KR20120002361A - 줄기세포 배양액을 포함하는 폐질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폐질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 줄기세포의 배양액으로 이루어진 폐질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 특히, 본 발명의 조성물은 흡연에 의해 발생된 폐기종을 효과적으로 치료할 수 있는 바, 만성폐쇄성질환 및 폐고혈압 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 배양액을 포함하는 폐질환 치료용 조성물 {Composition for treating pulmonary disease comprising mesenchymal stem cell-conditioned media}

본 발명은 폐질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 줄기세포의 배양액을 포함하는 폐질환 치료용 조성물로 특히, 흡연에 의한 만성폐쇄성폐질환 또는 폐고혈압을 치료할 수 있다.

만성폐쇄성폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease, COPD)이란, 유해한 입자나 가스의 흡입에 의해 폐에 비정상적인 염증 반응이 일어나면서 이로 인해 점차 기류 제한이 진행되어 폐 기능이 저하되고 호흡곤란을 유발하게 되는 호흡기 질환으로, 폐기종, 만성 기관지염, 폐고혈압 등이 동반된다.

현재 만성폐쇄성폐질환 (COPD)은 흡연이 가장 중요한 발병 위험인자로 여겨지고 있으며, 이외에 공해물질, 산업장 오염물질 등에 의해서도 발생할 수 있다. 만성폐쇄성폐질환의 발병에는 흡연에 의해 유도되는 직접적 폐손상 및 염증반응 이외에도 여러 가지 병인기전이 관여할 것으로 추측하고 있다 (O'Byrne PM, Postma DS. Am J Respir Crit Care Med 1999;159:S41-S66). 특히 상당수의 비흡연자들에서도 만성폐쇄성폐질환이 발병하는 이유나, 흡연자들 중 일부에서만 만성폐쇄성폐질환이 발병하는 이유, 만성폐쇄성폐질환 환자들에서 흡연을 중단하여도 기도의 염증반응과 기도상피세포의 세포사멸이 지속되는 이유 등이 아직 밝혀져 있지 않은 실정이다(Hodge S 등, Eur Respir J 2005;25:447-54). 따라서 만성폐쇄성폐질환은 현재까지 정확한 발병원인 및 병인기전이 밝혀져 있지 않으며, 이에 따라 근본적인 치료가 어렵다고 알려져 있으며, 질병이 진행되어 폐기능의 감소가 현저한 경우 사망위험이 높다고 알려져 있다(GOLD workshop summary. Am J Respir Crit Care Med 2001;163:1256-1276).

만성폐쇄성폐질환의 약물치료로는 기관지 확장제 (bronchodilator)와 코르티코스테로이드 (corticosteroid)가 증상의 완화에 도움이 된다고 알려져 있다. 현재, 흡입형태의 코르티코스테로이드와 기관지확장제, 또는 테오필린 (Theophylline) 등의 약물이 만성폐쇄성폐질환의 증상 완화에 도움이 된다고 알려져 있지만, 아직까지 개발된 대부분의 치료 약물들이 만성폐쇄성폐질환을 완치시키거나 근본적으로 개선시켜서 장기간에 걸친 자연 경과를 바꾸지는 못하는 상태이다.

만성폐쇄성폐질환은 2020년에 이르면 사망률이 전세계 3위인 질환이지만, 그 치료를 상기와 같이 대증요법에 의존하고 있는 실정이다. 따라서 근본적인 치료를 위해서는 손상된 폐조직을 재건하는 것이 중요하며, 이에 대한 연구가 절실한 상태이다.

본 발명자는 상기의 문제점 및 필요성을 인식하고, 만성폐쇄성폐질환을 효과적으로 치료하기 위해 폐조직을 재생시킬 수 있는 방법에 대해 예의 노력한 결과, 중간엽 줄기세포의 배양액이 흡연에 의해 발생된 폐기종 및 폐고혈압을 치료함을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은 만성폐쇄성폐질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 줄기세포의 배양액을 포함하는 만성폐쇄성폐질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 줄기세포 배양액은 중간엽 줄기세포의 배양액인 것이 바람직하다.

또한 상기 배양액은 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 3 내지 5 대 계대 배양하여 얻어지는 것을 특징으로 한다.

상기 무혈청 배지는 DMEM 배지가 바람직하다.

또한 본 발명의 상기 중간엽 줄기세포는 골수로부터 유래된 것이 바람직하다.

상기 조성물은 주사제 또는 흡입제 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명의 상기 폐질환은 만성폐쇄성폐질환 또는 폐고혈압인 것이 바람직하며, 상기 만성폐쇄성폐질환 또는 폐고혈압은 흡연에 의해 발생될 수 있다.

