KR20110134884A - 리포펩티드를 정제하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 리포펩티드를 정제하는 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 다프토마이신을 정제하는 개선된 방법을 제공한다.

Description

리포펩티드를 정제하는 방법{PROCESS FOR PURIFYING LIPOPEPTIDES}

본 발명은 화학적 명칭 N-데카노일-L-트립토필-D-아스파라지닐-L-아스파르틸-L-트레오닐글리실-L-오르니틸-L-아스파르틸-D-알라닐-L-아스파르틸글리실-D-세릴-트레오-3-메틸-L-글루타밀-3-안트라닐로일-L-알라닌 ε1-락톤으로 표시되는 다프토마이신을 정제하기 위한 개선된 정제 방법에 관한 것이다. 다프토마이신은 하기 화학식 I로 표시될 수 있다:

다프토마이신은 그램-양성 유기체에 활성을 지니는 리포펩티드 항생제이다. 다프토마이신은 스트렙로마이세스 로세오스포루스(Strepromyces reseosporus)의 발효 이후 발효 브로스(broth)의 정제의 의해 생성된다. 다프토마이신의 작용 메커니즘은 이것이 박테리아 막에 결합하여 막 포텐셜의 신속한 탈분극을 야기하는 것이다. 막 포텐셜의 손실은 단백질, DNA 및 RNA 합성의 억제를 야기하며, 이것이 박테리아 세포 치사를 초래한다. 다프토마이신은 복합적인 피부 및 피부 구조 감염(complicated skin and skin structure infections, cSSSI)과 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 혈류 감염 (세균혈증)용으로 승인되었다. 다프토마이신은 쿠비스트 파마슈티칼즈 (Cubist Pharmaceuticals)에 의해 상품명 Cubicin®으로 판매된다.

다프토마이신은 1980년대 중반에 여러 특허 및 저널에 처음 기재되었다; 미국특허 4,537,717 및 Dehono M. et al., Journal of Antibiotics, 1986, Vol. XL, No 6, 761-777. 그 후, 개선된 발효 방법 및 정제 방법에 관한 여러 간행물이 있어 왔다.

미국특허 4,885,243호에 다프토마이신을 제조하는 개선된 발효 방법이 기재되었다. 이 방법은 데칸 지방산 또는 이의 에스테르 또는 염을 스트렙로마이세스 로세오스포루스(Strepromyces reseosporus)의 발효 브로스에 공급하는 것을 기재한다. 발효 동안, 데칸 지방산은 분자에 삽입되어 다프토마이신의 데칸 측쇄를 형성할 것이다.

종래 기술에서, 다프토마이신을 정제하는 여러 정제 방법들이 기재되어 왔다. 미국특허 4,874,843호는 발효 브로스를 여과하고 HP-20 수지를 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 첨가하는 다프토마이신 정제 방법을 기술하고 있다. 용리 후에, 반정제된 다프토마이신을 HP-20ss 수지를 함유하는 컬럼에 통과시킨 다음 HP-20 수지를 함유하는 또 다른 컬럼에 통과시켰다. 이러한 단계들에 추가하여, 여러 추가의 크로마토그래피 단계로 순도를 증가시키려는 시도가 기재되어 있으나, 아무런 성과가 없었다. 상기 특허는 추가로 비-작용성 수지 및 수용액을 이용하여 물을 물리적으로 제거한 다음 수지를 극성 유기 용매로 재습윤시키는 단계를 포함시킴에 의해, 생성물의 순도가 80%에서 93%까지 증가되었다고 교시하고 있다. 상기 공정은 시간 소모적이며 산업적 생산에 그다지 적합하지 않다.

US RE 39071 특허는 다프토마이신의 생산에서 발견되는 두 주요 불순물인 무수-다프토마이신 및 다프토마이신의 베타-이성질체를 기재하고 있다. US RE 39071은 추가로 실시예 1-3에 기재된 방법을 이용하여, 언급된 두 불순물을 6% 미만으로 포함하는 다프토마이신 생성물을 얻을 것이라고 언급하고 있다. 실시예 3은 다프토마이신의 중간체 품질이 4개의 크로마토그래피 단계 및 추가의 탈염, 농축 및 동결 건조 단계를 포함하는 방법으로 추가로 정제된다고 기재하고 있다. 크로마토그래피 단계에서, 아세토니트릴이 세척 및 용리에 이용되며, 또한 냉각된 용액과 냉각된 방에서 상기 방법을 수행해야만 한다.

