KR20120016897A - 심혈관 질환과 연관된 단일염기다형성 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 심혈관 질환의 진단용 키트 및 심혈관 질환의 진단방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 다중 불포화지방산(polyunsaturated fatty acid, PUFA) 대사과정의 핵심 효소인 FADS1(fatty acid desaturase 1) 유전자 부근의 특정 SNP가 심혈관 질환의 위험도와 관계된 다양한 위험인자와 일관된 상관관계에 있어 이를 심혈관 질환에 대한 유전자 진단마커로 사용할 수 있음을 발견하였다. 따라서 본 발명은 관상동맥 질환을 비롯한 다양한 심혈관 질환에 대한 간편하고 신뢰성 높은 체외진단 시스템에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

심혈관 질환과 연관된 단일염기다형성 및 그의 용도{Single Nucleotide Polyrmorphisms Implicated in Cardiovascular Diseases and Use Thereof}

본 발명은 심혈관 질환과 연관된 단일염기다형성 및 그의 심혈관 질환 진단용 키트 및 진단방법으로써의 용도에 관한 것이다.

인지질에서의 다중 불포화지방산(polyunsaturated fatty acid, PUFA) 조성은 관상동맥 질환(coronary artery disease, CAD)과 같은 인간의 몇몇 복합질환과 관련되어 왔다(1). PUFA는 막의 유동성과 콜레스테롤 함량에 영향을 미칠 수 있고, 신호 분자의 생성에 영향을 미칠 수 있다(2-7). 이들은 또한 prostaglandins 및 leukotrienes와 같은 eicosanoids라고 불리는 염증의 강력한 촉진자(promoter)로 변화할 수 있다(processed to)(8, 9). 인지질에서의 PUFA 수준은 영양(10, 11)과 대사 모두에 의해 결정되는 것으로 알려져 있다. PUFA 대사에서의 핵심 효소는 FADS1(fatty acid desaturase 1) 및 FADS2(fatty acid desaturase 2)에 의해 각각 인코딩되는 D5D(delta-5-desaturase) 및 6D6(delta-6-desaturase)이다(12-14). 이들 두 유전자는 11번 크로모좀 상의 desaturase 유전자 클럭스터에 존재한다(11q12-13.1). 상기 클러스터는 아직 활성이 알려지지 않은 또 다른 desaturase 유전자인 FADS3도 포함하며, 이 유전자는 FADS1 및 FADS2 유전자와 각각 52 % 및 62 %의 서열 상동성을 가진다(12). 혈장 PUFA에 대한 유전자 연관 연구(genome-wide association study)는 크로모좀 11 상의 FADS1 , FADS2 및 FADS3를 인코딩하는 영역이 서로 연관되어있다는 강력한 증거를 보여준다(15). 아라키돈산(AA, 20:4ω6) 분석에 있어서 가장 중요한 연관성을 가지는 단일염기 다형성(single nuclerotide polymorphism, SNP) 부위는 FADS1 근처의 rs174537(flapstructure specific endonuclease, FEN1)인 것으로 나타났다. rs174537G>T의 소수 대립인자 동형접합체는 주 대립인자 동형접합체에 비하여 혈장 AA 수준이 더 낮고 LDL 콜레스테롤 및 총 콜레스테롤 수준은 더 높았다(15). 크로모좀 11 상의 FADS 좌위는 혈중 PUFA 농도를 좌우하는 주요 인자이고 따라서 관상동맥 질환에 영향을 줄 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에서는 rs174537를 포함한 FADS 유전자의 SNP와 혈청 인지질 내의 PUFA 및 CAD간의 관계를 조사하였다. 또한 본 발명자들은 이들 SNP가 산화 LDL, MDA(malondialdehyde) 및 8-epi-PGF_2α(8-epi-prostaglandin F_2α)와 같은 지질 과산화물에 대해 미치는 영향을 조사하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 심혈관 질환에 대한 간편하고 신뢰성 높은 체외진단 시스템을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 다중불포화지방산(poly unsaturated fatty acid, PUFA) 대사에서 핵심 효소인 지방산 탈포화 효소(fatty acid desaturase)를 인코딩하는 FADS1(fatty acid desaturase 1) 유전자 부근의 특정 SNP(GenBank SNP 데이터베이스, rs 174537)가 심혈관 질환의 위험도에 대한 지표가 되는 여러 인자들과 일관된 상관관계가 있어 심혈관 질환의 위험도에 대한 지표가 될 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 심혈관 질환(cardiovascular disease) 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 산화 스트레스 관련 질환의 네거티브 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 심혈관 질환의 네거티브 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 FEN 1(flapstructure specific endonuclease 1) 유전자 상의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 394번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs 174537)를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 심혈관 질환(cardiovascular disease) 진단용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 심혈관 질환에 대한 간편하고 신뢰성 높은 체외진단 시스템을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 다중불포화지방산(poly unsaturated fatty acid, PUFA) 대사에서 핵심 효소인 지방산 탈포화 효소(fatty acid desaturase)를 인코딩하는 FADS1(fatty acid desaturase 1) 유전자 부근의 특정 SNP(GenBank SNP 데이터베이스, rs 174537)가 심혈관 질환의 위험도에 대한 지표가 되는 여러 인자들과 일관된 상관관계가 있어 심혈관 질환의 위험도에 대한 지표가 될 수 있음을 발견하였다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 SNP는 11번 크로모좀 상에 존재하는 FADS1 유전자의 5kb 업스트림에 위치하는 FEN 1(flapstructure specific endonuclease 1) 유전자 상에 존재한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단일염기다형성 부위를 가진 개체는 감소된 심혈관 질환의 위험도를 가진다.

