KR20120006923A - 암 치료 또는 예방용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물, 이를 유효성분으로 함유하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물, 및 화학식 I의 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
[화학식 I]
Figure pat00019

(식 중, 치환기 R은 C2H5 또는 C2H3임).

Description

암 치료 또는 예방용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING CANCER}
본 발명은 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물, 이를 유효성분으로 함유하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물, 및 상기 화학식 I의 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 점점 더 증가되고 있는 심각한 질병 중의 하나이다. 암은 비정상 세포의 조절되지 않는 성장 및 확산을 특징으로 가지며, 신체의 모든 기관 및 조직에 부작용을 미칠 수 있고, 종종 죽음에까지 이르게 한다. 암의 개시 및 진행에는 다수의 인자들이 역할을 하며, 이는 암의 치료를 어렵게 하는 요인 중의 하나이다. 또한, 어린이들 사이에서 암의 발병률이 최근에 증가되고 있다. 미국에서 암은 2007년 약 1,444,000개의 새로운 케이스가 진단되고 있으며, 여기에는 방광을 제외한 임의의 부위의 비침투성암이 포함되어 있지 않으며, 기저 및 편평상피세포 피부암이 포함되어 있지 않다.
암의 분자상 진단은 정상세포보다 암세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 항원 또는 단백질인 바이오마커 분자이거나 또는 신규 합성된 바이오마커 분자에 의존한다. 이러한 바이오마커들은 종양세포에 의해 직접 제조되거나 또는 암의 존재에 반응하는 신체에 의해 제조될 수 있다. 환자의 샘플에서 바이오마커의 탐지는 암 진단에서 중요한 단계로서 주어질 수 있으며, 또한 암의 초기 단계에서 암을 검진해낼 수 있는 능력은 암환자의 생존률을 증가시킬 수 있게 해준다. 현재, 암치료를 위해 이용되는 많은 유형의 항암제가 있으며, 이는 여러 개의 다양한 카테고리로 분류된다. 가장 많이 사용되는 항암제의 카테고리 분류 및 그의 예 중 하나는 하기와 같다.
(1) DNA 손상제: 독소루비신은 인접 뉴클레오티드로 삽입되어 RNA와 DNA 합성을 차단하는 작용을 하는 안트라시클린 항생물질이다. 이러한 작용을 달성하기 위하여, 독소루비신은 DNA와 약물간의 강한 상호작용을 형성시키며, 또한 DNA 합성에 필수적인 효소 토포이소머라제 II를 억제한다. 독소루비신의 물질대사는 지질막의 과산화를 야기하는 자유 산소 라디칼을 생성하며, 칼슘은 심장조직으로부터 배출되는데, 이는 심근독성을 야기한다. 독소루비신의 주요한 임상 문제점은 약물 내성이다. 이러한 부작용에도 불구하고, 독소루비신은 광범위한 암에 사용되고 있으며 가장 널리 사용되는 안트라시클린이다.
(2) 알킬화제: 시클로포스파미드는 가장 흔하게 사용되는 알킬화제이다. 시토크롬 P-450 작용을 통해, 시클로포스파미드는 히드록실화 중간체로 변환되어 활성 포스포르아미드 머스타드 및 아크롤레인을 형성한다. 포스포르아미드 머스타드는 사슬내/사슬간 DNA 가교결합을 야기하며, 이는 광범위한 암세포의 세포사멸을 가져온다. 시클로포스파미드는 발암성을 갖고 있기 때문에, 이는 다른 암이 진행되는 위험을 증가시키며 면역계를 억제한다.
(3) 미세소관 억제제(MI): MI는 방추 미세소관 역학을 방해하며, 세포주기의 저지 및 세포자멸을 야기한다. 탁산류(파클리탁셀 및 도세탁셀)는 미세소관 중합제제이며, 빈카 알칼로이드는 미세소관 탈중합제제이다. 탁산류는 유방암 치료에 가장 활성제이다. 파클리탁셀은 β-튜블린에 결합하며, 미세소관 중합 및 안정성을 야기하며, 중기에서 후기로의 진행을 억제하며 세포자멸을 유도한다. 도세탁셀은 2세대 탁산이며, 파클리탁셀과 동일한 결합 부위를 가지며 친화도가 더 높다. 도세탁셀은 파클리탁셀보다 세포독성이 2 내지 4배 더 높다는 것이 입증되었다.
(4) 빈카 알칼로이드: 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 포도필로톡신 및 노코다졸은 미세소관 말단에 높은 친화도를 가지고 그에 결합되며, 동원체에 미세소관이 부착되는 것을 방해한다. 이는 미세소관 접합의 억제를 야기하며, 미세소관을 불안정하게 하며, 세포자멸을 유도한다. 이는 탁산류와 결합 부위를 공유하지 않는다. 이러한 MI는 일반적으로 독소루비신, 시클로포스파미드 치료에 대해 보조 치료제로서 사용된다.
(5) 아로마타제 억제제(AI): 아로마타제는 안드로겐을 에스트로겐으로 전환시키며, 이에 따라 국부 에스트로겐 농도가 증가된다. 이는 유방암에 대해 발암 역할을 할 수 있다. 아로마타제 억제제는 아로마타제를 억제하지만 난소에서 에스트로겐을 생성하는 것을 차단하지 않으며, 이는 폐경기 후의 여성에게만 작용한다. 아로마타제 억제제는 심혈관계 및 골에서 에스트로겐의 감소를 야기할 수 있다. 따라서, 심장 문제 및 골다공증이 주요한 부작용으로 나타난다.
(6) 비스테로이드성 호르몬 치료제: 타목시펜은 ER-음성 유방암 환자를 제외하고 골, 자궁 및 콜레스테롤 수준에서 에스트로겐성 효과를 갖는 한편, 유방에서 정상신호전달을 파괴하고 ER α/β에 직접 결합함으로써 항에스트로겐성 효과를 나타내는 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM)로서 작용한다. 자궁에 대한 전에스트로겐 효과는 타목시펜으로 치료된 유방암 환자에게서 자궁암의 진행 가능성을 증가시킨다. 랄록시펜은 차세대의 SERM으로서, 유방과 자궁 모두에서 항에스트로겐 효과를 갖는다. 따라서, 자궁내막의 성장이 자극되지 않는다. 랄록시펜은 2007년에 FDA에서 승인되었으며, 위험 내력이 높은 폐경기 후의 여성에게서 침습성 유방암의 위험 및 골다공증을 예방한다. 랄록시펜은 골 및 심장에서 전에스트로겐 효과를 가지며, 이는 골밀도를 높게 하고 콜레스테롤을 낮춘다.
상기 언급된 치료제 모두는 암세포를 사멸시키며 정상세포도 유사하게 사멸시킨다는 점에서 하나의 공통성을 가진다. 또한, 환자의 삶의 질을 매우 감소시키는 부작용이 존재한다.
최근에 2개의 추가의 유망한 항종양제가 개발되었다. 트라스투주마브(헤르셉틴)은 erbB-2 (her2/neu) 수용체에 결합하도록 특이적으로 설계된 모노클로날 항체이다. 이는 리간드 및 수용체 결합을 방해함으로써 세포외 성장신호를 억제한다. 트라스투주마브는 항체 의존성 세포성 세포독성을 유도할 수 있다. 그러나, 트라스투주마브 내성은 세포질 신호전달의 수준에서 발견되었으며, 페르투주마브와 같은 추가의 모노클로날 항체가 erbB 수용체 신호를 상승적으로 차단하기 위해 필요하다. 유망한 다른 약물은 티로신 키나제 억제제 글리벡(이마티니브 메실레이트)이다. 이마티니브는 다수의 티로신 키나제 효소의 특이적 억제제로서 작용하는 2-페닐아미노피리미딘 유도체이다. 이는 TK 활성 부위를 차지함으로써 기능하며, 활성의 감소를 야기한다. 이마티니브는 abl(아벨슨 원종양유전자), c-kit 및 PDGF-R(혈소판-유도 성장인자 수용체)에서 TK 도메인에 대해 특이적이다. 이마티니브는 bcr-abl의 ATP 결합 부위에 결합하고 단백질의 효소활성을 경쟁적으로 억제함으로써 작용한다. 이마티니브는 bcr-abl에 대해 선택적이며, 또한 상기 언급된 다른 타겟(ckit 및 PDGF-R)을 억제한다. 그러나, 글리벡으로 치료된 환자들에게서는 심장 문제, 빈혈 및 다른 부작용들을 발생시켰다.
따라서, 세포를 사멸시키는 수많은 방법들을 알고 있다고 하더라도, 표적 암세포를 특이적으로 사멸시키면서 부작용 및 세포독성을 매우 감소시키는 항암제의 개발이 여전히 요구되고 있다.
상기에서 알 수 있듯이, 이제까지 개발된 항암제는 항암효과가 우수한 경우 독성이 너무 강하여 신체기능이 약한 어린이, 노약자 또는 말기암 환자에게 적절하지 않다는 문제점이 있으며, 독성이 낮은 경우에는 항암효과가 저하되거나 항암효과를 빠른 시간 내에 나타내지 못하는 문제점이 있다. 또한, 대부분의 종래의 항암제는 혈액 독성, 위장 독성, 신경 독성, 피부 독성, 탈모, 불임 등의 부작용을 수반한다. 뿐만 아니라, 종래의 항암제는 암세포와 정상세포를 구분하지 못함에 따라 암세포 외에 정상세포까지도 파괴시킨다. 특히, 파클리탁셀은 전세계적으로 널리 사용되고 있는 항암제 중 하나이지만, 이는 난용성 물질로서 증류수에 거의 분산되지 않기 때문에 주사제로 사용하기 위해서는 또다른 물질을 혼합하여 사용하여야 하며, 임상적으로 이러한 물질의 과량 투여는 심장독성과 과민반응을 발생시키는 것으로 보고되고 있다.