미국특허 6,696,412 특허는 변형된 완충제가 용리에 이용되는 음이온 교환 크로마토그래피 단계와 다프토마이신이 마이셀(micelles)을 형성하는 마이크로여과 단계를 이용함에 의해 다프토마이신을 정제하는 방법을 기술하고 있다. 당업자에게 익숙한 기타 정제 단계와 함께 상기 언급된 두 단계가 조합된 여러 방법이 상기 특허에 기재되어 있다. 상기 특허에서 고도로 정제된 다프토마이신 생성물은 95-97%의 순도 수준을 지니는 다프토마이신으로 정의된다.

발명의 개요

본 발명은 95% 이상의 순도를 갖는 생성물을 초래하도록 다프토마이신을 정제하기 위한 개선된 정제 방법을 제공한다. 기재된 방법은 종래에 기재된 방법보다 단순하며, 하기 기재된 대로, 변형된 완충제의 이용이 불필요하고 환경에 이롭지 않은 아세토니트릴을 이용할 필요가 없다.

본 발명에 따른 방법은 음이온 교환 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피 단계를 이용한다. 또한, 전형적인 여과 단계 및 최종 생성물의 냉동건조가 수행될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 용리 완충제로서 사용된 1가 염 용액은 물 중의 염화나트륨 용액이다.

본 발명의 역상 크로마토그래피 단계 b)의 용리 완충제는 수성 알코올이다. 바람직하게는, 수성 알코올은 수성 에탄올이다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 다프토마이신은 물 중의 40-70%의 에탄올을 포함하는 용리 완충제를 이용하여 역상 크로마토그래피 단계로부터 용리된다.

본 발명은 하기 반응식 1로 제시된 단계들로 예시될 수 있다.

본 발명은 총 순도가 95% 이상인 다프토마이신 생성물을 야기한다. 무수-다프토마이신의 양은 0.5 내지 1.5%이고, 베타-이성질체의 양은 0.5% 미만이다.

본 발명에 따른 방법은 사용되는 완충제 및 단계들과 관련하여 당 분야에 공지된 방법보다 단순하고, 환경에 유해한 용매의 이용을 회피하는 정제 방법을 제공한다. 또한, 가장 중요한 두 불순물인 무수-다프토마이신 및 다프토마이신의 베타-이성질체의 매우 양호한 분리와 낮은 수준을 초래한다. 본 발명에 따른 방법은 종래에 기재된 생성물보다 적어도 더 순수한 생성물을 제공하면서 단순한 정제 방법을 제공한다.

발명의 상세한 설명

본 발명에 따른 방법의 출발 물질은 미국특허 4,885,243호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있고, 여기서 공급되는 지방산은 데칸산이다.

본 발명에 따르면, 다프토마이신은 먼저 음이온 크로마토그래피 단계를 이용하여 정제되고, 후속하여 두 번째 역상 크로마토그래피 단계에 의해 정제된다.

본 발명의 출발 물질로서 이용된 발효 브로스는 큰 입자 및 바이오매스(biomass)를 제거하기 위해 상기 크로마토그래피 단계 이전에 예비-처리될 수 있다. 예비-처리 방법으로서, 본 발명의 출발 물질로서 이용된 발효 브로스는 하나 이상의 정화 단계를 거칠 수 있다. 여러 가지 유용한 정화 단계가 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명에 따른 발효 브로스를 예비-처리하는데 유용한 정화 단계의 비제한적인 예로는 역삼투, 원심분리, 초여과, 마이크로여과, 나노여과, 및 정용여과(diafiltration)가 있다. 정화에 이용하기 위해 고 다공성 수지를 이용한 음이온 교환 단계도 가능하다.

당업자에게 널리 공지된 정화 방법들의 여러 조합이 음이온 교환 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피에 의해 다프토마이신을 추가로 정제하기 전에 발효 브로스를 예비-처리하도록 본 발명에 따라 이용될 수 있음을 이해하여야 한다.

정화된 발효 브로스를 음이온 교환 컬럼에 첨가한다. 카프토(Capto) Q, Q 세파로스(Sepharose) XL, Q 세파로스 FF, 소스(Source) 15 Q, 소스 30 Q 또는 매크로프렙 하이(Macroprep High) Q와 같은 강한 음이온 교환 수지 또는 이의 등가물 및 또한 시판되는 수지 DEAE 세파로스 FF, ANX 세파로스 FF, 소스 15 Q와 같은 약한 음이온 교환 수지 둘 모두를 본 발명에 따라 이용할 수 있다. 바람직한 수지는 시판되는 수지 카프토 Q와 같이, 덱스트란 표면 증량제를 지니는 고도로 가교된 아가로스 수지이다. 정화된 용액을 로딩시킨 후, 컬럼을 물로 세척한다.