상기 만성폐쇄성폐질환은 폐기종 또는 만성기관지염을 포함한다.

본 발명의 조성물은 흡연에 의해 발생된 폐조직을 재생시켜 폐기종을 치료하고, 폐고혈압을 치료하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의하면, 줄기세포 배양액을 이용하여 흡연에 의해 손상된 폐를 효과적으로 재생시킬 수 있는 바, 이는 만성폐쇄성폐질환 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1A는 폐 섬유아세포를 담배연기추출물 (cigarette smoke extract, CSE)에 노출시킨 후, MTT 분석법으로 살아있는 세포의 수를 측정한 결과이다. 도 1B는 subG1기에 있는 세포 수를 유세포측정기 (flow cytometer)로 측정한 결과이다. 도 1C는 세포자멸사 (apoptosis) 시 나타나는 DNA 가닥절단을 TUNEL 염색으로 확인한 것이다 (DNA nick: 붉은색, nuclear: 푸른색).
도 2는 쥐의 폐 섬유아세포인 RFL-6 세포에 대한 중간엽 줄기세포의 배양액(mesenchymal stem cell-conditioned media, MSC-CM)의 증식 효과를 나타낸 것이다. 2A는 MTT assay 로 살아있는 세포 수를 나타낸 것이고, 도 2B는 BrdU uptake assay 로 세포증식을 확인한 것이다. 중간엽 줄기세포의 배양액이 RFL-6 세포에서 농도의존적으로 세포증식을 유도하는 것을 보여주고 있다.
도 3은 MSC-CM이 CSE로 손상된 폐 섬유아 세포를 회복시켜주는 효과를 나타낸 것이다. 3A는 MTT assay 결과로 살아있는 세포 수를 나타낸 것이고, B는 현미경으로 세포 형태를 관찰한 것이고, C는 유세포 분석 (flow cytometry)으로 subG1기에 있는 세포수를 나타낸 것이며, D는 TUNEL (붉은색) 및 annexin V (녹색) 염색 결과를 나타낸 것이고, E는 BrdU uptake assay 로 측정한 세포 증식 결과를 나타낸 것이다. 이상의 결과는 MSC-CM이 농도의존적으로 세포자멸사를 억제하고, CSE에 의해 억제된 세포 증식 능력을 회복시켜주는 것을 보여주고 있다.
도 4는 CSE 노출 및 MSC-CM 처리에 따른 단백질 변화를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다. 이상의 결과는 MSC-CM이 세포자멸사와 관련된 단백질의 발현을 억제하고, 반대로 세포증식에 관련된 단백질의 발현 및 활성을 증가시킴을 보여주고 있다.
도 5는 MSC-CM의 CSE노출로 억제된 콜라겐 겔 수축 회복효과를 나타낸 것이다. 5B는 5A에서 보인 겔의 면적을 측정한 결과이다.
도 6은 MSC-CM의 CSE노출로 억제된 세포외기질 (extracellular matrix, ECM) 단백질 발현 회복 효과를 나타낸 것이다. 6A와 6B는 각각 세포외기질 단백의 mRNA 발현과 단백의 발현을 측정한 결과이고, 6C는 세포에서의 단백발현을 면역형광법으로 관찰한 결과이다. 6C는 콜라겐 겔 수축을 억제하는 Cox-2와 mPGES-2의 mRNA 발현 결과이다.
도 7은 CSE의 세포 증식 및 조직 재생 억제에 대한 MSC-CM의 회복 효과가 PI3-K/Akt의 활성을 통해 이루어진다는 것을 보여주는 실험 결과들이다. 7A는 MSC-CM에 의한 Akt 인산화가 PI3-K의 활성에 의한다는 것을 보여주며, 7B는 MSC-CM에 의한 세포증식 효과가 PI3-K 억제제에 의해 억제되는 것을 보여주고 있다. 7C는 MSC-CM에 의한 세포외기질 단백의 발현 증가가 역시 PI3-K 억제제에 의해 억제되는 것을 보여주고 있고, 7D는 MSC-CM에 의한 콜라겐 겔 수축능력의 증가가 PI3-K 억제제에 의해 억제됨을 보여주고 있다.
도 8은 담배연기 노출에 따른 폐기종에 대해 중간엽 줄기세포(MSC)의 배양액 (MSC-CM)의 치료효과를 나타낸 것이다. 8A는 폐의 조직학적 소견이며, 8B는 정량적 분석 결과인 MLI (median linear intercept)값을 나타낸 것이다.
도 9는 중간엽 줄기세포의 배양액 (MSC-CM)이 흡연에 의한 폐고혈압을 완화시키는 효과(9A)와, 흡연에 의해 소멸되는 혈관을 재생하는 효과(9B)를 나타낸 것이다.