본 발명의 목적은 종래의 항암제의 문제점을 해결하기 위하여, 암세포와 같은 이상 증식된 변이 세포만을 제거하고, 오히려 정상세포를 활성화시키고 손상된 정상세포를 복구시킬 수 있으며, 독성이 없고, 말기암 환자와 같은 신체기능이 약한 인간에게도 적합하게 적용할 수 있으며, 온화한 조건에서 제조가 가능하며, 기존의 유기용매를 사용하는 제조방법에 비해 훨씬 안전하고 친수성 약물로서 주사제 및 경구 모두로 이용할 수 있으며, 약의 효과가 나타나는 속도가 매우 빠른 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 하기 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물에 관한 것이다:
[화학식 I]
Figure pat00001
(식 중, 치환기 R은 C2H5 또는 C2H3임).
또한, 본 발명은 상기 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물을 유효성분으로 함유하는 암 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 암에는 유방암, 전립선암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 대장암, 골육종, 뇌종양, 자궁경부암, 갑상선암 등이 포함될 수 있지만 이에 제한되지 않으며, 본 발명에 따른 조성물은 모든 암의 종류에 효과가 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물과 함께 약학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있으며, 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물의 유효성을 감소시키지 않는 한 다른 성분들을 추가로 함유할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 당업계에 이미 잘 알려져 있으며, 당업자라면 특정 투여 경로에 적합한 담체를 용이하게 선택할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 정제수 1ml 당 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물이 0.3mg 이상 포함되며, 본 발명에서 달성하고자 하는 효과를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 1회 50ml~500ml의 양으로 체내에 투여 가능하며, 투여간격은 1일 1회 내지 12회일 수 있으며, 1일 12회 투여할 경우에는 2시간마다 1회씩 투여할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 흉막내, 소포내 또는 포막내), 국소, 경구, 직장 또는 비강 경로로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량 및 투여간격은 치료대상인 암의 유형, 환자의 연령, 환자의 체중과 같은 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 화학식 I의 화합물의 제조방법에 관한 것이다:
a) (i) 2-메틸부티르산, 및 (ii) 악티게닌-4-O-글루코시드, 3,5,7,9-테트라인 또는 알라닌을 2:1의 비율로 반응시키는 단계,
b) 3:1의 비율로 혼합한 (i) 구리 및 (ii) 루테올린-7-람노글루코시드, 사포닌, 피넨, 트랜스-게라니올, 리나롤(linalol) 또는 클로로겐산을 상기 a) 단계에서 수득한 생성물과 반응시키는 단계,
c) 1:1의 비율로 혼합한 (i) 비텍시카르핀 또는 헤스페리딘, 및 (ii) 3'-히드록시포르모노네틴, 캠페롤 또는 물을 상기 b) 단계에서 수득한 생성물과 반응시키는 단계,
d) 상기 c) 단계에서 수득한 생성물에 시니그린을 반응시키는 단계, 및
e) 상기 d) 단계에서 수득한 생성물에 발린을 반응시켜, 화학식 I의 화합물을 생성하는 단계.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 a) 단계의 반응은 80~120℃에서 10~30분 동안 수행되며, 상기 b) 단계의 반응은 120~170℃에서 10분 동안 수행되며, 상기 c) 단계의 반응은 80~120℃에서 5~8분 동안 수행되며, 상기 d) 단계의 반응은 100~140℃에서 5~10분 동안 수행되며, 상기 e) 단계의 반응은 -30~30℃에서 10~20분 동안 수행한 후에, 80~230℃에서 5~30분 동안 수행된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 a) 단계 내지 e) 단계에서 용매는 물(H2O)을 사용한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 e) 단계에서 수득된 화합물을 -5~30℃의 물에 용해하여 여과함으로써 정제한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 e) 단계에서 수득된 화합물을 하기 단계에 따라 정제한다:
(i) 100~150℃의 물에 상기 e) 단계에서 수득된 화합물을 용해하여 여과하는 단계,
(ii) 70~100℃에서 상기 (i) 단계에서 수득된 용액을 여과하는 단계,
(iii) 40~60℃에서 상기 (ii) 단계에서 수득된 용액을 여과하는 단계,
(iv) 15~30℃에서 상기 (iii) 단계에서 수득된 용액을 여과하는 단계,
(v) -1~15℃에서 상기 (iv) 단계에서 수득된 용액을 여과하는 단계, 및
(vi) 상기 (v) 단계에서 수득된 용액을 건조시킨 수득된 고체 화합물을 수득하는 단계.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 e) 단계에서 수득된 화합물을 하기 단계에 따라 정제한다:
(i) 100~150℃의 물에 상기 e) 단계에서 수득된 화합물을 용해하여 여과하는 단계,
(ii) 30~100℃에서 상기 (i) 단계에서 수득된 용액을 여과하는 단계,
(iii) -5~30℃에서 상기 (ii) 단계에서 수득된 용액을 여과하는 단계, 및
(iv) 상기 (iii) 단계에서 수득된 용액을 건조시킨 수득된 고체 화합물을 수득하는 단계.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 여과에 사용된 필터는 공극크기가 10-6m 이하이다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 인체 내에 투여시, 신경전달물질을 전체적으로 활성화시키고 비장 기능을 향상시키며 혈액을 정화하는 것으로 나타났다. 즉, 신체의 신경전달물질과 호르몬의 분비를 촉진하고 활성화시키며, 이에 따라 비장 활동이 촉진되고 체열이 내려간다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 인체 내 림프 기능을 전체적으로 향상시키며 비장 내의 림프구와 대식세포를 증식시킴에 따라, 림프와 혈액이 정화되는 것으로 나타났다. 암환자는 전체적으로 신체기능이 저하되어 있거나 합병증을 앓고 있는 경우가 많기 때문에, 독성이 강한 종래의 항암제를 견디는데 어려움이 있으나, 본 발명에 따른 조성물은 독성이 없어 정상세포를 해하지 않고 오히려 환자의 저하된 신체기능을 향상시켜 항암 치료에 유리한 신체 상태를 형성하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 말기암 환자에게도 부작용이나 약물에 의한 쇼크를 발생시키지 않고 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 인체 내에 투여시 암세포가 일시적으로 활동을 멈추고 검은색의 테두리를 갖는 다각형의 모양으로 조직의 구성이 변화하면서 세포가 터져 사멸하는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 골수를 자극하여 NK 및 NKT 세포를 생성하고, 이는 T세포, B세포로 분화되어 혈액이 미치는 모든 범위 내에 있는 암세포를 제거한다는 것이 발견되었다.
본 발명에 따른 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 모든 암을 치료 또는 예방할 수 있는 효과를 나타낸다. 특히, 본 발명에 따른 약학 조성물은 암세포와 정상세포를 구분하지 못하는 종래의 항암제와 달리, 암세포와 같은 이상 증식된 변이 세포만을 타겟으로 하여 제거하면서, 정상세포에는 세포독성이 없고 오히려 정상세포를 활성화시키고 손상된 정상세포를 복구시킨다. 또한, 본 발명에 따른 화학식 I의 화합물은 수용성이기 때문에, 주사제 및 경구제 등의 형태로서 사용이 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 약의 효과가 나타나는 속도가 매우 빠르며, 암 또는 합병증에 의해 약화된 신체기능을 회복시키는 작용을 할 수 있기 때문에, 말기암 환자에 대해 유용성이 매우 높을 뿐만 아니라, 어린이, 노약자에게 투여하는 데에도 적합하다. 더욱이, 본 발명에 따른 약학 조성물은 체내에 잠복해 있는 종양을 제거하고 혈액내 면역세포를 강화하므로, 암백신으로서 작용하여 암의 발병을 예방할 수 있다.
본 명세서에 첨부되어 있는 도면에서, 실험군은 하기의 실시예에서 수득한 화합물 II 및 III를 함유하는 본 발명에 따른 조성물로 처리한 군을 나타내며, 대조군은 하기의 실시예에서 탁솔 또는 시스플라틴으로 처리한 군을 나타내며, 비처리군은 하기의 실시예에서 특정 물질로 처리하지 않은 군을 나타낸다.
도 1은 화학식 II의 화합물의 NMR 데이터를 나타낸다.
도 2는 화학식 III의 화합물의 NMR 데이터를 나타낸다.
도 3은 화학식 III의 화합물의 질량 스펙트럼(Mass Spectrum)을 나타낸다.
도 4는 세포주 HCC 1419에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 5는 세포주 HCC 1419에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 생존도와 제2주(회복기) 동안의 생존도를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 6은 세포주 HCC 1419에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 세포독성과 제2주(회복기) 동안의 세포독성을 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 7은 세포주 HCC 1419에 대해, 실험군, 대조군 및 비처리군을 각각 제1주(LC50)의 48시간째에 올림푸스 IX70 도립현미경(inverted microscope)으로 배율 x200으로 촬영한 사진이다.
도 8은 세포주 HCC 1419에 대해, 실험군, 대조군 및 비처리군을 각각 제1주(LC50)의 4일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이며, 위의 사진은 배율 x40으로 관찰한 것이고, 아래 사진은 배율 x200으로 관찰한 것이다.
도 9는 세포주 HCC 1419에 대해, 실험군, 대조군 및 비처리군을 각각 제1주(LC50)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이며, 위의 사진은 배율 x40으로 관찰한 것이고, 아래 사진은 배율 x200으로 관찰한 것이다.
도 10은 세포주 HCC 1419에 대해, 실험군 및 대조군을 제1주(LC50)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다. 여기서, 실험군은 세포들이 단일 군집을 이루고 있는 반면, 대조군은 세포들이 웰 전체에 퍼져 있다.