본 발명에 따르면, 심혈관질환군과 대조군 대상자 모두에서 본 발명의 SNP인 rs 174537가 T 대립인자를 가질 경우 유의적으로 리놀레산(18:2ω6) 비율이 높았고, 아라키돈산(20:4ω6) 비율이 낮았으며, 아리키돈산(20:4ω6)/디호모 감마 리놀렌산(20:3ω6)의 비율과 아라키돈산(20:4ω6)/리놀레산(18:2ω6) 비율이 G/G 유전자형을 가진 사람보다 낮았다. 또한 rs174537 T 대립인자를 가질 때 대조군의 경우, 유의적으로 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 말론디알데하이드, 산화 LDL 농도가 낮았고 심혈관질환군의 경우, G/G 유전자형을 가진 군보다 LDL 입자 크기가 크다는 것을 확인하였다. 결론적으로 rs174537G>T의 T 대립인자는 심혈관질환 발병 위험의 감소와 유의하게 연관된다는 사실을 발견하였다.

본 명세서에서, 용어“뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 용어“단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)”은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우, 두 개의 대립 유전자(C 또는 T)라고 부르며, 일반적으로 거의 모든 SNPs는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 한 집단(population)내에서, SNP는 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다. 인간 집단 내에서 변이성(variations)이 존재하며, 지질학적 또는 민족적 군에서 공통적인 하나의 SNP 대립 유전자는 매우 희귀하다. 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다.

단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열 상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고(침묵 돌연변이라고도 불리움), 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP의 경우 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.

인간의 DNA 서열 상의 변이성은 병의 발병 및 인간이 어떻게 병원체, 화학물질, 약물, 백신 및 다른 시약에 반응하는 가에 영향을 미칠 수 있다. 또한, SNP는 맞춤형 의약의 개념을 실현하기 위한 중요한 도구(key enabler)로 생각된다. 무엇보다도, 최근에 마커로서 활발하게 개발되고 있는 SNP는 질병을 가지거나 또는 가지지 않는 군들 간에 게놈 부위를 비교함으로써 질병을 진단하는 생의학적 연구에서 가장 중요하다. SNP는 인간 게놈의 가장 많은 변이이며, 1.9 kb 당 하나의 SNP 비율로 존재하는 것으로 추측되고 있다(Sachidanandam et al., 2001). SNP는 매우 안정된 유전적 마커이고, 때때로 표현형에 직접적인 영향을 미치며, 자동화된 유전자형규명 시스템에 매우 적합하다(Landegren et al., 1998; Isaksson et al., 2000). 또한, SNP 연구는 곡식 및 가축 육성 프로그램에서도 중요하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.

본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 키트에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)).

출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem . 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 인간(예컨대, 비만 또는 당뇨 환자)으로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 키트에 있어서, 상기 특정 서열을 규명하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS , USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl . Acids Res ., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann . Rev . Genet ., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다.

다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다.

예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 인간으로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.

혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 DM 또는 MS 여부를 결정한다.

본 명세서에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 SNP를 포함하는 10-30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3’-말단 또는 5’-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3’-말단 또는 5’-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 대사 이상 또는 당뇨병의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 SNP를 마커로 하여 이의 존재가 상술한 방법을 통해 확인되면 리놀레인산의 농도가 높고 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 말론디알데하이드, 산화 LDL 농도가 낮으며 LDL 입자 크기가 크므로 심혈관 질환의 발병 위험도가 낮은 것으로 판단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 T 대립인자는 TT 동형접합체(homozygote)이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 심혈관 질환은 관상동맥 질환(coronary artery disease)이다. 가장 바람직하게는, 상기 관상동맥질환은 심근경색, 협심증, 다른 만성 관상동맥질환, 아테롬성 동맥경화증, 급성 관상동맥 증후군(예컨대, 불안정협심증, NSTEMI(non-ST-elevation myocardial infarction) 또는 STEMI(ST-elevation myocardial infarction) 또는 PAOD(peripheral arterial occlusive disease)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단일염기다형성 부위를 가진 개체는 감소된 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 말론디알데하이드, 산화 LDL 및 아라키돈산 농도를 가지며, 증가된 리놀레산(18:2ω6) 농도를 가진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단일염기다형성 부위를 가진 개체는 증가된 LDL 입자 크기를 가진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 아시아인에게 적용된다.

본 발명에서 용어“아시아”는 한국, 중국 및 일본 등을 비롯한 몽골계 인종이 거주하는 극동 지역을 의미한다. “아시아인”이란 조상이 아시아인인 개체군을 의미하며, 바람직하게는 적어도 10대 이상의 조상이 아시아인인 개체군을 의미한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 아시아인은 한국인이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 심혈관 질환의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 대한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 FEN 1(flapstructure specific endonuclease 1) 유전자 상의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 394번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs 174537)를 검출하는 단계를 포함하는 심혈관 질환의 네거티브 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 상술한 프라이머, 프로브, 항체 또는 앱타머를 필수 구성요소로 하는 바, 이들에 대한 상세한 설명은 본 발명의 방법에 이용되는 프라이머에도 적용된다. 따라서, 반복적인 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 명세서에서 용어 “네거티브 마커(negative marker)”는 특정 마커의 존재의 검출을 통해서 대상 질환의 부재 또는 낮은 발병가능성을 확인할 수 있은 마커를 말한다.

본 발명의 방법이 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 방법은 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 마커가 검출된 경우 상기 인간은 감소된 심혈관 질환 위험도를 가진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 심혈관 질환은 관상동맥 질환(coronary artery disease)이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 관상동맥질환은 심근경색, 협심증, 다른 만성 관상동맥질환, 아테롬성 동맥경화증, 급성 관상동맥 증후군(예컨대, 불안정협심증, NSTEMI(non-ST-elevation myocardial infarction) 또는 STEMI(ST-elevation myocardial infarction) 또는 PAOD(peripheral arterial occlusive disease)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단일염기다형성(SNP) 부위를 검출하는 단계는 마이크로어레이 방식 또는 유전자 증폭 방식으로 실시된다.

본 발명이 유전자 증폭 방식으로 실시되는 경우, 바람직하게는 프라이머를 이용한 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있다.

