. 고분자(A)와 siRNA(B)가 전하결합과 생분해성 공유결합으로 동시에 연결된 하기 구조의 고분자-siRNA 전달체.
    A-B
    (상기에서, A는 양전하와 작용기를 가진 고분자이고, B는 한쪽 또는 양쪽 말단에 작용기를 가진 siRNA 이다)
  2. 제1항에 있어서, 상기 고분자 (A)는 키토산 (chitosan), 글라이콜 키토산 (glycol chitosan), 프로타민 (protamine), 폴리 라이신 (polylysine), 폴리 아르기닌 (polyarginine), 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine), 덱스트란(dextran), 히알루론산(hyaluronic acid), 알부민(albumin) 또는 이들의 유도체들 중에서 양전하를 갖는 것 중에서 선택된 것인 고분자-siRNA 전달체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 siRNA (B)는 한쪽 또는 양쪽 말단에 고분자와의 연결을 위한 작용기가 달려 있는 형태인 것인 고분자-siRNA 전달체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 siRNA (B)는 단량체 siRNA, 여러 개의 siRNA가 분해성 결합으로 연결된 폴리 siRNA 또는 다량체 siRNA인 것인 고분자-siRNA 전달체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 siRNA (B)는 15내지 30개의 뉴클레오타이드 단량체 siRNA 또는 그의 중합체인 100 내지 400 뉴클레오타이드로 구성된 다량체 siRNA인 것인 고분자-siRNA 전달체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 고분자(A)와 siRNA(B)는 전하결합과 생분해성 결합으로 동시에 연결된 것으로, 고분자와 siRNA가 전하결합만으로 연결된 경우에 비하여 생체 내 안정성이 더욱 증가된 것이 특징인 고분자-siRNA 전달체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 고분자(A)와 siRNA(B) 간의 생분해성 결합은 이황화 결합(disulfide bond), 에스테르 결합, 안하이드라이드(anhydride) 결합, 히드라존(hydrazone) 결합 및 효소 특이적 펩티드 결합 중에서 선택되는 것인 고분자-siRNA 전달체.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 고분자-siRNA 전달체의 크기는 10 내지 2000 nm인 것인 고분자-siRNA 전달체.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 고분자-siRNA 전달체는 분자량이 103 내지 107 Da인 것인 고분자-siRNA 전달체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 고분자 나노입자는 수계에서 전하결합과 생분해성 공유결합을 동시에 사용하여 siRNA와 고분자가 연결되는 것을 특징으로 하는 고분자-siRNA 전달체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 고분자-siRNA 전달체는 암의 치료를 위하여 사용되는 것인 고분자-siRNA 전달체.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 고분자-siRNA 전달체를 유효량 포함하는 항암제 조성물.
  13. (a) 양전하를 갖는 고분자에 생분해성 공유 결합을 위한 작용기를 도입시키는 단계;
    (b) siRNA의 한쪽 또는 양쪽 말단에 작용기를 도입하거나 활성화시키는 단계;
    (c) 상기 (a) 단계에서 제조한 고분자와 (b) 단계에서 제조한 siRNA를 전하결합 및 생분해성 공유결합으로 결합시켜 나노 입자를 형성하는 단계;
    를 포함하는 siRNA 전달체의 제조 방법.
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