도 11은 세포주 MCF-7에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 제1주(LC50)의 세로축은 세포수를, 제2주(회복기)의 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 12는 세포주 MDA-MB-468에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 13은 세포주 SKBR3에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 14는 세포주 SKBR3에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 15는 세포주 SKBR3에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 16은 세포주 SKBR3에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 17은 세포주 SKBR3에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 세포독성을 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 18은 세포주 SKBR3에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 19는 세포주 SKBR3에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제2주(회복기) 동안의 세포독성을 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 20은 세포주 PC3에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 21은 세포주 PC3에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 생존도와 제2주(회복기) 동안의 생존도를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 22는 세포주 PC3에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 세포독성과 제2주(회복기) 동안의 세포독성을 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 23은 세포주 HT1299에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 24는 세포주 HT1299에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 생존도와 제2주(회복기) 동안의 생존도를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 25는 세포주 HT1299에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 세포독성과 제2주(회복기) 동안의 세포독성을 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 26은 세포주 HT1299에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제1주(LC50)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 27은 세포주 HT1299에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 24시간째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 28은 세포주 HT1299에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 4일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 29는 세포주 Saos-2에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 30은 세포주 Saos-2에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 24시간째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 31은 세포주 Saos-2에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 4일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 32는 세포주 Saos-2에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 33은 세포주 C-6에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 34는 세포주 C-6에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 35는 세포주 C-6에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 생존도와 제2주(회복기) 동안의 생존도를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 36은 세포주 C-6에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 세포독성과 제2주(회복기) 동안의 세포독성을 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 37은 세포주 AsPc에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수의 1/20의 값을 나타낸다.
도 38은 세포주 AsPc에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제1주(LC50)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 39는 세포주 AsPc에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 24시간째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 40은 세포주 AsPc에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 4일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 41은 세포주 AsPc에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 42는 세포주 MDA-MB-231에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 43은 세포주 MDA-MB-231에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 44는 세포주 MDA-MB-231에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 45는 세포주 MDA-MB-231에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 46은 세포주 RKO에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 47은 세포주 RKO에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 48은 세포주 RKO에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 49는 세포주 RKO에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 50은 HeLa 세포에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 51은 HeLa 세포에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 52는 HeLa 세포에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 53은 HeLa 세포에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 54는 TT 세포에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 55는 TT 세포에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 56은 TT 세포에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 57은 TT 세포에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 58은 TT 세포에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 59는 TT 세포에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 세포독성을 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 60은 TT 세포에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 61은 TT 세포에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제2주(회복기) 동안의 세포독성을 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 62는 세포주 HME 50 HT에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 63은 세포주 HME 50 HT에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제1주(LC50)의 48시간째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 64는 세포주 HME 50 HT에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제1주(LC50)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 65는 세포주 HME 50 HT에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 0일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 66은 세포주 HME 50 HT에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 67은 세포주 BJ에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수와 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 제1주(LC50)의 세로축은 세포수의 값, 제2주(회복기)의 세로축은 세포수의 1/1000의 값을 나타낸다.
도 68은 세포주 BJ에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 생존도와 제2주(회복기) 동안의 생존도를 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 69는 세포주 BJ에 대해 파장 500nm에서 XTT 분석법을 실시하여, 제1주(LC50) 동안의 세포독성과 제2주(회복기) 동안의 세포독성을 각각 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포독성(%)의 1/100의 값을 나타낸다.
도 70은 세포주 BJ에 대해, 실험군, 대조군 및 비처리군을 각각 제1주(LC50)의 7일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 71은 세포주 BJ에 대해, 실험군 및 대조군을 각각 제2주(회복기)의 4일째에 올림푸스 IX70 도립현미경으로 촬영한 사진이다.
도 72 및 도 73은 세포주 CCD-1074sk에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다. 다만, 도 73의 세로축은 세포수의 5배의 값을 나타낸다.
도 74은 세포주 CCD-1074sk에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제1주(LC50) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 75 및 도 76은 세포주 CCD-1074sk에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 세포수 값을 나타낸다.
도 77은 세포주 CCD-1074sk에 대해 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정한, 제2주(회복기) 동안의 생존도를 도시한 그래프이다. 여기서, 가로축은 배양시간을 나타내며, 세로축은 생존도(%) 값을 나타낸다.
도 78은 누드마우스에 WM-266-4(인간 악성 흑색종)를 투여한 후에 비처리군, 실험군 및 대조군의 시간 경과에 따른 종양의 크기를 비교한 그래프이다.
도 79는 암수 Sprague-Dawley 래트에 본 발명에 따른 조성물을 투여한 후 시간 경과에 따른 체중(g)의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 80은 누드마우스에서 본 발명에 따른 조성물이 투여된 이후에 나타나는 발모 현상을 촬영한 사진이다.
도 81에서, 상단 2개의 사진은 HME 50 HT 정상 세포주에 대해 각각 실험군 및 대조군을 제1주(LC50)의 4일째에 촬영한 사진이며, 하단 2개의 사진은 BJ 정상 세포주에 대해 각각 실험군 및 대조군을 제1주(LC50)의 4일째에 촬영한 사진이다.
도 82에서, 상단 2개의 사진은 HT1299 암 세포주에 대해 각각 실험군 및 대조군을 제1주(LC50)의 7일째에 촬영한 사진이며, 하단 2개의 사진은 AsPc 암 세포주에 대해 각각 실험군 및 대조군을 제2주(회복기)의 48시간째에 촬영한 사진이다.
이하, 본 발명에 따른 화학식 I의 화합물의 제조방법 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물의 효과에 대해 실시예 및 도면에 기초하여 설명한다. 다만, 본 발명을 실시예 및 도면에 한정하려는 취지는 아니며, 당업자라면 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형을 통하여 본 발명을 실시할 수 있을 것이다.
실시예 1
2-메틸부티르산 및 알라닌을 2:1의 중량비로 120℃ 및 3.0atm에서 30분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 3:1의 중량비로 혼합된 구리 및 클로로겐산을 첨가한 후, 120~170℃ 및 2.6~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 1:1의 중량비로 혼합된 헤스페리딘 및 물을 첨가한 후, 80~120℃ 및 2.7~3.5atm에서 8분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 시니그린을 첨가한 후, 100℃ 및 2.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 발린을 첨가한 후, -10~30℃ 및 2~7atm에서 10분 동안 반응시키고, 이어서 200~230℃ 및 1atm에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 전체 반응 동안, 용매는 물을 사용하였다.
상기 반응에 따라 수득한 생성물에 대해, 제1정제 방법으로서 상기 생성물을 115~125℃의 물에 용해한 후, 공극크기가 0.2㎛인 25mm 나일론 시린지 필터(VWR사 제조)를 사용하여 여과하였다. 이어서, 75~85℃, 55~65℃, 27~33℃, 2~22℃에서 순차적으로 각각 동일한 필터를 이용하여 여과하였다. 그 후, 상기 여과된 용액을 진공건조시켜 고체 화합물을 수득하였다.
또한, 상기 반응에 따라 수득한 생성물에 대해, 제2정제 방법으로서 상기 생성물을 110~130℃의 물에 용해한 후, 공극크기가 0.2㎛인 25mm 나일론 시린지 필터(VWR사 제조)를 사용하여 여과하였다. 이어서, 70~90℃, 23~27℃에서 순차적으로 각각 동일한 필터를 이용하여 여과하였다. 그 후, 상기 여과된 용액을 진공건조시켜 고체 화합물을 수득하였다.
상기 제1정제 방법 및 제2정제 방법에 따라 수득한 고체 화합물을 분석한 결과, 이는 모두 도 1의 NMR을 나타내었으며, 이로부터 수득된 화합물은 하기 화학식 II를 갖는다는 것이 확인되었다.
[화학식 II]
Figure pat00002

실시예 2
2-메틸부티르산 및 알라닌을 2:1의 중량비로 80~120℃ 및 2.7~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 3:1의 중량비로 혼합된 구리 및 클로로겐산을 첨가한 후, 120~170℃ 및 2.6~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 1:1의 중량비로 혼합된 헤스페리딘 및 물을 첨가한 후, 80~120℃ 및 2.7~3.5atm에서 8분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 시니그린을 첨가한 후, 120~140℃ 및 3.0~5.0atm에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 발린을 첨가한 후, -10~30℃ 및 2~7atm에서 10분 동안 반응시키고, 이어서 80~130℃ 및 2~7atm에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 전체 반응 동안, 용매는 물을 사용하였다.
상기 반응에 따라 수득한 생성물을 실시예 1에서와 동일한 정제 방법 2가지에 따라 각각 정제하였으며, 이에 따라 수득한 고체 화합물을 분석한 결과 이는 모두 도 2의 NMR 및 도 3의 질량 스펙트럼(Mass Spectrum)을 나타내었으며, 이로부터 수득된 화합물은 하기 화학식 III를 갖는다는 것이 확인되었다.
[화학식 III]
Figure pat00003
도 3의 질량 스펙트럼의 m/z=191.2에서 주된 봉우리(화살표로 표시됨)가 나타나는 것이 관찰된다. 이 봉우리는 화학식 III의 화합물에 2개의 물 분자가 수화된 형태를 나타내는 것으로 해석된다.
실시예 3
2-메틸부티르산 및 알라닌을 2:1의 중량비로 80~120℃ 및 2.7~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 3:1의 중량비로 혼합된 구리 및 클로로겐산을 첨가한 후, 120~170℃ 및 2.6~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 1:1의 중량비로 혼합된 헤스페리딘 및 캠페롤을 첨가한 후, 80~120℃ 및 1.3atm에서 8분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 시니그린을 첨가한 후, 120~140℃ 및 3.0~5.0atm에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 발린을 첨가한 후, -10~30℃ 및 2~7atm에서 10분 동안 반응시키고, 이어서 80~130℃ 및 2~7atm에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 전체 반응 동안, 용매는 물을 사용하였다.
상기 반응에 따라 수득한 생성물을 실시예 1에서와 동일한 정제 방법 2가지에 따라 각각 정제하였으며, 이에 따라 수득한 고체 화합물은 모두 화학식 III를 갖는다는 것이 확인되었다.
실시예 4
2-메틸부티르산 및 알라닌을 2:1의 중량비로 80~120℃ 및 2.7~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 3:1의 중량비로 혼합된 구리 및 클로로겐산을 첨가한 후, 120~170℃ 및 2.6~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 1:1의 중량비로 혼합된 헤스페리딘 및 3'-히드록시포르모노네틴을 첨가한 후, 120℃ 및 2.7atm에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 시니그린을 첨가한 후, 120~140℃ 및 3.0~5.0atm에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 발린을 첨가한 후, -10~30℃ 및 2~7atm에서 10분 동안 반응시키고, 이어서 80~130℃ 및 2~7atm에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 전체 반응 동안, 용매는 물을 사용하였다.