본 발명은 줄기세포의 배양액을 포함하는 폐질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포가 바람직하다.

상기 중간엽 줄기세포는 포유동물에서 유래된 성체 줄기세포를 포함한다. 또한 상기 성체 줄기세포는 지방조직, 골수조직, 제대혈 또는 태반에서 분리된 줄기세포를 포함한다.

줄기세포란 미분화 세포로서, 오랜기간 동안 분열을 하고 자기 갱신 (self-renewal)을 할 수 있으며, 어떤 조건이 주어지면 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 기원되는 조직에 따라 배아줄기세포와 성체줄기세포로 나뉘어지게 되는데, 잠재 능력은 배아줄기세포보다 한정적인 단점이 있으나, 윤리적 문제가 없고 부작용이 없는 성체 줄기세포를 대상으로 많은 치료제가 연구되고 있다.

구체적으로, 본 발명에서는 성체 줄기세포를 이용하고, 이는 시판되는 줄기세포나 생체조직으로부터 분리한 줄기세포를 이용할 수 있다.

본 발명에서 용어, '줄기세포 배양액'이란 줄기세포를 배양하여 얻은 배지에 포함된 구성 성분을 포함하는 물질로서, 상기 배양액을 제조하기 위한 줄기세포는 그 종류에 제한을 받지 않는다. 예를 들면, 배양액을 제조하는 줄기세포는 배아 줄기세포일 수 있고 또한 성체 줄기세포일 수 있다. 나아가 성체 줄기세포는 모든 조직의 성체 줄기세포에서 유래할 수 있다. 예를 들면 성체 줄기세포는 골수 유래, 제대혈 유래, 혈액 유래, 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래, 신경 유래, 부신 유래, 상피 유래 및 자궁 유래 등으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 골수 유래의 성체 줄기세포이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 골수 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 배양액을 제조하였다.

줄기세포 배양을 위한 배지는 당업계에 알려진 기본 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Isocove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 첨가할 수 있는데, 이러한 보조성분으로는 태아 송아지, 말 또는 사람 등의 혈청을 비롯하여, 미생물의 오염을 막기 위한 페니실린 G (Penicillin G), 스트렙토마이신 설페이트 (streptomycin sulfate) 및 젠타마이신 (gentamycin) 등의 항생제, 암포테리신 B (amphotericin B) 및 니스타틴 (nystatin) 등의 항진균제 (antifungal agent) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 성분 중 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시 예에서는, 분리된 줄기세포를 혈청이 포함되지 않은 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)의 비유도성 배지에 배양하여 비접착성 세포들을 제거하였다. 상기 과정으로 분리한 줄기세포를 3 내지 5 계대로 배양함으로써, 본 발명의 골수 유래 중간엽 줄기세포 배양액을 수득할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 쥐 (rat)에 6개월간 담배 연기를 노출 시킨 후, 중간엽 줄기세포의 배양액 (MSC-CM)을 쥐에 투여했을 때 손상된 폐포 조직이 재생되었다. 또한, 혈관 생성을 유도하였으며, 흡연으로 인해 증가되었던 우심실압을 감소시킴으로써 만성폐쇄성폐질환과 동반되는 폐고혈압을 완화시켰다.

따라서 본 발명의 중간엽 줄기세포의 배양액 (MSC-CM) 을 포함하는 조성물은 폐조직을 재생시킴으로써, 폐질환 특히, 만성폐쇄성폐질환 및 폐고혈압을 효과적으로 치료할 수 있다.

상기 만성폐쇄성폐질환 및 폐고혈압은 흡연에 의해 발생될 수 있다.

본 발명에 따른 중간엽 줄기세포 또는 그 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물은 인체에서 분리된 중간엽 줄기세포를 원료로 하므로 독성이 적고, 세포자체를 사용하는 것이기 때문에 발암의 가능성도 적을 것으로 판단된다.

상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 폐포를 발달시킬 수 있는 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제형 및 흡입제형 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플 또는 흡입제형은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다.

상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

이렇게 제조된 본 발명의 조성물 또는 약학적 제제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 또는 그러한 줄기세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있다. 또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 흉부 절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두 가능하나 카테터를 이용한 비외과적 투여방법이 보다 바람직하다.