본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 분석하여 진단한다. 본 발명은 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 검출하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 게놈 DNA)에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열을 결정함으로써 조사하여 MS 또는 DM을 결정할 수 있다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

본 발명의 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시될 수도 있다. 본 발명의 방법이 마이크로어레이 방식에 의하는 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다.

본 발명의 방법에서 이용되는 프로브는 상기 나열한 본 발명의 SNP를 포함하는 각 유전자상의 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는다.

프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에서 확인할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 마커인 서열목록 제1서열의 394번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위는 GenBank SNP 데이터베이스 rs 174537에 뉴클레오타이드 서열이 기재되어 있으며, 이 서열을 참조하여 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 네거티브 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 심혈관 질환의 위험도를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료보다 강하게 나오는 경우에는 심혈관 질환의 위험도가 낮은 것으로 진단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 아시아인에게 적용된다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 심혈관 질환의 진단용 키트 및 심혈관 질환의 진단방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 관상동맥 질환을 비롯한 다양한 심혈관 질환에 대한 간편하고 신뢰성 높은 체외진단 시스템에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 대조군과 관상동맥질환 환자들에서 혈청 인지질 내의 아라키돈산(20:4ω6) 비율과 리놀레인산(18:2ω6) 비율 및 소변 8-epi-PGF F_2a의 관계를 나타낸 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

실험대상

본 발명에서는 실험 참가자들은 연세대학교의 임상 영양유전자학 및 영양유전체학 연구실(Laboratory of Clinical Nutrigenetics and Nutrigenomics, 과제번호: 2010-0015017 및 M10642120002-06N4212-00210)에서 실시한 임상연구에 참가한 지원자들을 대상으로 연구를 진행하였다. 연구 대상자들의 연령은 40-79세였다. 대조군 대상자들은 건강증진센터에서 정기검진을 받던 중 모집하거나 연구내용을 간단히 소개하는 광고문을 통해 모집하였다. 제외된 사람의 기준은 다음과 같다: 정형외과적 제한, 지난 6개월간 체중의 감소/증가가 있거나 혈관질환, 당뇨병, 암(임상적 또는 병력), 신장 질환, 간 질환, 갑상선 질환, 및 급성 또는 만성 염증의 진단을 받은 대상자. 대상자 중 약물 또는 보조제를 복용하는 사람은 없었다. 관상동맥질환을 가진 환자들은 서울 연세대학교 세브란스 병원의 심혈관 유전체 센터에서 모집하였다. 모집된 대상자들의 기준은 다음과 같다: (a) 혈관조영적으로 하나 이상의 주관상동맥에서 50% 이상의 폐색을 가지는 관상동맥질환이 확인된 사람, (b) 증상, 효소 증가 또는 심전도 변화에 대한 세계보건기구 기준에 따라 심근경색(myocardial infarction, MI)이 확인된 사람, (c) 협착증(osteal stenosis) 및 경련과 같은 비-아테롬 유발 폐색이 없는 사람, (d) 정형외과적 제한 또는 당뇨병의 진단이 없는 사람, (e) 급성 또는 만성 염증 질환이 없는 사람. 최종적으로, 유전적인 연관성이 없는 1646명의 한국인(756명의 관상동맥질환 환자 및 890명의 대조군)이 본 연구의 조사대상이 되었다. 조사에 착수하기 전에, 모든 참가자들에게 본 연구의 목적에 대하여 상세히 설명한 뒤 동의를 얻었으며 수행된 연구의 프로토콜은 연세대학교 임상시험심사위원회의 승인을 받았다.

인체측정학 파라미터 및 혈액채취

환자들의 신장 및 체중은 아침에 의복 및 신발을 미착용한 채로 측정하였다. 체질량지수(BMI)는 체중을 신장의 제곱으로 나누어 계산하였다(kg/m²). 혈압은 20분의 휴식 후 자동혈압 모니터(TM-2654, A&D, Tokyo, Japan)를 이용하여 앉은 채로 환자의 왼팔에서 측정하였다. 정맥혈 표본은 12시간 밤사이 금식 후 EDTA-처리 튜브 또는 일반 튜브에 채집하였다. 특히, 항산화제 분석을 위한 튜브는 즉시 알루미늄 호일로 감싸고 연구실에 도착하기 전까지(1-3시간 이내) 얼음 위에 올려놓았으며, 이후 분석 전까지 -70℃에서 보관하였다.

FADS 유전자 다형성의 지노타이핑

상업적으로 구입 가능한 DNA 분리 키트(WIZARD^R Genomic DNA purification kit, Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 5 mL 전체 혈액으로부터 지놈 DNA를 추출하였다. 유전적 연구에 대한 이전의 보고, FADS 유전자 클러스터(15-18)에 대한 공개된 데이터베이스 및 HapMap 프로젝트(http://www.hapmap.org)에 기초하여, 384명의 연령과 성비를 일치시킨 관상동맥질환 환자 및 대조군에서 8개의 관련된 단일염기 다형성(SNP)을 예비적으로 스크리닝하였다[rs174537 (FEN1-10154G>T near FADS1), rs174575 (FADS2), rs1000778 (FADS3), rs2727270 (FADS2), rs174576 (FADS2), rs174570 (FADS2), rs174583 (FADS2), rs174456 (FADS3)]. 각각의 지노타이핑은 Taqman 분석(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 실시, 이들 8개의 SNP들은 HWE(Hardy Weinberg Equilibrium)를 만족하였다(p>0.05). 연관 불균형(Linkage Disequilibrium, LD) 검정으로부터 rs174537 (FEN1-10154G>T) 및 rs174575 (FADS2 rs174575C>G)가 r² 값이 높지 않음에도(r²=0.16) 깊이 연관되어 있음(D´=0.96; P<0.001)을 발견하였다. rs174537 및 rs2727270(FADS2 rs2727270C>T) 역시 연관도가 높음이 밝혀졌으며(D´=0.98; P<0.001), r²값도 비교적 높았다(r²=0.71); 그러나, 이들은 다른 블록에서 발견되었다. 흥미롭게도, rs174537은 rs174576, rs174570 및 rs174583와 매우 높은 연관도를 보였다(D’>0.99, r ² >0.95). ECRHS(European Community Respiratory Health Survey)의 LD 구조에 기초하여, 본 발명자들은 rs174537가 나머지 세 개의 SNP(rs174576, rs174570 및 rs174583)의 유전적 정보를 커버할 정도로 충분하다는 사실을 깨달았다. 나아가, rs1000778(FADS3 rs1000778C>T)은 rs174456(FADS3 rs174456T>C)과 높은 연관성을 가졌다(D’=1, r ² =1). 다른 한편, 상기 SNP는 rs174537, rs17457 및 rs2727270와 약한 LD를 가졌고, rs17457 및 rs2727270의 사이에 위치하였다. 따라서, 본 발명자들은 4개의 SNP(FEN1-10154 rs174537G>T, FADS2 rs174575C>G, FADS2 rs2727270C>T 및 FADS3 1000778C>T)를 대상으로 심층 분석을 실시하였다.