상기 반응에 따라 수득한 생성물을 실시예 1에서와 동일한 정제 방법 2가지에 따라 각각 정제하였으며, 이에 따라 수득한 고체 화합물은 모두 화학식 III를 갖는다는 것이 확인되었다.
실시예 5
2-메틸부티르산 및 악티게닌-4-O-글루코시드를 2:1의 중량비로 80~120℃ 및 2.7~3.0atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 3:1의 중량비로 혼합된 구리 및 루테올린-7-람노글루코시드를 첨가한 후, 120~170℃ 및 2.7atm에서 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 1:1의 중량비로 혼합된 비텍시카르핀 및 3'-히드록시포르모노네틴을 첨가한 후, 120℃ 및 2.7atm에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 시니그린을 첨가한 후, 120~140℃ 및 3.0~5.0atm에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 반응에 의해 수득한 생성물에 발린을 첨가한 후, -10~30℃ 및 2~7atm에서 10분 동안 반응시키고, 이어서 80~130℃ 및 2~7atm에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 전체 반응 동안, 용매는 물을 사용하였다.
상기 반응에 따라 수득한 생성물을 실시예 1에서와 동일한 정제 방법 2가지에 따라 각각 정제하였으며, 이에 따라 수득한 고체 화합물은 모두 화학식 III를 갖는다는 것이 확인되었다.
실시예 6 - 시험관내(in vitro) 실험
하기에서, 본 발명에 따른 조성물의 값은 실시예 1에서 수득한 화학식 II의 화합물을 함유하는 본 발명에 따른 조성물로 처리한 군의 값과 실시예 2 내지 5에서 수득한 화학식 III의 화합물을 함유하는 본 발명에 따른 조성물로 처리한 군의 값의 평균값을 기재하였다.
암 세포주에 속하는 HCC 1419, MCF-7, MDA-MB-468, SKBR3, PC3, HT1299, Saos-2, C-6, AsPc, MDA-MB-231, RKO, HeLa 세포 및 TT 세포와 정상 세포주에 속하는 HME 50 HT, BJ 및 CCD-1074sk에 대해, 물질대사(XTT 분석법) 및 세포 사멸(셀 카운트)의 변화 정도를 각각 실험하였다. 각각의 세포주에 대해서는 하기 표 1에 나타낸 배양배지에서 배양하였다.
세포주 배양배지
HCC 1419 DMEM + 10% 소태아혈청
MCF-7 DMEM + 10% 소태아혈청
MDA-MB-468 DMEM + 10% 소태아혈청
SKBR3 McCoy's 5a Medium Modified + 10% 소태아혈청
PC3 Ham's F12K + 10% 소태아혈청
HT1299 DMEM + 10% 소태아혈청
Saos-2 McCoy's 5a Medium Modified + 15% 소태아혈청
C-6 RPMI 1640 + 10% 소태아혈청
AsPc RPMI 1640 + 10% 소태아혈청
HME 50 HT 무혈청 배지(Clonetics Co.회사의 SF-171)
BJ DMEM + 10% 소태아혈청
CCD-1074sk IMDM + 10% 소태아혈청
MDA-MB-231 DMEM + 10% 소태아혈청
RKO EMEM + 10% 소태아혈청
HeLa EMEM + 10% 소태아혈청
TT Ham's F12K + 10% 소태아혈청
상기 표 1에서 DMEM은 Dulbecco's Minimum Essential Medium의 약자이며, IMDM은 Iscove's Modified Dulbecco's Medium의 약자이며, EMEM은 Eagle's Minimum Essential Medium의 약자이다.
정상 세포주에 대해서는 20,000 개의 세포의 밀도로, 암 세포주에 대해서는 10,000-20,000 개의 세포의 밀도로, 48-웰 Corning CellBind™ 플레이트에 세포를 파종하였으며, 파종으로부터 24 내지 48h 후에, 본 발명에 따른 조성물을 4.5e-2M의 농도로 상기 배양 세포에 첨가하였으며, 본 발명에 따른 조성물이 처음 투여된 시간을 0h로 하였다. 본 발명에 따른 조성물이 처음 투여된 때로부터 3일째 되는 날, 세포배양액을 교체하면서 본 발명에 따른 조성물을 동일한 농도로 배양배지에 첨가하였다.
반면, 양성 대조군으로서 탁솔을 파종으로부터 24 내지 48h 후에 2.2e-7M의 농도로 24시간 동안 병행 배양 세포에 첨가하였으며, 음성 대조군으로서 배양배지에 어떠한 물질도 첨가하지 않았다.
세포수 측정(cell count):
각 시점에서 트립신-EDTA를 사용하여 세포들을 채취하였다. 각각의 웰에서 총 세포수를 Beckman-Coulter Z1 Particle Characterization Unit을 사용하여 측정한 경우에는 본 명세서에 첨부된 도면의 그래프에서 세로축이 세포수의 1/20의 값으로 표시되었으며, 총 세포수를 Beckman-Coulter Vi-Cell을 사용하여 측정한 경우에는 세로축이 세포수의 값으로 표시되었다. 세포주에 대해 각각 2개의 48-웰 플레이트를 사용하였으며, 웰 내에서 생존 세포의 세포수를 0h, 12h, 24h, 48h, 4d 및 7d에서 측정하였다. 첫번째 플레이트에서, 세포를 0h 및 3d에서 본 발명에 따른 조성물로 처리하고 배지를 교환하였으며, 탁솔은 24h 동안 처리하였다. 이에 따라 제1주의 LC-50 곡선을 얻었다. 두번째 플레이트에서, LC-50 7d는 회복기 0h와 동일하다. 회복기 0h에서, LC-50 7d의 잔여물에 대해 배지를 비처리 배지로 교환하였다. 비처리군은 제1주 말기에 과잉생산됨으로 인해 회복기에서 측정하지 않았다. 이에 따라 제2주의 회복 곡선을 얻었다.
XTT 세포 생존도 분석(XTT Cell Viability Assay):
XTT 분석은 항암제 또는 다른 약학 화합물의 생존도/세포독성에 대한 분석방법으로 알려져 있다. 정상 세포주에 대해서는 10,000 개의 세포의 밀도로, 암 세포주에 대해서는 5,000 개의 세포의 밀도로, 96-웰 조직 배양 플레이트에 세포를 파종하였다. 배양 기간 동안 형성된 포르마잔(formazan) 염을 ELISA 리더를 이용하여 정량하였다. 최적의 파장으로서 500nm를 사용하였으며, 0h, 12h, 24h, 48h, 4d 및 7d에서 각각 측정하였다. 이에 따라 정량된 값은 소프트웨어 SoftMax Pro 4.8을 이용하여 획득하였다.
XTT 분석에 의한 세포독성(cytotoxicity) 측정:
제조사의 지시에 따른 식을 이용하여 실험군 및 대조군 각각에 대해 하기와 같이 세포 생존도를 계산하였다(블랭크는 배지에 대해서만 XTT로 측정한 값을 나타낸다):
[처리군(본 발명에 따른 조성물 또는 탁솔) - 블랭크]/비처리군 x 100%
세포독성은 제조사의 지시에 따라 하기와 같이 세포독성을 계산하였다:
[비처리군의 흡수값 - (처리군(본 발명에 따른 조성물 또는 탁솔) - 블랭크)]/비처리군 x 100%
상기 기재된 실험방법을 실험군, 대조군, 비처리군 모두에 대해 동일하게 수행하고 측정하였다. 하기에는 개별 세포주에 대해 각각 수득한 값을 구체적으로 나타내었다.
(1) HCC 1419
세포주 HCC 1419는 원발성 유관 상피암 세포주로서, 이 세포는 저분화형이며, Her2-neu 과잉발현, p53을 발현하지 않는다. HCC 1419는 상피세포 특정 마커인 상피 당단백질2(EGP2: epithelial glycoprotein 2)와 시토케라틴 19를 표현하는 반면, 에스트로겐 리셉터 및 프로게스테론 리셉터를 표현하지 않는다.
세포주 HCC 1419에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 4).
0h 12h 24h 48h 4d 7d
실험군 2727 3057 2782 847 451 152
3142 3096 2672 624 404 113
2392 2906 2651 573 227 133
평균값 2754 3020 2702 681 361 133
대조군(탁솔) 2626 3451 3488 3502 2940 1710
3788 3553 2664 3199 2975 1794
3055 3434 2957 2232 1716 1718
평균값 3156 3479 3036 2978 2544 1741
비처리군 2633 2717 6776 6995 25178 15380
2954 5101 6256 5943 23320 10355
평균값 2794 3909 6516 6469 24249 12868
세포주 HCC 1419에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 4).
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 69 57 81 52 32
122 28 14 29 58
89 18 40 107 75
평균값 93 34 45 63 55
대조군(탁솔) 8522 5340 4901 5721 7316
9639 7966 5431 6317 3792
8472 5755 5830 6001 6604
평균값 8878 6354 5387 6013 5904
상기 결과로부터, 실험군에서는 암세포수가 급격히 감소한 후 회복하지 못하였으나, 대조군에서는 암세포수가 감소하다가 더 이상 줄어들지 않고 그 개체수를 유지하고 있음을 알 수 있다.
세포주 HCC 1419에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 5 및 도 6).
Figure pat00004
세포주 HCC 1419에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 5 및 도 6).
Figure pat00005
상기 결과로부터, 실험군에서는 세포 생존도가 0에 가깝고 웰 내에 잔존해있는 암세포수가 거의 없음을 알 수 있다.
또한, HCC 1419 실험에서 다음과 같은 현상이 관찰되었다. 본 발명에 따른 조성물로 처치한 세포는 군집을 이루어 한 장의 종이처럼 뭉쳐 있었으며, 이는 웰에서 떨어진 모두 죽은 세포로서, 세포수측정을 위해 웰을 세척할 경우 모두 씻겨나갔다. 반면, 탁솔을 처치한 세포주는 웰 전체에 퍼져 흩어져 성장하고 있었다. 이는 본 발명에 따른 조성물이 암세포의 전이 성질을 억제한다는 것을 보여준다(도 7 내지 10).