상기 조성물의 유효성분인 중간엽 줄기세포 배양액의 1일 투여량은 20배 농축액 1.2ml/kg 체중이 바람직하며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 실시 예를 통해서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시 예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

담배연기추출물 ( cigarette smoke extract , CSE ) 준비와 쥐 및 폐섬유아세포 (lung fibroblast )에 담배 연기 노출

CSE는 40ml의 담배 연기를 50ml의 플라스틱 시린지 (plastic syringe)에 집어 넣고, 10ml의 DMEM과 섞어서 준비하였다. 10ml의 CSE 당 1개피의 담배를 사용하였다. 0.22μm 필터를 통해 여과된 CSE 용액을 100%로 간주하였다.

또한 동물실험을 위해 8주된 암컷 Lewis rats에 하루에 20개피의 담배연기를 노출시켰으며, 이를 일주일에 5일 반복하며 6개월간 반복 수행하였다. 담배 1개피에는 8.5mg의 타르 (tar), 0.9mg의 니코틴 (nicotine)이 함유되어 있었다.

골수세포의 분리

골수세포(Bone marrow cell, BMC)는 7주된 수컷 Lewis rat에서 분리하였다. 쥐를 안락사한 후, 대퇴골과 경골을 절제하고 골에 붙어있는 결합조직 (connective tissue)을 무균 상태에서 제거하였다. 골수를 골에서 추출하고, 골수세포들을 피펫팅 (pipetting)으로 분산시킨 후 부유물을 40㎛ mesh (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 여과시켰다. 여과된 전체 골수세포는 5분 동안 1,000g에서 원심분리하고, 적혈구(RBC)는 150 mM의 염화암모늄 (ammonium chloride) 및 10 mM의 중탄산칼륨 (potassium bicarbonate)으로 용해시켰다. 골수세포를 DMEM으로 씻은 후, 2x10⁶ cells/ml로 DMEM 내에 부유시켰다.

중간엽 줄기세포( Mesenchymal stem cell , MSC ) 배양 및 이의 배양액 ( MSC -conditioned media , MSC - CM ) 준비

골수세포를 완전배지 (complete medium, 10% FBS, 페니실린, 스트렙토마이신 (streptomycin)을 함유하는 DMEM)와 함께 플라스틱 세포배양용기(SPL Lifescience, Korea)에 넣고 5% CO₂, 37℃에서 배양하였다.

3일 후, 부착되지 않은 세포를 완전배지 (complete medium)를 이용하여 제거하였으며, 배지를 일주일에 한번 또는 두 번 교체하였다. 배양용기가 세포로 90% 정도 차면, 0.25% trypsin-EDTA으로 세포를 떼어내어, 1:3 비율로 계대배양 하였다.

중간엽 줄기세포 배양액 (MSC-CM)은 3번째에서 5번째 계대의 중간엽 줄기세포로부터 얻었다. 세포배양용기에 세포가 90%정도 차면, 지름 15cm 배양접시에 있는 중간엽 줄기세포를 PBS (phosphate-buffered saline)로 씻고, 50ml의 새로운 무혈청 DMEM에서 배양하였다. 24시간 후 중간엽 줄기세포 배양액 (MSC-CM)을 모으고, 0.22 ㎛ 필터로 여과시킨 후, 액체 질소에 동결시키고, -70℃에 보관시켰다. 사용하기 바로 전에, 동결된 MSC--CM를 냉장고에서 하룻밤 동안 해동하고, 무균상태에서 20배 농축하였다. 상기 준비된 줄기세포배양액 (MSC-CM)을 담배 연기에 노출 시킨 쥐에 투여하였다. 20배 농축한 MSC-CM을 꼬리 정맥을 통해 1회 0.3ml, 1주일에 2번씩, 5주에 걸쳐 투여하였다.

MTT 분석 및 BrdU uptake 분석

정상 인간 폐 섬유아세포 (Normal human lung fibroblasts (NHLF, Cambrex, Walkerville, MD, USA)) 또는 쥐 태아 폐 섬유아세포 (rat fetal lung fibroblasts (RFL-6, ATCC, Manassas, VA, USA))를 완전 배지 (10% FBS 및 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM)에서 배양하였다. 96-웰 플레이트 (96-well plate)의 각 웰에 7 내지 9 계대의 NHLF 또는 3 내지 8 계대의 RFL-6 세포 5,000 개씩을 분주하였다. MTT 분석(Roche)과 BrdU uptake 분석(Calbiochem)은 제조사의 공지된 방법으로 수행하여, 살아있는 세포의 수 측정 및 세포의 증식여부를 측정하였다.