혈청 지질 프로파일 및 공복시 글루코스

공복시 혈청의 총 콜레스테롤 및 중성지방(triglyceride) 농도를 Hitachi 7150 Autoanalyzer(Hitachi Ltd. Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. 혈청 압죽미립(chylomicron), LDL(low density lipoprotein) 및 VLDL(very low density lipoprotein)을 덱스트란 황산 마그네슘을 이용하여 침전시킨 후, 상층액에 남아있는 HDL-C(high density lipoprotein cholesterol)을 효소적 방법으로 측정하였다. LDL 콜레스테롤은 혈청 중성지방 농도가 400 mg/dL (4.52 mol/L) 미만인 대상자에 대하여 Friedewald 공식을 이용하여 간접적으로 계산하였다. 혈청 중성지방 농도가 4.52 mol/l(400mg/ml)이상인 대상자에서, LDL 콜레스테롤을 Hitachi7150 Autoanalyzer를 이용하여 효소적 방법으로 측정하였다. 공복시 글루코스는 Glucose Analyzer(Beckman Instruments, Irvine, CA, USA)를 이용하여 글루코스 산화제 방법을 통해 측정하였다.

LDL 입자 크기

연속 부양 원심분리를 통해 분리한 LDL의 입자 크기의 분포는 상업적으로 구입 가능한 2-16%의 아크릴 아마이드(Alamo Gels Inc., San Antonio, TX)의 선형농도 구배를 가지는 불포화 폴리아크릴아마이드 슬랩 겔을 이용한 Pore-gradient Lipoprotein System(CBS Scientific, CA, USA)으로 측정하였다. 각각의 밴드의 상대적인 이동(relative migration, Rf)을 측정하기 위하여 표준적인 라텍스 비드(34 nm), 티로글로불린(17 nm), 아포페리틴(12.2 nm) 및 카탈레이즈(10.4 nm)를 사용하였다. 겔은 GS-800 Calibrated Imaging Densitometer(Bio-Rad Laboratories, Graz, Austria)를 이용하여 스캐닝하였다. LDL 입자의 크기는 기준시료의 Rf 값을 참고하여 계산하였다. 측정내(intra-assay) 변이계수 및 측정간(inter-assay) 변이계수는 각각 0.73% 및 1.46%이다.

혈장 산화 LDL 및 혈청 고 민감성 C-반응 단백질

혈장 산화 LDL(ox-LDL)은 효소 면역분석기(Mercodia, Uppsala, Sweden)를 이용하여 측정하였다. 나타난 색상 반응을 Wallac Victor² 다중표지 계측기(Perkin Elmer Life Sciences, Turku, Finland)를 이용하여 판독하였다. 고 민감성 C-반응 단백질(high sensitivity C-reactive protein, hs-CRP)의 혈청 농도는 ADVIA 1650(Bayer, Tarrytown, NY, USA)를 통해 0.001-31 mg/dL 범위의 CRP를 검출할 수 있는 high-sensitivity CRP-Latex(II) X2 kit(Seiken Laboratories Ltd., Tokyo, Japan)을 이용하여 측정하였다.

소변 8- epi -프로스타글란딘 F ₂ 및 혈장 말론디알데히드

소변 8-epi-프로스타글란딘 F_2a를 조사하기 위하여 12시간 금식 후 소변을 1% 부틸화된 하이드록시톨루엔을 함유하는 폴리에틸렌 튜브에 수집하였다. 튜브를 즉시 알루미늄 호일로 감싸고 분석 전까지 -70℃에서 보관하였다. 8-epi-프로스타글란딘 F₂는 효소 면역분석기(BIOXYTECH Uurinary 8-epi-PGF₂ ^TM Assay Kit, OXIS International Inc., Portland, OR, USA)를 이용하여 측정하였으며, 얻어진 색깔반응은 Wallac Victor² 다중표지 계측기를 이용하여 650 nm 에서 측정하였다. 소변 크레아틴은 알칼린 피크르산화(Jeffe) 반응을 이용하여 측정하였다. 소변 8-epi-PGF₂ 농도는 pmol/mmol creatinine으로 표현하였다. 혈장 말론디알데히드(Plasma malondialdehyde, MDA)는 Buckingum(19)의 방법에 따라 형광측정법으로 분석하였다.

혈청 인지질 내의 지방산 조성

혈청 인지질 내의 지방산 조성을 기체 크로마토그래피(Hewlett Packard 5890A, CA, USA)를 이용하여 Folch 등(20) 및 Lepage 등(21)의 방법을 변형한 방법을 통하여 분석하였다. Chemstation 소프트웨어를 사용하여, 증가한 지방산을 100%로 설정함으로써 개개의 지방산들을 상대적 백분율로 계산하였다. D5D(delta-5-desaturase) 활성을 DGLA (dihomo-γ-linolenic acid, 20:3ω6)에 대한 아라키돈산(AA, 20:4ω6)의 비율로 나타내었고, D6D(delta-6-desaturase) 활성을 리놀레인산(LA, 18:2ω6)에 대한 γ-리놀레인산(GLA, 18:3ω6)의 비율로 나타내었다.