(2) MCF-7
세포주 MCF-7은 유방암 세포주로서, 3-이소폼(isoform)의 에스트로겐 리셉터를 표현하며, 이 에스트로겐 리셉터에 의해 성장이 조절된다.
이 세포주에 대해 제1주에서 본 발명에 따른 조성물로 처리한 군은 탁솔 처리군에 비해 세포사멸의 차이가 크지 않지만, 제2주에는 전체 세포가 모두 죽었고 어떠한 회복도 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 상당한 회복을 나타내고 적은 개체수를 계속해서 유지해 나간 탁솔 처리군과는 대조적이다.
세포주 MCF-7에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 11).
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 45000 68000 120000 2000 0
66000 56000 13000 4000 0
62000 100000 7000 8000 2000
평균값 57667 74667 46667 4667 667
대조군(탁솔) 67000 54000 19000 7000 4000
60000 38000 30000 27000 5000
39000 39000 21000 31000 4000
평균값 55333 43667 23333 21667 4333
비처리군 34000 88000 150000 250000 120000
37000 81000 78000 230000 97000
평균값 35500 84500 114000 240000 108500
세포주 MCF-7에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 11).
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 3181 563 652 325 271
4035 702 461 417 151
2646 517 581 666 234
평균값 3287 594 565 469 219
대조군(탁솔) 1648 807 2010 1892 1693
2087 728 2517 2011 1524
2361 404 1726 2135 2098
평균값 2032 646 2084 2013 1772
(3) MDA-MB-468
세포주 MDA-MB-468은 전이성 선암을 갖는 환자에게서 적출한 조직에서 얻어졌다. 세포당 1x106 개의 EGF 리셉터가 표현된다.
이 세포주의 경우, 웰에 세포가 거의 남아 있지 않으며, 남은 세포들은 매우 스트레스를 받았거나 죽은 것처럼 보인다. 실험군의 결과를 대조군의 결과와 비교할 때, 본 발명에 따른 조성물은 MDA-MB-468 세포주에 부정적인 영향을 끼친 것이 명백한 반면, 탁솔로 처치한 세포주는 점차 회복되고 있음을 알 수 있다. 본 발명에 따른 조성물로 처치한 세포수는 계속해서 감소하고 있는 반면, 탁솔을 처치한 세포수는 증가하고 있다. 본 발명에 따른 조성물이 정상세포에는 어떠한 독성도 보이지 않았다는 사실을 감안할 때, 본 발명에 따른 조성물을 더 장기간 처치하거나 더 고농도로 처치하면 암세포의 사멸에 더 효과적일 것이다.
세포주 MDA-MB-468에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 12).
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 32000 39000 21000 10000 6000
33000 21000 25000 13000 1000
24000 25000 15000 13000
평균값 29667 28333 23000 12667 6667
대조군(탁솔) 32000 30000 12000 18000 7000
40000 16000 17000 20000 3000
24000 10000 15000 17000
평균값 36000 23333 13000 17667 9000
비처리군 38000 45000 61000 82000 23000
30000 39000 78000 60000 47000
평균값 34000 42000 69500 71000 35000
세포주 MDA-MB-468에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 12).
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 17000 16000 20000 20000 4000
23000 8000 10000 18000 9000
13000 9000 20000 4000 15000
평균값 17667 11000 16667 14000 9333
대조군(탁솔) 12000 3000 4000 10000 11000
9000 4000 4000 9000 15000
4000 4000 17000 9000 9000
평균값 8333 3667 8333 9333 11667
상기 결과로부터, 실험군에서는 계속해서 암세포의 수가 감소하였으나, 대조군에서는 제2주에 암세포의 수가 다시 회복되고 있음을 알 수 있다.
(4) SKBR3
세포주 SKBR3은 전이성 흉막 삼출증을 앓는 환자에게서 적출된 유방암 세포주이다.
세포주 SKBR3에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기 표 10에 기재하고, 생존도를 하기 표 11에 기재하였다(도 13 및 14). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 4000 12000 5000 4000 4000
5000 8000 4000 3000 4000
4000 5000 4000 8000 4000
평균값 4333 8333 4333 5000 4000
대조군(탁솔) 2000 11000 4000 1000 1000
4000 11000 4000 1000 4000
2000 6000 4000 1000 4000
평균값 2667 9333 4000 1000 3000
비처리군 7000 7000 4000 6000 12000
3000 6000 6000 9000 27000
평균값 5000 6500 5000 7500 19500
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 100 79 67 100 60
100 78 80 100 50
100 83 40 50 25
평균값 100 80 62 83 45
대조군(탁솔) 100 69 0 0 100
100 69 0 100 50
100 71 50 0 0
평균값 100 70 17 33 50
비처리군 75 63 100 86 86
67 86 88 90 77
평균값 71 75 94 88 82
세포주 SKBR3에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기 표 12에 기재하였다(도 15).
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 67000 22500 30000 8000 2000
80000 25000 32000 4000 4000
72000 20000 22000 8000 1000
평균값 73000 22500 28000 6667 2333
대조군(탁솔) 80000 60000 36000 12500 12000
72000 56000 40000 22000 8000
60000 32000 56000 15000 10000
평균값 70667 49333 44000 17250 10000
세포주 SKBR3에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수, XTT 분석법에 따른 생존도 및 세포독성을 하기 표 13에 기재하였다(도 16 및 도 17).
Figure pat00006
세포주 SKBR3에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수, XTT 분석법에 따른 생존도 및 세포독성을 하기 표 14에 기재하였다(도 18 및 도 19).
Figure pat00007
(5) PC-3
세포주 PC-3은 전립샘 선암의 골전이에서 분리된 세포주이다. PC-3 세포주는 저 산성인산분해효소와 테스토스테론-5-알파(남성호르몬의 일종) 환원효소 활성을 보인다. PC-3 인체 전립선 암세포주는 전형적인 전립선암 세포주이며 높은 전이 가능성을 가지며 p53 및 p63을 표현하지 않는다. 다른 연구에서도 PC-3 세포가 탁솔에 비교적 내성이 있다는 점이 증명되었으나, 본 발명에 따른 조성물은 PC-3 세포를 사멸하는데 매우 효과적이었으며, 또한 PC-3 세포의 회복이 관찰되지 않았다.
세포주 PC-3에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 20).
0h 12h 24h 48h 4d 7d
실험군 4285 4650 5555 1994 491 371
3200 5920 7330 1937 345 535
5075 5755 5570 1097 536 159
평균값 4187 5442 6152 1676 457 355
대조군(탁솔) 5445 5805 4820 1969 975 1796
9845 5775 6435 2248 1250 1542
4450 4805 4360 1821 861 829
평균값 6580 5462 5205 2013 1029 1389
비처리군 5550 11870 10020 13280 6175 2275
2665 8580 8245 13601 6172 4649
평균값 4108 10225 9132.5 13440.5 6173.5 3462
세포주 PC-3에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 20).
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 485 151 60 434 17
86 161 105 272 58
177 170 50 142 13
평균값 249 161 72 283 29
대조군(탁솔) 389 328 303 1376 753
760 318 378 1023 550
392 269 369 1574 145
평균값 514 305 350 1324 483
세포주 PC-3에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 21 및 도 22).
Figure pat00008
세포주 PC-3에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 21 및 도 22).
Figure pat00009
(6) HT 1299
세포주 HT 1299는 비소세포 폐암 세포주이다. HT 1299 세포는 부분 삭제된 p53단백질 동종접합을 가지고 있으며, p53 단백질 표현이 적다. 본 실험에서, 본 발명에 따른 조성물로 처치한 후 생존해있는 HT 1299 세포를 발견하기가 어려웠다.
세포주 HT 1299에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 23).
0h 12h 24h 48h 4d 7d
실험군 2760 5750 4115 1250 655 539
3080 5620 4860 1574 685 496
1965 3845 4130 950 434 426
평균값 2602 5072 4368 1258 591 487
대조군(탁솔) 2270 3085 4255 1526 536 736
5520 5350 2690 1484 712 629
3420 2680 2810 1382 488 982
평균값 3737 3705 3252 1464 579 782
비처리군 2045 3825 4275 8818 9108 9131
2985 8630 7445 4061 8317 10597
평균값 2515 6227.5 5860 6439.5 8712.5 9864
세포주 HT 1299에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 23).
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 331 766 747 704 68
1215 376 742 819 43
740 612 339 549 202
평균값 762 585 609 691 104
대조군(탁솔) 789 129 499 545 144
776 262 386 470 107
1193 291 410 322 104
평균값 919 227 432 446 118
세포주 HT 1299에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 24 및 도 25).
Figure pat00010
세포주 HT 1299에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 24 및 도 25).
Figure pat00011
또한, 대조군에서는 탁솔의 독성으로 인해 세포의 세포막이 파열된 이후에 핵이 파괴되어 검게 변하는 일반적인 사멸 모습을 보인 반면, 실험군에서는 세포막이 검게 변하고 핵이 먼저 파열된 이후에 세포막이 무너지는 실험군만의 독특한 사멸현상이 관찰되었다(도 26 내지 28).
(7) Saos-2
세포주 Saos-2는 골암 세포주이다.
세포주 Saos-2에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 29).
0h 12h 24h 48h 4d
실험군 2016 1647 2040 1982 1494
2151 1804 1978 1940 1652
2314 1735 2094 1852 1420
평균값 2160 1729 2037 1925 1522
대조군(탁솔) 2221 1790 1376 822 570
2135 1705 1452 776 435
2143 1756 1529 857 255
평균값 2166 1750 1452 818 420
비처리군 2726 1740 2234 2406 4421
2361 2325 2203 2755 1034
평균값 2544 2033 2219 2581 2728
세포주 Saos-2에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 29).
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 995 722 707 912 263
1026 800 787 670 454
980 764 798 674 337
평균값 1000 762 764 752 351
대조군(탁솔) 291 165 249 589 289
759 126 165 602 793
778 258 312 416 822
평균값 609 183 242 536 635
또한, 대조군에서는 탁솔의 독성으로 인해 세포의 세포막이 파열된 이후에 핵이 파괴되어 검게 변하는 일반적인 사멸 모습을 보인 반면, 실험군에서는 세포막이 검게 변하고 핵이 먼저 파열된 이후에 세포막이 무너지는 실험군만의 독특한 사멸현상이 관찰되었다(도 30 내지 32).