본 방법의 음이온 교환 크로마토그래피 단계 a)의 용리 완충제는 1가 염 용액이다. 상기 1가 염은, 예를 들어 NaCl 또는 KCl과 같은 클로라이드 염일 수 있다. 다른 1가 염, 예를 들어 소듐 아세테이트와 같은 아세테이트의 1가 염도 이용할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 다프토마이신은 물 중의 NaCl 구배를 이용하여 컬럼으로부터 용리될 수 있는데, 상기 구배는 0.1M NaCl에서 1.5M NaCl, 바람직하게는 0.2M NaCl에서 1.0M NaCl이다.

그 후, 반-정제된 다프토마이신을 역상 컬럼에 첨가한다. 바람직한 역상 수지는 시판되는 수지인 소스 PRC 30, SP20ss, HP20ss 또는 동등한 폴리스티렌 기반(based) 수지 유형과 같이, 폴리스티렌 및 디비닐 벤젠으로 제조된 단분산(monosized) 다공성 수지이다. 다프토마이신 용액을 컬럼에 적용시킨 후에, 컬럼을 15% 알코올, 예를 들어 15% 에탄올을 함유하는 물로 세척한다.

다프토마이신을 수성 알코올, 예를 들어 C1-C3 알킬 알코올, 예컨대 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올로 용리시킬 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 다프토마이신은 용리 용매로서 에탄올을 이용하여 역상 컬럼으로부터 용리된다.

다프토마이신은 일 구체예에 따라 물 중의 에탄올 구배에 의해 역상 컬럼으로부터 용리된다. 구배는 5-80% 에탄올 및 바람직하게는 40-70%의 에탄올이다.

본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 추가의 역상 크로마토그래피 단계가 존재한다. 본 발명의 바람직한 구체예는 상이한 pH 상에서 두 역상 컬럼을 진행시켜 생성물의 순도를 개선시키는 것이다. 바람직한 일 구체예에서, 첫 번째 컬럼은 중성 pH에서 진행되고 두 번째 컬럼은 산성 pH에서 진행된다. 두 역상 크로마토그래피 단계들이 pH와 관련하여 어떤 순서로 진행되는 지는 중요하지 않다. 첫 번째 컬럼이 산성 pH에서 진행되고 두 번째 컬럼이 중성 pH에서 진행될 수 있거나 그 반대도 가능하다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 첫 번째 역상 크로마토그래피 컬럼은 pH 6.5-8.5, 바람직하게는 pH 7.5-8.0에서 용리된다. 본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 두 번째 역상 크로마토그래피 컬럼은 pH 2.5-3.5, 바람직하게는 pH 3.0-3.1에서 용리된다.

본 발명에 따른 방법에서 역상 크로마토그래피 단계에 이용되는 컬럼은 시판되는 수지인 소스 30RPC와 같은 스티렌 기반 수지일 수 있다. 다른 동등한 역상 크로마토그래피 수지, 예를 들어 SP20ss, HP20ss 또는 당업자에게 공지된 동등한 폴리스티렌 기반 수지 유형이 또한 이용될 수 있다.

그 후 정제된 다프토마이신을 표준 조건하에 정제하고 냉동건조시킨다. 정제된 최종 다프토마이신의 순도는 95% 이상이다.

실시예 1

정화 후에, 부분적으로 정제된 다프토마이신 용액을 음이온 교환 컬럼 상에 로딩시켰다. 출발 물질을 정용여과에 의해 정화시켰다.

이온 교환 크로마토그래피 상에서 정제:

정용여과된 다프토마이신을 음이온 교환 컬럼, 카프토 Q 수지 상에 로딩시켰다.

완충제를 하기 조성으로 분리된 탱크에서 제조하였다:

완충제 1: DI-수

완충제 2: 0.2M NaCl

완충제 3: 0.4M NaCl

완충제 4: 1.0M NaCl

로딩시키기 전에 출발 용액의 pH를 희석된 NaOH를 이용하여 6-8로 조정하였다. 다프토마이신을 20 g/L 수지의 최대 용량으로 수지에 결합시켰다. 수지에 결합시킨 후에, 발효 관련 불순물을 먼저 완충제 1로 세척한 다음 완충제 2로 세척하였다.