유세포 분석 ( flow cytometry )

SubG1기 세포의 비율을 유세포 분석기로 분석하였다. 배양용기가 세포로 70% 정도 찼을 때, 폐 섬유아세포를 PBS로 헹구고, 혈청이 없는 상태에서 24시간 CSE에 노출시켰다. 폐 섬유아세포는 트립신-EDTA(trypsin-EDTA (Invitrogen))를 이용하여 배양용기로부터 떼어낸 후, 70% 에탄올로 고정시키고, 5 ㎍/ml RNase (Roche)를 처리하고, 핵의 DNA는 0.1 mg/ml 프로피디움 요오드(propidium iodide (Sigma))로 염색하였다. 전체 10,000 세포를 FACS Calibur flow cytometer 및 CELL QUEST analysis program (BD Biosciences)로 분석하였다.

TUNEL 분석 및 아넥신 V 염색 ( Annexin V staining )

세포자멸사 (apoptosis)를 TUNEL 분석법과 아넥신 V 염색으로 분석하였다. TUNEL 분석을 위해 유리 커버 슬립 (22 X 22 mm, Corning, Lowell, MA, USA)에 부착된 폐 섬유아 세포를 완전배지의 6-웰 플레이트에서 하룻밤 배양시킨 후, PBS로 헹구고, 24시간 동안 CSE에 노출시킨 후, 무혈청 DMEM (대조군 배지) 또는 MSC-CM 에서 24시간 더 배양하였다. 20분 동안 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액으로 세포를 고정시킨 후, 0.1% Triton X-100 로 투과성을 갖게 하고, 1시간 동안 2% BSA와 반응시켰다. 그리고 하룻밤 동안 세포를 4℃에서 FITC가 결합된 항-아넥신 V 항체 (1: 500)와 반응시킨 후, 0.1% Tween-20 이 함유된 PBS (PBS-T) 로 세척 후, TUNEL 분석(Roche)을 수행하였다.

웨스턴 블롯 분석 ( Western blot analysis )

단백질의 발현 및 인산화를 분석하기 위해 웨스턴 블롯을 시해하였다. 세포 용해 용액 (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1% NP-40, 2.5 mM sodium pyrophosphate), 1 mM β-βglycerophosphate, 1 mM Na₃VO₄, 2 mM p-nitrophenyl phosphate 및 protease inhibitor cocktail)을 사용하여 30분간 폐 섬유아세포를 용해시켰다.

14,000 g로 20분간 4℃에서 원심분리한 후, 상청액 내 단백질을 10 또는 15% SDS-PAGE gel에서 분리한 후, 니트로셀루로오즈 막 (nitrocellulose membrane)에 부착시켰다. 니트로셀루로오즈 막을 5% 탈지유와 1시간 동안 반응시킨 후, 1차 항체(1: 1,000)를 첨가하고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 니트로셀루로오즈 막을 0.5% Tween-20이 포함된 완충액 (Tris-buffered saline, TBS-T)으로 세척한 후, HRP-conjugated 2차 항체(1: 5,000)와 반응시켰다. 이후 ECL 시약(Amersham)과 LAS-3000 (Fuji, Japan)을 사용하여 각 단백질을 관찰, 분석하였다.

RT - PCR 로 mRNA 발현 확인

유전자의 mRNA 발현을 조사하고자 RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction)을 시행하였다. 피브로넥틴 1 (fibronectin1), 엘라스틴 (elastin), 콜라겐 (collagen (COL1A1 and COL4A1), 사이클로옥시게나제 (cyclooxygenase-2 (COX-2)), microsomal PGE synthase-2 (mPGES-2), 및 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)의 발현을 RT-PCR로 측정하였다. 쥐의 폐 섬유아세포의 total RNA는 TRIzol reagent (Invitrogen)로 분리하였으며, total RNA 1 ㎍을 기질로 하여 cDNA를 합성하였다. 사용된 PCR 프라이머는 하기와 같았다.