식이섭취 /육체활동 수준의 측정

24시간 회상방법 및 반정량적 음식빈도 설문(semi-quantitative food frequency questionnaire, SQFFQ)을 모두 이용하여 조사 대상자들의 일반적인 식이 정보를 얻었다(22). 본 발명자들은 먼저 분석을 수행하고 이후에 24시간 회상방법으로 수집한 데이터가 일반적인 식이 패턴을 반영하는지를 조사하였다. 모든 대상자들은 3일간(주중 2일 및 주말 1일) 식이 기록을 하는 동안 공인된 영양사의 구두 또는 서면 지시를 받았다. 3일간의 기록에서 식이의 에너지 값 및 영양소 함량은 Computer Aided Nutritional 분석 프로그램(CAN-pro 2.0, Korean Nutrition Society, Seoul, Korea)을 이용하여 계산하였다.

총 에너지 소모(TEE)(kcal/day)를 24시간 동안의 기초대사율 및 신체활동을 포함하는 활동 패턴과, 음식의 특이 동적 대사량을 이용하여 계산하였다. 각각의 대상자들에 대한 기초 대사율은 Harris-Benedict 등식으로 계산하였다(24).

통계적 분석

통계적 분석은 SPSS version 12.0 for Windows (SPSS, Chicago, IL, USA)를 이용하여 수행하였다. HWE(Hardy-Weinberg Equilibrium) 및 연관불균형 검사는 Haploviewver 4.1(Broad Inst, MA, USA)를 이용하여 수행하였다. 관상동맥질환과 유전자형간의 관련은 카이제곱 검정(chi-square test) 또는 혼동요인을 보정한 지수적 회귀 모델의 교차비(odds ratio, OR)를 이용하여 계산하였다. Student t-검정(독립 t-test)을 이용하여 두 그룹 간의 파라미터를 비교하였다. 본페로니(Bonferroni) 방법을 이용한 변수의 일원배치 분석(one-way analysis)(ANOVA)을 이용하여 유전자형 그룹간의 차이점을 비교하였다. 일반 선형모델(General linear model, GLM) 분석 또한 혼동요인 보정 후의 비교에 이용되었다.

각각의 변수가 정상적인 분포인지 여부를 Kolmogorov-Smirnov 테스트를 이용하여 검사하였으며, 왜곡된 변수들은 통계적 분석을 위하여 대수적으로(logarithmically) 변형하였다. 빈도는 카이제곱 검정을 이용하여 검사하였다. Pearson 상관계수를 이용하여 변수간의 관계를 조사하였다. 평균값은 변환되지도 보정되지도 않은 값으로 제시하였다. 결과는 평균±표준오차로 표현하였으며, 양측 검정값(two-tailed value)이 P<0.05 이면 통계적 유의성을 가지는 것으로 간주한다.

실험결과

대조군과 관상동맥질환 환자의 특징

대조군 대상자 및 관상동맥질환 환자들의 일반적인 특징은 표 1에 나타내었다. 관상동맥질환 환자들은 대조군들보다 더 연령이 높고(P=0.032) 체중이 많았다(P<0.001). 관상동맥질환 환자들은 대조군들과 다른 흡연(20.6% vs. 24.4%; P=0.070) 및 음주 비율(55.4% vs. 63.9%; P<0.001)을 보였다. 지질저하제(lipid-lowering drugs, LLD)(64.4% vs. 0%, 각각 환자 및 대조군 P<0.001), 항고혈압제(89.8% vs. 6% P<0.001), 및 항혈전제(91.7% vs. 2% P<0.001)가 대조군보다 환자군에서 더 많이 사용되고 있었다. 수축 혈압은 대조군보다 관상동맥질환 환자들에서 더 높았다. 연령, 체질량지수, 흡연여부, 음주여부, 수축 및 확장 혈압을 보정하기 전과 보정한 후 모두 관상동맥질환 환자들은 총 콜레스테롤, LDL　콜레스테롤, HDL 콜레스테롤 및 산화 LDL 콜레스테롤이 더 낮았고, 글루코스, 중성지방, 말론디알데하이드, 8-epi-PGF_{2 α} 및 CRP가 더 높았으며 LDL 입자크기가 더 작았다. 연령, 체질량지수, 흡연여부, 음주여부, 수축 및 확장 혈압을 보정한 후에 관상동맥질환 환자들은 대조군 대상자들에 비해 혈청 인지질의 리놀레인산(18:2ω6) 및 에이코사디에노산(20:2ω6)의 비율이 더 낮았고, DGLA(dihomo-γ-linolenic acid, 20:3ω6), 아라키돈산(AA, 20:4ω6), α-리놀레인산(ALA, 18:3ω3) 및 아이코사펜타엔산(EPA, 20:5ω3)의 비율이 더 높았다(표 1). 본 발명자들은 관상동맥질환 환자들을 LLD를 처리하지 않은 환자들(n=269)과 처리한 환자들(n=487)의 2개의 서브그룹으로 나누었다. LLD를 처리하지 않은 환자들은 LLD를 처리한 환자들에 비해 총 콜레스테롤(183.3±2 vs. 157.4±2 mg/dl; P<0.001) 및 LDL-콜레스테롤(107.2±2 vs. 82.4±2 mg/dl; P<0.001)의 농도가 더 높았다. HDL-콜레스테롤, 중성지방, LDL 입자크기, 8-epi-PGF_{2 α}, MDA 및 CRP에 있어서 LLD를 처리하지 않은 환자들과 LLD를 처리한 환자들간의 유의한 차이는 없었다.