다프토마이신의 용리 및 회수를 완충제 3을 이용해 등용매적으로 수행하였다. 용리시킨 후에, 컬럼을 완충제 4로 스트리핑하여 임의의 남아있는 다프토마이신 또는 강한 결합 불순물을 제거하였다.

다프토마이신을 약 5-10 BV 부피에 기초하여 수집하였다.

역상 크로마토그래피 I ( RPC I):

다프토마이신을 스티렌 기반 소스 30RPC 수지를 이용하여 HPLC에 의해 정제하였다.

단계에 대한 완충제를 분리된 탱크에서 제조하였다:

완충제 1: DI-수

완충제 2: 12-16% 에탄올

완충제 3: 55-65% 에탄올

다프토마이신을 중성 pH (pH 7.5-8.0)에서 정제하였다. 먼저, 컬럼을 완충제 1과 평형화시켰다. 다프토마이신을 컬럼 상에 로딩시킨 다음 (최대 로딩 정도 < 30 g/L 수지) 덜 소수성인 불순물을 완충제 2로 세척하였다 (주로 분해 생성물).

그 후, 다프토마이신을 12-16 BV에 걸쳐 구배 용리 15 내지 60% 에탄올 (완충제 1에서 2로의 구배 혼합)에 의해 회수하였다. 다프토마이신을 UV 시그널에 기초하여 수집하였다.

역상 크로마토그래피 II :

순도에 기초하여, 첫 번째 역상 크로마토그래피 단계 (RPC I)로부터 분획을 수집하고 풀링하고, 탱크에 다프토마이신이 침전되는 것을 방지하기 위해 빠른 교반하에 아세트산을 이용하여 pH를 3.0-3.1로 조정하였다.

상기 단계에 대한 완충제를 분리된 탱크에서 제조하였다:

완충제 1: DI-수, 아세트산으로 pH 3.0-3.1로 조정하였다.

완충제 2: 30-35% 에탄올, 아세트산으로 pH 3.0-3.1로 조정하였다.

완충제 3: 65-75% 에탄올, 아세트산으로 pH 3.0-3.1로 조정하였다.

pH 조정된 다프토마이신 용액을 컬럼 상에 로딩시키고 (최대 로딩 정도 < 30 g/L 수지) 덜 소수성인 불순물을 완충제 1로 세척하였다.

8-12 BV에 걸쳐 혼합 완충제 2 및 3의 35% 내지 70% 에탄올 구배로 진행시켜 다프토마이신의 용리 및 회수를 수행하였다.

다프토마이신을 UV 시그널에 기초하여 수집하였다.

실시예 2

발효 브로스를 정화시키기 위해, 여러 정화 방법을 이용하였다. 먼저, 발효 브로스를 원심분리하여 큰 입자 및 바이오매스를 제거하였다. 발효 브로스의 pH는 6.4였고, 건조 물질 (DM)은 약 6-7%였다. 원심분리 후에, 상청액은 3%의 DM만을 함유하였다. 그 후, 상청액을 25-100 ㎛ 필터를 통해 추가로 예비-여과시켜 25-100 ㎛ 보다 큰 입자를 제거하였다.

그 후, 원심분리되고 예비-여과된 용액을 펠리콘(Pellicon) 2,500 kD (밀리포어) 필터를 통해 초여과시켜 큰 입자를 제거하였다. 초여과 후에, 용액을 나노여과에 의해 더 농축시켰다 (up-concentrate). 사용된 필터는 DL-시리즈인 350D (GE Osmonics)였다. 체류물은 5 g/l의 다프토마이신을 함유하였고, pH는 6이었다.

체류물을 본 발명에 따른 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 의해 추가로 정제하였다. 사용된 수지는 GE 헬쓰케어로부터의 카프토 Q (90 ㎛)였다. 필요한 경우, 체류물을 컬럼에 로딩시키기 전에 체류물의 pH를 NaOH를 이용하여 6으로 조정하였다. 체류물을 컬럼에 로딩시킨 후에, 컬럼을 물로 세척하고, 다프토마이신을 NaCl 단계 구배로 용리시켰다. 용리액은 물 중에 0.2M, 0.4M 및 1.0M NaCl을 함유하였다. 음이온 교환 컬럼으로부터 풀링된 분획은 약 2.5 g/l의 다프토마이신을 함유하였다.