(1) 엘라스틴 (elastin)

정방향 프라이머: 5’- TGCCAAATCTGCTGCTAAGG-3’: 서열번호 1

역방향 프라이머: 5’-TTAGCAGCTTTGGATGCAGC-3’: 서열번호 2

(2) 피브로넥틴 1 (fibronectin1)

정방향 프라이머: 5’-GCCACCTTAACTCCTATACC-3’ : 서열번호 3

역방향 프라이머: 5’-GGAATGTTCACAGAAGTGGC-3’: 서열번호 4

(3) COL1A1

정방향 프라이머: 5’-TGGTGAGAAAGGATCTCCTG-3’ : 서열번호 5

역방향 프라이머: 5’-ATGCCTCTGTCACCTTGTTC-3’: 서열번호 6

(4) COL4A1

정방향 프라이머: 5’-GGTGATAAAGGTGATGTCGG-3’ :서열번호 7

역방향 프라이머: 5’-AATTCCAATGCCAGGGAGAC-3’:서열번호 8

(5) COX-2

정방향 프라이머: 5’-CGGTGAAACTCTAGACAGAC-3’ :서열번호 9

역방향 프라이머: 5’-GATACTGGAACTGCTGGTTG-3’:서열번호 10

(6) mPGES-2

정방향 프라이머: 5’-TGACCCTGTACCAGTACAAG-3’ :서열번호 11

역방향 프라이머: 5’AAACCAGGTAGGTCTTGAGG-3’:서열번호 12

(7) GAPDH

정방향 프라이머: 5’-CTCATGACCACAGTCCATGC-3’ :서열번호 13

역방향 프라이머: 5’-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3’: 서열번호 14

콜라겐 겔 수축 분석 ( collagen gel contraction assay )

폐 섬유아세포를 무혈청 조건에서 24시간 동안 CSE에 노출시킨 후, 액상 콜라겐 용액과 섞어, 최종 세포 밀도가 9.0 X 10⁵ cells/ml, 최종 콜라겐 농도가 1.5 mg/ml이 되게 하였다. 24-웰 플레이트에 응고시킨 콜라겐 용액을 6-웰 플레이트에 옮긴 후, 무혈청 DMEM 또는 MSC-CM 으로 24시간 배양하였다.

디지털 카메라(Nikon D90, Nikon, Japan)로 겔 이미지를 촬영한 후, 이미지분석 소프트웨어 (TINA, Germany)를 사용하여 겔 면적을 측정하였다.

세포 내 콜라겐 및 피브로넥틴의 염색

RFL-6 세포들을 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액으로 고정시키고, 0.1% Triton X-100로 투과성을 갖게 한 후, 2% BSA와 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, 4℃에서 하룻밤 동안 항-콜라겐 1(1: 1,000) 또는 항-피브로넥틴 항체 (1: 500) 과 반응시킨 후, FITC 가 결합된 항-토끼(1: 100) 또는 Alexa Fluor 647이 결합된 항-염소 항체(1:100)와 1시간 동안 반응시켰다. 1 ㎍/ml Hoechst 33258 (Calbiochem)로 핵을 염색한 후, 공촛점 레이저 현미경(Carl Zeiss, Germany)으로 세포 내 각 단백과 핵을 관찰하였다.

우심실압 ( right ventricular systolic pressure , RVSP ) 측정

각 쥐(rat)를 케타민/자일라진 (ketamine/xylazine)으로 마취시키고 인공호흡을 시킨 상태에서, 압력 모니터 (pressure monitor, Hewlett-Packard, USA)가 연결된 23G 주사바늘을 직접 우심실에 삽입하여 우심실압 (right ventricular systolic pressure (RVSP))을 측정하였다.

조직학적 분석

4㎛ 두께의 폐 부위를 조직학적 분석에 사용하였다. 헤마톡실린과 에오신 (hematoxylin & eosin)으로 염색한 조직절편에서 평균 선행 절편 (mean linear intercept, MLI)을 측정하였고, elastin-van Gieson 방법으로 염색한 조직절편에서 혈관 근육화 (vascular muscularization) 정도를 측정하였다.

본 발명의 데이터는 평균±SEM 으로 표기하였다. 양 그룹간의 데이터 비교는 One-way ANOVA 및 Mann-Whitney test를 사용하였다. p 값이 0.05 미만인 경우를 유의적 차이가 있는 것으로 간주하였다.

실시예 1: 담배연기 추출물 ( CSE ) 의 세포 사멸 유도 효과

폐 섬유아세포에 담배연기가 미치는 영향을 알아보기 위해, 정상인의 폐 섬유아세포 (lung fibroblasts (NHLF)) 및 쥐 폐 섬유아세포 (rat fetal lung fibroblasts (RFL-6))에 CSE를 24시간 노출시켰다. MTT 분석 결과, CSE가 농도 의존적으로 살아있는 NHLF 및 RFL-6 세포수를 감소시켰다(도 1A). 또한 담배연기는 유세포분석에서 subG1기의 세포비율을 (도 1B), TUNEL 염색에서 TUNEL-양성세포 수를 증가시켰다 (도 1C). NHLF에 비해, RFL-6 세포에서 살아있는 세포수가 더 많이 감소되고, subG1기 및 TUNEL-양성세포 수의 증가가 더 크게 나타났다. 이 결과는 CSE 에 대한 감수성이 NHLF에 비해 RFL-6 세포에서 더 높다는 것을 암시하고 있다.