대조군 및 관상동맥질환 환자들의 인체측정학 및 생화학적 파라미터

	대조군 (n=890)	관상동백질환 환자 (n=756)	P-값	P1
남성/여성 (%)	81.2/18.8	83.5/16.5	0.238	-
연령 (yr)	56.5±0.21	57.3±0.32	0.032	-
체질량지수(kg/m2)	23.7±0.07	25.2±0.11	<0.001	-
혈압(mm Hg)
수축	123.5±0.51	127.4±0.62	<0.001	-
확장	78.3±0.35	77.4±0.36	0.081	-
공복혈당 (mg/dL)∮	86.7±0.27	89.7±0.56	<0.001	0.015
중성지방 (mg/dL)∮	128.1±2.53	152.6±3.33	<0.001	<0.001
총 콜레스테롤 (mg/dL)	194.9±1.11	166.6±1.42	<0.001	<0.001
LDL 콜레스테롤 (mg/dL)	118.3±1.04	91.2±1.29	<0.001	<0.001
HDL 콜레스테롤 (mg/dL)∮	51.5±0.48	45.5±0.40	<0.001	<0.001
LDL 입자크기 (nm)	23.78±0.03	23.45±0.03	<0.001	<0.001
말론디알데하이드 (nmol/mL)∮	9.19±0.11	10.7±0.19	<0.001	<0.001
hs-CRP (mg/dL)∮	1.30±0.11	2.12±0.16	<0.001	<0.001
8-epi-PGF 2a (pg/mg creatinine)∮	1266.6±22.0	1414.7±28.4	0.001	0.002
산화 LDL(u/l)∮	64.2±0.93	59.5±0.92	<0.001	<0.001
혈청 인지질 내 FA 조성(%)
총 포화지방산 FA	54.6±0.29	53.8±0.24	0.034	0.068
총 단일불포화 지방산∮	11.2±0.12	11.2±0.10	0.853	0.279
총 불포화 ω-6 지방산	20.3±0.25	20.7±0.21	0.336	0.755
18:2 (ω-6)	12.9±0.17	12.2±0.14	0.001	0.002
18:3 (ω-6)∮	0.29±0.02	0.26±0.01	0.021	0.305
20:2 (ω-6)∮	0.60±0.07	0.36±0.01	<0.001	<0.001
20:3 (ω-6)	1.54±0.03	1.87±0.03	<0.001	<0.001
20:4 (ω-6)	4.61±0.09	5.74±0.10	<0.001	<0.001
총 불포화 ω-3 지방산	5.26±0.13	5.55±0.13	0.130	0.295
18:3 (ω-3)∮	0.15±0.01	0.18±0.01	0.001	0.043
20:3 (ω-3)∮	0.09±0.01	0.09±0.01	0.230	0.647
EPA∮	1.26±0.04	1.46±0.05	0.009	0.026
DPA∮	0.58±0.01	0.60±0.01	0.157	0.583
DHA∮	3.18±0.08	3.23±0.07	0.184	0.274

각 값들은 평균±표준오차로 나타내었다; ^∮로그 변환을 통하여 검사함.

P값은 독립 t-검정에 의해 통하여 측정하였다.

P1: 연령, 체질량지수, 흡연, 음주, BPS 및 BPD를 보정한 값.

EPA: Eicosapentaenoic acid, DPA: Docosapentaenoic acid, DHA: Docosahexaenoic acid

rs174537G >T, rs174575C >G, rs2727270C >T 및 rs1000778C >T 유전자형의 분포

유전자형의 분포는 환자와 대조군 각각에서 뿐만 아니라 전체 대상자들에 있어서도 Hardy-Weinberg 평형을 이루었다. SNP rs174575C>G (FADS2), SNP rs2727270C>T (FADS2) 및 rs1000778C>T (FADS3)의 유전자형과 대립인자의 빈도는 대조군과 관상동맥질환 환자 간에 유의한 차이를 보이지 않았다(표 2). 4개의 SNP 중에서, FADS1 부근의 rs174537G>T (FEN1)만이 대조군과 관상동맥질환 환자 간에 유전자형 분포(P=0.069) 및 대립인자 빈도(P=0.063)의 차이를 보였다(표 2).

연령, 체질량지수, 흡연여부, 음주여부, 수축 및 확장 혈압을 보정한 후에, SNP rs174537G>T의 소수 T 대립인자 빈도는 대조군(0.323 P=0.032)과 비교했을 때 관상동맥질환 환자(0.293)들에 있어서 유의하게 낮았다(표 3). rs174537G>T SNP (FEN1)의 소수 T 대립인자의 존재는 관상동맥질환의 낮은 위험도와 연관되어 있다[OR 0.80 (95% CI 0.66-0.97), P=0.023] (표 3). 연령, 체질량지수, 흡연여부, 음주여부, 수축 및 확장 혈압을 보정한 후에도 유의한 연관성은 유지되었다[OR 0.77 (95% CI 0.63-0.95), P=0.015].

관상동맥질환 환자들의 FEN1 rs174537G>T에 따른 보정된 교차비(Odds ratio, OR)

	보정전 교차(95%CI†)	P 값	보정후 교차비(95%CI†)	P 값
FEN1 rs174537 (G>T)
G≠ vs. T	0.868 (0.75-1.01)	0.063	0.840 (0.72-0.99)	0.032
G/G+G/T≠ vs. T/T	0.954 (0.69-1.33)	0.781	0.913 (0.64-1.31)	0.617
G/G≠ vs. G/T+T/T	0.799 (0.66-0.97)	0.023	0.771 (0.63-0.95)	0.015

교차비는 연령, 체질량지수, 흡연여부, 음주 여부, 수축혈압 및 확장혈압을 보정한 후 지수적 회귀모델을 이용하여 계산하였다

†신뢰구간, ≠ Indicated reference,

SNP rs174537G>T 및 SNP rs174575C>G는 연관불균형 검정을 통해 매우 연관성이 높음이 밝혀졌다(D´=0.965; P<0.001); 그러나, r² 값은 크게 높지 않았다(r²=0.186). SNP rs174537G>T 및 SNP rs2727270C>T 역시 연관불균형 검정을 통해 매우 연관성이 높고(D´=0.985; P<0.001), 크게 관련되어있음이 밝혀졌으나(r²=0.675), 이들은 동일한 블록(block)에 있지 않았다.