그 후, 음이온 교환 컬럼으로부터 풀링된 분획을 첫 번째 역상 크로마토그래피 (RPC I)에 로딩시켰다. 사용된 수지는 GE 헬쓰케어로부터의 소스 30RPC (30 ㎛)였다. 로딩시킨 후에, 컬럼을 물로 세척하고 pH 7-8에서 20-50% 에탄올 구배로 용리시켰다. 상기 단계로부터의 분획화 풀은 약 6 g/l의 다프토마이신을 함유하였다.

상기 분획화 풀을 동일한 수지를 지니는 두 번째 역상 컬럼에 추가로 로딩시켰다. 이전 역상 컬럼으로부터의 다프토마이신 용액을 로딩시킨 후에, 컬럼을 물로 세척하고 다프토마이신을 pH 3.0에서 20-50% 에탄올 구배로 용리시켰다. 상기 단계로부터의 분획화 풀은 약 8 g/l의 다프토마이신을 함유하였다.

그 후, 다프토마이신 용액을 DL-시리즈인 GE 오스모닉스로부터의 350D 막을 지니는 나노여과 단계를 통해 가공하였다.

나노여과 후에, 다프토마이신 용액을 표준 조건을 이용하여 냉동건조시켰다.

최종 생성물의 순도는 95-97%의 범위이다.

Claims (20)

1. a) 부분적으로 정제된 다프토마이신을 포함하는 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩시키는 단계;
   b) 상기 단계 a)의 용액을 역상 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩시키는 단계; 및
   c) 임의로, 상기 단계 b)의 용액을 역상 크로마토그래피 컬럼 상에 적어도 한 번 더 로딩시키는 단계를 포함하며,
   상기 단계 a)의 용리 완충제가 1가 염 용액이고, 상기 단계 b)의 용리 완충제가 수성 알코올인, 다프토마이신을 정제하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 단계 a) 전에, 1회 또는 수 회의 정화 단계가 수행되는 방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피 단계 b)의 생성물이 1회 또는 수 회의 여과 단계에 의해 추가로 정제되는 방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 역상의 생성물이 냉동건조 단계에 의해 추가로 처리되는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 단계 a)의 용리액이 NaCl인 방법.
6. 제 2항에 있어서, 상기 용리 완충제가 0.1-1.5M NaCl인 방법.
7. 제 1항에 있어서, 상기 단계 b)의 용리 완충제가 수성 에탄올인 방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 용리 완충제가 5-80% 에탄올인 방법.
9. 제 1항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 단계가 덱스트란 표면 증량제를 지니는 고도로 가교된 아가로스 수지를 이용하여 수행되는 방법.
10. 제 1항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피 단계가 스티렌 기반(based) 수지 컬럼을 이용하여 수행되는 방법.
11. 제 1항에 있어서, 상기 단계 b)가 한 번 반복되는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 첫 번째 역상 크로마토그래피 컬럼이 pH 6.5-8.5에서 용리되는 방법.
13. 제 11항에 있어서, 상기 두 번째 역상 크로마토그래피 컬럼이 pH 2.5-3.5에서 용리되는 방법.
14. a) 다프토마이신을 포함하는 발효 브로스(broth)를 1회 또는 수 회의 정화 단계로 처리하는 단계;
    b) 상기 단계 a)의 용액을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩시키는 단계;
    c) 상기 단계 b)의 용액을 역상 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩시키는 단계;
    d) 임의로, 상기 단계 c)의 용액을 역상 크로마토그래피 컬럼 상에 적어도 한번 더 로딩시키는 단계;
    e) 상기 단계 d)에서 생성된 용액을 1회 또는 수 회의 여과 단계로 처리하는 단계; 및
    f) 상기 단계 e)의 여액을 냉동건조시킴으로써 다프토마이신의 정제된 분말을 수득하는 단계를 포함하여, 다프토마이신을 정제하는 방법.
15. 제 14항에 있어서, 상기 단계 a)의 정화 단계가 역삼투, 원심분리, 여과. 초여과, 나노여과, 음이온 교환 크로마토그래피의 기술들 중 어느 하나 또는 이들의 조합인 방법.
16. 제 14항에 있어서, 상기 단계 b)의 용리액이 NaCl인 방법.
17. 제 16항에 있어서, 상기 용리 완충제가 0.1-1.5M NaCl인 방법.
18. 제 14항에 있어서, 상기 단계 c)의 용리 완충제가 수성 에탄올인 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 용리 완충제가 5-80% 에탄올인 방법.
20. 제 14항에 있어서, 상기 단계 c)가 한 번 반복되는 방법.