실시예 2: 줄기세포 배양액의 폐 섬유아세포 증식 유도 효과

RFL-6 세포의 증식에 대한 중간엽 줄기세포 배양액 (MSC-CM)의 효과를 알아보았다. 혈청이 없는 상태에서 밤새 배양시킨 RFL-6 세포를 무혈청 DMEM (대조군,CON) 또는 MSC-CM에서 24시간 배양하였다. MTT 분석 결과, MSC-CM 는 농도의존적으로 살아있는 RFL-6 세포의 수를 증가시켰다 (도 2A). MSC-CM의 RFL-6 세포 증식효과를 알아보기 위해 BrdU uptake 분석을 수행하였다 (도 2B). MSC-CM은 농도의존적으로 RFL-6 세포에서 BrdU uptake를 증가시켰다.

실시예 3: CSE 에 노출된 폐 섬유아세포에서 MSC - CM 의 세포 사멸 억제 및 세포 증식 효과

RFL-6 세포에 여러 농도의 CSE를 24시간 동안 노출시킨 후, 배양액을 무혈청 DMEM (CON) 또는 MSC-CM로 교체하여, 세포들을 24시간 더 배양시켰다. 모든 농도의 MSC-CM(1배에서 10배)는 농도 의존적으로 살아있는 세포 수를 증가시켰다 (도 3A). 또한, CSE 노출 후 대조군에서는 세포형태가 심각하게 붕괴되었지만, MSC-CM을 처리한 세포에서는 세포 형태의 비교적 잘 유지되었다 (도 3B). 또한 MSC-CM은 CSE 노출에 따른 subG1기 세포의 비율 증가를 감소시켰으며 (도 3C), TUNEL-양성 및 아넥신 V-양성 세포의 빈도수를 감소시켰다 (도 3D). 아울러, MSC-CM는 CSE 노출에도 불구하고 용량의존적으로 BrdU uptake를 유의적으로 증가시켰다 (도 3E). 상기의 결과로부터 MSC-CM은 담배 연기 노출에 따른 세포자멸사(apoptosis)를 억제하며, RFL-6 세포의 증식을 증강시킴을 확인할 수 있었다.

실시예 4: CSE 에 노출된 폐 섬유아세포에서 생화학적 변화에 대한 MSC - CM의 효과

CSE는 농도 의존적으로 active caspase-3, p21, 및 p27을 증가시킨 반면, 전체 Akt, 인산화된 Akt를 감소시켰다 (도 4). 반면에, MSC-CM은 CSE 노출에 따른 상기의 생화학적 변화를 반대로 변화시켰다. 즉, MSC-CM은 CSE에 의해 증가된 active caspase-3, p21, 및 p27를 감소시켰고, 감소된 전체 Akt 및 인산화된 Akt를 증가시켰다.

실시예 5: CSE 에 의해 감소된 콜라겐 겔 수축 능력에 대한 MSC - CM 의 효과

COPD 환자의 폐 섬유아세포는 콜라겐 겔 수축 (collagen gel contraction)을 포함한 회복기능이 손상되었음이 보고되었다. 따라서 본 발명에서는 콜라겐 겔 수축 여부를 이용하여 CSE에 의해 손상된 폐 섬유아세포의 회복 기능이 MSE-CM에 의해 복구되는지 알아보았다. 아무런 자극이 없을 때 RFL-6 세포는 콜라겐 겔을 25%까지 수축하였고, 4%의 CSE에 노출된 폐 섬유아세포는 콜라겐 겔 수축 능력을 완전히 상실하였다 (도 5). 반면에, 10배로 농축된 MSC-CM은 CSE에 노출된 세포 및 노출이 되지 않은 대조군 세포 모두에서 콜라겐 겔 수축 능력을 증가시켰다.