SNP rs174575C>G 및 SNP rs2727270C>T 사이에(D´=0.748; P<0.001), 또한 SNP rs1000778C>T 및 다른 3개의 SNP 사이에 LD 값이 낮았다. SNP 1000778C>T가 관상동맥 질환의 위험도와 아무런 연관을 보이지 않았으며, 혈청 인지질의 ω6 지방산을 포함하는 rs1000778C>T 유전자형-관련 표현형이 대조군과 관상동맥질환 환자들 간에 유의한 차이를 보이지 않았기 때문에, 본 발명자들은 rs1000778C>T 다형성에 대한 추가 분석을 실시하였다.

rs174537G>T SNP, rs174575C>G SNP 및 rs2727270C>T SNP에 대한 하플로타입(Haplotype) 분석을 실시한 결과, rs174537G>T의 G/G 유전자형을 가진 대조군들은 두 명을 제외하고 모두 rs174545C>G 및 rs2727270C>T SNP의 야생형 동형접합체를 가지고 있었다. 따라서, rs174537-rs174575 또는 rs174537-rs27272720의 GC/GC 하플로타입 빈도, rs174545-rs2727270의 CC/CC 하플로타입 빈도 또는 rs174537-rs174575-rs2727270의 GCC/GCC 하플로타입 빈도는 rs174537G>T SNP의 G/G 유전자형의 빈도와 매우 유사하였다(표 2). rs174537-rs174575, rs174537-rs27272720, rs174545-rs2727270 또는 rs174537-rs174575-rs2727270의 하플로타입 분포는 대조군과 관상동맥질환 환자군 간에 차이가 나는 경향을 보였다(표 2). 하플로타입 분석은 각각의 SNP에 의해 알 수 있는 정보 이상을 제공하지는 않으므로, 본 발명자들은 각각의 SNP에 대한 결과를 도출하였다.

rs174537G>T, rs174575C>G 및 rs2727270C>T 유전자형에 따른 지질 프로파일, LDL 입자크기 및 지질 과산화물

대조군 및 관상동맥질환 환자군의 임상적 특성을 rs174537G>T, rs174575C>G 및 rs2727270C>T SNP의 유전자형에 따라 분석하였다. 대조군과 관상동맥질환 환자들 모두에서 SNP의 유전자형에 따른 연령, 체질량지수, 수축 및 확장 혈압, 혈청 내 HDL-콜레스테롤, 중성지방, CRP 및 공복혈당 농도, 총 에너지 섭취, 주영양소로부터 얻는 에너지 비율의 유의한 차이는 없었다. 대조군에서, rs174537G>T의 희귀 T 대립인자는 G/G 유전자형을 가진 사람보다 훨씬 더 낮은 총 콜레스테롤(P=0.006) 및 LDL 콜레스테롤(P=0.006)을 가진다(표 4). 비록 관상동맥질환 환자들에서는 이러한 연관성이 관찰되지 않았지만, rs174537T 대립인자를 가진 관상동맥질환 환자들은 G/G 유전자형을 가진 사람들보다 더 큰 LDL 입자크기를 가진다(P=0.015). 유사하게, rs174575C>G SNP의 희귀 G 대립인자를 가진 대조군들은 C/C 유전자형을 가진 사람보다 더 낮은 농도의 총 콜레스테롤(P=0.019), LDL 콜레스테롤(P=0.006) 및 산화-LDL(P=0.021)을 가진다. 나아가, rs2727270C>T의 희귀 T 대립인자를 가진 사람들은 T/T 유전자형에 비하여 대조군에서는 더 낮은 MDA(P=0.01)를, 관상동맥질환 환자들에서는 더 큰 LDL 입자 크기(P=0.026)를 가졌다.

rs174537G >T, rs174575C >G 및 rs2727270C >T의 혈청 인지질의 지방산 조성

본 발명자들은 rs174537G>T, rs174575C>G 및 rs2727270C>T의 유전자형이 혈청 인지질의 지방산 조성에 미치는 영향을 조사하였다(표 4). 대조군에 있어서, rs174537 T 대립인자를 가지는 사람들은 G/G 유전자형에 비하여 혈청 인지질 내에 매우 높은 비율의 리놀레인산(LA, 18:2ω6, P=0.003)과 낮은 아라키돈산(AA, 20:4ω6, P=6.6X10^-6)을 가졌다. 유사하게, rs174537T 대립인자를 가지는 관상동맥질환 환자들은 더 높은 리놀레인산(P=1.6X10^-5) 및 α-리놀레인산(ALA, 18:3ω3, P=0.019)와, 더 낮은 아라키돈산(P=1.5X10^-4)을 가진다. 결과적으로, rs174537G>T의 소수 변형을 가지는 사람들은 대조군 및 관상동맥질환 환자들 모두에서 더 높은 AA/DGLA 및 AA/LA 비율을 가진다. rs174575C>G SNP에 있어서, 대조군 그룹의 G 대립인자 보유자는 C/C 유전자형을 가진 사람들에 비하여 더 낮은 아라키돈산(P=0.017) 및 AA/LA 비율을 보였으며, 관상동맥질환 환자들에서의 G 대립인자 보유자는 C/C 유전자형을 가진 사람들에 비하여 더 높은 리놀레인산(P=6.0X10^-5)과 α-리놀레인산(P=0.025) 및 더 낮은 아라키돈산(P=0.021) 및 AA/LA 비율을 가졌다.

rs2727270C>T SNP에 있어서, 대조군 그룹의 T 대립인자 보유자는 C/C 유전자형을 가진 사람들에 비하여 더 높은 리놀레인산(P=4.9X10^-5) 및 더 낮은 아라키돈산(P=0.003), AA/DGLA 및 AA/LA 비율을 가졌고, 관상동맥질환 환자들에서의 T 대립인자 보유자는 C/C 유전자형을 가진 사람들에 비하여 더 높은 리놀레인산(P=2.9X10^-4) 및 DGLA(20:3ω6, P=0.039)와, 더 낮은 아라키돈산(P=0.002) 및 AA/LA 비율을 가진다.