(8) C-6
세포주 C-6 교모세포종은 가장 흔한 악성 신경교종으로, 여러 치료방법에 저항력을 보이며, 대부분의 환자는 진단 1년 이내에 사망한다. 쥐 C-6 신경아교종 세포주는 N,N'-니트로소-메틸우레아에 노출된 위스터 퍼쓰 쥐에서 만들어졌으며, 쥐의 뇌에 주입했을 때 형태학적으로 GBM과 비슷하여, 이런 종류의 종양 연구를 위한 생체내, 시험관내 연구에 모두 사용되고 있다.
본 실험에서, 상기 세포는 탁솔에 저항력을 나타낸 반면, 본 발명에 따른 조성물로 처치한 세포는 4일 후에 사멸하였고 회복하지 못하였다.
세포주 C-6에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 33).
0h 12h 24h 48h 4d 7d
실험군 5035 4600 2464 7947 7116 17
6102 3934 4777 6888 3248 8
5525 4234 5447 5283 6303 30
평균값 5554 4256 4229 6706 5556 18
대조군(탁솔) 7077 5442 3853 5378 6751 2671
4897 4240 3340 6722 6905 3426
6111 3726 3895 6630 6026 7253
평균값 6028 4469 3696 6243 6561 4450
비처리군 5384 5320 5877 20286 29190 32825
5873 4002 6305 15960 24075 29837
평균값 5629 4661 6091 18123 26633 31331
세포주 C-6에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 34).
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 542 54 105 38 34
231 39 33 95 31
271 58 39 27 43
평균값 348 50 59 53 36
대조군(탁솔) 3948 4285 5457 4083 4316
4207 3984 3930 3184 3634
2984 3392 3166 4825 3989
평균값 3713 3887 4184 4031 3980
세포주 C-6에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 35 및 도 36).
Figure pat00012
세포주 C-6에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 35 및 36).
Figure pat00013
(9) AsPc
세포주 AsPc는 췌장암 세포주이다.
세포주 AsPc에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 37).
0h 12h 24h 48h 4d 7d
실험군 2743 1602 2705 2420 1640 1350
2601 1762 2454 1920 1480 1710
2519 1898 2480 2177 1847 790
평균값 2621 1754 2546 2172 1656 1283
대조군(탁솔) 2039 2279 2161 2130 2020 2174
2111 2550 2310 1800 2100 1902
2340 2833 2336 2810 2007 1393
평균값 2163 2554 2269 2247 2042 1823
비처리군 2796 2705 2941 4416 5693 7700
2402 3917 3106 4682 5343 4900
평균값 2599 3311 3023.5 4549 5518 6300
세포주 AsPc에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 37).
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 1180 1242 1135 475 82
1281 1164 1171 457 32
1192 1148 790 470 42
평균값 1218 802 769 311 38
대조군(탁솔) 1213 1372 1490 327 101
1770 1357 1202 724 85
1301 1358 1210 842 73
평균값 1428 1362 1301 631 86
실험군에서는 암세포의 세포막이 검게 변하여 죽어가고 있음이 관찰되었으며, 이러한 암세포는 다시 재생될 가능성은 매우 희박하다(도 38).
또한, 대조군에서는 탁솔의 독성으로 인해 세포의 세포막이 파열된 이후에 핵이 파괴되어 검게 변하는 일반적인 사멸 모습을 보인 반면, 실험군에서는 세포막이 검게 변하고 핵이 먼저 파열된 이후에 세포막이 무너지는 실험군만의 독특한 사멸현상이 관찰되었다(도 39 내지 41).
(10) MDA-MB-231
유방암 세포주인 MDA-MB-231은 본 발명에 따른 조성물에 의해 유의적인 영향을 받았다. 실험군의 결과를 대조군의 결과와 비교할 때, 제1주(LC50)의 4일째에 실험군의 세포수가 대조군의 세포수보다 작다는 것을 알 수 있다. 따라서, 제1주(LC50)의 4일째가 세포 사멸의 중요한 전환점이 된다.
또한, 대조군에서 제1주(LC50) 동안 생존한 세포들은 제2주(회복기) 동안 성장하고 회복되는 반면, 실험군에서 제1주(LC50) 동안 생존한 세포들은 제2주(회복기) 동안 성장하지 못하고 모두 사멸하였다.
세포주 MDA-MB-231에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기 표 31에 기재하고, 생존도를 하기 표 32에 기재하였다(도 42 및 도 43). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 40000 50000 56000 12500 7500
41500 46000 42000 16000 1200
32000 32000 50000 18000 2000
평균값 37833 42667 49333 15500 3567
대조군(탁솔) 42000 39000 16000 24000 9000
53000 22000 23000 26500 4000
47000 32000 13000 19500 16000
평균값 47333 31000 17333 23333 9667
비처리군 48000 55000 75000 110000 120000
36000 48000 95000 75000 150000
42000 52000 84000 120000 150000
평균값 42000 51667 84667 101667 140000
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 95 82 50 43 10
93 80 72 35 16
93 90 60 55 26
평균값 94 84 61 44 17
대조군(탁솔) 92 84 56 39 50
90 80 82 56 50
86 86 67 48 35
평균값 89 83 68 48 45
비처리군 91 94 80 78 77
95 82 86 80 81
89 88 85 83 67
평균값 91.7 88 83.7 80.3 75
세포주 MDA-MB-231에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 세포수를 하기 표 33에 기재하고, 생존도를 하기 표 34에 기재하였다(도 44 및 도 45). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 9000 8000 9000 4000 4000
12500 9000 7000 2000 2000
8000 4000 12500 4000 0
평균값 9833 7000 9500 3333 2000
대조군(탁솔) 17500 32000 36000 31000 39000
22000 24000 12500 22500 42000
12500 16000 25000 13000 15000
평균값 17333 24000 24500 22167 32000
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 33.3 12.5 0 50 0
25 17.1 25 100 100
37 37.1 18.2 0 0
평균값 31.8 22.2 14.4 50.0 33.3
대조군(탁솔) 50 35 40 32 46.7
45.9 22.3 39 52.7 33.3
36.7 42.2 50 23.1 51
평균값 44.2 33.2 43.0 35.9 43.7
(11) RKO
대장암 세포주인 RKO는 본 발명에 따른 조성물에 대해 명백한 민감도를 나타내었다. 실험군에서, 제1주(LC50)의 48시간째가 본 발명에 따른 조성물에 의해 세포사멸이 빠르게 나타나기 시작하는 중요한 전환점이 된다. 또한, 제2주(회복기) 동안 내내, 실험군에서 생존한 세포들의 수는 대조군에서 생존한 세포들의 수보다 작았다.
세포주 RKO에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기 표 35에 기재하고, 생존도를 하기 표 36에 기재하였다(도 46 및 도 47). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 55000 57800 34200 14000 24600
52600 83200 34200 22800 27200
50800 102400 81000 23600 24600
평균값 52800 81133 49800 20133 25467
대조군(탁솔) 49000 98000 52600 36000 25400
54000 99800 49800 36000 22800
48000 101600 133800 36000 38600
평균값 50333 99800 78733 36000 28933
비처리군 48000 125200 246800 288000 412000
51600 114600 259000 349000 445000
평균값 49800 119900 252900 318500 428500
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 95.5 95 66.7 49.2 18
93.8 98.3 61.5 54 19.2
96.6 97.2 64.5 56.3 17.1
평균값 95 97 64 53 18
대조군(탁솔) 94.4 95.5 78.3 50 42
95.8 94.6 78.9 50 38.6
93.9 76 62.4 33
평균값 95 95 78 54 38
비처리군 94.2 97.2 97.9 84.8 90
95.5 93.9 98.3 81.2 94
평균값 95 96 98 83 92
세포주 RKO에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기 표 37에 기재하고, 생존도를 하기 표 38에 기재하였다(도 48 및 도 49). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 24600 15800 14800 22000 15800
27200 12200 21800 14800 9600
24600 21800 24600 20000 12200
평균값 25467 16600 20400 18933 12533
대조군(탁솔) 58000 31000 38000 31000 18000
53000 39000 30000 26000 39000
57000 26000 35000 39000 48000
평균값 56000 32000 34333 32000 35000
비처리군 48000 125200 246800 288000 412000
51600 114600 259000 349000 445000
평균값 49800 119900 252900 318500 428500
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 17.8 19.4 15 38 34
18.8 17.7 23.9 43.6 17.5
16.3 22 28 48 26.4
평균값 18 20 22 43 26
대조군(탁솔) 27.3 28.6 56 67.5 25
41.4 50 48.3 66.7 33
50 50 62.2 55.6 45
평균값 40 43 56 63 34
(12) HeLa 세포
자궁경부암 세포주인 HeLa 세포에 대한 실험에서, 본 발명에 따른 조성물로 처리된 제1주(LC50) 동안 세포수가 유의적으로 감소하였다. 제1주(LC50)의 48시간째에 본 발명에 따른 조성물이 탁솔보다 더 많은 세포사멸을 가져왔다.