실시예 6: 세포외기질 ( extracellular matrix ) 단백과 콜라겐 젤 수축을 억제하는 효소에 대한 MSC - CM 의 효과

MSC-CM이 ECM 단백질의 발현 회복에 관여하는지를 알아보기 위해 본 발명에서는 ECM 단백질의 발현을 조사하였다. 그 결과, 농도 의존적으로 CSE 노출은 엘라스틴 (elastin), 피브로넥틴 1 (fibronectin 1), COL1A1 및 COL4A1 의 mRNA (도 6A), 콜라겐 1 및 피브로넥틴 단백량을 감소시켰다 (도 6B). 반면에, MSC-CM은 대조군 세포에서 뿐만 아니라 CSE에 의해 손상된 RFL-6 세포에서도 이들 유전자의 mRNA 및 단백질 양을 증가시켰다. 또한, 콜라겐 1 및 피브로넥틴에 대한 세포 면역염색에서도 같은 결과를 보였다 (도 6C). 또한 MSC-CM은 콜라겐 겔 수축의 억제 물질로 잘 알려진 PGE₂를 생산하는 효소인 COX-2 및 mPGES-2의 발현 증가를 감소시켰다 (도 6D).

실시예 7: MSC - CM 의 효과를 나타내는 신호 전달 경로

CSE 노출 후, 세포 생존에 대한 효과 및 ECM 단백질 발현과 콜라겐 겔 수축에 대한 MSC-CM의 회복 효과가 어떤 신호 전달 경로를 통해 이루어지는 지를 조사하였다. MSC-CM은 Akt의 인산화를 증가시킨 반면, PI3-K 억제제인 LY294002는 MSC-CM에 의한 Akt 인산화를 억제하였다 (도 7A). 또한, LY294002는 MSC-CM에 의한 세포 생존을 억제하였으며 (도 7B), ECM 단백질 발현의 회복도 억제하였다 (도 7C). 아울러, LY294002는 MSC-CM에 의한 콜라겐 겔 수축 능력의 회복도 억제하였다 (도 7D). 이상의 결과는 MSC-CM에 의한 회복 효과가 PI3-K/Akt 경로를 매개함을 시사하고 있다.

실시예 8: 중간엽 줄기세포 ( MSC ) 배양액 ( MSC - conditioned media ( MSC - CM ))에 의한 흡연으로 유도된 폐기종 치료효과 확인.

본 발명자는, 6개월간 흡연시킨 암컷 Lewis rats에 세포가 없는 중간엽 줄기세포 배양액 (MSC-CM)을 투여하여, 폐조직 재생을 관찰하였다. 그 결과, 조직학적 검사에서 흡연에 의해 발생된 폐기종이 발생된 폐에서 MSC-CM에 의해 폐조직이 재생되는 것이 확인되었으며 (도 8A), 정량적 검사에서도 흡연에 의해 증가되었던 MLI (mean linear intercept)가 MSC-CM에 의해 정상화되었다 (71.6±2.1μm) (도 8B).

아울러, 줄기세포배양액은 혈관 생성을 촉진시켰으며 (도 9A, B), 흡연으로 인해 증가되었던 우심실압 (RVSP)을 정상화시켰다 (도 9C).

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Composition for treating pulmonary disease comprising mesenchymal stem cell-conditioned media <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for elastin <400> 1 tgccaaatct gctgctaagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for elastin <400> 2 ttagcagctt tggatgcagc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for fibronectin 1 <400> 3 gccaccttaa ctcctatacc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for fibronectin 1 <400> 4 ggaatgttca cagaagtggc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for COL1A1 <400> 5 tggtgagaaa ggatctcctg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for COL1A1 <400> 6 atgcctctgt caccttgttc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for COL4A1 <400> 7 ggtgataaag gtgatgtcgg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for COL4A1 <400> 8 aattccaatg ccagggagac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for COX-2 <400> 9 cggtgaaact ctagacagac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for COX-2 <400> 10 gatactggaa ctgctggttg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mPGES-2 <400> 11 tgaccctgta ccagtacaag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mPGES-2 <400> 12 aaaccaggta ggtcttgagg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GAPDH <400> 13 ctcatgacca cagtccatgc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GAPDH <400> 14 ttcagctctg ggatgacctt 20

Claims (10)

1. 줄기세포의 배양액을 포함하는 폐질환의 예방 및 치료용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 줄기세포의 배양액은 중간엽 줄기세포의 배양액인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 배양액은 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 3 내지 5 대 계대 배양하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 배지는 DMEM 배지인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 골수로부터 유래된 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 주사제 또는 흡입제 형태로 제형화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 1항에 있어서, 상기 폐질환은 만성폐쇄성폐질환 또는 폐고혈압인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 만성폐쇄성폐질환 또는 폐고혈압은 흡연에 의해 발생된 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 7항에 있어서, 상기 만성폐쇄성폐질환은 폐기종 또는 만성기관지염인 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 흡연에 의해 발생된 폐기종을 치료하고, 폐조직을 재생시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
    

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