혈청 인지질 내의 아라키돈산 비율과 LDL-콜레스테롤, 지질과산화물 및 리놀레인산과의 관계

Pearson 상관 분석에 의하여, 본 발명자들은 혈청 인지질 내의 아라키돈산 비율이 대조군에 있어서 LDL-콜레스테롤(r=0.189, P<0.001), 산화 LDL(r=0.256, P<0.001), MDA(r=0.175, P<0.01) 및 8-epi-PGF_2α(r=0.153, P<0.01)와 양의 상관관계가 있다는 사실을 발견하였다. 그러나, 관상동맥질환 환자들에 있어서, 혈청 인지질의 아라키돈산 비율은 LDL-콜레스테롤(r=-0.212, P<0.001) 및 산화 LDL(r=-0.133, P<0.05)과 음의 상관관계가 있었으며, 8-epi-PGF_2α(r=0.148, P<0.01)와 양의 상관관계가 있었다. 소변 내의 8-epi-PGF_2α 농도는 CRP와 대조군(r=0.154, P<0.001) 및 관상동맥질환 환자들(r=0.100, P<0.01) 모두에서 양의 상관관계에 있었다. 나아가, 아라키돈산의 비율은 혈청 인지질 내의 리놀레인산과 대조군(r=0.545, P<0.001) 및 관상동맥질환 환자(r=0.222, P<0.001) 모두에서 양의 상관관계를 보였다(도 1). 혈청 인지질의 지방산 조성에 있어서, 리놀레인산은 다중불포화지방산 섭취와 대조군(r=0.152, P<0.01) 및 관상동맥질환 환자(r=0.139, P<0.01) 모두에서 양의 상관관계를 가졌다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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<110> Industry-Academic cooperation foundation Yonsei University <120> Single Nucleotide Polymorphisms Implicated in Cardiovascular Diseases and Use Thereof <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 806 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tggccacctc ttctgggaga actggatggt gagctcctcc ctggccaggt aaccggaagt 60 tatgactgtc cctggggctg atggaccccc agtttcttct tgagcctaag aggccatggg 120 agaagacgct caggacaaat gaagggaagt agtgattatt ttttcttgcc cattcatgtg 180 tttactcaga aaatattgat tggggcccca tctgtcccag gccctgtgct gggtgggcct 240 agctgcaggg gagagaggtg gagtagacac aggttttgac ttccaagaac gtactctata 300 gtgagggaga aaagacgtgc agaaagcacc tgcaacagag gtgggggtgc ttctgaggga 360 ggcccgagcc ctgtcgccct gcagaagaga cagkgtccaa gacagaggga gagcccagct 420 agacacacag cagacatggt gctcgggcct gaaaccacat cacagacgca cagccaaagc 480 ctcaggtaga tgggcaagct gcctgcagcc aggctgcatg ccaccctgtg agggagacag 540 ccagacagac ctgggtttga atcccagctg tgtgattttg ccacactgtg tgatttttag 600 gaagtggctc agtttcctca tccagaagat ggggctagta gcagcactgt gtcactggat 660 tgtactgagg atggggctaa tgaaatactt tgatgtgccc agagcatagt gggtgaggga 720 acccagcaca acaggactgg gaaggaggca ggggccaggt ggaggtggct gtggacctgc 780 cagtcccggg cacggtctgc atggag 806

Claims (14)

1. FEN 1(flapstructure specific endonuclease 1) 유전자 상의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 394번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs 174537)를 포함하는 10-100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 심혈관 질환(cardiovascular disease) 진단용 키트.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 T 대립인자는 TT 동형접합체(homozygote)인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 단일염기다형성 부위를 가진 개체는 감소된 심혈관 질환의 위험도를 가지는 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
   
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 관상동맥 질환(coronary artery disease)인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 관상동맥질환은 심근경색, 협심증, 다른 만성 관상동맥질환, 아테롬성 동맥경화증, 급성 관상동맥 증후군(예컨대, 불안정협심증, NSTEMI(non-ST-elevation myocardial infarction) 또는 STEMI(ST-elevation myocardial infarction) 또는 PAOD(peripheral arterial occlusive disease)인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 단일염기다형성 부위를 가진 개체는 감소된 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 말론디알데하이드, 산화 LDL 및 아라키돈산 농도를 가지며, 증가된 리놀레산(18:2ω6) 농도를 가지는 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 단일염기다형성 부위를 가진 개체는 증가된 LDL 입자 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 아시아인에게 적용되는 것을 특징으로 하는 분석용 키트.
   
9. 심혈관 질환의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 FEN 1(flapstructure specific endonuclease 1) 유전자 상의 단일염기다형성(SNP) 부위로서 서열목록 제1서열의 394번째 뉴클레오타이드 위치에 T를 가지는 단일염기다형성 부위(GenBank SNP 데이터베이스, rs 174537)를 검출하는 단계를 포함하는 심혈관 질환의 네거티브 마커를 검출하는 방법.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 마커가 검출된 경우 상기 인간은 감소된 심혈관 질환 위험도를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 제 9 항 또는 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 관상동맥 질환(coronary artery disease)인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
    
12. 제 11 항에 있어서, 상기 관상동맥질환은 심근경색, 협심증, 다른 만성 관상동맥질환, 아테롬성 동맥경화증, 급성 관상동맥 증후군(예컨대, 불안정협심증, NSTEMI(non-ST-elevation myocardial infarction) 또는 STEMI(ST-elevation myocardial infarction) 또는 PAOD(peripheral arterial occlusive disease)인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
    
13. 제 9 항에 있어서, 상기 단일염기다형성(SNP) 부위를 검출하는 단계는 마이크로어레이 방식 또는 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
14. 제 9 항에 있어서, 상기 방법은 아시아인에게 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.

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