세포주 HeLa 세포에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기 표 39에 기재하고, 생존도를 하기 표 40에 기재하였다(도 50 및 도 51). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 214000 289000 35000 66000 82000
162000 246000 61000 83000 89000
188000 551000 53000 68000 88000
평균값 188000 362000 49667 72333 86333
대조군(탁솔) 136000 276000 70000 39000 34000
184000 219000 79000 31000 32000
158000 158000 105000 26000 36000
평균값 159333 217667 84667 32000 34000
비처리군 127000 306000 350000 1147000 1072000
131000 319000 311000 1418000 1418000
평균값 129000 312500 330500 1282500 1245000
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 93.4 92.4 37.5 86.7 57.1
89.2 87.3 82.4 84.2 56
90.7 92.3 33.3 82 40
평균값 91.1 90.7 51.1 84.3 51
대조군(탁솔) 90.3 77.8 75 66.7 74.5
90.5 78 88.9 71.4 37.5
88.9 75 70.8 66.7 85.7
평균값 89.9 76.9 78.2 68.3 65.9
비처리군 89.7 90.4 88.9 63 65
86.7 88.6 90.1 72.2 56.3
평균값 88.2 89.5 89.5 67.6 60.65
세포주 HeLa 세포에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기 표 41에 기재하고, 생존도를 하기 표 42에 기재하였다(도 52 및 도 53). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 92000 31000 27000 9000 9000
109000 22000 18000 0 9000
88000 48000 12500 4000 18000
평균값 96333 33667 19167 4333 12000
대조군(탁솔) 34000 26000 23500 18000 18000
35000 9000 22000 13000 18000
31000 35000 12000 22000 18000
평균값 33333 23333 19167 17667 18000
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 50 28.5 17.1 0 0
56.3 35.7 22.2 0 40
47.2 18.2 14.5 8.3 0
평균값 51.2 27.5 17.9 2.8 13.3
대조군(탁솔) 66.7 16.7 33.3 50 100
82.3 20 27.6 25 0
77.1 50 25 40 25
평균값 75.4 28.9 28.6 38.3 41.7
(13) TT 세포
갑상선암 세포주인 TT 세포에 대한 실험에서, 본 발명에 따른 조성물로 처리된 경우의 세포수는 매우 급격하게 감소되었다. 세포수와 생존율은 모두 제1주(LC50)의 48시간째에 유의적으로 감소하였다. 또한, 본 발명에 따른 조성물로 처리된 세포들은 제2주(회복기)에서도 회복하지 못함을 알 수 있었다. 반면, 탁솔로 처리된 세포들은 실험군보다 더 많이 생존하였다.
TT 세포에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기 표 43에 기재하고, 세포수로부터 계산한 생존도(%)를 하기 표 44에 기재하였다(도 54 및 도 55). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 120000 236000 57000 32000 9000
139000 302000 54000 22000 9000
114000 149000 79000 27500 0
평균값 124333 229000 63333 27167 6000
대조군(탁솔) 117500 74000 109000 72500 26000
123000 96000 114000 56000 35000
133000 149000 175000 84000 35000
평균값 124500 106333 132667 70833 32000
비처리군 125000 302000 477000 989000 1120000
136000 376000 538000 893000 1160000
평균값 130500 339000 507500 941000 1140000
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 83.3 90.7 30.8 17.5 0
85.3 79.7 33.3 25 0
82 64.7 35.3 13.2 0
평균값 83.5 78.4 33.1 18.6 0
대조군(탁솔) 80.8 64.7 72 70.1 66.7
78.4 72.7 76.9 66.7 37.5
79.5 76.5 72.5 66.7 75
평균값 79.6 71.3 73.8 67.8 59.7
비처리군 83.3 82.6 62.7 90.4 95
85.7 84.9 96.7 91.5 91.4
평균값 84.5 83.75 79.7 90.95 93.2
TT 세포에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기 표 45에 기재하고, 세포수로부터 계산한 생존도(%)를 하기 표 46에 기재하였다(도 56 및 도 57). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 9000 0 4000 2000 0
9000 18000 4000 1000 2000
4000 4000 4000 2000 2000
평균값 7333 7333 4000 1667 1333
대조군(탁솔) 53000 9000 31000 15000 9000
35000 26000 26000 12500 17500
44000 18000 35000 22500 8000
평균값 44000 17667 30667 16667 11500
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 50 0 100 0 0
0 25 0 100 0
0 0 0 0 0
평균값 16.7 8.3 33.3 33.3 0
대조군(탁솔) 75 0 42.9 35 25
50 83.3 50 25 42.3
70 40 12.5 52.7 33.3
평균값 65 41.1 35.1 37.6 33.5
TT 세포에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수, XTT 분석법에 따른 생존도 및 세포독성을 하기 표 47에 기재하였다(도 58 및 도 59).
Figure pat00014
TT 세포에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수, XTT 분석법에 따른 생존도 및 세포독성을 하기 표 48에 기재하였다(도 60 및 도 61).
Figure pat00015
(14) HME 50 HT - 정상 상피 세포
인체 유방상피세포인 HME는 인접 정상 조직에서 유래된 세포주이다.
본 실험에서, 실험군에서는 어떠한 세포독성도 관찰되지 않았다. 오히려, HME 50 HT 세포는 잘 성장하였으며 회복기에는 세포들이 넘칠 정도로 자랐으며 매우 건강하고 스트레스를 받지도 않았다.
세포주 HME 50 HT에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 62).
0h 12h 24h 48h 4d 7d
실험군 17000 25000 20000 26000 28000 41000
22000 26000 21000 28000 28000 49000
23000 27000 21000 25000 28000 66000
평균값 20667 26000 20667 26333 28000 46667
대조군(탁솔) 11000 23000 11000 18000 9000 19000
21000 13000 9000 11000 9000 14000
12000 14000 14000 18000 9000 17000
평균값 14667 16667 11333 15667 9000 16667
비처리군 18000 25000 28000 31000 32000 67000
20000 25000 29000 29000 38000 32000
평균값 19000 25000 28500 30000 35000 49500
세포주 HME 50 HT에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 62).
0h 12h 24h 48h 4d 7d
실험군 50000 52000 60000 56000 60000 59000
46000 57000 52000 57000 58000 69000
39000 47000 62000 55000 65000 64000
평균값 45000 52000 58000 56000 61000 64000
대조군(탁솔) 17000 13000 15000 16000 19000 19000
13000 15000 11000 17000 12000 15000
19000 13000 12000 18000 18000 14000
평균값 16333 13667 12667 17000 16333 16000
상기 결과로부터, 실험군은 비처리군과 유사하게 성장하는 모습을 알 수 있으며, 이는 본 발명에 따른 조성물이 정상세포에 부정적인 영향이 없음을 나타내는 것이다. 즉, 실험군에서는 일주일 동안 약물에 노출되어 있음에도 불구하고, 약에 노출된 기간 및 회복 기간 동안 모두에서 개체수가 증가되고 있다. 반면, 탁솔로 처치된 군에서는 하루동안 약물에 노출되었음에도 불구하고 이후 2주동안 개체수가 증가되지 못하고 그 수를 유지할 뿐이었으며, 이는 정상세포가 탁솔에 의해 받는 스트레스가 크다는 것을 의미한다.
또한, 대조군에서는 정상세포의 형태가 파괴되고 스트레스를 많이 받는 모습이 관찰되는 반면, 실험군에서는 정상세포가 매우 건강하게 자라고 있는 모습이 관찰되었다(도 63 내지 66).
(15) BJ - 정상 섬유아 세포
세포주 BJ는 신생아의 정상 표피에서 유래된 것이며 텔로머라제를 발현하지 않는다.
본 발명에 따른 조성물로 처치한 군에서 세포독성이 나타나지 않았으며, 세포들은 매우 건강했고 스트레스를 받지 않았으며 강화된 세포 성장이 관찰되었다.
세포주 BJ에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 67).
0h 12h 24h 48h 4d 7d
실험군 13000 14000 20000 24000 59000 63000
9000 10000 22000 34000 61000 67000
15000 17000 13000 28000 58000 61000
평균값 12333 13667 18333 28667 59333 63667
대조군(탁솔) 17000 9000 17000 10000 5000 9000
18000 12000 11000 11000 5000 4000
14000 12000 10000 14000 9000 7000
평균값 16333 11000 12667 11667 6333 6667
비처리군 10000 20000 24000 29000 33000 47000
11000 16000 25000 34000 31000 34000
평균값 10500 18000 24500 31500 32000 40500
세포주 BJ에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기의 표에 기재하였다(도 67).
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 56 67 100 77 63
73 72 74 88 85
60 65 82 56 90
평균값 63 68 85 74 79
대조군(탁솔) 49 7 14 7 29
4 9 16 18 19
5 7 8 8 35
평균값 19 8 13 11 28
상기 결과로부터, 정상세포는 실험군에서 비처리군보다 더 잘 성장하는 모습을 보이고 있는 반면, 대조군에서는 탁솔의 독성으로 인한 스트레스 때문에 세포수가 감소하다가 회복기의 4일째가 지난 뒤에 회복의 모습을 나타내고 있다.
세포주 BJ에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 68 및 도 69).
Figure pat00016
세포주 BJ에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 흡광도, 생존도 및 세포독성을 하기의 표에 기재하였다(도 68 및 도 69).
Figure pat00017
상기 결과로부터, 실험군에서는 정상 세포의 생존율이 1에 가깝거나 그 이상의 값을 나타내고 있으며, 세포 독성이 0에 가깝다는 것을 알 수 있다.
또한, 실험군에서의 정상세포들은 비처리군과 매우 유사한 세포 성장 모습이 관찰된 반면, 대조군에서는 세포 형태가 완전히 파괴된 모습이 관찰되었다(도 70 및 도 71).
(16) CCD-1074sk
정상의 인간 피부 섬유아세포인 세포주 CCD-1074sk는 제1주(LC50) 동안 본 발명에 따른 조성물로 처리하였을 때 어떠한 물질로도 처리되지 않을 때와 유사한 정도로 성장하였다. 반면, 탁솔로 처리된 대조군에서는 제1주(LC50) 동안 세포의 성장이 저해되었으며, 제2주(회복기)에서도 회복이 매우 느리게 나타났다.
세포주 CCD-1074sk에 대해, 제1주(LC50) 동안 측정한 세포수를 하기 표 55에 기재하고, 생존도를 하기 표 56에 기재하였다(도 72, 도 73 및 도 74). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 7000 7000 11000 25000 27000
4000 13000 15000 17000 25000
9000 18000 15000 8000 41000
평균값 6667 12667 13667 16667 31000
대조군(탁솔) 9000 15000 10000 6000 11000
7000 16000 11000 3000 12000
평균값 8000 15500 10500 4500 11500
비처리군 10000 13000 11000 12000 24000
6000 25000 17000 14000 43000
평균값 8000 19000 14000 13000 33500
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 100 50 100 76 78
50 73 72 84 82
70 90 71 67 92
평균값 73 71 81 76 84
대조군(탁솔) 70 71 80 43 92
75 89 83 33 57
평균값 73 80 82 38 75
비처리군 100 80 63 79 89
100 82 63 88 94
평균값 100 81 63 84 92
세포주 CCD-1074sk에 대해, 제2주(회복기) 동안 측정한 세포수를 하기 표 57에 기재하고, 생존도를 하기 표 58에 기재하였다(도 75, 도 76 및 도 77). 여기에서 생존도는 세포수 측정 웰 내에서 세포를 트립판 블루로 염색하여 측정하였다.
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 21000 25000 31000 19000 41000
18000 39000 29000 20000 33000
18000 32000 33000 22000 29000
평균값 19000 32000 31000 20333 34333
대조군(탁솔) 10000 8000 10000 4000 18000
11000 21000 6000 7000 9000
평균값 10500 14500 8000 5500 13500
0h 24h 48h 4d 7d
실험군 88 79 100 96 87
87 68 88 96 91
85 84 85 96 94
평균값 87 77 91 96 91
대조군(탁솔) 82 71 27 43 19
75 89 57 33 37
평균값 79 80 42 38 28
실시예 7 - 생체내(in vivo) 실험
(1) 생체내 항암 효과
암세포주는 WM-266-4(인간 악성 흑색종)를 선택하였다. 이 세포 105개를 PBS에 부유시키고, Matrigel(BD biosciences)와 1:1로 혼합하였다. 이에 따라 제조된 상기 세포주가 포함되어 있는 혼합액 80μl를 5주령 암컷 누드마우스(BALB/c nu/nu) 14마리 각각의 오른쪽 옆구리에 피하주사하였다.
그 후, 종양 부하량(tumor burden)의 평균이 1,000이 되었을 때, 상기 누드마우스 중 5마리에는 아무런 처리도 안 하였으며(비처리군), 다른 5마리에는 시스플라틴 0.0025mg/g(시료의 질량/마우스의 체중)을 투여하였으며(대조군), 다른 4마리에는 화학식 II 및 III의 화합물을 각각 0.00035mg/g(시료의 질량/마우스의 체중)의 농도로 1일 2회 투여하였다(실험군). 여기에서, 종양 부하량(tumor burden) = π/6 × 0.5 × 길이 × (너비)2으로 계산되었다.
2일마다 상기 마우스의 종양의 크기와 체중을 측정하였다. 마우스가 폐사된 후에는 종양을 적출하여 종양의 크기와 체중을 측정하였다. 이에 따른 결과는 도면에 그래프로 나타내었다.
상기 실험 결과로부터, 본 발명에 따른 조성물로 처리한 군이 시스플라틴으로 처리한 군에 비해 종양의 크기가 현저하게 작다는 것을 알 수 있다(도 78).
(2) 누드마우스의 T세포 분화
5주령 암컷 누드마우스(BALB/c nu/nu) 3마리에게 18일 동안 PBS를 경구투여하였으며, 다른 3마리에게 18일 동안 1일 2회 화학식 II의 화합물을 0.00033mg/g(화합물의 질량/마우스의 체중)의 농도로 경구투여하였다. 그 후, 말초혈액단핵세포(PBMC)에서 혈액을 채취하여 T 세포수를 FACS로 분석하였으며, 이 때 1차 항체는 항마우스 CD8을 사용하였으며, 2차 항체는 FITC-컨쥬게이티드 래트 항마우스 IgG(FITC-conjugated rat anti-mouse IgG)를 사용하였다.
실험결과를 하기 표 59에 나타내었으며, 이로부터 본 발명에 따른 조성물로 처치한 실험군의 T 세포수가 PBS를 투여한 대조군의 T 세포수의 약 2배에 달하였음을 알 수 있다. 또한, 실험군에서 나타내는 T 세포수는 야생형의 정상 래트의 T 세포수에 근접하고 있음을 알 수 있다.
흉선이 없는 마우스에서 T 세포가 증가되었다는 것은 줄기세포에 의해서만 가능하므로, 상기 실험결과는 본 발명에 따른 조성물이 줄기세포 분화를 유도하여 T 세포를 분화시키도록 작용했음을 의미한다.
CD8-양성 T 림프구 % PBMC
야생형 4.92
PBS-처리 누드 마우스 1.94
본 발명에 따른 조성물-처리 누드 마우스 3.84
실시예 8 - 부작용 확인 실험
(1) 설치류에 대한 독성 시험
Sprague-Dawley 래트에 본 발명에 따른 조성물을 단회 경구투여하여 독성을 시험하였다. 대조군(물)에 비해, 실험군(본 발명에 따른 조성물)에서는 암수 각 5마리에 시험물질을 80ml/kg(조성물의 부피/래트의 중량), 즉 28mg/Kg(화합물의 중량/래트의 중량)의 용량으로 단 회 투여하였다.
실험결과, 본 발명에 따른 조성물을 투여하더라도 사망한 동물이 없었으며, 일반증상에서 이상 소견이 없었으며, 시험물질 투여와 관련된 체중 변화에 이상이 없었으며, 부검 결과 역시 이상 소견이 없었다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물의 투여와 관련된 이상 증상이 전혀 관찰되지 않았다(도 79).
(2) 누드마우스의 발모
누드마우스에 2주 동안 1일 2회 본 발명에 따른 조성물을 투여하였다.
그 결과, 도 53으로부터 누드마우스에서 발모가 나타남을 확인할 수 있으며, 이는 누드마우스의 비정상적인 유전자가 본 발명에 따른 조성물의 일정 기간 투여에 따라 야생형 흰 생쥐의 정상 유전자로 돌아가는 변화 과정에서 나타나는 증상이다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물을 항암제로서 투여하더라도 탈모의 부작용이 발생하지 않는다(도 80).
(3) 정상세포의 성장 형태
본 발명에 따른 조성물로 처치한 정상세포들은 어떠한 물질로도 처리되지 않은 정상세포들과 매우 유사한 세포 성장의 모습을 나타내었다. 그러나, 탁솔로 처치한 정상세포들은 탁솔의 독성으로 인한 스트레스로 인해 세포 형태가 파괴되는 모습을 나타내었다. 즉, 탁솔은 암세포 뿐만 아니라 정상세포도 정상적으로 성장하지 못하게 하며, 이는 세포의 종류에 대한 탁솔의 선택성이 매우 낮다는 것을 보여준다(도 81).
(4) 암세포의 사멸 형태
시험관내에서 본 발명에 따른 조성물로 처치한 모든 암세포들은 생물학적 마커 표현에 무관하게 탁솔에 비해 상대적으로 깨끗하게 암세포를 사멸시켰다. 이와 같이 깨끗하게 암세포가 사멸될 경우, 신체는 잔여물을 처리하기 위한 부담을 덜하게 되므로, 신체기능이 저하된 환자에게 적합하게 투여할 수 있다(도 82). 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 정상세포에 대해서는 독성 없이 잘 성장할 수 있도록 하는 반면, 암세포에 대해서는 깨끗하게 사멸시킬 수 있는 선택적이고 특이적인 효과를 나타낸다.

Claims (21)

  1. 하기 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물:
    [화학식 I]
    Figure pat00018

    (식 중, 치환기 R은 C2H5 또는 C2H3임).
  2. 제1항에 따른 화학식 I의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이의 수화물을 유효성분으로 함유하는, 암 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 암이 유방암, 전립선암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 대장암, 골육종 또는 뇌종양, 자궁경부암 또는 갑상선암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    비경구, 국소, 경구, 직장 또는 비강 경로로 투여되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 하기 단계를 포함하는 제1항에 따른 화학식 I의 화합물의 제조방법:
    a) (i) 2-메틸부티르산, 및 (ii) 악티게닌-4-O-글루코시드, 3,5,7,9-테트라인 또는 알라닌을 2:1의 중량비로 반응시키는 단계,
    b) 3:1의 중량비로 혼합한 (i) 구리 및 (ii) 루테올린-7-람노글루코시드, 사포닌, 피넨, 트랜스-게라니올, 리나롤(linalol) 또는 클로로겐산을 상기 a) 단계에서 수득한 생성물과 반응시키는 단계,
    c) 1:1의 중량비로 혼합한 (i) 비텍시카르핀 또는 헤스페리딘 및 (ii) 3'-히드록시포르모노네틴, 캠페롤 또는 물을 상기 b) 단계에서 수득한 생성물과 반응시키는 단계,
    d) 상기 c) 단계에서 수득한 생성물에 시니그린을 반응시키는 단계, 및
    e) 상기 d) 단계에서 수득한 생성물에 발린을 반응시켜, 제1항에 따른 화학식 I의 화합물을 생성하는 단계.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 a) 단계의 반응은 80~120℃에서 10~30분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 b) 단계의 반응은 120~170℃에서 10분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 c) 단계의 반응은 80~120℃에서 5~8분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 d) 단계의 반응은 100~140℃에서 5~10분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 e) 단계의 반응은 -30~30℃에서 10~20분 동안 수행하거나 또는 80~230℃에서 5~30분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 e) 단계의 반응은 -30~30℃에서 10~20분 동안 수행하고, 이어서 80~230℃에서 5~30분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제5항에 있어서,
    상기 a) 단계 내지 e) 단계에서 용매는 물(H2O)을 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제5항에 있어서,
    상기 e) 단계에서 수득된 생성물을 -5~30℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제5항에 있어서,
    상기 e) 단계에서 수득된 생성물을 100~150℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 정제 단계 이후에, 수득된 생성물을 70~100℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 정제 단계 이후에, 수득된 생성물을 40~60℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 정제 단계 이후에, 수득된 생성물을 15~30℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 정제 단계 이후에, 수득된 생성물을 -1~15℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  19. 제14항에 있어서,
    상기 정제 단계 이후에, 수득된 생성물을 30~100℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 정제 단계 이후에, 수득된 생성물을 -5~30℃의 물에 용해하여 여과하는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  21. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 여과에 사용된 필터는 공극크기가 10-6m 이하인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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